Hazai orchideafajok, szimbionta gombáik és az abiotikus környezet kapcsolatának vizsgálata különbözı élıhelyeken

Átírás

1 DOKTORI (PHD) ÉRTEKEZÉS TÉZISEI Hazai orchideafajok, szimbionta gombáik és az abiotikus környezet kapcsolatának vizsgálata különbözı élıhelyeken Ouanphanivanh-Kiss Noémi Kensy Környezettudományi Doktori Iskola (iskolavezetı: Dr. Jánosi Imre) Környezetbiológia program (programvezetı: Dr. Ács Éva) Témavezetı: Prof. Dr. Szigeti Zoltán egyetemi tanár, az MTA doktora Eötvös Loránd Tudományegyetem Növényélettani és Molekuláris Növénybiológiai Tanszék Budapest 2015

2 Bevezetés Az orchideafélék családjába tartozó több, mint 25000, különleges szépségő faj közül sok veszélyeztetett. Az ember környezetromboló hatása mellett az is különösen sérülékennyé teszi az orchideafajokat, hogy kölcsönösen elınyös (mutualista) kapcsolatban állnak az ıket beporzó rovarokkal, valamint szimbionta gombapartnereikkel is, így eredményes megırzésükhöz az orchideák életfeltételei mellett szimbionta partnereik és megporzóik életfeltételeit is ismernünk kell, ám az utóbbi két tényezırıl még viszonylag hiányosak az ismereteink. Az orchideák csíranövényeit fejlıdésük során teljesen gombapartnerük táplálja, mert a magok nem, vagy csak nagyon kis mennyiségben tartalmaznak tartalék tápanyagokat, és a kapcsolat kifejlett egyedeknél is fennmarad. A mikorrhiza partnerek általában a Rhizoctonia formanemzetség képviselıi közül kerülnek ki (Ceratobasidium, Thanatephorus, Sebacina és Epulorhiza nemzetségek), de az utóbbi évtizedekben több, korábban ektomikorrhizásként ismert gombanemzetségrıl (Tuber, Russula, Coprinus) is kimutatták, hogy az orchideák mikorrhiza partnerei lehetnek. Ez az utóbbi stratégia fıként az erdei orchideák körében terjedt el, ugyanis az erdıkben az orchideák nem tudják csak fotoszintézis révén elıállítani a számukra szükséges tápanyagokat, így a környezı fákkal ektomikorrhizát is képezı szimbionta partnerük révén közvetlenül a környezı fáktól kapják meg a számukra még szükséges szerves vegyületeket. Az orchideák specifitását szimbionta partnereik filogenetikai spektrumának szélességével lehet legjobban definiálni. Ilyen értelemben véve a generalista orchideák több gombanemzetség vagy -család képviselıivel mikorrhizálódnak, míg a specialista fajok csupán egy gombafajjal, vagy gombáknak egy nagyon szők csoportjával. Nem teljesen egyértelmő, hogy az orchideák számára a rendkívül hatékony, a szimbionta felek között szoros együttmőködést lehetıvé tevı specialista stratégia, vagy a sokféle gombapartnerrel való együttélést lehetıvé tevı generalista stratégia tekinthetı-e jobb választásnak. Míg a természetes élıhelyeken elıforduló orchideafajok szimbionta gombapartnereirıl egyre több adattal rendelkezünk, addig a bolygatott élıhelyeken (például felhagyott bányákban) élı orchideákat mikorrhizáló gombákat alig ismerjük, hazai viszonylatban pedig egyáltalán nem történtek eddig vizsgálatok. Egyre több vizsgálati eredmény utal arra, hogy bizonyos környezeti tényezık (például hımérséklet, vízellátottság) is befolyásolják egy adott élıhelyen kialakuló gombaközösség összetételét, azonban ezen tényezık orchidea szimbionta gombákra gyakorolt hatását még nem ismerjük. 2

3 Célkitőzések Munkánk során célul tőztük ki, hogy 1. molekuláris biológiai módszerekkel azonosítsuk felhagyott bányákban élı orchideaegyedek gombapartnereit, a. összehasonlítsuk a vizsgált bányákból kimutatott gombaközösségeket, b. összehasonlítsuk a felhagyott bányák és természetes élıhelyek szimbionta gomba közösségeit, c. további adatokhoz jussunk az Orchis militaris fajspecifitását illetıen; 2. egy számítógépes adatbázis felhasználásával meghatározzuk, mely földalatti gombafajok illetve nemzetségek élhetnek szimbiózisban erdei orchideafajokkal, 3. molekuláris biológiai módszerekkel azonosítsuk két erdei élıhelyen élı orchideaegyedek gombapartnereit; 4. különbözı hımérséklető és vízaktivitású táptalajokon meghatározzuk különbözı vízellátottságú élıhelyekrıl izolált gombatörzsek hımérsékleti optimumát és nedvességigényét, a napi növekedési ráta mérésével. Anyagok és módszerek Terepi vizsgálatainkat három felhagyott bányában Pusztavám Cica-homok, felhagyott szénbánya; Székesfehérvár Sóstói Homokbánya; Tokodaltáró - Gete-alji homokbánya valamint két erdei élıhelyen végeztük Algyı Lúdvári-erdı; Szigetcsép homoki tölgyes. A pusztavámi bányában Orchis militaris, Székesfehérváron Orchis militaris, Anacamptis coriophora, Anacamptis palustris ssp. palustris és Dactylorhiza incarnata, Tokodaltárón pedig Orchis militaris, Epipactis palustris és Dactylorhiza incarnata egyedek gyökerébıl győjtöttünk mintákat az orchideák virágzási idejében, között. Algyın Epipactis helleborine agg., Szigetcsépen pedig Cephalanthera damasonium és Epipactis microphylla egyedekbıl vettünk gyökérmintákat folyamán. A gyökerekbıl gyökérszegmens technikával izoláltuk a bennük élı gombatörzseket, vagy közvetlenül mikorrhizált gyökérszakaszokból mutattuk ki az ıket kolonizáló gombákat molekuláris 3

4 biológiai módszerekkel. A gombákat az nrits régió szekvenciája alapján azonosítottuk az NCBI BLAST adatbázisának segítségével. A filogenetikai elemzéseket maximum likelihood módszerrel a RaxML GUI 0.95 programmal végeztük, a szekvenciákat a MAFFT és ALTER programokkal illesztve és konvertálva. A vizsgált élıhelyeken győjtött mintákból talajanalízis is történt, emellett cönológiai felvételeket is készítettünk. A cönológiai felvételekbıl késıbb az edényes növények nedvességigényét és degradációtőrését határoztuk meg a Flóra Adatbázis WB és VDT értékeit alapul véve, hogy minél alaposabban össze tudjuk egymással hasonlítani az egyes felhagyott bányák vegetációját. A földalatti gombák számítógépes adatbázisában többek között a következı paraméterek szerepelnek: fajnév, herbáriumi szám, győjtés ideje, győjtı neve, földrajzi tájegység, település, élıhely típusa, élıhely kitettsége, győjtıkutya neve, talaj típusa, növénytársulás, gazdanövény. Emellett miden egyes gomba környezetében készült cönológiai felvétel is, melybıl értékes információkat nyerhetünk arra vonatkozóan, hogy egy adott földalatti gomba közelében elıfordult-e orchidea. Az adatbázis orchideákra vonatkozó adatait a Microsoft Office Excel 2003 programjának segítségével elemeztük. A hımérsékleti és szárazságstresszes kísérletek során két orchidea szimbionta nemzetség (Ceratobasidium és Epulorhiza) úszólápi, nedves és változóan nedves élıhelyekrıl származó gombatörzseinek növekedését vizsgáltuk PDA táptalajon C-os hımérsékleten, valamint 0,988-0,64 a w vízaktivitási értékek között mértük a táptalajok közepére oltott 9 mm átmérıjő korongokból kinövı koncentrikus telepek átmérıjét, és ez alapján meghatároztuk a törzsek napi növekedési rátáját az egyes kísérleti beállításokon. 5%- os szignifikanciaszint mellett, az adatok normalitásától és számától függıen paraméteres (egyszempontos ANOVA) vagy nem paraméteres (Kruskal-Wallis teszt) próbákkal vizsgáltuk, hogy van-e szignifikáns különbség az egy nemzetségbe tartozó törzsek növekedési adatai között az egyes kísérleti beállításokon. Új tudományos eredmények 1. A felhagyott bányákban élı orchideák gyökerébıl 42 szekvenciát tudtunk kimutatni, köztük három szimbionta gombanemzetség (Ceratobasidium, Sebacina és Epulorhiza) és négy endofita csoport (Coprinaceae, Fusarium spp., Leptodontidium spp. és Pezizaceae) képviselıit. Elsıként mutattunk ki Coprinaceae családba tartozó gombákat fotoszintetizáló orchideák gyökerébıl. 4

5 a. A gombaközösség Székesfehérváron volt a legdiverzebb (három szimbionta gombacsoport és három endofita csoport), Tokodaltárón közepesen gazdag (három szimbionta gombacsoport és egy endofita csoport), Pusztavámon pedig a legszegényebb (egy szimbionta gombacsoport és három endofita csoport). Úgy tőnik, hogy minél kevésbé degradált, minél természetközelibb egy élıhely, annál gazdagabb szimbionta gombaközösség fordul ott elı. b. Természetes élıhelyekkel összevetve a bányákban feltőnıen gyakrabban tudtuk kimutatni az Epulorhiza nemzetség képviselıit, fıként az Epulorhiza 2 csoportba tartozó gombákat. Eredményeink arra engednek következtetni, hogy az Epulorhiza gombák, fıként az Epulorhiza 2 gombacsoport elsısorban bolygatott élıhelyeken fordulnak elı. c. Eredményeink egyértelmően rámutatnak, hogy az Orchis militaris specifitása tágabb, mint ahogy azt korábban gondolták. A régebben specialistának tartott orchideafaj gyökerébıl a mások által kimutatott Epulorhiza 2 szimbionták egyetlen alcsoportja mellett az Epulorhiza 2 szimbionták másik két alcsoportját, Epulorhiza 1, Ceratobasidium és Sebacina szimbiontákat, valamint Coprinaceae családba tartozó, Fusarium spp. és Cadophora sp. endofitákat is ki tudtunk mutatni. Mindezek fényében kijelenthetjük, hogy az Orchis militaris a generalista orchideák közé sorolható specifitását tekintve. 2. Az erdei élıhelyeken Tuber excavatum és Tuber rapaeodorum gombákat tudtunk kimutatni, utóbbit mi mutattuk ki elsıként orchideákból. 3. A földalatti gomba adatbázis adatai alapján is elsısorban Tuber és Hymenogaster fajokról várható, hogy orchideák mikorrhiza partnereiként azonosítják ıket. E két gombanemzetség képviselıi tették ki együttesen az orchideák közelében elıforduló földalatti gombák 75 százalékát. 4. A hımérsékleti és szárazságstresszes kísérletek eredményei alapján láthattuk, hogy szinte minden kísérleti beállításnál szignifikáns különbséget tapasztaltunk az egy nemzetségbe tartozó törzsek növekedési adatai között, ami arra enged következtetni, hogy a különbözı élıhelyekrıl származó törzsek alkalmazkodtak az élıhelyükön fennálló környezeti viszonyokhoz. Az elızetes elvárásainktól való kisebb-nagyobb eltérések azt sugallják, hogy a szimbionta gombák nem lehetnek szőktőrésőek a hımérséklet- és vízellátottság szempontjából. 5

6 Következtetések A vizsgált erdei élıhelyeken és a felhagyott bányákban egyaránt igaz, hogy az orchideák viszonylag kedvezıtlen körülmények között élnek, hiszen az erdıkben kevés a fény, a bányákban pedig pionír körülmények uralkodnak. Mindkét élıhelyen ki tudtunk mutatni az ott élı orchideák gyökerébıl nem klasszikus (nem Rhizoctonia s.l.) szimbiontákat, sıt az erdei élıhelyeken élı orchideák gyökerébıl csak nem-rhizoctonia gombákat tudtunk kimutatni. Irodalmi adatok alapján igazoltnak tekinthetı, hogy az erdei orchideák valóban mikorrhiza kapcsolatban állnak a gyökerüket kolonizáló ektomikorrhizás Tuber nemzetségbe tartozó gombákkal, tehát az orchideák evolúciója során már lezajlott a partnerváltás. Elképzelhetınek tartjuk, hogy a bányákban az orchideák evolúciójának egy másik, korábbi állomását figyelhetjük meg, melynek során az orchideák gyökerében egyszerre vannak jelen a klasszikus szimbionták és egyéb gombacsoportok. Az orchideák gyökerében jelenlévı endofita gombákról nem tudhatjuk, hogy mutualista kapcsolatban állnak-e az orchideákkal, de több gombacsoport (Fusarium spp., Leptodontidium spp.) esetében felmerült a kölcsönös elınyökön alapuló kapcsolat lehetısége, egy Coprinus fajt pedig orchidea szimbionta gombaként azonosítottak japán kutatók. Mindezek fényében feltételezzük, hogy az orchideák, fıként a bányákban fennálló kedvezıtlen körülmények között, generalistaként sokféle gombát beengednek a gyökerükbe, és ezekbıl a gombákból az evolúció során akár szimbionta partnerek is lehetnek. Az Orchis militaris látszólagos specifitását vélhetıen az okozta, hogy az adott élıhelyen nem volt elérhetı más gombapartner. Mindez a környezeti tényezık orchideákra és szimbionta gombákra gyakorolt hatásának a vizsgálatára irányítja figyelmünket, hiszen egy orchideafaj eredményes védelméhez fontos ismernünk nem csupán szimbionta gombapartnereit, hanem az azok számára szükséges optimális abiotikus életfeltételeket is. 6

7 A dolgozat témájához kapcsolódó publikációk jegyzéke Referált tudományos folyóiratokban megjelent dolgozatok Ouanphanivanh N, Illyés Z, Merényi Zs, Orczán ÁK, Szigeti Z, Bratek Z (2013) Mycorrhizal fungi and endophytes of orchids living in three Hungarian abandoned mines. Sydowia 65:(2) pp Illyés Z, Ouanphanivanh N, Rudnóy Sz, Orczán ÁK, Bratek Z(2010) The most recent results on orchid mycorrhizal fungi in Hungary. Acta Biologica Hungarica 61:(Supplement 1) pp Illyés Z, Halász K, Rudnóy Sz, Ouanphanivanh N, Garay T, Bratek Z (2009) Changes in the diversity of the mycorrhizal fungi of orchids as a function of the water supply of the habitat. Journal of Applied Botany and Food Quality-Angewandte Botanik 83: pp Ouanphanivanh N, Zs Merényi, ÁK Orczán, Z Bratek, Z Szigeti, Z Illyés (2008) Could orchids indicate truffle habitats?: Mycorrhizal association between orchids and truffles Acta Biologica Szegediensis 52:(1) pp Ouanphanivanh N, Illyés Z, Rudnóy Sz, Bratek Z (2007) Hazai Orchis militaris élıhelyek orchidea-mikorrhiza gombáinak vizsgálata. Tájökológiai Lapok 5:(2) pp Kivonatok folyóiratokban, konferencia kiadványokban Ouanphanivanh N, Illyés Z, Szigeti Z, Bratek Z (2009) A Székesfehérvár-Sóstói felhagyott homokbányában élı orchideák szimbionta gombapartnereinek azonosítása. 8. Magyar ökológus kongresszus, Szeged, augusztus In: Körmöczi L (szerk.) 8. Magyar Ökológus Kongresszus: elıdások és poszterek összefoglalói. p Ouanphanivanh N, Szigeti Z, Illyés Z (2010) Egyes hazai homok- és szénbányákban élı orchideák gombapartnereinek azonosítása molekuláris biológiai módszerekkel. Magyar Biológiai Társaság, Botanikai Szakosztály, szakülés, április 26., Budapest. Botanikai közlemények, 97 (1-2) p

8 Egyéb publikációk jegyzéke Kivonatok folyóiratokban, konferencia kiadványokban Varga T, Merényi Zs, Ouanphanivanh N, Lenykó A, Bóna L, Bratek Z (2014) Erdei orchideáink és földalatti gombák közös élıhely preferenciája. X. Aktuális Flóra- és Vegetációkutatás a Kárpát-medencében Konferencia Sopron, március 7-9. In: Schmidt Dávid, Kovács Miklós, Bartha Dénes (szerk.) X. Aktuális flóra- és vegetációkutatás a Kárpát-medencében nemzetközi konferencia, pp Illyés Z, Ouanphanivanh N, Rudnóy Sz, Bratek Z (2012) Orchids in the Carpathian Basin and their Mycorrhizal Associations. 15th European Orchid Congress. Budapest, április pp Ouanphanivanh N, Illyés Z (2007) Hazai orchideafajok és szimbionta gombáik vizsgálata: fajspecifitás, vagy élıhelyspecifitás. Magyar Biológiai Társaság, Botanikai Szakosztály, szakülés, december 4., Budapest, Botanikai Közlemények 93(1-2) p. 127 Illyés Z, Eszéki E, Ouanphanivanh N, Garay T, Halász K, Geösel A, Lukács N, Bratek Z (2006) Conservation methods of Hungarian native orchids and identification of symbiotic mycorrhizal fungi. 1st European Congress of Conservation Biology, Eger, augusztus In: 1st European Congress of Conservation Biology: Book of Abstracts, p Illyés Z, Garay T, Ouanphanivanh N, Bratek Z (2006) Orchidea-szimbionta gombák ökológiai diverzitása vizes élıhelyeken.7. Magyar ökológus kongresszus, Budapest, szeptember 4-6. In: Szentesi Á, Szövényi G, Török J (szerk.) 7. Magyar Ökológus Kongresszus: Elıadások és poszterek összefoglalói. p. 91. Elıadások Illyés Z, Ouanphanivanh N, Rudnóy Sz, Bratek Z (2009) Orchideaszimbionta gombák azonosítása molekuláris taxonómiai módszerekkel. 80 éves a Debreceni Egyetem Növénytani Tanszéke címő konferencia, Debrecen, november Illyés Z, Ouanphanivanh N, Jezovith G, Bratek Z (2007) Orchideaszimbionta gombák azonosítása molekuláris taxonómiai módszerekkel. Diószegi-nap: Molekuláris taxonómiai, filogenetikai és filogeográfiai kutatások Magyarországon, Debrecen, november 17. 8