TOXIKOLÓGIA GYAKORLATOK

Átírás

1 PÉCSI TUDOMÁNYEGYETEM TTK BI Általános és Környezeti Mikrobiológiai Tanszék TOXIKOLÓGIA GYAKORLATOK Szerkesztette: Vágvölgyi Csaba, Pesti Miklós Az összeállításban résztvettek: Kucsera Judit, Manczinger László, Pesti Miklós, Pfeiffer Ilona, Takács Krisztina, Vágvölgyi Csaba Pécs 2005 A kétciklusú képzés bevezetése a magyar felsőoktatásban a természettudományi szakokon alkalmazkodás a munkaerőpiaci igényeihez. HEFOP P /1.0 Az Európai Szociális Alap támogatásával

2 2

3 BEVEZETÉS A jegyzet célja, hogy a toxikológia gyakorlatokra való felkészülést elősegítse, a kísérlet menetének leírása segítséget nyújtson a végrehajtáshoz. A gyakorlatos jegyzet egyben jegyzőkönyvként is szolgál, kísérletek kiértékelése rögzíthető benne. A jegyzet elején a laboratóriumi munkavédelmi rendszabályokat az általános anyag- és eszközismeret, majd a mikroszkóp rövid leírása követi. Az egyes gyakorlatokat az elméleti tudnivalók összefoglalásával kezdjük, majd a kísérlet anyag- és eszközigényét adjuk meg (zárójelben feltüntetve az 1 párosra vonatkozó mennyiségeket), ezt követi a gyakorlat menetének leírása. Megadjuk azt, hogy az elvégzett kísérlettel kapcsolatosan milyen kérdésekre kell választ adni, javaslatot teszünk a kísérlet kiértékelésének módjára. 1

4 I. A LABORATÓRIUM RENDJE A toxikológia gyakorlatokon a laboratóriumokra vonatkozó általános rendszabályokat be kell tartani (elektromos;- és; gázkészülékek kezelésével, sav, lúg, méreg, robbanásveszélyes vegyszerek kezelésével kapcsolatos előírások). Ha a gyakorlat során mikroorganizmusokkal dolgozunk a fertőzésveszély miatt az általános mikrobiológiai rendszabályokat is szigorúan be kell tartani. A toxikológiai vizsgálatok során számos olyan anyaggal, vegyszerrel dolgozhatunk, amelyek potenciális veszélyt jelenthetnek az emberre, ezért ügyeljünk a megfelelő védőfelszerelés használatára és az anyagok előírásszerű kezelésére. A gyakorlatokon tartsuk be a gyakorlatvezető utasításait! Laboratóriumban étkezni, dohányozni, laboratóriumi edényekből inni, laboratóriumi eszközöket egyéb célra felhasználni szigorúan tilos! A gyakorlatokon védőköpenyt kell használni. Ezt a munkaköpenyt lehetőleg más célra ne használjuk, vagy egyéb gyakorlatokon való használat esetén gyakran tisztítsuk. Csak kifogástalan állapotban levő eszközöket és edényeket használjunk! A mérgező vegyszerekkel körültekintően bánjunk! A mérgező anyagokkal szennyezett edényeket, eszközöket a külön erre a célra rendszeresített kidobóba gyűjtsük! Élő tenyészetek kiömlése, tenyészeteket tartalmazó edények törése esetén a fertőzésnek kitett felületeket, a törött edényeket fertőtlenítő folyadékkal (pl. neomagnol) csírátlanítsuk! Az esetről a gyakorlatvezetőt informáljuk. Oltóeszközök leégetését előírásszerűen végezzük; nagy mennyiségű oltóanyag rátapadása esetén a láng közepén szárítsuk, utána égessük, különben szétfröccsenhet a mikrobatömeg. Tilos a lefolyóba önteni élő mikrobák tenyészetét vagy szuszpenzióját! Elpusztításuk hővel vagy vegyszerrel történik. Tilos továbbá bármilyen vegyszert a lefolyóba önteni! Ne öntsünk a lefolyóba megolvasztott agaros táptalajt, mert a csövek eltömődnek! Mosogatás előtt az edényeket autoklávozással, vagy fertőtlenítő szerekben (formalin, neomagnol, sterogenol, flóraszept) történő több órás áztatással kell csíramentesíteni. Munka befejeztével a laboratóriumi asztalt fertőtlenítő folyadékkal (flóraszept vagy neomagnol) megnedvesített ruhával le kell törölni! A laboratóriumból való távozás előtt (gyakorlat közben is) kezet kell mosni fertőtlenítő folyadékban! 2

5 II. ANYAG ÉS ESZKÖZISMERET 2.1. TÁPTALAJOK A mikrobák vizsgálata tenyésztés közben vagy tenyésztés után történik. A tenyésztésre táptalajokat használunk. A mikroorganizmusok tápanyagszükségletüket a táptalajból fedezik. A különböző mikróbák tápanyagigénye rendkívül változatos lehet, de vannak olyan táptalaj összetevők amelyek alapvetően szükségesek. A tápközeg komponensei két fő részből állnak: Esszenciális összetevők Járulékos összetevők: -víz oldószer -prekurzorok -energiaforrás redukált, nagy energiatartalmú vegyületek -vitamiok -szén-forrás -nitrogén-forrás -ásványi anyagok enzimek A táptalajok osztályozása különböző szempontok alapján történhet. Halmazállapot szerint 1. Folyékony táptalajok: a tápoldat komponensek összemérése során a szilárdító anyagot kihagyjuk (táplevesek, tápoldatok). 2. Szilárd táptalajok: a folyékony táptalajt szilárdító anyaggal egészítjük ki. Szilárdító anyagok az alábbiak lehetnek: A) Agar-agar: poliszacharid, 1-3%-ban használatos (1% lágyagar), dermedéspontja koncentrációtól függően 38 C feletti, tengeri moszatokból készítik, csak igen kevés mikroorganizmus hidrolizálja. B) Zselatin: polipeptid, 10-30%-ban használatos, dermedéspontja a koncentráció függvénye, számos mikroba bontja. C) Szilikagél: előnye, hogy szerves anyagokat nem tartalmaz. A táptalaj készítése időigényes. Ritkán alkalmazzák, általában kemolitotróf mikroorganizmusok tenyésztésekor. Felhasznált anyag szerint 1. Természetes táptalajok: szerves eredetű anyagok, melyeknek pontos összetételét nem ismerjük, pl. húsfőzet, élesztő kivonat, maláta, melasz, gyümölcslevek, tej. 2. Szintetikus táptalajok: összetételüket pontosan ismerjük. 3. Félszintetikus táptalajok: természetes és szintetikus összetevők keverékei. 3

6 Az alkalmazott tápanyagkomponensek szerint 1. Alaptáptalajok: a növekedéshez szükséges alapanyagokon kívül (esszenciális összetevők) speciális adalékanyagokat nem tartalmaznak, pl. T 1 univerzális táptalaj 2. Szelektív táptalajok: alaptáptalaj + szelektív gátlóanyag (pl. antibiotikum). Egyes mikroba csoportok visszaszorítását célozzák. 3. Differenciáló vagy indikátor táptalajok: alaptáptalaj + indikátor anyag, amely speciális anyagcsere reakciókat jelez (pl. laktóz bontás, savképzés). 4. Speciális táptalajok: különböző vizsgálatok céljainak megfelelően, vagy különböző speciális igényű mikrobák számára összeállított táptalajok. Táptalaj készítés: először a szilárd alkotókat mérjük be, majd feloldjuk nem teljes térfogatban. Oldódás után állítjuk be a végleges térfogatot. A ph érték beállítása 5%-os HCl ill. 5 %-os NaOH-dal történik finomskálás indikátor papírral vagy műszerrel történő ellenőrzés mellett, majd autoklávozunk. Autoklávozás után az agar tartalmú táptalajok ph-ja 0,1-0,5 ph értékkel csökken a szilárdító anyag enyhe hidrolízise és változása miatt. Agar tartalmú táptalajok nyomás alatt sterilezhetők, zselatin tartalmúak csak áramló gőzben (nyomás alatt erős hidrolízis következik be). A hőérzékeny táptalaj komponenseket szűréssel való sterilezés után adjuk az autoklávozott és megfelelően lehűtött alaptáptalajhoz TENYÉSZTÉSHEZ HASZNÁLT EDÉNYEK Minden tenyésztéshez használt laboratóriumi edényt a táptalaj kifejtése előtt vattadugóval kell ellátni (gyapot- vagy papírvatta egyaránt használható). Kémcsövek: folyékony táptalajból (1.C. ábra) 5 ml mérendő be. Szilárd táptalajból magas agar (1.B. ábra) esetén 10 ml, ferde agarhoz (1.A. ábra) 5 ml szükséges. A ferde táptalaj készítésével célunk a nagyobb felület biztosítása. A B C 1. ábra: A kémcső mint tenyészedény 4

7 Lombikok: Erlenmeyer-lombikban és talpas gömblombikban létrehozhatunk folyadék-tenyészetet, de önthetünk lemezt (2.B.) ábra és ferde táptalajt (2.A. ábra) is. 2. ábra: Erlenmeyer-lombik mint tenyészedény 3. ábra: Roux-plack 4. ábra: Kolle-csésze Speciális tenyészedények: a Roux-palack (3. ábra) és a Kolle-csésze (4. ábra). 5

8 A fenti edényféleségek (beleértve a nem speciális Erlenmeyer-lombikot is) mind szilárd, mind nyugvófelszínes folyadékkultúra nevelésére alkalmasak (a táptalaj rétegvastagsága kicsi, felülete nagy). A tenyészedényeket a táptalaj betöltése után vattadugóval zárjuk, majd autoklávozással sterilezzük. Célszerű az edényeket papír, celofán vagy alufólia "sapkával" ellátni sterilezés előtt, nehogy az autokláv gőzterében a vattadugók átnedvesedjenek. Petri-csésze: a leggyakrabban használt laboratóriumi tenyészedény (5. ábra). A táptalaj kiöntése előtt szárazon sterilezzük. A táptalaj kiöntésekor a fedőt csak a szükséges mértékig emeljük. A 9 10 cm átmérőjű csészébe ml táptalaj szükséges. A tenyészedényeket az alábbiak szerint jelöljük: 1.) a mikroorganizmus neve és laborkódja, 2.) az oltás dátuma, 3.) a táptalaj típusa, 4.) a gyakorlat száma, 5.) a kivitelező neve. 5. ábra: Petri-csésze A fermentor olyan változatos méretű tenyészedény, amely gépi segédletekkel a tenyészetek nevelésére használható, ahol a tenyésztés körülményeit megfelelő ellenőrző rendszerekkel tudjuk biztosítani. A tápoldatban szaporodó mikroorganizmusok homogenitását keveréssel, oxigénnel való egyenletes ellátásukat steril levegőbefúvással érjük el OLTÓESZKÖZÖK Oltótű és az oltókacs: hőszigetelt végű, leégethető fémnyelű (Kolle-nyél, 6. ábra) tűzálló fémtűvel vagy hurokkal (kaccsal) ellátott eszköz. Sterilezése lángban, leégetéssel történik. Mikrotiterkacs: a hurok helyett kalibrált térfogatú fémkosara van, amely ismert térfogatú folyadék (szuszpenzió) átvitelére alkalmas. 6. ábra: Oltótű, oltókacs 6

9 Pipetták: Folyadéktenyészetek ismert térfogatának átoltására használhatók az üvegpipetták, amelyeket fémdobozban, vagy alufóliába csomagolva száraz hővel sterilezzük. Biopipetták: (automata pipetták) különböző térfogat adagolására alkalmas (rögzített, vagy szabályozható méretű) eszközök, cserélhető sterilezhető műanyag pipetta heggyel STERILEZÉS A tiszta tenyészetekkel végzett munkák előtt az eszközökön, tenyészedényekben, tápközegben lévő mikrobákat el kell pusztítani. Sterilezés során minden mikróbát elpusztítunk. A dezinficiálás pedig csak a kórokozó mikroorganizmusok elpusztítását jelenti. A sterilezésnek különböző módjai vannak. I. Fizikai módszerekkel történő sterilezés A) Sterilezés hővel Leégetés lánggal: oltótű, oltókacs esetében alkalmazzuk átoltások során. Száraz hővel: üveg, fémeszközöket, pl. pipettákat, Petri-csészéket sterilezünk így. A hőlégsterilizálók megadott hőmérsékletre állítható önreguláló elektromos berendezések. A sterilezés időtartama 4 óra 140 C-on vagy 2 óra 160 C-on. Nedves hővel Pasteurözés: magas hőmérsékleten (60-96 C) a vegetatív sejtek nagy részének elpusztítása, időtartama 1-40 perc, pl. 65 C 30 perc; 85 C 5 perc. Hátránya, hogy a Clostridium spórák túlélik. Arnoldozás: sterilizálás áramló gőzben 100 C-on percig. Ekkor a vegetatív sejtek elpusztulnak, a spóráknak azonban csak egy része. Kivitelezése le nem zárt autoklávban vagy szelep nélküli kuktafazékban történik. Tyndallozás: három egymást követő napon arnoldozunk. A kezelések közötti időben a spórák kihajtanak és elpusztíthatók (frakcionált csíramentesítés). Hőérzékeny tápkomponensek esetén (pl. zselatin) alkalmazhatjuk. Autoklávozás: sterilezés nyomás alatt (autokláv: 7. ábra). A leggyakrabban alkalmazott körülmények: 120 C, 1,0 atmoszféra túlnyomás, perc. Egy adott nyomáson elérhető hőmérséklet az autoklávtérben a levegő és gőz arányától függ. túlnyomás (atm) gőz teljes levegő ( C) gőz 1/2 levegő ( C) gőz levegő nélkül ( C) 0, , , ,

10 A sterilezésre használt berendezésének megfelelő működését ismert hőtűréssel rendelkező mikroorganizmusokkal ellenőrizetjük, pl. autokláv esetén B. stearothermophilus; hőlég estetén Bacillus speciesek. Szimplafalú autokláv kezelése: 1. Ellenőrizzük, hogy van-e megfelelő mennyiségű víz az autoklávban. 2. Behelyezzük a sterilizálandó anyagokat (edény, eszköz, tenyészet). 3. Lezárjuk az autokláv fedelét, szorítócsavarokkal egyenletesen leszorítjuk. 4. Ellenőrizzük, hogy a gőz-szelep nyitva van-e. 5. Bekapcsoljuk az autokláv fűtését. 6. Megvárjuk, amíg az autokláv felmelegszik. A gőzszelepet csak az intenzív gőzkiáramlás megindulása után 2-3 perc múlva zárjuk el. 7. Bekapcsolt autoklávot magára hagyni tilos! A nyomás emelkedésekor ellenőrizzük, hogy a biztonsági szelep működik-e. 8. A kívánt nyomásérték elérésekor az autoklávot 20 percen keresztül megfelelő hőmérsékleten tartjuk, majd a fűtést kikapcsoljuk. 9. Megvárjuk amíg a túlnyomás nullára csökken. Nyitjuk a gőz-szelepet, majd az autokláv fedelét. Vigyázzunk! A felszálló gőz éget! A duplafalú és automata autoklávok kezelése a készülékekhez mellékelt használati utasítás szerint történik. 7. ábra l. gőz-szelep, 2. nyomásmérő, 3. biztonsági szelep, 4. hőmérő, 5. fedél, 6. vízszintjelző, 7. rakfelület, 8. fűtőtest, 9. vízszint 8

11 Gyakorlatainkban gyakran alkalmazunk autokláv helyett kuktafazekat sterilezésre. Így is teljes csírátlanítás érhető el. A kuktafazékba desztillált vizet kell tölteni kb. kétujjnyi magasságban, behelyezni az eszközöket, majd lezárjuk és gázlánggal melegítjük a kuktát. A forrástól számítva 20 percig sterilezünk. B) Sterilezés UV-sugárzással: különböző sugárzások (Röntgen-, radioaktív-, UV-sugárzás) csíraölő hatásúak. A gyakorlaton nm sugárzási maximumú UV (germicid)-lámpákkal sterilezünk. C) Sterilezés szűrőkkel: folyadék sterilezésére vagy folyadék és szilárd táptalajok hőérzékeny komponenseinek csíramentesítésére szűrőket alkalmazunk. Abszorpciós szűrők: Chamberland (zománc nélküli porcelán), Berkefeld (kovaföld), Seitz (azbeszt); ezek egy idő után telítődnek. Pórus szűrők: leggyakrabban a szinterüveg (zsugorított porózus üveglemez) szűrők és a membránszűrők használatosak. A bakteriológiai szinterüveg szűrők között legismertebb a G-5 jelzésű szűrő, 0,1µm pórusátmérővel. A membránszűrők anyaga különböző szerves polimer lehet: leggyakrabban a 0,22 vagy a 0,45 µm pórusátmérőjű készítményekkel dolgozunk (Milliporevagy Sartorius szűrők). A baktériumok eredményes szűréséhez max. 0,3 µm pórusátmérőjű szűrőt használjunk. A szűrés elősegítésére vízlégszivattyút, olajlégszivattyút (8. ábra), vagy fecskendőhöz hasonló nyomópumpát (9. ábra) alkalmazunk. 8. ábra 9. ábra l. szűrőtölcsér, 2. szűrőlap l. dugattyú, 2. fecskendőház 3. gumidugó, 4. szívópalack 3. szűrőtartó, 4. szűrőlap, 5. vattazár (membrán) 9

12 D) Sterilezés ultrahanggal: Ritkán alkalmazott eljárás. II. Sterilezés kémiai úton A kemikáliák fehérjékkel és egyéb sejtkomponensekkel való reakciók révén fejtik ki sterilező hatásukat. A hatás a koncentráció és az idő függvénye. Alkalmazhatók nehézfémsók (HgCl 2, AgNO 3 ), oxidálószerek (KMnO 4, H 2 O 2 ), halogének (klór, jód), szerves oldószerek (pl. 70%-os etanol, dimetilszulfoxid), a fenol 3%-os vizes oldata (karbol), a formalin 3%-os vizes oldata; gáz (etilénoxid). Felületaktív, zsíremulgeáló kation szappan, membránkárosító, spórákat nem öl. A neomagnol (benzolszulfonkloramid-nátrium) 0,1%-os vizes oldatában a keletkező NaOCl a fehérjék aminocsoportjait klórozza. Megfelelő koncentrációban sporocid. Hatástalanítja a toxinokat is. Steril oltófülke Használata a táptalajoknak steril edényekbe való kifejtésekor, Petri-csészékbe történő lemez készítésekor, ezek leszárításakor, valamint oltási műveletek végzése esetén ajánlatos. Különösen Petricsészék, illetve folyadéktenyészetek, hosszú tenyészidőre beállított kultúrák inokulálását célszerű a steril fülkében elvégezni. Az ún. "biohazard" típusú oltófülke lényege, hogy a levegő a beépített szívó és nyomóhatást kifejtő elektromotorok hatására a fülke hasznos belső terének tetején elhelyezett szűrőn keresztül csíramentesen kerül a munkatérbe, ott lefelé áramlik, majd a lyuggatott munkalapon keresztül elhagyja a munkateret. Az ismételt steril szűrőn való átjutás előtt egy előszűrőn halad át a levegőáram. Ez a mozgásirány, valamint a munkatér és a külvilág határfelületén egyéb segédberendezések (kiküszöbölendő az örvénymozgást) megakadályozzák, hogy a fülkébe a külső térből bárminemű szennyezés, fertőzésforrás bekerülhessen, egyben megakadályozza a munka során a belső térben használt mikroorganizmusok kikerülését is. A steril fülkék ezen típusa alkalmas a patogén mikroorganizmusokkal való munkára is A MIKROORGANIZMUSOK TENYÉSZTÉSE A mikrobákat kontrollált körülmények között kell tenyészteni. Fontos az optimális hőmérsékleten való tartás a gyors növekedés biztosítása érdekében. Erre a célra termosztátokat használunk (duplafalú, vízköpennyel, önreguláló elektromos fűtéssel ellátott szekrények). A mikróbák különböző levegőztetést igényelnek. Az aerob szervezetek nevelésekor ha azok nem szilárd táptalaj felületén nőnek a megfelelő levegőztetésről körkörös rázatással vagy fermentorban való tenyésztéssel gondoskodhatunk. A rázógépek termosztálását vízfürdő segítségével vagy száraz levegő befúvással biztosítjuk. Anaerobok esetén oxigén elvonást, illetve reduktív körülményeket kell a tápközegben biztosítani. Az egyes mikroorganizmusok tápnygszükséglete eltérő, ezért tenyésztéskor a megfelelő táptalajt kell alkalmazni. Végül, pedig a tenyésztési időt is figyelembe kell venni, mivel ez is más-más 10

13 az egyes mikróbáknál (baktériumoknál 1-2 nap, élesztőgombáknál 2-3 nap, penész- ill. fonalasgombáknál 1 hét) MIKROSZKÓP-ISMERET Ebben a fejezetben röviden áttekintjük a mikroszkóp használatával kapcsolatos tudnivalókat. Mikroszkópunk binokuláris tubussal, keresztasztallal, négy revolverváltóval, cserélhető achromát objektívvel, két pár okulárral rendelkező készülék. A fényforrás beépített alacsonyfeszültségű lámpa (10. ábra). Az objektíveken néhány jellemző érték van feltüntetve, pl.: nagyítás olajimmerzió (WI - vízimmerzió Glyc - glicerin immerzió) HI 100/1,25 160/0,17 numerikus apertura fedőlemez vastagsága tubushossz Az első szám az objektív nagyítóképességét jelzi, ha a tubus hossza mm-ben az alatta lévő számmal (160) egyenlő. Az első sorban a törtvonal utáni szám az objektív numerikus aperturája. A második sorban a törtvonal utáni szám azt a fedőlemez vastagságot jelzi mm-ben, melynél a felette lévő numerikus apertura érték érvényes. A legnagyobb nagyítású objektíven a nagyítást jelző szám előtt álló HI a "homogén immerzió" szavak rövidítése. Azt jelzi, hogy ennél az objektívnél a jelzett numerikus apertura és nagyítás értékek akkor érvényesek, ha az objektív frontlencséje és a preparátum között nem levegő van (mint a többi, úgynevezett száraz-objektívnél), hanem immerziós olaj (cédrus olaj vagy anizol), melynek fénytörése az üveg fénytörésével azonos. Az okulárokon jelzik a nagyítóképességet és (kis körbe írva) az ún. mező számot (lásd később). Műszerünk teljesítőképességét a fenti adatok alapján egyszerűen kiszámíthatjuk. A feloldóképesség annak a legkisebb tárgynak az átmérője, amelyet a műszerrel még éppen felismerhetünk. A feloldóképesség (F) a megvilágításra használt fény hullámhosszától (λ) és az objektív numerikus aperturájától (NA) legkedvezőbb megvilágítási viszonyok esetén az alábbi képlet szerint függ: λ F = 2 x NA 11

14 A numerikus apertura a tárgy és az objektív frontlencséje között lévő közeg törésmutatója (n) valamint a frontlencse félnyílásszöge (α) sinusának a szorzata: NA = n x sinα frontlencse tárgy A nyílásszöget a tárgy egy pontjából a frontlencse széleihez húzott két egyenes adja (élesre állított kép esetén!). A sinα maximális értéke 1; gyakorlatban 0,95 az elérhető érték, ekkor a teljes nyílásszög kb Száraz objektíveknél n = 1 (levegő) homogén immerziós objektíveknél n = 1,51. (cédrusolaj) Számításainknál a fény hullámhosszát 500 nm-nek vegyük; ez az emberi szem által legjobban érzékelhető, világoszöld színű fény hullámhossza. A mikroszkóp nagyítása az objektív nagyításának és az okulár nagyításának szorzata. Az objektíven jelölt nagyítás 160 mm tubushosszra vonatkozik. Egyes mikroszkópoknál a binokuláris tubus 160 mm-nél hosszabb; ebben az esetben a nagyítás kiszámításánál a binokuláris tubuson látható faktorral (1,6x) is szorozni kell. Azt, hogy a mikroszkóp látómezejében megfigyelt terület mekkora a valóságban, kiszámíthatjuk, ha az okuláron jelzett mezőszámot elosztjuk az objektív nagyításával, így mm-ben kapjuk a kérdéses kör átmérőjét. Természetesen a tubushosszat itt is figyelembe kell vennünk. A binokuláris tubust mindenki beállítja a saját pupillatávolságára, a tubuson lévő 55-től 75-ig számozott skála a pupillatávolságot jelzi mm-ben. A binokuláris tubuson korrigálható a két szem közötti esetleges dioptriakülönbség. A bal szemet behunyva a képet a mikrométer-gombbal élesre állítjuk, majd a jobb szemet behunyva a képet a tubuson lévő gyűrűvel állítjuk élesre. Akiknél a két szem egyforma, a 0-jel vonása egybeesik a tubus oldalán lévő vonással. Az élesre állítást úgy végezzük, hogy oldalról ellenőrizve először a tárgyasztalt a durvabeállító gombbal az objektív felé közelítjük, míg az objektív a preparátumot csaknem érinti, majd a mikroszkópba nézve a tárgyasztal süllyesztésével (előbb a durvabeállítóval, majd amikor a kép már látszik, a mikrométer gombjával) állítunk élesre. A mikroszkópos kép jó minőségét és egyenletes kivilágítottságát a lámpa égőjének és blendéjének, a kondenzor magasságának és blendéjének megfelelő beállításával, továbbá a kondenzorba homályos üveg illetve színszűrő behelyezésével igyekszünk elérni. A kondenzor alsó részén található, kihajlítható lencsét csak a 6,3x-os nagyítású objektívvel kapcsolatban iktassuk be. A mikroszkóphoz csatlakoztatható fáziskontraszt berendezés, sötétlátóteres kondenzor és UV-fényforrás is (lásd a megfelelő gyakorlatokat). 12

15 Mikroszkópos fotózás Amikor a mikroszkópozás során látott képet rögzíteni akarjuk, akkor szükségessé válik a mikroszkóp és a fényképezőgép (kamera) összekapcsolása. Ez történhet egyszerű mechanikai úton, de az összekapcsoláskor közbeiktathatunk különböző típusú automatikus rendszereket elsősorban a vizsgált tárgyon áthaladó fény mérésére, és az ehhez szükséges expozíciós idő automatikus mérésére. Gyakorlatunkban a BA2 típusú fénymérő és exponáló automatát használjuk. Ezen keresztül csatlakoztatjuk a kamerát a fáziskontraszt mikroszkóphoz. (Többféle típusú kamera használható mikroszkópos fotózáshoz, ha a normál fényképezőgép optikáját eltávolítva illeszteni tudjuk a mikroszkóphoz.) Az exponáló automata segítségével különböző fedettségű, sötét illetve világos, jól megvilágított és gyenge világítottságú preparátumról készíthető jól exponált film. Az automata fénymérő üvegszál optikán beméri az adott preparátum megvilágítási viszonyait és ennek megfelelően vezérli a felvétel expozíciós idejét (ez a másodperc tört részeitől 5-6 perc hosszúságú lehet). A fényképezésre szánt mikroszkópos preparátummal szemben magas minőségi követelményeket támasztunk: l.) A tárgylemezek, fedőlemezek teljesen tiszták, karcmentesek és optikailag is megfelelőek legyenek. 2.) A vizsgálandó anyag, élő sejt, vagy rögzített preparátum mindig egyrétegben (egy síkban) helyezkedjen el. Ez lényeges, mert az átvilágítás során egyik réteg zavarja a másikat. Az egy síkban elhelyezkedő mikrobák mélységélessége jelentősen javul, így morfológiájuk jól tanulmányozható és a képi látvány is tökéletesebb. 3.) Beszáradt, vagy zsugorodott preparátum nem fényképezhető. 4.) A tárgylemezre felvitt anyag (intakt sejtek, fonalak, konidiumok) mindig folyadékba legyen ágyazva. Ez a fénytörésből eredő zavaró problémákat csökkenti, a fényképezéshez elengedhetetlen kontúrélességet fokozza. A tárgylemezre vitt anyagra cseppentsünk az alkalmazandó folyadékból, vagy eleve ebbe a folyadékcseppbe készítsük el a fényképezendő preparátumot, tiszta fedőlemezzel fedjük le, a felesleges folyadékot itassuk fel. (Ne ússzon a fedőlemez!) 5.) Az expozíciós idő alatt állítsuk le, vagy fékezzük le a preparátum mozgását. A pillanatnyi mozdulatlanság előfeltétele az éles felvételnek. A mozgás leállítása, vagy lassítása történhet zselatinba, glicerinbe történő ágyazással, tárgylemezhez történő fixálással, ragasztással, vagy pl. konidiumok cellux szalagra történő ragasztásával. 6.) Válasszunk ki jellemző, nem zsúfolt látómezőt a fényképezésre. 7.) A felvételeket viszonylag gyorsan készítsük el, mert a fényforrás melegít, a preparátum száradása megindul, és beindul a Brown-féle mozgás is. 13

16 8.) A kép "megszerkesztésekor" síkban gondolkodjunk (a binokuláris mikroszkópok térben adják a képet). A fénykép "kevesebbet" ad vissza a binokuláris feltétben látottaknál. 9.) A mikroszkópos felvétel készítése előtt ügyeljünk a preparátum élesre állítására. Itt a képkeresőben látható szálkereszt élesre állításához igazodjunk. A mikroszkópos fekete-fehér felvételek készítéséhez leggyakrabban a közepes érzékenységű (15/10, vagy 17/10 din) filmek alkalmazhatók. Ezek szemcsézettsége finom, jól nagyíthatók, kontrasztosak, a részleteket jól visszaadják. Színes felvételek készítésekor műfény diafilm, fluorescens-mikroszkóp esetében napfény diafilm használható 18/10 din alsó érzékenység határral. Mikroszkópunk vázlata (10. ábra): l: talp; 2: durva beállítógomb; 3: mikrométer beállítógomb; 4: kondenzor emelő-süllyesztő gomb; 5: kondenzor, kihajlítható alsó lencse, kihajlítható tartógyűrű színszűrő vagy opálüveg számára, blende; 6: tárgyasztal keresztasztallal; 7: keresztasztal mozgató gombjai; 8: objektívek a revolverváltóban; 9: binokuláris tubus okulárokkal; 10: mikroszkóp megvilágító rendszere (talpba épített transzformátor, izzó). 10. ábra: Laboratóriumi mikroszkóp vázlata 14

17 III. GYAKORLATOK A gyakorlatokon párokban dolgozunk, ezért az Anyagok és eszközök pontban az egy párra vonatkozó mennyiségeket zárójelben tüntettük föl. 15

18 1. gyakorlat: ÁTOLTÁSOK GYAKORLÁSA Az elkészített táptalajokat (T-1 T-5a) különböző steril tenyészedényekbe szétosztjuk, majd a táptalajokat hagyjuk lehűlni, illetve megdermedni. A kémcsöveket megdöntve helyezzük el a ferdeagar, és függőlegesen a magas agar készítéséhez. A lehűlt tápoldatba, illetve a megdermedt táptalajra oltunk. a) Oltás ferde agarra Mikroorganizmusok: Escherichia coli, Serratia marcescens, Bacillus cereus var. mycoides, B. megaterium, Micrococcus luteus, (T-1); Saccharomyces cerevisiae, Candida utilis, Rhodotorula rubra, Syncephalastrum racemosum, Aspergillus niger 48 órás tenyészetei T-5 ferde agaron (a baktériumok T-1, a gombák T-5 táptalajon növekednek jól). Anyagok és eszközök: T-1 ferde agar (4 db) T-5 ferde agar (4 db) A leoltás menete: 1) Bal kézbe fogjuk a leoltandó tenyészetet tartalmazó és az "üres " kémcsövet (11. ábra). A csövek helyzete közel vízszintes legyen. Hüvelykujjunkkal a tenyerünkhöz szorítjuk a csöveket. (Rögzíthetjük a csöveket az ujjak közé szorítással is.) Az agar oltandó felülete mindig felénk legyen fordítva. 2) Az üres cső vattadugóját megforgatjuk, hogy könnyen kiemelhető legyen, ha a belefejtett táptalajtól beragadt volna. 3) Az oltóeszközt úgy fogjuk jobb kézzel, mintha íróeszközt fognánk. Közel függőleges helyzetben a gázlángba tartva, felizzítjuk az oltókacsot, majd a nyél fém részét lángoljuk le. 4) Jobb kezünk gyűrűs- és kisujjával kiemeljük a tenyészetes cső dugóját úgy, hogy a kiemelés után a dugó szabad része ne érintkezzen semmivel. Lángoljuk le a kémcső száját. 5) A kaccsal benyúlunk a kémcsőbe, lehűtjük üres agarfelületen. A tenyészetből inokulumot veszünk ki. (Inokulum = az a mikrobamennyiség, amellyel be/le/oltjuk az új táptalajt.) A kacs nem érhet a cső oldalához. Lelángoljuk a kémcső száját, a dugót visszahelyezzük a tenyészetes csőbe. 6) A beoltandó kémcső dugóját kivesszük, lelángoljuk a kémcső száját (vigyázzunk, az inokulum ne érjen a lángba!). Beoltjuk a táptalaj felületét zegzugos vonal mentén (12.A. ábra) lángoljuk a frissen leoltott cső száját, visszahelyezzük a vattadugót. Leégetjük az oltókacsot (először szárítva, majd izzítva), állványba állítjuk, majd állványba helyezzük a kémcsöveket is. 16

19 11. ábra: Ferde agarra történő oltás egy lehetséges módja Figyelem! Az egész műveletet a gázláng közvetlen közelében végezzük, ügyelve arra, hogy a beoltás folyamata kellő ütemű legyen, ugyanakkor nagy levegőmozgást széles mozdulatokkal, kapkodással ne keltsünk. A tenyészedényeket oltás előtt lássuk el jelöléssel. Átoltunk 4 baktérium, 2 élesztőgomba és 2 fonalasgomba törzset. b) Oltás magas agarba (szúrt tenyészet) Mikroorganizmusok: Serratia marcescens, Bacillus cereus var. mycoides, Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, Rhodotorula rubra 48 órás tenyészetei T-1 illetve T-5 ferde agaron. Anyagok és eszközök: T-1 magas agar (2 db) T-5 magas agar (2 db) A gyakorlat menete: Oltás menete ugyanaz mint előbb, csak tűvel és zegzugos vonalhúzás helyett egyetlen szúró mozdulattal oltunk be 2 baktérium és 2 élesztőgomba törzset (12.B. ábra). A 12. ábra: Ferde- illetve magas agar leoltása B 17

20 c) Oltás kémcsőből folyékony táptalajba Mikroorganizmusok: Serratia marcescens, Escherichia coli, Bacillus megaterium, Micrococcus luteus, Saccharomyces cerevisiae, Syncephalastrum racemosum, Aspergillus niger 48 órás tenyészetei T-1 illetve T-5 ferde agaron Anyagok és eszközök: 15 ml T-1a tápoldat kémcsőben (4 db) A beoltás menete: az a) gyakorlatnál leírtak szerint történik. A kémcsöveket egyenként beoltjuk 2 baktérium, 1 élesztőgomgba és 1 fonalasgomba törzzsel A mikroorganizmusokat szuszpendáljuk a folyadékban. 1. gyakorlat: Eredmények és értékelés 1. Rajzoljuk és írjuk le, hogyan szaporodnak a különböző mikrobák a szúrt tenyészetekben (gázterelés, milyen mélyen nő). 18

21 1. gyakorlat: Eredmények és értékelés 2. Ellenőrizzük az átoltás eredményességét. 3. Figyeljük meg az átoltott mikroorganizmusok színét, telepmorfológiai (fénye-matt felszín) tulajdonságait. Ábrázoljuk megjelenési formájukat. 4. Rögzítsük hogy folyadéktenyészetben milyen a különböző mikrobák tenyészete (egyformán zavarosít, felületen úszik, kiülepszik, milyen a színük)? Mikroba Ferde agar Magas agar Folyékony tenyészet keverés előtt keverés után 19

22 2. gyakorlat: MIKROORGANIZMUSOK SZAPORODÁSA KÜLÖNBÖZŐ TÁPTALAJOKON Jelen gyakorlat a címben megjelölt célkítűzés mellett a kémcsőből Petri-csészére történő oltás technikájának elsajátításának célját is szolgálja. A mikroorganizmusok szaporodás intenzitása függ a törzs jellegétől és a tenyésztési körülményektől. Ugyanazon mikroorganizmus különböző táptalajokon különböző gyorsasággal szaporodhat és eltérő morfológiai sajátságokat mutathat. Ez a jelenség a mikroszervezetek gyors adaptív tulajdonságával magyarázható, nem örökletes, ún. modifikatív sajátság. Mikroorganizmusok: Escherichia coli, Serratia marcescens, Bacillus megaterium, Bacillus cereus var. mycoides, Saccharomyces cerevisiae, Rhodotorula rubra, Trichoderma viridae, Aspergillus niger (vad típusú, prototrof), Aspergillus niger 341 ade - (adenin auxotrof mutáns törzse) és 48 órás tenyészetei T-1, illetve T-5 ferde agaron. Anyagok és eszközök: T-1, T-2, T-3, T-4 és T-5 táptalajt tartalmazó Petri-csésze (1-1 db) félkémcső 2 ml steril fiziológiás sóoldattal (3 db) A gyakorlat menete: Az egyes táptalajokból 3-3 Petri-csészét öntünk ki. A táptalajok megdermedése után a táplemezeket le kell szárítani! Amennyiben steril fülke nem áll rendelkezésre, a csészéket óvatosan nyitjuk, a fedelet kézben lefelé tartva steril vattával páramentesítjük, ezután a 13. ábra szerint az asztallapra helyezzük, majd a táplemezt tartalmazó csésze felet tetőcserépszerűen rátesszük. (E művelet előtt célszerű az asztallapot fertőtlenítőszeres ruhával letörölni.) Steril fülkében a csészék normál helyzetben nyitott fedővel száríthatók. A leoltani kívánt mikrobákból a steril fiziológiás sóoldatban szuszpenziót készítünk (úgy mintha kémcsőből folyadék tápoldatba oltanánk). Fonalasgombák esetében célszerű a konidium szuszpenziót sterilvizes lemosással készíteni. Az agar dermedése, majd a csészék szárítása után a szuszpenziókból oltókaccsal 3-3 mikrobát oltunk le Petri-csészénként egymástól 2-2,5 cm távolságra, egyenes vagy zegzugos vonal mentén. A leoltás menete: leégetett oltókaccsal inokulumot veszünk ki a szuszpenziót tartalmazó félkémcsőből, majd azt állványba helyezzük, ezután a Petri-csésze fedőt felemeljük annyira, hogy az oltóeszköz alá férjen. A Petri-csészéket termosztátba helyezzük, 48 órán át 30 C-on inkubálunk. 13. ábra: Táptalajjal frissen kiöntött Petri-csészék szárítása 20

23 2. gyakorlat: Eredmények és értékelés l. Táblázatban tüntessük fel az egyes fajok szaporodáserősségét a különböző táptalajokon. Mikroorganizmus Táptalajok T-1 T-2 T-3 T-4 T erős, ++ közepes,+ gyenge szaporulat, nem szaporodik 2. Írjuk le a morfológiai jellegzetességeket, eltéréseket a különböző táptalajokon. 21

24 3. gyakorlat: TISZTATENYÉSZETEK KÉSZÍTÉSE Kevert tenyészetek, a természetben található többféle fajból álló úgynevezett nyers tenyészetek, ezek tisztítása, egyes fajok tiszta (ún. egysejt) tenyészetének kinyerése szilárd táptalaj alkalmazásával szélesztés, illetve lemezöntés módszerével történhet. A) Szélesztés Mikroorganizmusok: Escherichia coli, Serratia marcescens, Micrcoccus luteus 48 órás tenyészete T-1 ferde agaron. Anyagok és eszközök: T-1 Petri csésze (2 db) 4 ml steril fiz.só félkémcsőben (1 db) A gyakorlat menete: A táptalaj kiöntése után kevert szuszpenziót készítünk steril fiziológiás sóoldatban a három baktérium fajjal. (Micrococcus luteus-ból nagy oltókacsnyi, Escherichia coli-ból kis oltókacsnyi, Serratia marcescens-ből pedig csak oltótűnyi mennyiséget vigyünk a sóoldatba!) Ezután a szuszpenziót kémcsőkeverővel homogenizáljuk. Petri-csészére egy-egy kacsnyit kiviszünk a felületre és a 14. ábra szerint szélesztjük: (1) zegzugos vonalat húzunk, a kacsot leégetjük (2) innen újabb csíkozást végzünk, ismét leégetünk, majd (3) harmadszor is így szélesztünk. A másik csészét a 15. ábra szerint szélesztjük: (1) csíkot húzunk a csésze közepére, hagyjuk a csíkot beszáradni, majd a száradás után (2) zegzugos vonal mentén szétkenjük a beszáradt szuszpenziót. 14. ábra: 15. ábra: A szélesztés különböző módjai A csíkhúzás során a baktériumok száma egyre fogy, végül különálló telepeket kapunk. 48 órás inkubáció után a szín alapján elkülönítjük a telepeket (természetesen kevert szuszpenzióknál egymás után többször szélesztünk a már különálló telepekből, így győződünk meg arról, hogy hasad-e tovább több fajra az izolált telep). 22

25 3. gyakorlat: Eredmények és értékelés l. Rajzoljuk le, milyen eloszlásban jelennek meg a telepek szélesztésnél. 23

26 B) Lemezöntés Mikroorganizmusok: A szélesztésnél használt kevert szuszpenzió. Anyagok és eszközök: T-1 1% agarral Petri csésze (4 db) (frissen készítendő!) 4,5 ml fiz.só félkémcsőben (7 db) 100 ml főzőpohár automata pipetta (100 ul) bakterológiai pipetta A gyakorlat menete: A kevert szuszpenzióból 0,5 ml-t kivéve steril pipettával a 16. ábra szerint 10x hígítási sorozatot készítünk 7 lépcsőben. Hígítás során az egyre híguló szuszpenzióval mindig "átöblítjük" (felszívjuk, kifolyatjuk) a pipettát, mielőtt a 0,5 ml szuszpenziót a következő csőbe átvisszük. A megolvasztott 1% agartartalmú T-1 táptalajt eril kémcsövekbe adagoljuk 15 ml-ként és 40 C-os vízfürdőben tartjuk a beoltásig. A hígítási sorozat utolsó öt hígítási lépcsőjéből (IV.-V.-VI.-VII.) steril pipettaheggyel egy-egy steril folyékony1% T-1 táptalajt tartalmazó kémcsőbe 0,1ml-nyi szuszpenziót viszünk át. (A leghígabb szuszpenzióval kezdjük, így egy pipettaheggyel dolgozhatunk végig.) Kémcsőkeverővel homogenizálunk, majd steril Petri-csészékbe öntjük a kémcsövek tartalmát. (lemezöntés) és hagyjuk megszilárdulni. Az agarba dermedt sejtek egymástól elválva képeznek telepeket. 16. ábra: 10x-es léptékű hígítási sorozat készítése Megjegyzés: Mindkét módszer kvantitatívvá tehető és így sejtszámolásra alkalmas. Dermedés után 48 órán keresztül 30 C-on inkubálunk. 24

27 3. gyakorlat: Eredmények és értékelés 1. Írjuk le, melyik hígításban különülnek el egymástól a baktérium telepek lemezöntésnél. 2. Rajzoljunk le olyan lemezeket, ahol a telepek jól számolhatók. 25

28 4. gyakorlat: MIKROORGANIZMUSOK MORFOLÓGIAI VIZSGÁLATA RÖGZÍTETT FESTETT PREPARÁTUMOKKAL, EGYSZERŰ FESTÉSEK Festéssel jobban megfigyelhetővé tudjuk tenni a mikroorganizmusokat, nagyobb sejteken belül sejtalkotókat ismerhetünk fel és egyéb, a sejtek beltartalmára vonatkozó adatokat nyerhetünk. Az 1-2 µ m nagyságú baktérium sejtek esetében a festés magát a sejtalak, a mikroszkópos kép felismerését teszi lehetővé, hisz méretük kicsinysége miatt önmaguk csekély interferencia jelenséget idéznek elő. A festett preparátumon áthaladó nem monochromatikus fénynyaláb a festékre jellemző hullámhossz tartományban elnyelést szenved, így a kép vizuális érzékelhetősége növekszik. Rögzített preparátumok készítésével kapcsolatos általános tudnivalók A tárgylemezeket detergenssel zsírtalanítjuk, desztillált vízzel alaposan leöblítjük és törlés nélkül szárítjuk. Kaccsal vagy tűvel kis csepp vízbe szuszpendáljuk a vizsgálandó mikroba kis sejttömegét, a cseppet szétkenjük és hagyjuk beszáradni. A szárítás melegítéssel való siettetése zsugorodást eredményez! A baktériumokat (1-2 µm) a tárgylemezre felvitt szuszpenzió teljes beszáradása után hővel rögzítjük úgy, hogy a beszáradt kenetet 4 5-ször áthúzzuk gázláng felett. A gombák rögzítésére etanol : éter = 1 : 1 keverékét használjuk, mert hő hatására - a gombasejt (4-5 µm) nagyobb mérete miatt - alakja megválozhat. Az etanol-éter keveréket rácsepegtetjük a beszáradt kenetre, majd hagyjuk bepárlódni. A rögzítést minden festés előtt végezzük el! Festés után a preparátumot először 40x-es nagyítású objektívvel ellenőrizzük, majd immerziós olaj (vagy anizol) alkalmazásával l00x-os nagyítású immerziós lencsével vizsgáljuk. A mikroszkóppal kapcsolatos tudnivalókat lásd a mikroszkóp leírásánál! A) Festés metilénkékkel Mikroorganizmusok: Micrococcus luteus, Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis 24 órás tenyészete T-1, Saccharomyces cerevisiae, Geotrichum candidum 24 órás tenyészete T-5 ferde agaron. Anyagok és eszközök: Metilénkék festékoldat (R-1), tárgylemezek, fedőlemezek, festőkád, mikroszkóp. A gyakorlat menete: A megfelelő rögzítés után 5 percig festjük a preparátumot, utána csapvízzel mossuk, amíg a mosófolyadék színtelenül folyik le. A preparátum szárítása siettethető szűrőpapírral való leitatással. 26

29 B) Festés karbolos fukszinnal Mikroorganizmusok: Staphylococcus aureus, Bacillus megaterium, Candida utilis 24 órás tenyészetei T-1 illetve T-5 ferde agaron. Anyagok és eszközök: Karbolos fukszin (R-2), tárgylemezek, fedőlemezek, festőkád, mikroszkóp. A gyakorlat menete: A rögzített kenetet 30 mp-ig festjük, majd csapvízzel mossuk, szárítjuk. Megjegyzés: Immerziós olaj alkalmazása után az objektívlencsét benzolos vagy xilolos vattával tisztítsuk meg. Alkoholt e célra ne használjunk, mert a lencsék ragasztottak és az alkohol a ragasztóanyagot kioldja! 4. gyakorlat: Eredmények és értékelés 1. Rajzoljuk le a mikroszkópos képeket, ábrázoljunk egy-egy látómezőt a mikrobákkal, vigyázva a méretarányok megtartására. 27

30 5. gyakorlat: MIKROORGANIZMUSOK MORFOLÓGIAI VIZSGÁLATA RÖGZÍTETT FESTETT PREPARÁTUMOKKAL, ÖSSZETETT FESTÉSEK Az összetett festések esetén több egyszerű festékkel egymás után festünk, vagy festékkomplexeket viszünk a kenetre. E technikával azt kívánjuk elérni, hogy különböző sejttípusokat, csoportokat elkülönítsünk, illetve sejten belül tudjunk elkülöníteni egyes elemeket. A) Gram-festés (Hucker szerint) Ha kristályibolyával festett baktériumokra jódoldatot öntünk, a sejtekben sötétlila színű jódfesték komplex képződik. Ez a komplex a Gram-negatív baktériumokból etanollal könnyen kimosható, a Gram-pozitívakból nem. Az elszíntelenített Gram-negatív baktériumokat szafraninnal pirosra festjük, hogy jól felismerhetők legyenek. Az eltérő festődés alapja az, hogy a Gram-pozitív és Gram-negatív baktériumok között lényeges strukturális és kémiai különbségek vannak, elsősorban a sejtfalban. Mikroorganizmusok: Micrococcus luteus, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus var. mycoides, Escherichia coli, Serratia marcescens 24 órás tenyészete T-1 ferde agaron. Anyagok és eszközök: R-3, R-4, R-5 festékoldatok, etanol, tárgylemezek, festőkád, mikroszkóp, immerziós olaj. A gyakorlat menete: Kenetet készítünk az egyes baktériumokból külön-külön, majd egy Gram-pozitív és egy Gram-negatív baktérium keverékéből. Száradás után hővel rögzítünk. 1 percig festünk kristályibolyával (R-3), ezt pár másodperces csapvizes mosás követi. 1 percig Lugol-oldattal kezelünk (R-4), ezután csapvizes öblítés, majd szárítás következik. A tárgylemezt csipesszel megfogva festőkád felett pipettából etanolt csepegtetve a kenetre 30 másodpercig mossuk. Szárítjuk a preparátumot. Szafraninnal (R-5) kontrasztfestést alkalmazunk másodpercig, majd csapvizes öblítés és szárítás következik. Megjegyzés: Feltétlenül fiatal, 24 órásnál nem idősebb tenyészetekkel dolgozzunk, idős sejteknél a különbségek elmosódnak! 28

31 5. gyakorlat: Eredmények és értékelés 1. Rajzoljuk le a mikroszkópos képeket a festődésnek megfelelő színnel vigyázva a méretarányok megtartására. 29

32 B) Spórafestés A baktériumok és gombák spórái egyszerű festéssel nem festődnek, mert a többrétegű spórafalba a festék nehezen épül be, ezért a festék bevitelére ún. agresszív festést alkalmazunk (fenol és melegítés). Az így megfestett spóra etanolos mosáskor nem színtelenedik el, míg a vegetatív sejtből a festék kimosódik. A vegetatív sejtek láthatóvá tételére ún. kontrasztfestést alkalmazhatunk. Az alábbi spórafestési eljárások baktériumok és gombák esetében egyaránt alkalmazhatók. Spórafestés előtt a hővel való rögzítés szükségtelen. a) Módosított Dorner-féle módszer: Mikroorganizmus: Bacillus megaterium 48 órás tenyészete T-1 ferde agaron. Anyagok és eszközök: Karbolos fukszin (R-2) festékoldat, etanol, tárgylemez, fedőlemezek, szűrőpapír, üvegkád, mikroszkóp, immerziós olaj. A gyakorlat menete: A tenyészetből kenetet készítünk, rögzítés nélkül szárítjuk. Szűrőpapírt helyezünk a kenetre, erre karbolos fukszint csepegtetünk percig forró vízfürdő fölé helyezzük a preparátumot. A festéket folyamatosan pótoljuk. A szűrőpapírt eltávolítjuk, a preparátumot etanollal mossuk a lecsepegő folyadék elszíntelenedéséig, majd csapvízzel öblítjük, leitatással szárítjuk. A spórák vörösek, a vegetatív sejtek fehérek. b) Schaeffer-Fulton módszer: Mikroorganizmus: Saccharomyces kluyveri CBS 3082 törzse egy hetes tenyészete T-5 ferde agaron. Anyagok és eszközök: Malachit-zöld (R-6) és szafranin (R-5) festékoldat, tárgylemezek, fedőlemezek, festőkád, mikroszkóp. A gyakorlat menete: A Saccharomyces kluyveri tenyészetből tárgylemezen szuszpenziót készítünk, szárítjuk rögzítés nélkül. Szűrőpapírt helyezünk a kenetre rácsepegtetünk malachit-zöld oldatot (R-6) és 10 percig forró vízfürdő felett melegítjük. Közben az elpárolgott folyadékot a festékoldat állandó adagolásával pótoljuk. Ezután 30 mp-ig folyóvízben mossuk a preparátumot, majd 30 mp-ig kontrasztfestést alkalmazunk szafraninnal (R-5). Végül csapvizes öblítés, majd szárítás következik. A spórák zöldek, a vegetatív alakok pirosra festődnek. 30

33 5. gyakorlat: Eredmények és értékelés 2. Rajzoljuk le fiatal és idős tenyészet mikroszkópos képét a festődésnek megfelelő színnel. 3. Rajzoljuk le a mikroszkópos képet méretarányosan és a festődésnek megfelelő színnel. 31

34 6. gyakorlat: MIKROORGANIZMUSOK NAGYSÁGÁNAK MÉRÉSE Különböző vizsgálatoknál gyakran szükséges a szervezetek méreteinek megállapítása. A méreteket az okulár- és az objektívmikrométer segítségével határozzuk meg. Az okulármikrométer az okulárba helyezhető kerek üveglemez, általában beosztású skálával. Ez az okulárral forgatható, a tárgy pedig a tárgyasztallal mozgatható, így a skálát rá tudjuk állítani a látómezőben található bármely objektumra. Leolvashatjuk, hogy a vizsgált mikroba méretei hány okulár beosztásnak felelnek meg. Az okulármikrométer kalibrálása az objektívmikrométerrel történik. Az objektívmikrométer egy speciális tárgylemez, amelynek közepén 1 mm-nyi távolság 100 egységre van osztva. Az objektívmikrométer osztásközeinek mérete 10 µm. Mikroorganizmusok: Schizosaccharomyces pombe, Geotrichum candidum 24 órás 25 C-on rázatott tenyészete T-5a tápoldatban. (A Geotrichum inokulum készítéshez maximum 48 órás ferde agaros tenyészet használható). Anyagok és eszközök: R-2 festékoldat, okulár- és objektívmikrométer, tárgylemezek, fedőlemezek, mikroszkóp. A gyakorlat menete: Az objektívmikrométert tárgyként használjuk, élesre állítjuk a skáláját. Az okulár skálát párhuzamos állásba állítjuk, a kezdő pontokat fedésbe hozzuk (17. ábra). 17. ábra: 1. okulármikrométer skála, 2. objektívmikrométer skála 1) Olvassuk le, hogy a 16x-os és a 40x-es nagyítású lencse alkalmazásakor hány objektívmikrométer beosztásnak felel meg az okulár beosztása! 32

35 2) Számítsuk ki a 16x-os és a 40x-es nagyítású objektíveknél az okulár mikrométer egy osztásközének értékét µm-ben! A leolvasott objektívmikrométer osztások számát osztjuk az okulárosztások számával (jelen esetben ez 100) és szorozzuk 10-zel (az objektívmikrométer egy osztásközének nagysága µm-ben). Okulármikrométer köz = leolvasott objktívmikrométer osztások száma X 10 okulárosztások száma (100) 3) A gombatenyészetekből készítsünk kenetet karbolos fukszinnal (R-2) 30 mp-ig festünk, (lásd 4. gyakorlat B rész). 4) Mérjük le vegetatív sejt, illetve arthrospóra hosszát, szélességét és adjuk meg az átlagértéket µm-ben! 6. gyakorlat: Eredmények és értékelés l. Számítsuk ki a l6x-os és a 40x-es nagyítású objektívek esetében az okulármikrométer egy osztásközének értékét µm-ben. 2. Mérjük meg tíz Schizosaccharomyces pombe sejt és tíz Geotrichum candidum vegetatív sejt és arthrospóra hosszát és szélességét. 3. Számoljuk ki az átlagméreteket. 33

36 7. gyakorlat: BAKTÉRIUMOK ÉS ÉLESZTŐK SEJTSZÁMMEGHATÁROZÁS MÓDSZEREI A legtöbb baktérium és az élesztőgombák esetében a sejtek szaporodása során az utódsejtek elválnak egymástól. Ezeknél az élőlényeknél a sejtek szaporodása jól nyomonkövethető mind közvetlen, mind közvetett módszerekkel. A közvetlen sejtszámmeghatározás módszerei közül a mikroszkópos számolást, és a turbidimetriát alkalmazzuk leggyakrabban, de pl. a nedvessúlymeghatározás is ilyen módszer. I. Közvetlen sejtszámolási módszerek: 1. Bürker-kamrás sejtszámolás: Nagyobb méretű sejteknél közvetlen sejtszámolás valósítható meg Bürker-kamrával. Ez a módszer az összsejtszám megállapítására ad lehetőséget. Gyakran alkalmazott, gyors és egyszerű sejtszámlálási módszer. 2. Turbidimetria: A meghatározás folyadéktenyészetek "zavarosságának" mérésén alapszik. A turbidimetriás mérésnél a műszeren mért "sűrűség"-értékeket kalibrálnunk kell. Ez közvetlen sejtszámolással vagy közvetve, élőcsíraszám megállapítással történik. Gyakorlatunkon a közvetlen sejtszámolás módszerét alkalmazzuk. Kalibrációs görbét veszünk fel, ahol egy-egy turbiditás értéknek meghatározott sejtszám felel meg. A vizsgálandó szuszpenzióból egyrészt felező hígítást készítünk és műszeresen megmérjük az egyes fokozatok zavarosságát, optikai denzitását (OD), másrészt Bürkerkamrás számolással meghatározzuk az eredeti sejtszámot. Az összsejtszámméréssel történő kalibrálás különböző tenyészeteknél alkalmazható, az élőcsíraszám meghatározással történő kalibrálás csak a logaritmikus szaporodási fázisban (ahol az összsejtszám és az élőcsíraszám gyakorlatilag azonos) ad pontos eredményt. A kalibrálást minden mikroorganizmus törzzsel külön kell elvégezni a mikroorganizmusok eltérő nagysága miatt, s a kalibrációs görbe mindig csak egy meghatározott korú tenyészetre vonatkoztatható. Megjegyzés: Mivel a mérés fotométerrel történik, az eredményeket befolyásolhatja a táptalaj színe vagy színes mikrobáknál a mikroorganizmus pigmentáltsága. Sárga színű tápoldatok esetén célszerű a zöld tartomány ( nm) helyett vörösben ( nm) elvégezni a méréseket. Ha spektrofotométerrel dolgozunk, az intervallumokon belül ott mérjünk, ahol maximális az elnyelés. II. Közvetett sejtszámolási módszerek: A közvetett sejtszámolási eljárások esetében nem a tényleges sejtszámot kapjuk meg, hanem az "élőcsíraszámot", azaz a vizsgált tenyészetek azon sejtjeinek (egységeinek) számát, amelyek különálló telepeket képesek létrehozni. Bürker-kamrás méréssel összehasonlítva különösen idősebb tenyészetek esetében jelentős sejtszámkülönbséget kaphatunk a közvetlen számolás és a tenyésztési 34

37 7. gyakorlat: Eredmények és értékelés 1. Bürker-kamrás sejtszámolás: Számoljuk ki a Bürker-kamrás mérés alapján az eredeti szuszpenziók sejtszámát. Tíz Bürker-kamra egység átlagsejtszámából kiszámoljuk 1 mm 3 szuszpenzió sejtszámát (egy kamraegységre jutó átlagértéket szorozzuk a kamratérfogat nevezőjével), majd kiszámítjuk a ml-kénti sejtszámot. Sejtszám Eredeti 10x 10 2 x 10 3 x 10 4 x 10 5 x 10 6 x 10 7 x Lemezöntés (1 ml) Szélesztés (50µl) 35

38 próba eredménye között. A jelenség magyarázatát a 18. ábra adja meg. A két mérés között a legkisebb eltérés a logaritmikus fázisban (3) van. 1. lappangási fázis 2. gyorsuló fázis 3. logaritmikus fázis 4. lassulási fázis 5. megállapodási fázis 6. hanyatlási fázis 18. ábra: Élő- és összsejtszám változása a tenyészetben 3. Lemezöntés: A mikróbákat a táptalajban elszuszpendáljuk, és megfelelő hőmérsékleten tenyésztjük. A mikróbák egymástól jól elváló tepeleket képeznek. Fontos, hogy a mikróbákat megfelelően oszlassuk el a táptalajban, mivel egy sejt, illetve egy sejtaggregátum is egyetlen telepet fog képezni. 4. Szélesztés: A felületre felvitt sejtszuszpenziót egyenletesen eloszlatjuk, "szélesztünk", majd beszárítjuk a lemez felületét, így a mikroorganizmusok különálló sejtjei a táptalaj egy adott pontjához rögzülnek. Ez az előfeltétele annak, hogy a belőlük kifejlődő telepek száma alapján a felvitt élőcsírák számát megadhassuk. Más módszerek is ismertek a mikróbaszuszpenziók élősejtszámának mérésére. Ilyenek pl. a mikróbatenyészet metabolikus aktivitását (széndioxid kibocsátás, oxigénfelhasználás), enzimaktivitását mérő procedúrák. Mikroorganizmusok: Saccharomyces cerevisiae 5 napos rázatott tenyészete T-5a tápoldatban. Anyagok és eszközök: 1. Bürker-kamrás sejtszámolás: Bürker-kamra, mikroszkóp 2. Turbidimetria: 5 ml T-5a tápoldat kémcsőben (6db) biopipetta (5 ml, 1 ml), Spektromom-401 fotométer, Bürker-kamra, mikroszkóp. 36

39 7. gyakorlat: Eredmények és értékelés 2. Turbidimetria: Táblázatban tüntessük fel a turbidimetriás mérés két különböző hullámhosszon mért elnyelési (OD) értékeit. Számoljuk ki a Bürker-kamrás mérés alapján az eredeti szuszpenziók sejtszámát. Sejtkoncentráció X X/2 X/4 X/8 X/16 X/32 X/64 Sejtszám (db/ml) OD (extinkció) 520 nm 620 nm Ábrázoljuk grafikonokon az egyes turbiditásokhoz tartozó sejtszám értékeket. Normál skálájú grafikonokon rajzoljuk meg a kalibrációs egyenest (a koordinátarendszer helyére ragasszuk a milliméter papírt, a tengelyeket lássuk el a megadott vázlat jelzéseivel). 37