2.4. Az enantiomer összetétel meghatározás módszerei 1

Átírás

1 2.4. z enantiomer összetétel meghatározás módszerei 1 Enantiomer keverékek összetételének jellemzésére leggyakrabban alkalmazott mód a feleslegben lévő enantiomer százalékos összetételének megadása. (100*X R, ahol X R a fő enentiomer móltörtje.) Egy másik nagyon sokszor alkalmazott módszer az un. enantiomer felesleg (ee) megadása, ami nem más, mint a két enatiomer százalékos összetételének a különbsége. ee = 100 * (X R X ) / (X R + X ), ahol X R > X, az egyes enantiomerek móltörtjei. ee = 100 * (2X R 1) Gyakran használják az enantiomer tisztaság (ep) fogalmát is. ajnos az irodalomban nem egységes a fogalom használata, számos alkalommal a fő enantiomer százalékos összetételét értik alatta, máskor pedig az enentiomer felesleg szinonimájaként használják. z enantiomer tisztaságot szokták az un. optikai tisztasággal (op) is megadni. op = ([α] / [α] max )*100, ahol [α] az enantiomer keverék mért forgatása, [α] max pedig a tiszta fő enantiomer optikai forgatása. z enantiomer elegyek összetételének meghatározására számos analitikai módszer létezik. módszerek többségében közvetlenül magát az enantiomer elegyet vizsgáljuk, azonban bizonyos esetekben szükség lehet segédanyagok (akirális vagy királis származékképzők) alkalmazására. z alkalmazott módszereket a táblázatban foglaltuk össze Táblázat: Enantiomer összetétel meghatározás módszerei Módszer elve konkrét mérés minta kezelése mért anyag 1. Kiroptikai módszerek : α, Φ, Δε 2. Diasztereotopicitás (külső összehasonlítás) B: emissziós cirkuláris polarizáció : diasztereomerek NMR vizsgálata akirális oldószerben (vagy szilárd fázisban) B: NMR királis oldószerben (királis szolvatálószer) sz eredeti keverék D sz eredeti keverék E vagy sz E D E 1 fejezet alapját Ernest L. Eliel és amuel. Wilen: tereochemistry of rganic Compound (Wiley 1994) művének ide vonatkozó része (6.5. fejezet) képezte.

2 3. Diasztereomer kapcsolat (elválasztás) 4. Kinetikus módszerek (enantiomer szelektivitáson alapuló megkülönböztetés) kinetikus rezolválás C: NMR királis shiftreagens jelenlétében : Kromatográfia diasztereoszelektív állófázison i) GC, PLC, VRK ii) PLC (királis oldószerben) B: Kromatográfia enantioszelektív állófázison GC, PLC, VRK elektroforézis : Enzimatikus módszerek (kvantitatív enzimkatalizált reakciók) B: Kémiai módszerek eredeti keverék D sz eredeti keverék eredeti keverék eredeti keverék eredeti keverék vagy D sz 5. Fúziós sajátságok DC eredeti keverék E vagy D sz D 6. Izotóphígítás Izotóp analízis sz E 7. Potenciometria Elektrokémiai cella eredeti keverék E Jelmagyarázat: sz akirális származékképzővel kezelt minta (enantiomer elegy) D sz diasztereomer származékképzővel kezelt minta (diasztereomer elegy) E eredeti enantiomer keverék D származtatott diasztereomer keverék E D E E E E D legalkalmasabb módszer kiválasztását számos tényező befolyásolhatja, és nem feltétlen a legkényelmesebb módszer a legmegfelelőbb. mérések során nagyon óvatosan kell eljárni, hiszen számos esetben módosulhat a minta összetétele, ami hamis mérési eredményeket eredményezhet. okszor a kémiai tisztítás (a reakcióelegy feldolgozása, mosása, átkristályosítás, szublimáció, stb.) során is megváltozik az enantiomer összetétel Kiroptikai módszerek Ezek a módszerek egyszerűek, gyorsak, roncsolásmentesek, alapvetően az optikai forgatás mérésén alapulnak, viszont nagyon érzékenyek, ebből következően nem mindig száz százalékosan megbízhatóak.

3 z optikai tisztaság meghatározásához szükség van a tiszta enantiomerre ([α] max ). z optikai forgatás függ a hullámhossztól, a hőmérséklettől, a koncentrációtól, és az esetleges szennyezőktől. zámos példa van arra, hogy korábbi évekből származó eredmények később pontatlannak bizonyultak, főképpen azért, mert a számításhoz használt [α] max érték pontatlan volt, vagy, mert a minta oldószer nyomokat, vagy egyéb szennyezőket tartalmazott. Álljon itt egy példa erre: L-leucin redukciója L-leucinollá más-más forgatási értéket eredményezett, ha borán-dimetilszulfid komplexszel végezték ([α] 20 D = +4,89 (neat)), mint amikor NaB 4 -del, vagy a megfelelő észter redukciójakor Lil 4 -del ([α] 20 D = +1,22-1,23 (neat)). Először azt gondolták, hogy az eltérés oka az utóbbi esetekben bekövetkező racemizáció, de utólag kiderült, hogy mindhárom esetben optikailag teljesen tiszta termék keletkezett, és a forgatásbeli eltérés oka egy kismennyiségű, de nagyon nagy optikai aktivitású szennyezés volt, amitől a hidroklorid só átkristályosításával meg lehetett szabadulni. koncentráció hatását mutatja az optikailag aktív 2-fenilpropanal enantiomer keverékének (op 68%) mért forgatásai: [α] 21 D = +214,7 (c 1,5, benzol) és [α] 21 D = + 182,2 (c 46,4, benzol). jelenség különösen erős, ha poláris molekulákat (pl.: alkoholokat, karbonsavakat) apoláros oldószerben mérnek. Többfunkciós molekulák pl. diolok vagy hidroxisavak szintén hajlamosak a koncentrációs effektusra, amikor tömény oldatban az intramolekuláris kapcsolatok a kevés oldószer molekula jelenléte miatt intermolekulárissá válnak. fenti adatok is mutatják, hogy a mért optikai tisztaság (op) számértéke nem mindig azonos az enantiomer felesleg (ee) számértékével. z enantiomertisztaság és az optikai tisztaság különbözőségét először oreau tapasztalta 1969-ben. tiszta 2-etil-2-metilborostyánkősav ([α] 22 D = +4,4 (c 15, CCl 3 ) forgatási értéke alapján a 75:25 arányú enantiomerkeverékre (ee = 50%) oreau +2,2 forgatási értéket kalkulált, miközben a mért érték [α] 22 D = +1,6 (c 15, CCl 3 ) lett, ami kb. 36%-os optikai tisztaságnak (op) felel meg. jelenséget főképpen gyengén poláris, vagy apoláris oldószerekben (C 2 Cl 2, CCl 3 vagy benzol) tapasztalta, viszont erősen poláris oldószerekben (etanol, piridin, diglim, acetonitril) a különbség eltűnt. Ezt követően a fenti jelenségre számos példát mutattak ki. z optikai forgatás és az enantiomer tisztaság közötti linearitás hiánya a szakirodalomban oreau-effektus néven vált ismerté. z eltérés mértéke számos paraméter függvénye, mint az optikai forgatás méréséhez használt fény hullámhossza, vagy a minta koncentrációja. jelenség különösen jelentős a közepes enantiomer felesleg esetén, és szinte eltűnik a 100% ee, illetve a 0% ee tájékán.

4 fentiekből következik, hogy a pontos enantiomer összetétel meghatározáshoz kalibrációt kell végezni. ok esetben a vizsgálandó minta optikai forgatása nagyon kicsi érték, ami a számításokban komoly hibát okozhat. Ennek csökkentésére szoktak alkalmazni jó kromofór tulajdonságú akirális származékképzőket. Például királis alkoholok ([α] D ~ 0,7) acetilezésével is növelhető az érzékenység ([α] D ~ -12), de a 3,5-dinitrobenzoil-észterükett képezve az érzékenység még egy nagyságrenddel növekszik ([α] D ~ 150) Diasztereotopicitáson alapuló NMR módszerek Diasztereomer származékképzésen alapuló módszerek Enantiomer elegyek összetételének meghatározására alkalmazott első NMR módszerek kovalens diasztereomer elegyek összetételének analízisén alapultak. legelső vizsgálatok során királis alkoholokat és aminokat királis savklorid segítségével a megfelelő észterekké, illetve amidokká alakították, majd az így kapott diasztereomer elegyeket analizálták. folyamat során királis származékképzőt alkalmaztak. diasztereomerek akirális környezetben is különböznek egymástól, így szerencsés esetben lesz olyan atom, vagy atomcsoport, melynek a jelei jól elkülöníthetően jelennek meg az NMR spektrumban. Ily módon az egyes komponensek mennyiségi viszonyai megállapíthatók lesznek. mennyiben a származékképzés kvantitatív játszódott le, akkor a kapott összetétel megegyezik az eredeti enantiomer elegy összetételével. () (R) + Cl (R) C 3 100% konverzió (R) C 3 () (R) C 3 (R) ábra: Példa királis származékképző alkalmazására ( metoxi-jel jól elkülönül az NMR spektrumban)

5 fenti módszer előnye, hogy nagymértékű szelektivitás jellemzi (biztosan található megfelelő származékképző) illetve nem szükséges hozzá tiszta enantiomer. átránya viszont, hogy 100 %-ban enantiomertiszta származékképző szükséges a vizsgálathoz, és feltétlen szükséges, hogy a kémiai reakció 100 %-os konverzióval játszódjon le. (Nem lehetünk biztosak benne, hogy mindkét enantiomer ugyanolyan sebességgel reagál a származékképzővel, ezért fontos, hogy ne maradjon kiindulási anyag.) További hátrány, hogy a termékem utólag már nem tisztítható, a vizsgálat nem roncsolásmentes. (Illetve, ha mégis tisztításra lenne szükség a vizsgálat előtt, akkor előre meg kell határozni, kalibrálni kell, a tisztítási folyamat során esetlegesen bekövetkező diasztereomer összetétel változást.) Minden egyes anyagra meg kell találni a megfelelő származékképzőt, ami ezáltal nagyon megdrágítja a vizsgálatot. módszer kifejlesztéséhez ismert összetételű enantiomer elegy szükséges ábrán néhány gyakran alkalmazott királis származékképzőt tüntettünk fel. C 3 C 2 C F 3 C C 3 (R)-(-)--metilmandulasav mentoxiecetsav (R)-(+)-2-metoxi-2- trifluormetilfenilecetsav MTP Mosher-sav F F 3 C C 3 F F F Cl P P (R)-2-metoxi-2-metil-2- (pentafluorfenil)ecetsav MMP ()-(+)-binaftil-2,2'-diil hidrogén-foszfát ábra: Példák királis származékképzőkre α-zubsztituált királis aldehid elegyek meghatározására alkalmazott módszer királis aminokkal in situ képzett diasztereomer chiff-bázis elegyek analízise. kapott eredmények jó egyezést mutatnak más hagyományosabb (és lassabb) módszerekkel mért adatokkal. diasztereotopicitás (külső összehasonlítás) érdekes esete, mikor a származékképző kétfogú akirális reagens. Ebben az esetben három termék képződik: a két optikailag aktív királis izomer (R,R és,) és a mezo (R,) vegyület ( ábra). két királis izomer

6 egymásnak enantiomerje, ezért egy jelet ad az NMR spektrumban, míg a mezo vegyület megfelelő jele ettől eltérő helyen jelentkezik. mért termékek (két jel) aránya megegyezik az eredeti enantiomer keverék arányával. (Ez abban az esetben igaz, ha feltételezzük, hogy a disztereomerek képződési sebessége megegyezik. Ez egyben a módszer alkalmazhatóságának korlátja is.) Példaként lásd a táblázatot: (R) X X () > < (R) X X () (R) X X (R) > < > < () X X (R) () X X () > < > < mezo vegyület (egy termék) enantiomerek (királis izomer) ábra: Kétfogú akirális származékképző alkalmazása Táblázat: Elegyösszetétel kétfogú akirális származékképző alkalmazása esetén Kiindulás elegy összetétele Keletkező treo izomerek Keletkező mezo izomer racém elegy (100 mol) (50% R - 50% ) 12,5 mol R,R és 12,5 mol, összesen: 50% királis 25 mol R, (,R) összesen: 50% mezo enantiomertiszta elegy (100 mol) (100% R) 50 mol R,R és 0 mol, összesen: 100% királis 0 mol R, (,R) összesen: 0% mezo vegyes keverék (100 mol) (75% R 25% ) 31,25 mol R,R és 6,25 mol, összesen: 75% királis 12,5 mol % R, (,R) összesen: 25% mezo Konkrét példaként álljon itt a racém 1-feniletanol és PCl 3 reakciójában képződő didenilfoszfonátok esete ( ábra). kapott elegy 31 P-NMR spektrumában három jel látható 1:1:2 arányban. ( foszforatom tetraéderes geometriája miatt pszeudoaszimmetria centrum, ezért a két mezo izomer különböző jelet ad.)

7 RT Cl 3 R + PCl 3 P(R) 3 P (R) 2 + RCl () piridin + PCl 3 (R) Ph (R) P + () Ph mezo P Ph (R) + () Ph mezo Ph (R) P + Ph (R) Ph Ph P () () enantiomerek (azonos 31 P-NMR jel) ábra: z 1-feniletanol és a PCl 3 reakciója Nem csak kovalens vegyületek esetén lehetséges NMR spektroszkópiával a diasztereomerek megkülönböztetése, hanem ionos sók esetében is van rá példa. a racém savakat és bázisokat összekeverünk diasztereomer sókeveréket nyerünk, melyben mindkét enantiomer sav, mindkét enantiomer bázissal párt képez. z ionpárok cseréje gyorsabban játszódik le, minthogy azt NMR méréssel érzékelni lehetne, ezért a jelek átlagolódnak, és az elegy úgy viselkedik, mintha egységes anyag volna. zonban, ha az egyik ellenion csak egy enantiomerből áll, akkor nem beszélhetünk kicserélődésről, és ily módon a kapott diasztereomer sópárok jelei elkülönülten jelennek meg az NMR spektrumban. jelenség elsősorban aprotikus oldószerekben (CDCl 3, C 6 D 6, DM-d 6, esetleg pridin-d 5 ) észlelhető, ahol az ionpárok aggregátumként vannak jelen. Protikus oldószerek (pl. CD 3 D) szétrombolhatják az aggregátumokat nagymértékben csökkentve ezzel a hatást Királis oldószer (szolvatálószer) használatán alapuló módszerek z 1960-as évek közepén közvetlenül is demonstrálták az enantiomerek megkülönböztetésének lehetőségét NMR spektroszkópiával, amikor elkészítették a racém 2,2,2-trifluor-1-feniletanol (TFPE) 19 F-NMR spektrumát (-)-α-metilbenzilamin (PE) oldószerben. trifluormetil csoport jele nem azonos kémiai eltolódásnál jelentkezett a két enantiomerben. ( különbség mértéke 2 z volt 56 Mz-en.) Ezt követően számos esetben bizonyították, hogy enantiomerek eltérő NMR spektrumot produkálnak, ha királis oldószerben veszik fel azokat. Később az is kiderült, hogy nincs szükség teljes egészében királis oldószerre, elégséges az is, ha csak kisebb mennyiségben van jelen királis segédanyag

8 valamilyen akirális oldószerben. ( királis segédanyag mennyiségének minimum a vizsgált mintáéval azonos mértékűnek kell lennie.) Ez utóbbi esetben a segédanyagot királis szolvatálószernek nevezzük. jelenség nem különbözik lényegesen az előző fejezetben tárgyalt diasztereomer elegyképzéstől. vizsgált molekula két enantiomerje és a királis oldószermolekulák által alkotott molekulakomplex diasztereomer viszonyban van egymáshoz képest, következésképpen a halmaz adott részei által érzékelt kémiai környezet eltérő lehet. z eltérő környezet létrehozásához sokszor elég, ha az akirális szolvátburokban megjelennek valamely királis segédanyag molekulái ( ábra). + : királis oldószer : királis oldószer : akirális oldószer ábra: Királis oldószer (szolvatálószer) használata ábrán néhány gyakran alkalmazott királis oldószer (szolvatálószer) látható. CF 3 CF 3 CF 3 ()-(+)-TFPE ()-(+)-TFNE ()-(+)-TFE C 3 (R)-(+)-PE N 2 C 3 (R)-(+)-NE N 2 ()-(-)-binaftol ábra: Királis oldószerek (szolvatálószerek)

9 királis oldószerrel végzett vizsgálatok nagy előnye, hogy gyors eredményt szolgáltat, roncsolásmentes (elvileg visszanyerhető a minta, bár a gyakorlatban nem gyakran csinálnak ilyet). vizsgálathoz nincs szükség 100%-os konverzióra és itt sem kell enantiomertiszta autentikus minta. átránya azonban, hogy 100%-os enantiomer tisztaságú oldószerre (szolvatálószerre) van szükség, ami nagyon megdrágítja a vizsgálatokat Királis shift reagens használatán alapuló módszerek lantanida fémek β-diketonokkal alkotott komplexeinek érdekes és hasznos tulajdonságai vannak az NMR spektroszkópiában. lantanida fém Lewis sav típusú komplexálódása a molekula bázikus részén egy alapvető kémiai eltolódási effektust eredményez, ami a lantanida atom körül kialakuló pozitív (shielding) és negatív (deshielding) árnyékolási kúpokkal értelmezhető. leggyakrabban alkalmazott lantanida fémek a lantán (La), az európium (Eu), a prazeodímium (Pr) és az itterbium (Yb). Királis komplexképző alkalmazása esetén enantiomer elegyek vizsgálatához is fel tudjuk használni őket, tekintve, hogy a vizsgált mintával keletkező komplexek diasztereomer viszonyban lesznek. módszer előnye, hogy a nagy jelkülönbség miatt, jól alkalmazható, itt sincs konverziókövetelmény. minta ugyan nem visszanyerhető, de ez nem olyan nagy probléma, viszont a reagensek eléggé drágák, és itt is fontos szempont, hogy a királis komplexképző 100%-ban enantiomertiszta legyen. CF 3 Ln ábra: Királis shift reagenssel képzett komplex (Ln: La, Eu, Pr, Yb) R R * Diasztereomer kapcsolaton alapuló kromatográfiás és rokon elválasztási módszerek kromatográfiás módszerek a leghatékonyabbak enantiomer elegyek összetételének meghatározására. korai években még itt is szükséges volt az enantiomer elegyek diasztereomer eleggyé történő átalakítására, valamely királis származékképző alkalmazásával.

10 Ilyenkor magát az elválasztást akirális állófázison hajtották végre. Korábban gázkromatográfiát (GC) alkalmaztak, később a nagyfelbontású folyadékkromatográfia (PLC) is teret hódított magának. kromatográfiás módszerek másik típusa, amikor királis állófázist alkalmaznak. Ez esetben nincs szükség a minta előkészítésére, az enantiomer elegyet közvetlenül mérhetjük. Mind a GC, mind a PLC esetében ismertek ilyen megoldások. legújabb módszerek során PLC-vel végeztek olyan elválasztásokat is, ahol akirális állófázis mellett királis mozgófázist alkalmaztak. fent említett összes módszer közös jellemzője, hogy stabil vagy átmeneti diasztereomer képződmények jönnek létre, melyek különböző oldhatósági, stabilitási vagy adszorpciós tulajdonságai a felelősek a sztereoizomerek elválasztásáért Diasztereoszelektív (akirális) állófázis alkalmazása diasztereomerek minden tulajdonságukban különböznek még akirális környezetben is, ezért elválaszthatók akirális állófázison akirális oldószer segítségével. z elegy tisztítását nem szabad elvégezni, mert az megváltoztathatja az összetételt (vagy ismerni kell a változás hatását). Enantiomer elegyek esetében királis származékképző segítségével kell a mintát diasztereomer eleggyé alakítani a vizsgálat előtt. Ez esetben is érvényesek a korábban elmondottak: azaz a királis származékképzőnek 100%-ban enantiomertisztának kell lennie, illetve az átalakulásnak szintén 100%-ban le kell játszódnia. (z enantiomerek különböző sebességgel reagálnak királis anyagokkal, ezért nem maradhat kiindulási anyag a reakció után.) módszer előnye, hogy nem igényel királis állófázist (egyszerűbb és olcsóbb) viszont így is nagy variálhatóság jellemzi. királis származékképző tisztasága fontosságának bizonyítékául nézzük meg a következő példát: legyen a vizsgált mintánk () összetétele 99,5% R izomer és 0,5% izomer (99% ee). mennyiben egy olyan királis származékképzőt (B(+)) használunk, mely 1%-ban szennyezett a másik enantiomerrel (B(-)) (99%-os tisztaság), akkor a reakció után az alábbi összetétel alakul ki: 98,5 % (R)-B(+), 0,5 % ()-B(+), 1,0 % (R)-B(-), 0,0 % ()-B(-). kromatográfiás vizsgálat után akirális állófázison két jelet fogunk kapni: az (R)-B(+) és az ()-B(-) származékok egymásnak enantiomerjei ezért egy jelet adnak, ahogy az ()-B(+) és az (R)-B(-) származékok is. Eszerint az előbbi páros mennyisége 98,5 %, míg az utóbbi páros mennyisége 1,5 % lesz, ami 97% ee-nak felel meg. Tehát minimális izomer szennyezés is már nagyon komoly hibát okoz a mérésben.

11 kromatográfiás elválasztás elvét a ábra szemlélteti. Királis származékképzőként itt is szóba jöhetnek az előző fejezetben említett vegyületek, illetve származékaik ( ábra és ábra). a) b) ábra: kromatográfiás elválasztás elve akirális állófázison (a: segédanyag nélkül, b: királis segédanyag alkalmazásával) GC: Illékony minták esetében a gázkromatográfia alkalmazása tűnik a legegyszerűbbnek. osszú kapilláris segítségével több tízezres tányérszám érhető el, vivőgázként hidrogént alkalmaznak, ami olcsón hozzáférhető. Változtatni a vivőgáz sebességét, valamint a kolona hőmérsékletét lehet. átránya, hogy kicsi a variálhatósága és korlátolt az alkalmazhatósága. PLC: Nagyobb méretű molekulák vizsgálatára is alkalmas. z oldószer összetételével befolyásolható az elválasztás, ezáltal nagy variálhatóság jellemzi. gradiens elúció is alkalmazható, de drágább módszer, mint a GC. Általában kis hatékonyság jellemzi. Királis oldószerrel vagy szolvatálószerrel végzett vizsgálatok esetén nincs szükség 100%-os konverzióra, sem mintaelőkészítésre, viszont az alkalmazott oldószer (szolvatálószer) enantioemertisztasága 100% kell legyen. Kapillár elektroforézis: GC és a PLC előnyeit egyesíti, hátránya viszont, hogy csak töltéssel rendelkező rendszereken alkalmazható.

12 Enantioszelektív (királis) állófázis alkalmazása Enantiomerek elválasztásához királis környezet szükséges. Ezt valamilyen királis állófázis (CP) alkalmazásával biztosíthatjuk. z enantiomerek elválasztása királis állófázison a keletkező átmeneti diasztereomer képződmények (aggregátumok, adszorbeátumok) fizikai-kémiai paramétereinek (képződési energia, stabilitás, stb.) függvénye. módszer nagy előnye, hogy az alkalmazott királis állófázisnak nem kell teljesen enantiomertisztának lennie. módszer elvét a ábra szemlélteti. stabil adszorbció ábra: kromatográfiás elválasztás elve királis állófázison z elválasztás kapacitását (hatékonyságát) az állófázison rendelkezésre álló aktív helyek mennyisége határozza meg ( ábra). mennyiben az alkalmazott királis állófázis enantiomertisztasága csökken, az is az elválasztás hatékonyságának romlását eredményezheti.

13 nagy kapacitású oszlop kis kapacitású oszlop ábra: kromatográfiás elválasztás kapacitása Általában a királis állófázist mindkét enantiomer formában elő lehet állítani. (Ez alól a protein alapú és a ciklodextrin alapú királis állófázisok a kivételek.) mennyiben azonos mintát elemzünk a kétfajta állófázison, az a retenciós idők megcserélődését eredményezi ( ábra). (R)-CP ()-CP ábra: kromatográfiás elválasztás enantiomer viszonyban álló királis állófázison jó enantiomer elválasztáshoz minimum 3 pontos kötődés szükséges az állófázis és a minta között ( ábra).

14 B B E E 3 pontos kapcsolat - stabil csak 2 pontos kapcsolat -gyenge E B ábra: z enantiomer felismerés elve következőkben néhány példát mutatunk be királis állófázis kialakítására. Gázkromatográfia: z egyik elterjedt változat egy királis polisziloxán származék a Chirasil-Val TM, melynek szerkezete a ábrán látható. Viszonylag olcsón elérhető és létezik mindkét enantiomer formában. Viszont csak kismértékben variálható. C 3 C 3 i i 3 C C 2 C C N C CNtBu C ábra: Chirasil-Val TM gázkromatográfiás oszlop szerkezete Egy másik szintén elterjedt megoldás a ciklodextrin alapú oszlopok. Mind az α, β, és γ változat megtalálható, 5,6 vagy 7 glükózegységből épülnek fel, amelyek egy királis üreget

15 képeznek. Nagy hatékonyságú rendszerek, de csak ez egyik enantiomer formában léteznek. szabad hidroxil-csoportok átalakításával nagymértékben változtatható a szerkezet, ami a szelektivitás változását egyes esetekben akár az enantiomerek retenciós sorrendjének változását is eredményezheti. Folyadékkromatográfia z egyik elterjedt típus a Pirkle típusú megoldás, amelyből létezik kovalens és ionos elven működő változat is. hatékonyság függ a kialakuló hidrogénhíd-kötésektől, a kialakuló π-π vagy dipol-dipol kapcsolatoktól, illetve a sztérikus hatásoktól. Előnye a nagyobb variálhatóság (oldószer, additívek), de kisebb hatékonyságú és drágább, mint a GC oszlopok ábrán Whelk-1 nevű oszlop szerkezete látható. Ebből a típusból létezik mindkét enantiomer forma. N i 3 C C 3 N 2 N ábra: Whelk_1 folyadékkromatográfiás oszlop szerkezete Folyadékkromatográfiás oszlopok között is elterjedtek a ciklodextrin alapú rendszerek. Egy másik változat a cellulóz, amilóz alapú rendszerek, melyek széles spektrumú, nagy hatékonyságú oszlopok, helikális felépítésűek, és csak egy enantiomer formában léteznek. asonlóan a ciklodextrin alapú rendszerekhez itt is változtathatóak a szabad hidroxil-csoportok. z egyik leghatékonyabb megoldás a fehérje alapú rendszer, viszont ez a változat nagyon érzékeny, stabilitása nem mindig tartós, így sajnos nem használható általánosan. Ebben az esetben is csak az egyik enantiomer forma létezik. Egy különleges megoldás az alakfelismerő polimer állófázis kialakítása. Ennek során kémiai szintézissel először kialakítják a cellát. Ezt polimerizáció segítségével oldják meg, majd a felhasznált királis mintamolekulát hidrolízissel eltávolítják a rendszerből. z így létrejövő üregbe speciálisan csak az egyik enantiomer forma illik bele, ami nagy

16 hatékonyságú elválasztást tesz lehetővé az adott típusú szubsztrátok vonatkozásában ( ábra). N Cl N polimerizáció N 3 N Na, C 3 - D,L-pN 2 PheEt N 3 + L-pN 2 PheEt ábra: lakfelismerő polimer állófázis Enantiomer szelektivitáson alapuló kinetikus módszerek zámos analitikai módszer alapszik azon, hogy az egyes enantiomerek különböző sebességgel reagálnak királis reagensekkel. z ezen az elven alapuló preparatív módszereket kinetikus rezolválásnak nevezik. sebességkülönbség abból származik, hogy a reakcióban képződő átmeneti komplexek egymással már diasztereomer viszonyban állnak, így az aktíválási szabadenergiájuk is különbözik. z enentiomer szelektivitáson alapuló kinetikus módszereket két nagy csoportba oszthatjuk: enzimatikus és nem enzimatikus (kémiai) módszerekre Enzimatikus módszerek Egyes enzimek speciális tulajdonsága, hogy kizárólag egy adott vegyület egyik enantiomerjével lépnek reakcióba, miközben a másik enantiomer változatlan formában marad vissza. Ezen tulajdonságot kiválóan ki lehet használni enantiomer keverékek összetételének

17 meghatározására. Praktikusan egy enantiomer elegy esetén a minor komponens átalakítása a hatékony módszer, meghatározva ezzel a szennyező mennyiségét, ezáltal az enantiomer tisztaságot. Erre példa az (R)-tejsav enantiomer tisztaságának meghatározása. mintát ()- laktát-dehidrogenáz enzimmel kezelve szöchiometrikus nikotinamid-dinukleotid kofaktor (ND + ) jelenlétében, a minta ()-tejsav tartalma piroszőlősavvá oxidálódik, miközben a kofaktor redukálódik (ND). képződő ND mennyisége UV spektroszkópiával 340 nm-en mérve meghatározható ( ábra). + ND ()-laktát dehidrogenáz 344 nm UV + C + ND + C ábra: z (R)-tejsav enantiomer tisztaságának meghatározása Ezen módszerek esetében is meg kell azonban győződni arról, hogy a kívánt reakció teljesen lejátszódott-e, vagy ismerni kell a reakció egyensúlyi állandóját, hogy ezt korrekciós tényezőként figyelembe tudjuk venni. Bizonyos esetekben léteznek olyan enzimpárok, melyek külön-külön reagálnak az enantiomer formákkal. Elvégezve a minta vizsgálatát az enzimpár mindkét enzimjével a kapott eredmények kontrolálhatók, hiszen együttesen 100 %-ot kell szolgáltatniuk. Például az L-aminosav-oxidáz és a D-aminosav-oxidáz katalizálja az L- illetve a D-aminosavak oxidatív átalakulását ( ábra). R 2 N L- vagy D-aminosav L- vagy D-aminosav oxidáz + 1/2 2 R + N ábra: minosavak összetételének meghatározása enzimatikus módszerrel Nem enzimatikus (kémiai) módszerek nem enzimatikus módszerek alkalmazhatóságának feltétele, hogy megoldjuk a keletkező termékek detektálását. Természetesen szemben az enzimatikus módszerekkel itt

18 sokkal nehezebb olyan rendszereket találni, ahol az enantiomerek megfelelő sebességkülönbséggel reagálnak. Egy viszonylag új módszer az un. tömegjelölt kvázi enantiomerek képzése, melyeket ezután tömegspektrometriával lehet analizálni ( ábra). CR termék1 C DCC, bázis gyors k f R + B C DCC, bázis lassú k sb B CR termék2 C C DCC, bázis lassú k s B C DCC, bázis gyors k fb B C ábra: Kinetikus rezolválás tömegjelzett karbonsavak segítségével z eljárás során az enantiomer keverék alkoholokat két különböző királis karbonsavval reagáltatják, melyek sztereocentruma egymásnak ellentéte, és a két molekula egy C 2 -csoportban különbözik egymástól (ΔM = 14) ( ábra). (Nem minden esetben szükséges egy C 2 -csoportnyi különbség, lehetséges, hogy egy D csere is elég.) z egyik karbonsav az (R)-alkohollal reagál gyorsabban a megfelelő észter származékot képezve, a másik karbonsav pedig az ()-alkohollal teszi ugyanezt. kapott reakcióelegy tömegspektrumából az intenzitások (I termék1, I termék2 ) és a kinetikai paraméterek (k f, k s és q) ismeretében az alábbi módon meghatározható az enantiomer alkohol elegy összetétele: I termék1 / I termék2 = y * q és ee % = [(y-1)(s+1)/(y+1)(s-1)]*100, ahol s = k f / k s. (I termék1, I termék2 : mért intenzitás, q: ionizációs korrekciós faktor, k f, k s : sebességi állandók, y: korrigált intenzitás arány) fenti eljárást az alábbi molekulák esetében alkalmazták sikerrel ( ábra).

19 C C N N C 3 C B C ábra: Példák kinetikus rezolválásban alkalmazott molekulákra Fúziós módszerek Enantiomer keverékek olvadáspontjának mérése elvileg elegendő információt szolgáltat az elegy összetételének meghatározásához. dott elegy összetétele, alapjában, közvetlenül leolvasható az olvadásgörbét ábrázoló kétkomponensű fázisdiagramról. zokban az esetekben, amikor a vegyületek molekulakonglomerátumokat képeznek, vagy gyenge enantiomer tisztasággal rendelkeznek (30-90 %), az enantiomer összetétel meghatározása történhet közvetlenül differenciál scanning kaloriméter (DC) segítségével. kalorimetriás módszerek széles körben használhatóak, és sokkal gyakoribb felhasználást érdemelnének. Elterjedésüknek egyetlen gátja van, hogy a DC berendezések nem túl elterjedtek a szerves kémiai laborokban Izotóphígításon alapuló módszerek z izotóphígítás egy olyan analitikai módszer, amely hasznos lehet, ha egy anyag (nevezzük -nak) mennyiségét kell meghatározni, egy olyan elegyben, melyben hasonló szerkezetű anyagok (, B és C ) vannak, és az anyag kvantitatíven nem választható

20 el. Minimális mennyiségű tiszta komponensre van szükség, és a tisztítás során nagy veszteségek is megengedhetőek. z eljárás alapja, hogy egy ismeretlen enantiomer összetételű elegyet összekeverünk egy ismert összetételű izotóppal jelzett eleggyel, majd vagy a tiszta enantiomer, vagy a racém elegy reizolációja után megállapítjuk a mintában az izotóppal jelzett és a nem jelzett molekulák arányát. kapott eredmény alapján meghatározható az eredeti enantiomer összetétel Potenciometriás módszerek Királis ionok összetétele meghatározható potenciometriásan egy elektrokémiai cellában, amely tartalmaz két folyékony polivinil-klorid (PVC) membránt, melyek tartalmazzák egy elektromosan semleges királis ionofor két enantiomer tiszta, egymással tükörképi viszonyba lévő komponenseit (Például: (R,R) és (,)-5-nonyl-tartarátot.) két membrán mindegyike szelektíven átengedi a vizsgált minta egyik enantiomerjét. (Egyik az egyiket, másik a másikat.) Ennek hatására potenciálkülönbség alakul ki a vizsgált minta oldata és a két referencia oldat között. megfelelő kalibráció megléte esetén, az adatokból megállapítható a vizsgált minta összetétele.