KÖRNYEZETTOXIKOLÓGIA. Környezettoxikológia helye, szerepe toxicitási tesztek I II. Molnár Mónika, Gruiz Katalin

Átírás

1 KÖRNYEZETTOXIKOLÓGIA Környezettoxikológia helye, szerepe toxicitási tesztek I II. Molnár Mónika, Gruiz Katalin Budapesti Műszaki és Gazdaságtudományi Egyetem Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudományi Tanszék Mérnöktanári Mesterszak 2014 BMEVEMBMMT1

2 TEMATIKA előadás Környezettoxikológia jelentősége, szerepe Toxicitási tesztek osztályozása Tesztorganizmusok Egy fajt alkalmazó tesztek Szárazföldi ökoszisztéma tesztelése - egy fajt alkalmazó talajtesztek Vízi ökoszisztéma tesztelése - egy fajt alkalmazó tesztek Több fajt alkalmazó tesztek csoportjai Mikrokozmosz, mezokozmosz Szabadföldi vizsgálatok Page 2

3 Veszély KOCKÁZAT Vegyi anyag Környezeti minták szennyezett környezet Veszélyessége: kémiai szerkezetéből adódó immanens tulajdonság Mindent ami problémát okoz meg kell ismerni!! Vegyi anyag kikerül a környezetbe Vegyi anyagok tesztelése Page 3 KOCKÁZAT Vegyi anyag kockázata a környezettel való kölcsönhatás révén nyilvánul meg A környezeti kockázat számszerűsített értéke a környezet-védelemmel, környezetgazdálkodással kapcsolatos döntések tudományos alapja

4 Page 4 A környezettoxikológia helye és szerepe A környezettoxikológia a vegyi anyagoknak az ökológiai rendszerek szerkezetére és funkciójára gyakorolt hatását vizsgálja és ebből igyekszik előrejelzést adni a teljes ökoszisztémára. Az embert az ökológiai rendszer részeként kezeli. Az ökológiai rendszereket teljes komplexitásában átfogja, a molekuláris szinttől az egyed és a közösség szintjén keresztül a teljes ökoszisztémáig. Multidiszciplináris, egy sor szakterület együttműködésére alapoz. A környezettoxikológia eredményei használhatóak egyes vegyi anyagok valamint szennyezett területek kockázatának jellemzésére, támogatják a környezetmenedzsment és környezetpolitika döntéseit. Hatáson alapuló határértékek és más környezetminőségi kritériumok képzéséhez Monitoring-rendszerek tervezéséhez Kockázatcsökkentési intézkedésekkel kapcsolatos döntésekhez

5 Page 5 A környezettoxikológia a kockázatkezelésben

6 DEFINÍCIÓK Környezettoxikológia: a környezettoxikológia a környezetbe került vegyi anyagok káros hatását vizsgálja. Vizsgálja az ökoszisztémára és az emberre gyakorolt káros hatásokat. Mérési, tesztelési módszerei fizikaikémiai és biológiai végpontok alapján következtet a káros hatások nagyságára. Teljes ökoszisztémák minden részletére kiterjedő vizsgálata nem lehetséges, ezért kiválasztott, jellemző fajok vagy laboratóriumi tesztorganizmusok válasza alapján következtetünk az ökoszisztéma egészére. Vegyi anyag: vegyi úton előállított vagy átalakított anyag, melyet kémiai sajátságai miatt gyártunk és használunk fel. A vegyi anyag környezeti kockázata veszélyességéből és a környezettel való kölcsönhatásából adódik, nagysága a vegyi anyag környezeti koncentrációjának és az ártalmatlan koncentrációnak a hányadosa. A környezetbe kikerült veszélyes vegyi anyag a szennyezőanyag. Page 6

7 A vegyi anyag kölcsönhatása a környezettel A vegyi anyag környezetbe kerülése után kölcsönhatásba lép a környezettel. Terjed, megoszlik a különböző fázisok között, átalakul, degradálódik, stb. Ezek a folyamatok határozzák meg a vegyi anyag környezeti koncentrációját, azt, amely eléri a biota tagjait és hat rájuk. 2. A vegyi anyag kölcsönhatásba lép az élőlény egy aktív helyével, melyet molekuláris szinten kell értelmeznünk. A hatás molekuláris szinten lehet egy élőlény életfontosságú szerkezeti eleme vagy valamely fontos szereppel bíró molekulája, pl. enzimfehérje, nukleinsav vagy membránreceptor. 3. A molekuláris szintű kölcsönhatás eredményeképpen magasabb szintekre is áttevődik és megjelenik a hatás, pl. biokémiai vagy fiziológiai szinten, a viselkedés szintjén, a populáció, a közösség vagy az egész ökoszisztéma szintjén. Page 7

8 A környezettoxikológia fő funkciói A vegyi anyag kölcsönhatásának leírása a környezettel A hatás helye, receptor Fiziológia és viselkedés Közösségi paraméterek Vegyi anyag bekerülése Ökoszisztémára gyakorolt hatások Biotranszformáció A vegyi anyag sorsának és transzportjának leírása Biokémiai paraméterek Populációs paraméterek A vegyi anyag hatásainak leírása és jellemzése a környezettel Page 8

9 A vegyi anyag kölcsönhatása a környezettel 2. Molekuláris szinten; biokémiai paraméterek: Stresszfehérjék termelése, metallotionein termelés, acetilkolin-észteráz gátlás Szervezet szintjén; fiziológia és viselkedés: Kromoszómasérülések, daganatképződés, teratogén hatások, szaporodóképesség, viselkedés megváltozása: kompenzáló viselkedés, pusztulás Populáció szintjén: A populáció sűrűsége, produktivitása, párzás sikeressége Közösség szintjén: A közösség összetétele, a közösség diverzitása, a közösség stabilitása, energiafelhasználásának hatékonysága Ökoszisztéma szinten: A fajok összetétele és eloszlása, anyagcsere, elemkörforgalom, a táj megváltozása Page 9

10 Környezeti minták ökotoxikológiai tesztelése (1) Környezeti minták tesztelésének problémái: Szennyezőanyagok keveréke Kölcsönhatások: szennyezőanyagok, mátrix és a biota között Vizsgált közeg: extraktum, teljes talaj Szennyezett talaj tesztelésének problémái Szennyezőanyag keverék: szinergizmus, antagonizmus Biotranszformáció: termékek hatása Biodegradáció Hozzáférhetőség: eltérő fizikai-kémiai és biológiai hozzáférhetőség Page 10 Az analitikai program csak a szennyezőanyagok kis hányadát tartalmazza A környezeti minta biotikus és abiotikus tulajdonságai befolyásolják az eredményt

11 Környezeti minták ökotoxikológiai tesztelése (2) Az ökotoxikológiai tesztelés megoldás a problémák egy részére Integrálja a toxikus anyagok kölcsönhatásait Integrálja a szennyezőanyag és a mátrix kölcsönhatásait A szennyezőanyag biológiailag hozzáférhető részét méri Kémiai analitikai módszerrel nem kimutatható anyagok hatását is méri Az analitikai programba be nem vett veszélyes anyagok hatását is méri Ökotoxikológiai tesztekkel szemben támasztott követelmények Ökológiai relevancia, környezeti realitás Reprodukálhatóság Megbízhatóság Érzékenység Page 11

12 Vegyi anyagok viselkedése a környezetben A toxicitás megoszlása a talaj szilárd-víz, valamint szilárd-gáz fázisai között kockázatot jelent a felszín alatti vízre és a levegőre. Üledékek esetében a szilárd fázis és a pórusvíz közötti megoszlás a felszíni víz minőségét veszélyezteti. Erős kötődés és rossz biodegradálhatóság a kémiai időzített bomba jelenségéhez vezet. Az aktuális toxicitást (az ökoszisztémában realizálódó hatást) szilárd fázisú minták és adszorbeált szennyezőanyag esetében a direkt kontakt vagy interaktív tesztek jellemzik megfelelően, ahol megnyilvánulhatnak a kölcsönhatások. Ezek eredményei magukban foglalják az összes komponens közötti kölcsönhatást: szennyezőanyagok, szennyezett közeg, organizmus(ok). Page 12

13 Vegyi anyagok viselkedése a környezetben Vegyi anyagok sorsa és viselkedése a környezetben: mozgékonyság, hozzáférhetőség, biodegradálhatóság befolyásolják az aktuális toxicitást. Mozgékonyság, hozzáférhetőség befolyásolja az aktuális toxicitást: kölcsönhatás a szennyezőanyagok, valamint a szennyezőanyag és a mátrix között. Transzport és hozzáférhetőség integrált metodikával jellemezhető. Szorpciós kapacitás: a szennyezőanyag és toxicitása megoszlik környezeti elemek fázisai között. Integrált megközelítés: fizikai-kémiai jellemzők + biológiaiökotoxikológiai jellemzők helyszín specifikus kockázat. Page 13

14 Tesztegyüttes fémekkel szennyezett kertek talajának részletes helyszínspecifikus szennyezettség-felmérésére TalajTesztelő Triád A toxikus fémekkel szennyezett terület talajának részletes állapotfelmérésére Fizikai -kémiai és kémiai analitikai módszerek A talajtulajdonságok és a talaj összes és mozgékony fémtartalmának jellemzésére Biológiai módszer a bioakkumuláció jellemzésére Környezettoxikológiai tesztek A talaj toxikus hatásának jellemzésére Királyvizes feltárás (HCl:HNO 3 =3:1) Összes fémtartalom ICP Lakanen-Erviö kivonat Ammónium-acetát+ecetsav+EDTA Növények által felvehető ICP Acetátos kivonat ecetsav ph=4,5 Mobilis fémtartalom ICP Vizes kivonat ICP Bioakkumulációs teszt A növények által felvehető fémhányad mérésére (Növények fémtartalmának mérése salétromsav+h 2 O 2 feltárás ICP-AES-el) Talajtulajdonságok ph, redox, EC, CaCO 3, N-, P- és humusz-tartalom Kiskerti növények fémtartalma Salétromsav + H 2 O 2 feltárás ICP-AES Dehidrogenáz enzimaktivitásgátlási teszt (bakteriális tesztorganizmus) Azomonas agilis Biolumineszcencia gátlási teszt (bakteriális tesztorganizmus) Vibrio fischeri Gyökér- ill. szárnövekedés gátlási teszt (növényi tesztorganizmus) Sinapis alba Page 14

15 Szénhidrogénekkel szennyezett terület remediációt megalapozó felmérésére alkalmazott módszeregyüttes TalajTesztelő Triád A szénhidrogénekkel szennyezett terület remediációt támogató részletes felmérésére Kémiai analitikai módszerek A szennyezettség jellemzésére a talajban és a talajvízben Biológiai vizsgálatok A talajökoszisztéma, talajaktivitás jellemzésére Környezettoxikológiai tesztek A talaj toxikus hatásának jellemzésére Talaj ultrahangos extrakciója hexán-aceton (2:1) eleggyel Extraktum gravimetriával Talajvíz extrakciója n-pentánnal extraktum gravimetriával Talaj aerob heterotróf telepképző sejt számának meghatározása Biolumineszcencia-gátlás vizsgálata Vibrio fischeri bakteriális tesztorganizmussal Talajból összes extrahálható szénhidrogén (EPH) GC alkalmazásával Talajvízből összes extrahálható szénhidrogén (EPH) GC alkalmazásával Talaj szénhidrogén biodegradáló sejtkoncentrációjának mérése Szaporodás-gátlás vizsgálata Tetrahymena pyriformis állati egysejtűvel Talajmikroflóra dehidrogenáz enzim aktivitásának mérése Talajlégzés mérése statikus rendszerben (zárt palack teszt) Page 15 Talajlégzés mérése dinamikus rendszerben (levegőztethető oszloreaktorban)

16 Ökotoxikológiai tesztek osztályozása Fajok száma szerint Page 16 - Egy fajt alkalmazó teszt - Több fajt alkalmazó A tesztorganizmus - Baktérium - Alga - Gomba - Növény - Állat - Több faj együtt (mikrokozmosz, mezokozmosz ) Tesztelendő ökoszisztéma - Vízi ökoszisztéma - Szárazföldi ökoszisztéma Expozíciós szcenárió - Teljes test - Etetési kísérletek - Ismert mennyiség beinjektálása (intramuszkuláris, intravénás) - Kontrollált mennyiség gyomorba juttatása

17 Több fajt alkalmazó ökotoxikológiai tesztek Több fajt alkalmazó tesztek (Callow, 1993) A bioteszt leírása Két baktérium törzs kompetíciós tesztje. 5 napos teszt Mikrobiális prédapredátor teszt. Időtartam: 3-5 hét. Mikrokozmosz tesztek. Időtartam: 3-10 hét Mezokozmosz tesztek Időtartam: 5-6 hónap Vizsgált tulajdonság a kompetíció eredménye Préda, predátor egyedszáma Egyedszám, fajössztétel, légzés, heterotrof aktivitás, Egyedszám, fajösszetétel, anyagcsere körforgalmak, + Szabadföldi vizsgálatok Page 17

18 Ökotoxikológiai tesztek osztályozása A vizsgált környezeti elemek és fázisok Víz és pórusvíz Extraktumok, eluátumok, csurgalékok, stb. Szilárd fázisú minták: teljes talaj, teljes üledék Az ökotoxikológiai tesztelés célja Vegyi anyagok toxicitásának, mutagenitásának és teratogenitásának vizsgálata, Hatáson alapuló környezetminőségi kritériumok képzése Biomonitoring (integrált monitoring) Korai figyelmeztető rendszerek Környezeti minták toxicitásának, mutagenitásának és teratogenitásának vizsgálata Keverékek, hulladékok toxicitásának, mutagenitásának és teratogenitásának vizsgálata Közvetlen, hatáson alapuló döntési rendszerek Page 18

19 Teszt időtartama Page 19 Ökotoxikológiai tesztek osztályozása - Rövid idejű = akut - Hosszú idejű = krónikus Teszt típus Laboratóriumi teszt (bioassay): akut, krónikus toxicitás, mutagenitás, teratogenitás Mikrokozmosz, mezokozmosz (több fajt alkalmazó toxicitási teszt) In situ biomonitoring (aktív, passzív) Diverzitás Biodegradációs Bioakkumulációs. Leggyakoribb mérési végpontok Toxicitási tesztek: növekedés (sejtszám, tömeg, gyökérhossz, klorofill tartalom), túlélés, halál, immobilizáció, légzés: O 2 fogyasztás, CO 2 termelés, enzimaktivitások, ATP termelés, szaporodás, lumineszkálás etc. Mutagenitási tesztek: mutánsok száma, revertánsok száma, kromoszóma hibák Rákkeltő hatás: tumorok Teratogenitási tesztek: reproduktivitás, cytogenetikai jellemzők Biodegradációs tesztek: O 2 fogyasztás, szubsztrátfogyás, termékképzés, CO 2 termelés Bioakkumulációs tesztek: az akkumulált vegyi anyag kémiai analízise

20 Page 20 Értékelés és interpretáció Koncentráció (dózis) válasz összefüggés tesztelése Mérési végpont: a tesztorganizmus mérhető válasza; biokémiai, fiziológiai, viselkedési, populációs, közösségi jellemzők és ökoszisztéma hatások Vizsgálati végpont: a mérési végpontból statisztikai értékeléssel kapott, a toxicitást, vagy más káros hatást jellemző érték. A jellemző koncentrációt a koncentráció (dózis) hatás görbéről olvassuk le: az értékelés mindig statisztikai / grafikus- EC 20, EC 50 (Effective Concentration) ED 20 / ED 50 (Effective Dose) LC 20 / LC 50 (Lethal Concentration) LD 20 / LD 50 (Lethal Dose) NOEC / NOEL (No Observed Effects Concentration / Level) NOAEC / NOAEL (No Observed Adverse Effects Concentration / Level) LOEC / LOEL (Lowest Observed Adverse Effects Concentration / Level) MATC (Maximum Allowable Toxicant Concentration) NOEC < MATC < LOEC

21 Fényintenzitás-gátlás [%] Koncentráció-válasz összefüggés Page EC20 EC log Cu koncentráció [mg/kg]

22 Akut toxicitás - végpontok Akut toxicitás mérése esetén (rövid idejű kitettség) a koncentráció hatás görbéről leolvashatjuk a 10, vagy 90 %-os gátlást okozó koncentrációt LC 10, LC 20, LC 50, LC 90 = letális koncentráció (Lethal Concentration), mely a tesztorganizmus 10, 20, 50 vagy 90 %-ának pusztulását okozza. EC 10, EC 20, EC 50, EC 90 = hatásos koncentráció (Effect Concentration), mely a mérési vagy vizsgálati végpont 10, 20, 50, 90 %-os csökkenését okozza. LD 10, LD 20, LD 50, LD 90 = letális dózis (Lethal Dose), mely a tesztorganizmus 10, 20, 50 vagy 90 %-ának pusztulását okozza. ED 10, ED 20, ED 50, ED 90 = hatásos dózis (Effect Dose), mely a végpont 10, 20, 50, 90 %- os csökkenését okozza. Page 22

23 Krónikus toxicitás - végpontok Krónikus toxicitás vizsgálatából, a koncentráció-hatás görbe alapján grafikusan, vagy statisztikai módszerekkel meghatározott értékeket szokták megadni: NOEC = (No Observed Effects Concentration), az a legnagyobb koncentráció, amelynek nincs megfigyelhető hatása. NOEL = (No Observed Effects Level Concentration), az a legnagyobb dózis, amely nem okoz megfigyelhető hatást. LOEC = (Lowest Observed Effects Concentration) az a legkisebb koncentráció, amelynek hatása már megfigyelhető. LOEL = (Lowest Observed Effects Level) az a legkisebb dózis, amelynek hatása már megfigyelhető. MATC = (Maximum Allowable Toxicant Concentration), a szennyezőanyag maximális, még megengedhető koncentrációja. Page 23

24 A tesztorganizmus: általános követelmények 1. Hozzáférhetőség: a tesztorganizmus széles körben elérhető legyen Laboratóriumi kultúra Más kultúrák, törzsgyűjtemények Gyűjtés szabadföldről 2. Fenntartás Laboratóriumban fenntartható legyen Nagy mennyiségben elérhető, beszerezhető legyen 3. A tenyészet genetikai tulajdonságai Ismert genetikai összetétel Ismert genetikai történet (norvég patkány, Escherichia coli) 4. Érzékenysége Relatív érzékenység a toxikus szennyezőanyagra Speciális érzékenység egy vagy több szennyezőanyagra Page 24 Széles spektrumú érzékenység

25 A tesztorganizmus: általános követelmények 5. Mennyire reprezentálja az ökoszisztémát Érzékenysége legyen jellemző rendszertani egységére Lehet a legérzékenyebb Érzékenyebb, mint az ökoszisztéma átlaga átlagos érzékenységű Milyen rendszertani egységet (család, stb.) reprezentál 6. Koncentráció - válasz összefüggés A válasz legyen arányos a toxikus anyag koncentrációjával A hatásos koncentrációtartomány széles legyen 7. A teszt ismételhetősége, statisztikája Page 25

26 Egy fajt alkalmazó talajtesztek

27 Bakteriális tesztek talaj vizsgálatára Biokémiai, fiziológiai változások Aliivibrio fischeri lumineszcencia gátlási teszt (laborgyakorlat) Azotobacter agile dehidrogenáz enzimaktivitás gátlási teszt Túlélés, pusztulás Bacillus subtilis teszt, agardiffúziós módszerrel Pseudomonas fluorescens toxicitási teszt (MSZ , talajkivonat, indikátor: TTC) Géntoxikológiai tesztek mutáció Ames-teszt (Salmonella tiphymurium) Mutatox-teszt (Vibrio fischeri nem világító variáns, mutagén hatásra lumineszcencia) 27 Page 27

28 Aliivibrio fischeri biolumineszcencia gátlási teszt I. (Laborgyakorlat) Aliivibrio fischeri: fényt emittáló tengeri baktérium Érzékenysége: mind toxikus fémekre, mind szerves makro- és mikroszennyezőkre érzékeny. Végpont: lumineszcencia intenzitáscsökkenése, a minta hígítási sorából EC 20, EC 50 határozható meg. Szükséges műszer: luminometer. Tesztelés időtartama: 30 perc. Szabvány módszerek: US EPA Microtox, DIN 38412, teljes talajra adaptált és direkt kontaktra kidolgozott változat: BME- MGKT. Page 28 LUMAC luminométer Bakteriális lumineszcens fény képzésének alapegyenlete: FMNH 2 + O 2 + RCHO FMN + ROOH + H 2 O + fény (FMNH 2 a redukált míg a FMN az oxidált flavin mononukleotid) 28

29 Vibrio fischeri biolumineszcencia gátlási teszt II. A mérés kivitelezés során 2 % NaCl koncentráció fenntartása szükséges (tengeri baktérium). Érzékenység mérése: Cu hígítási sor, végeredmény megadása réz-egyenértékben segíti a környezettoxikológiai eredmények összehasonlítását hatáson alapuló határértékekhez viszonyítható Kontroll: OECD vagy szennyezetlen kontroll talaj (mintához fizikai-kémiai és biológiai tulajdonságaiban hasonló talaj) célja: mintaszuszpenzió zavarosságának figyelembe vételéhez Minta: szárított, porított, szitált hígítási sor az EC 20 és EC 50 értékek meghatározásához 29 Page 29

30 Azomonas agilis dehidrogenáz enzimaktivitás gátlási teszt I. Az Azomonas agilis érzékenysége: a szennyezőanyagok széles skálájára érzékeny tesztorganizmus. Túlságosan is érzékeny, így a teszt során, a szennyezőanyag toxicitásán kívüli okok is okozhatnak gátlást. Screenelésre, a negatív minták kiszűrésére javasolható. Végpont: dehidrogenáz aktivitás megléte vagy hiánya, illetve csökkenése, a hígítással: EC 20, EC 50 Szükséges műszer: vizuális (alternatív elektronakceptor színének megjelenése: igen, nem), vagy fotométer (alternatív elektronakceptor színintenzitása) Tesztelés időtartama: 48 óra Szabványosított módszerek: MSZ 21978/30 (veszélyes hulladékok kivonatára), talajra adaptált, direkt kontaktra illetve talajszuszpenzióra kidolgozott változatát a BME ABÉT-n fejlesztettük ki. 30 Környezettoxikológia előadás Page 30

31 Azomonas agilis dehidrogenáz enzimaktivitás gátlási teszt II. Környezeti stressz az elektrontranszport rendszer megsérülhet. Az elektrontranszport lánc első szakaszának lépéseit a dehidrogenáz enzim katalizálja. Alternatív elektronakceptor: TTC (2,3,5-trifeniltetrazólium-klorid), mely az elektrontranszportlánc zavartalan működése esetén redukálódik, és piros színű trifenil-formazánná alakul. Toxikus anyagok jelenlétében a dehidrogenáz enzimaktivitás gátolt. Minta: steril talaj, hígítási sor (ha más mikrobák kerülnek a tesztoldatba, azok dehidrogenáz aktivitása meghamisítja az eredményt) Referencia: réz hígítási sorozat 31 kutatas/kutatas_muszer_altalanos_hu.html Page 31

32 Bacillus subtilis teszt, agardiffúziós módszerrel I. Tesztorganizmus: BME-en a gyöngyösoroszi Pb és Zn bánya területén izolált, fémekre érzékeny törzs Érzékenysége: közepesen érzékeny talajbaktérium, elsősorban toxikus fémekre, mint Zn, Cd, Cu érzékeny Végpont: növekedés-gátlás, kioltási zóna formájában, hígítási sor kioltási zónáiból EC 50 Kiértékelés: vizuális Tesztelés időtartama: óra 32 Page 32

33 Bacillus subtilis teszt, agardiffúziós módszerrel II. Agaros táptalajban egyenletesen eloszlatott és lemezként kiöntött Bacillus subtilis szaporodását, a lemez felületére helyezett, agarral szilárdított talajmintakorong toxicitásától függően gátolja. A mintakorong körül kialakult kisebb denzitású zóna toxicitás Oldat: a kisebb denzitású zóna átmérője szennyezőanyag mennyisége Teljes talajminták: a módszer kvalitatív természetű (toxikus, nem toxikus) Elővizsgálat, a negatív minták kiszűrése Napi akár 500 minta Page 33 A minták a következő négy csoportba sorolhatók: kioltási zóna erős gátlás toxikus minta gyengítési zóna gyenge gátlás gyengén toxikus minta nincs zóna nincs gátlás nem toxikus a minta serkentési zóna serkentő hatás nem toxikus a minta 33

34 Ames mutagenitási teszt talajra I. A teszt típusa: egy fajt alkalmazó, reverz mutagenitási teszt, géntoxicitás kimutatására Tesztorganizmus: Salmonella tiphymurium mesterségesen hisztidin auxotróffá tett törzsei: TA 1535, TA 1537, TA 1538 stb. Végpont: a hisztidin termelő képesség visszanyerése: hisztidin-mentes táptalajon revertáns telepek megjelenése Időigény: óra Szabvány: ISO 16240:2005 szabvány vízminősítésére, OECD 471 vegyi anyagok tesztelésére, BME ABÉT-en direkt kontaktra 34 Page 34

35 Ames mutagenitási teszt talajra II. Telepek kis mennyiségű hisztidint tartalmazó táptalajon: reverz mutánsok mutagén hatás (minimál glükóz agar) Mutagén anyag nélküli kontroll: spontán revertánsok Érzékenységvizsgálat: 4-nitrofenilén-diamin 35 Page 35

36 Növényi tesztorganizmusok Magasabb rendű növények Többnyire egynyári növények és fűfélék Pusztulás csírázásgátlás nem mindig elég érzékeny, mag belső tartalékainak hasznosítása Növekedés gyökér- és szárnövekedés gátlása Fotoszintetikus enzimaktivitások klorofill mérése Metabolikus enzimaktivitások pl. peroxidáz, szuperoxid-dizmutáz, glutation-s-transzferáz Szimbiotkius nitrogén-megkötés Angolperje Fehér mustár Kerti zsázsa Page 36

37 Sinapis alba (fehér mustár) gyökér- és szárnövekedés gátlási teszt Sinapis alba érzékenysége: a szennyezőanyagok széles skálájára érzékeny. Végpont: csírázásgátlás, szár- és gyökérnövekedés gátlás, ED 20 és ED 50 a minták hígítási sorozatából, nedves és száraz biomassza tömeg. Szükséges műszer: vonalzó, vizuális értékelés. Tesztelés időtartama: 72 óra. Szabványosított módszerek: MSZ kivonatra, teljes talajra adaptált, direkt érintkezésre kidolgozott változat: BME ABÉT 37 Page 37

38 Egysejtű állatok Állati tesztorganizmusok Protozoák: Tetrahymena pyriformis, Colpoda cullus, Paramecium aurelia Többsejtű állatok Elsősorban talajlakó állatok Tetrahymena pyriformis Paramecium aurelia 38 Page 38

39 Tetrahymena pyriformis szaporodás gátlási teszt Tetrahymena pyriformis nagyon érzékeny, talaj pórusvizében élő protozoa. A talajok toxikus hatása állatok számának (sejtszám) változása. Talajminta: szárított, porított, szitált, steril Tápoldat: PP táp + antibiotikumok Inkubálás: szobahőmérsékleten (20 25 C-on), sötétben, 100 rpm-mel rázatva A sejtszámot 72 óra alatt többször meghatározzuk mikroszkópos sejtszámlálással: Bürker-kamrával A szaporodási görbe exponenciális szakaszára illesztett görbe meredekségét hasonlítjuk össze a szennyezetlen kontrolléval. 39 Page 39

40 Eisenia fetida (földigiliszta) teszt I. Eisenia fetida érzékenysége: közepesen érzékeny. Az expozíciós útvonalak: bőrkontakt és az emésztés Akut hatásokkal szemben ellenállóbb, a krónikus toxicitás és a reproduktivitás nagyobb érzékenységet biztosít. Végpontok: akut és krónikus toxicitás esetében: az állatok száma, letalitás, hígítással EC 20 és/vagy EC 50, valamint NOEC reproduktivitásnál: az utódok száma, NOEC bioakkumuláció vizsgálata esetén: koncentráció a szövetekben. Szükséges műszer: állatok száma: manuális és vizuális, bioakkumuláció vizsgálata esetén a szennyezőanyagnak megfelelő analitikai műszer Időigény: szűrőpapír teszt talajkivonattal (OECD, 1984) esetén 24 és 48 óra mesterséges talajteszt OECD talajba kevert minta-szuszpenzióval (OECD, 1984; EEC, 1982) esetén 7 és 14 nap Page 40

41 Page 41 Folsomia candida (Collembola) mortalitási teszt I. (Laborgyakorlat) Folsomia candida: ugróvillások rendjébe tartozó, talajlakó, ősi rovar Teszt típusa: egy fajt alkalmazó, laboratóriumi, állati, akut toxicitási és krónikus (reproduktivitási) teszt. Mikrokozmosz tesztként is alkalmazható. A Folsomia candida érzékenysége: fémekre kevéssé, szerves szennyezőanyagokra érzékeny, főleg az illékonyakra és a bőrön át felszívódókra. Végpont: állatok száma: letalitás, hígításból LC 20 és LC 50, reproduktivitási teszt alapján NOEC. Szükséges műszer: citoplaszt mikroszkóp vagy vizuális Tesztelés időtartama: akut: 5 10 nap, reprodukciós: 20 nap Szabvány: ISO 11267:1999, OECD/OCDE

42 Folsomia candida (Collembola) mortalitási teszt II. A vizsgálathoz azonos korú (14 napos) állatkákat kell felhasználni, ezért szükséges a szinkron populáció létrehozása. A teszthez g légszáraz talaj- vagy üledékminta szükséges. ED 20 és ED 50 meghatározása céljából, a mintákból hígítási sort készítünk (OECD standard talajt) A mintákat 5 5 ml vízzel megnedvesítjük mg élesztő. Az üvegekbe db állatkát juttatunk Inkubálás: 7 napig sötét, C-os helyen A kiértékelés: a talajt vízzel felszuszpendáljuk A felszínen úszkáló állatkákat megszámoljuk. A megmaradt illetve elpusztult állatkák számából következtetünk a vizsgált minta toxicitására. A hígítási sorból kapott értékeket (megmaradt állatok darabszáma) a hígítás tömegarányának függvényében ábrázoljuk. Page OECD talaj: tőzeg (10%), kaolinit agyag (20%), ipari kvarc homok (70%)

43 Egy fajt alkalmazó tesztek vízi ökoszisztéma tesztelése

44 egy fajt alkalmazó tesztek Page 44 Vízi ökoszisztéma tesztelése Vízi ökoszisztéma tesztelése szárazföldi ökoszisztéma tesztelése Sok, elterjedt szabvány módszer Széles körben alkalmazott tesztorganizmusok Algatesztek Békalencseteszt Daphniateszt Haltesztek FETAX Fejlesztés alatt álló, nem szabványosított módszerek

45 Vízi tesztorganizmusok környezettoxikológiai tesztelésre Békalencse: Lemna gibba Protozoa: Tetrahymen pyriformis (állati egysejtű) Halteszt Page 45 Vízibolha: Daphnia magna Guppi: Poecilia reticulata

46 Algatesztek Az algák használata a vízi rendszerek ökotoxikológiai vizsgálatára általánosan elterjedt. Az alga növekedési teszt a toxikus vegyi anyagoknak az elsődleges termelők anyagcsere-folyamataira gyakorolt gátló hatását vizsgálja. Édesvízi és tengeri algákat használhatunk tesztorganizmusként. Az ASTM (American Society for Testing and Materials) ajánlásai: Édesvízi algák Zöld algák: Selenastrum capricornutum, Scenedesmus subspicatus, Chlorella vulgaris Kék algák (cianobaktériumok): Microcystus aeruginosa, Anabena flos-aquae Kovamoszatok: Navicula pelliculosa Tengeri algák Kovamoszatok: Skeltonema costatum, Thalassiosira pseudonana Page Ostoros 46 moszatok: Dunaliella tertolecta

47 Algatesztek - édesvízi algák az ökotoxikológiában (Calow, 1993) Vizsgált vegyület Tesztorganizmus A teszt időtartama Tiszta vegyületek Selenastrum capricornutum 5 nap Microcystis aeruginosa Navicula seminulum Növényvédőszerek Selenastrum capricornutum 5 nap Anabaena flos-aquae Navicula seminulum Vízoldható vegyületek Selenastrum capricornutum 3 nap Scenedesmus subspicatus Chlorella vulgaris Tiszta vegyületek keveréke Selenastrum capricornutum Scenedesmus quadricauda 4 nap Humán és állati gyógyszerek Chlorella vulgaris Selenastrum capricornutum Microcystis aeruginosa 14 nap Page 47

48 Édesvízi algák az ökotoxikológiában Chlorella vulgaris mikroszkópos képe (Alga Resource Database) Pseudokirchneriella subcapitata mikroszkópos képe (Alga Resource Database) Page 48 Scenedesmus subspicatus mikroszkópos képe (Culture Collection of Autotrophic Organisms)

49 Page 49 Algateszt a teszt jellemzői Teszt típusa: Egy fajt alkalmazó, laboratóriumi, akut toxicitási teszt Tipikus alkalmazási területe: Vízben oldható vegyi anyagok; felszíni vizek, talajvizek, szennyvizek toxikológiai vizsgálata. Tesztorganizmus: egysejtű, édesvízi vagy tengeri algafajok Teszt végpontja: szaporodásgátlás Szükséges műszer: mikroszkóp vagy fotométer A teszt időtartalma: h (vagy hosszabb) A teszt során felhasznált tenyészet kora: A sejtszaporodás logaritmikus fázisában lévő tenyészet (kb. 6-8 napos) A teszt szabványosított formája: MSZ :1986 Veszélyes hulladékok vizsgálata. Algateszt (metanolos klorofill extrakció) MSZ :1989 Veszélyes hulladékok vizsgálata. A mérgezőképesség meghatározása algatenyészettel MSZ EN ISO 8692:2005 Vízminőség. Édesvízi alga növekedésgátlási tesztje egysejtű zöldalgafajokkal ISO 8692:2004 Water quality - Freshwater algal growth inhibition test with unicellular green algae OECD 201 Alga, Growth Inhibition Test (extrakció nélkül)

50 Békalencse A békalencsék a víz felszínén úszó egyszikű, lágyszárú vízinövények. Nagyon elterjedt, gyorsan szaporodó évelők. Méretük 2 12 mm lehet. Virágaik egyivarúak. Ritkán virágoznak, általában testük sarjadzásával szaporodnak. A békalencsék szaporodási sebessége eltérő, a Lemna nemzetség duplázódási ideje laboratóriumi körülmények között 0,35 2,8 nap. Az apró békalencse tömeges megjelenése eutrofizációt jelez. Lemna minor, Lemna gibba Page 50

51 Békalencseteszt - kivitelezés Tesztoldatok: 150 ml-es főzőpoharakba a hígítási sor minden tagjából kiveszünk 1 1 ml-t és a békalencsék fenntartásához használt tápoldattal kiegészítjük 125 ml-re. Kontroll minták A tesztoldatok tetejére darab kétlevelű, sérülésmentes zöld színű békalencsét helyezünk. Az összeállított mérőoldatokat C-os termosztátban inkubáljuk 7 napig megvilágítás mellett (8:16 órás sötét:világos ciklus, Daylite, lux). A tesztelési idő alatt minden nap ugyanabban az időpontban megszámoljuk a békalencsék leveleinek számát. Értékelés: levélkeszám, levelek területe, klorofilltartalom Page 51

52 Békalencseteszt a teszt jellemzői Teszt típusa: Egy fajt alkalmazó, laboratóriumi, krónikus növényi teszt Alkalmas: Vízben oldható vegyi anyagok; felszíni vizek, talajvizek, szennyvizek toxikológiai vizsgálata. Tesztorganizmus: Lemna minor, Lemna gibba Végpont: levélkeszám, levelek területe, klorofilltartalom Tesztelés időtartalma: 7 nap A teszt szabványosított formája: A magyar szabvány előkészületben. ISO 20079:2005 ISO Water quality -- Determination of the toxic effect of water constituents and waste water on duckweed (Lemna minor) - Duckweed growth inhibition test OECD :2002 Lemna species Growth inhibition test Page 52

53 Daphnia Forrás: itismdaphnia/ch2f1.htm A Daphnia, a vízibolha az egyik legelterjedtebb vízi tesztorganizmus. Két faja népszerű, mint ökotoxikológiai tesztorganizmus: a Daphnia magna és a Daphnia pulex. A Daphnia magna akár 5 mm-re is megnőhet, míg a D. pulex és C. dubia maximális mérete 2 3 mm. A Daphniák baktériumokat és élesztőt, algát is esznek. Vízminőség fontos faktor. Page 53

54 Daphnia A Daphniák szűznemzéssel szaporodnak, egy nőstény általában egyszerre 4 10 ivadéknak ad életet (ez időszak alatt a kikelt lárvák is nőstények). Az embriók fejlődése az anyaállat testében akár mikroszkóp nélkül is megfigyelhető. A fiatal nőstények négy napos koruktól már minden harmadik napon tovább szaporodnak, körülbelül 40 napos életükben akár 25 alkalommal. Daphnia születése Forrás: Page 54

55 Daphnia, akut teszt 10 db 24 órásnál nem idősebb újszülött. Az állatkákat 100 ml tesztoldatot tartalmazó 125 ml-es edénybe helyezzük. A tesztelendő vegyi anyag 5 különböző koncentrációját vizsgáljuk + a negatív kontroll és a referenciaanyag. (3 ismétlés ) Végpontként a mozgásképtelenséget illetve mozdulatlanságot használjuk. A mérést 24 óra és 48 óra elteltével végezzük. Az akut teszt során nem etetjük az állatokat. Optimális hőmérséklet 20 o C, a megvilágító fény intenzitása lux közötti érték lehet, 16 órás megvilágítást 8 óra sötétség követ. A ph: 7,0-8,6 között változhat, az oldott oxigén koncentrációja %. A 48 órás akut teszt jól alkalmazható tiszta vegyi anyagok veszélyességének felmérésére, vegyi anyagok keverékeire, szennyvizekre Page és 55más elfolyó vizekre, veszélyes hulladékokra.

56 Daphnia, krónikus teszt A 21 napos krónikus teszt: az állatok túlélésén kívül növekedésüket és szaporodásukat is vizsgálhatjuk. Az állatok etetéséről gondoskodni kell. Szakaszos vagy folytonos. A szakaszos kísérletet rendszeresen frissíteni kell. A folyamatos átfolyást biztosító kamra előnye, hogy hígítással állandó összetételű és minőségű közeget produkál, nem kell frissíteni. A krónikus teszt szintén 10 állatot alkalmaz, minimum 2 ismétlésben, 100 ml-es edényben 80 ml tesztoldattal, 21 napon keresztül. A végpontok a túlélés, a növekedés és a szaporodás. Page 56

57 Teszt típusa: Egy fajt alkalmazó, akut v. krónikus toxicitási teszt Tipikus alkalmazási területe: Vízben oldható vegyi anyagok; felszíni vizek, talajvizek, szennyvizek toxikológiai vizsgálata Tesztorganizmus neve: Daphnia magna, Daphnia pulex és Ceridodaphnia dubia Teszt végpontja: Immobilizáció, túlélés, növekedés, szaporodás A teszt időtartalma: 6 96 h A teszt során felhasznált tenyészet kora: 24 órás A teszt szabványosított formája: MSZ :1993 Települési szilárd hulladékok vizsgálata. Daphniateszt MSZ :1985 Veszélyes hulladékok vizsgálata. Daphniateszt MSZ EN ISO 6341:1998 Vízminőség. A mobilitásgátlás meghatározása Daphnia magna Strauson (Cladocera, Crustacea). Akut toxicitási teszt (ISO 6341:1996) MSZ ISO 10706:2002 Vízminőség. Anyagok hosszú távú mérgező hatásának meghatározása Daphnia magna Strauson (Cladocera, Crustacea) OECD 202 Daphnia species, acute Immobilisation Test, Part I the 24 h EC 50 acute immobilisation test, Part II the reproduction test (at least 14 days) Page 57 Daphniateszt a teszt jellemzői

58 Daphnia, szívritmus mérése Szívritmus mérése: új mérési végpont Érzékenyítés Kutatási eredmények: koffein, nikotin, Gyógyszerhatónyagok Daphnia szívritmus mérése Page 58

59 Haltesztek 1. Kiterjedten használják vízi ökoszisztémák érzékenységének jellemzésére, a vízi ökoszisztémát veszélyeztető vegyi anyagok hatásának vizsgálatára. Általánosan elterjedt a peszticidek és más ipari és mezőgazdasági vegyi anyagok hatásának mérésére, valamint szennyvizek, elfolyók és veszélyes hulladékok vizsgálatára. A legnépszerűbb édesvízi teszthalak a Pimephales promelas, a Lepomis macrochirus, az Ictalarus punctatus és az Oncorhynchus mykiss. Guppi: Poecilia reticulata Page 59 Zebradánió: Brachidanio rerio

60 Haltesztek 2. A tesztállatok: korban és méretben azonos egyedek. Fiatal állatok, melyek tömege fajtól függően 0,1-5,0 g lehet. A leghosszabb hal hosszmérete ne legyen nagyobb, mint a legrövidebb kétszerese. A tesztedény méretaránya adott. A tesztoldat legalább 150 mm mély legyen a 0,5 g-nál nagyobb tömegű halak számára, és legalább 50 mm mély a 0,5 g alattiak esetében. A teszt időtartama statikus teszt esetén 96 óra, hosszabb idejű teszteknél legalább 96 óránként frissítésre van szükség, vagy átfolyásos megoldásra. A víz hőmérséklete fajtól függően 12 o C-tól (O. mykiss) 25 o C-ig (P. promelas) változhat. A víz ph-ja a vízkeménységtől és a fajok igényétől függően 6,5 és 8,5 között változhat. A megvilágítás: a 16 órás megvilágítást perc átmenettel 8 órás sötétség kövesse. Az oldott oxigén koncentráció % között változhat. Végpontként a pusztulás vagy a mozgásképtelenség mérhető. Page 60

61 Teratogenitás vizsgálata békaembrióval (FETAX) A teratogenitási tesztek: az utódokban jelentkező fejlődési rendellenességeket vizsgálják, amely megmutatkozhat az embrió pusztulásában, gátolt növekedésében és fejlődésében, valamint fenotípusban is jelentkező fejlődési rendellenességekben. Az embriók érzékenyebbek, mint a kifejlett egyed. A természet általában többszörös védelemmel látja el az embriókat, de a békaembriók a szabadban fejlődnek. A Xenopus laevis békafaj az emberre is extrapolálható eredményt ad. Jól ismert kísérleti állatfaj, széles körben használják genetikai és fejlődésgenetikai vizsgálatokhoz. Laboratóriumi körülmények között jól tenyészthető és fenntartható, egyszerre sok utódot hoz létre, így a kísérletekhez és mérésekhez megfelelő számú egyed áll rendelkezésünkre. Page 61

62 Teratogenitás vizsgálata békaembrióval (FETAX) A FETAX - gyorsteszt. Segítségével veszélyes hulladékok valamint tiszta és keverék vegyi anyagok teratogén hatása Mindez a metanotróf baktériumban: tesztelhető. Ökotoxicitás pontos előrejelzésére is alkalmas, hiszen a gyanúsított anyagok már sokkal kisebb koncentrációban hatnak a békaembriókra, mint a felnőtt, kifejlett egyedekre. A FETAX módszert a teratogenitás szűrésére és kizárására lehet a legjobban használni, negatív eredmény esetén. docs/fetax2000/fetax.jpg Page 62

63 A tesztedény egy nagyméretű akvárium a tenyésztésre szánt felnőttek számára, legalább 30 cm magas, liter térfogatú, buborékoltató levegőztetéssel. Egy Mindez a metanotróf baktériumban: 40x40 cm-es akváriumban 4-6 egyed élhet. Page 63 Teratogenitás vizsgálata békaembrióval (FETAX) - a teszt kivitelezése Minimum 2 éves felnőtt hímekre és 3 éves nőstényekre van szükség. A felnőtt hím 7,5-10 cm hosszú, a nőstény cm hosszú. Az embriókat Petri-csészében tartjuk és a tesztelést is abban végezzük. 10 ml tesztelegyben 25 embriót helyezünk a vizsgálathoz. Az embriók a tesztelendő vegyi anyagnak állandóan, végig a teszt alatt ki vannak téve. A tesztelendő anyagot naponta ismételten alkalmazzuk. A teszt időtartama 96 óra. A koncentrációk száma 5, az ismétléseké legalább 2. A tesztközeg hőmérséklete a felnőtteknél átlagosan 23 o C, az embrióknál 24 O C. 12 órás megvilágítást 12 órás sötétség követ. A végpont az akut tesztnél a pusztulás, a szubakut vizsgálatnál a teratogenitás.

64 Teratogenitás vizsgálata békaembrióval (FETAX) - alkalmazások Ammónium-perklorát hatása (Oklahoma State University, 2008) Időtartam: 4 nap Mindez a metanotróf baktériumban: Végpont: növekedés, fejlődési rendellenességek 1 mg/l fejlődési rendellenesség 2000 mg/l 50 % reproduktivitás csökkenés Page 64 Areas/Environmental- Restoration/Risk-Assessment/ER- 1236

65 Árvaszúnyoglárva teszt Árvaszúnyog lárva Chironomus riparius Az árvaszúnyogok (Chironomidae) közeli rokonai a szúnyogoknak. Hosszúlábú állatok, magaspúpú, csuklyaalakúan előrenyúlt torrészlettel és karcsú lábakkal. A rovarok osztályán belül található Chironomidae családban található a legtöbb és ökológiai szempontból legfontosabb faj. A világszerte elterjedt árvaszúnyog a vízi táplálékláncban kiemelkedő szerepet játszik, mivel számos gerinces és gerinctelen állatnak fontos táplálékforrásként szolgál. Page 65 C. riparius hím imágó

66 Árvaszúnyoglárva teljes életciklus teszt Az árvaszúnyogok életszakaszai Az árvaszúnyog teszt előnye, hogy a tesztorganizmusok könnyen kezelhetők és fenntarthatók, viszonylag rövid életciklussal (3-4 hét) rendelkeznek, ivaros szaporodásuk miatt vegyületek endokrin rendszer károsító hatása vizsgálható. A gerinctelen állatok közül a rovarok endokrin rendszere ismert a legjobban, a két nem egyedei könnyen megkülönböztethetők egymástól. Az FLC teszt robosztus, populáció-releváns végpontokat állít fel, amik használhatók a mezőgazdaságban alkalmazott vegyszerek kockázatfelmérése során. Page 66

67 Page 67 Árvaszúnyoglárva teljes életciklus teszt Különböző expozíciós útvonalak vizsgálhatók; mind a szennyezett vizek, mind a szennyezett üledékek tesztorganizmusokra gyakorolt hosszútávú hatása tanulmányozható. Az FLC teszt nem ér véget az imágó bábból való kikelésével, hanem azok (szülői generáció, P) összegyűjtése és tenyész-ketrecbe engedése után a következő utód generáció (F1) egyedei révén vizsgálja a szaporodási képességet, a termékenységet. Azokat a tojásokat, amikből a későbbi utód generáció alakul ki ugyanolyan szennyezett víz-üledék rendszerben tartják fejlődésük során, mint a szülői generációt. Két generációt ölel föl (P és F1), az alábbi plusz információkat szolgáltatva ezzel: másodgenerációs végpontok (az akkumuláció, továbbörökített hatások, stb eredményeként érzékenyebb generáció) reprodukciós képesség, termékenység felmérése.

68 Page 68 Microbiotesztek Környezeti minták ökotoxicitásának vizsgálata: törzstenyészet fenntartása. Nehézkes és időigényes feladat: az állománynak ugyanis ellenőrzött és állandó érzékenységűnek kell lennie. A tenyészet fenntartása kiküszöbölhető tartósított tesztszervezetek felhasználásával, ún. mikrobiotesztek alkalmazásával. A Ghenti Egyetemen a LABRAP (Laboratory for Biological Research in Aquatic Pollution) kifejlesztett toxkitek. A tesztek közös jellemvonása, hogy a tesztszervezeteket immobilizált vagy alvó formában lehet tárolni, életképességüket fél-egy évig megőrzik, tesztszervezettől függően. Ezeket meghatározott körülmények közé helyezve kikeltethetők, a teszt gyorsan, alacsony költség- és időráfordítással elvégezhető.

69 REACH OECD tesztek REACH: Registration, Evaluation, Authorization and Restriction of Chemicals EU-ban júniusától él, és júniusában hatályba lépett a vegyi anyagok bejelentését, értékelését, korlátozását és engedélyezését szabályozó rendelet. A vegyi anyagok gyártásából és használatából adódó kockázatokat egy komplex rendszerben kell menedzselni. A REACH feladata, hogy minden évi 1 tonna fölött gyártott, importált vagy használt, kereskedelmi forgalomba hozott vegyi anyagot regisztráljon Európában, felmérje ezek kockázatát és az eredmény birtokában osztályozza és címkézze a vegyi anyagokat és ha szükséges kockázatcsökkentési intézkedést, pl. korlátozást vagy tiltást rendeljen el. REACH rendelet végrehajtója és közreműködője az ECHA Organization for Economic Cooperation and Development (OECD) : Guidelines for the Testing of Chemicals RAC bizottság Page 69

70 OECD tesztek OECD guidelines for testing chemicals Organization for Economic Cooperation and Development (OECD) : Guidelines for the Testing of Chemicals _1_1_1_1,00.html Vegyi anyagok hatásának tesztelése REACH rendelet Page 70

71 OECD tesztek, irányelvek A REACH rendelet értelmében alkalmazandó ökotoxicitási tesztek: a BIZOTTSÁG 440/2008/EK RENDELETE (2008. május 30.) a vegyi anyagok regisztrálásáról, értékeléséről, engedélyezéséről és korlátozásáról (REACH) szóló 1907/2006/EK európai parlamenti és a tanácsi rendelet értelmében alkalmazandó módszerek: C.1. Akut toxicitás hal esetében C.2. Daphnia-fajok akut immobilizációs vizsgálata C.3. Alganövekedés-gátlási vizsgálat C.4. A gyors biológiai lebonthatóság meghatározása II. Rész. DOC (oldott szerves szén) csökkenésének vizsgálata (C.4-a. Módszer) III. Rész. Módosított OECD-vizsgálat (DOC-csökkenés) (C.4-b. Módszer) IV. Rész. CO 2 -fejlődés-vizsgálat (C.4-c. Módszer) V. Rész. Manometrikus respirometriás mérés (C.4-d. Módszer) VI. Rész. Zártpalack-módszer (C.4-e. Módszer) VII. Rész. MITI-vizsgálat (C.4-f. Módszer) C.5. Lebomlás biokémiai oxigénigény C.6. Lebomlás kémiai oxigénigény C.7. Lebomlás abiotikus lebomlás: hidrolízis a ph függvényében Page 71

72 OECD tesztek, irányelvek 2. C.8. Toxicitás földigilisztákra C.9. Biológiai lebomlás Zahn Wellens vizsgálat C.10. Biológiai lebomlás eleveniszap-szimulációs vizsgálat C.11. Biológiai lebomlás eleveniszap-légzésgátlási vizsgálat C.12. Biológiai lebomlás módosított SCAS-vizsgálat C.13. Biokoncentráció vizsgálata: átfolyásos hal vizsgálat C.14. Halivadékok növekedési vizsgálata C.15. Rövid távú toxicitási vizsgálat halembriókkal és hallárvákkal C.16. Háziméh akut orális toxicitás-vizsgálat C.17. Háziméh akut kontakt toxicitás-vizsgálat C.18. Kémiai anyagok talajon történő adszorpciójának vizsgálata egyensúlyi rendszerben C.19. Adszorpciós együttható becslése talajon és szennyvíziszapon nagyhatékonyságú folyadékkromatográfiával (HPLC) C.20. Daphnia magnán végzett reprodukciós vizsgálat C.21. Talajlakó mikroorganizmusok: nitrogén-átalakítási vizsgálat C.22. Talajlakó mikroorganizmusok: szénátalakítási vizsgálat C.23. Aerob és anaerob átalakítás a talajban C.24. Aerob és anaerob átalakítás vízi üledékrendszerekben Page 72

73 TÖBB FAJT ALKALMAZÓ TESZTEK

74 A környezettoxikológia fő funkciói A vegyi anyag kölcsönhatásának leírása a környezettel A hatás helye, receptor Fiziológia és viselkedés Közösségi paraméterek Vegyi anyag bekerülése Ökoszisztémára gyakorolt hatások Biotranszformáció A vegyi anyag sorsának és transzportjának leírása Biokémiai paraméterek Populációs paraméterek A vegyi anyag hatásainak leírása és jellemzése a környezettel Page 74

75 Több fajt alkalmazó ökotoxikológiai tesztek Több fajt alkalmazó tesztek (Callow, 1993) A bioteszt leírása Két baktérium törzs kompetíciós tesztje. 5 napos teszt Mikrobiális prédapredátor teszt. Időtartam: 3-5 hét. Mikrokozmosz tesztek. Időtartam: 3-10 hét Mezokozmosz tesztek Időtartam: 5-6 hónap + Szabadföldi vizsgálatok Vizsgált tulajdonság a kompetíció eredménye Préda, predátor egyedszáma Egyedszám, fajössztétel, légzés, heterotrof aktivitás, Egyedszám, fajösszetétel, anyagcsere körforgalmak, Page 75

76 Definíciók: mikrokozmosz, mezokozmosz Mikrokozmosz: kisméretű, sokfajú ökológiai (laboratóriumi) tesztrendszer, melynek felhasználási célja, ökotoxikológiai tesztelés, biodegradáció és bioakkumuláció vizsgálata. A mikrokozmoszban vizsgálhatóak a fajok közötti és a közösségen belüli kölcsönhatások, valamint a biota kölcsönhatása az abiotikus tényezőkkel. Eltérőek lehetnek térfogatukat, méretüket vagy bonyolultságukat tekintve. Mezokozmosz: a valóságos ökoszisztémát modellező mesterséges rendszer. A mezokozmoszokban minden trófikus szint képviselve van, komplexebb, mint a mikrokozmosz, ezért környezeti realitása nagy, a mezokozmoszban mért eredmények közvetlenül felhasználhatók az ökoszisztéma jellemzésére, az ökoszisztémával kapcsolatos döntésekben. A mezokozmoszt általában a szabadban alakítják ki, gyakran a természetes ökoszisztéma izolált és kontrollált részeként. Page 76

77 Definíciók: trófikus szint, szabadföldi vizsgálatok Trófikus szintek: a táplálékláncban egymás fölött elhelyezkedő szintek: termelők a növények, elsődleges fogyasztók a növényevő állatok, ezeket fogyasztók a ragadozók. Az elpusztult élőlények (holt szerves anyag) ismételt felhasználhatóságát a detritusz biztosítja biodegradációval és mineralizációval. Szabadföldi vizsgálatok: az ökoszisztéma vizsgálatának olyan szintje, ami nem modellrendszert, vagy mesterséges rendszert alkalmaz, amelyből extrapolálni kellene a teljes méretű ökoszisztémára, hanem közvetlenül vizsgálja az ökoszisztémát természetes viszonyok között. Alkalmazható ökológiai vagy ökotoxikológiai vizsgálatként, vagy félüzemi léptékű kísérleti technológiaként. Page 77

78 MIKROKOZMOSZ

79 Mikrokozmosz Vízi mikrokozmosz Standardizált vízi mikrokozmosz Rázatott lombikos mikrokozmosz Tavi mikrokozmosz Folyami mikrokozmosz Szennyvíz tisztító mikrokozmosz Szárazföldi mikrokozmosz Gyökér mikrokozmosz Talajmag mikrokozmosz Talajjal töltött edény Talajjal töltött oszlop Talaj mikrokamra Szárazföldi mikrokozmosz rendszer Page 79 Gruiz Katalin - Könyvbemutató NOAA's National Centers for Coastal Ocean Science Science Serving Coastal Communities The New Jersey Water Resources Research Institute

80 SAM - Standardized Aquatic Microcosm = szabványosított vízi mikrokozmosz 64 nap: 1 hét előkészítés és akklimatizálás a beoltás algákkal négy nap elteltével makrogerinctelenek 7 nap elteltével a vizsgálandó vegyi anyag. A tesztelendő anyagot ezután hetente vagy kéthetente ismételten adagolják, a mintavételeket követően. Mintavétel kéthetente: oldott tápanyagok mennyisége, vízkeménység, mesterséges ökoszisztéma egyedszámait és fajeloszlását. Pontosan előírások: a mikrokozmoszba helyezendő fajok típusa, száma. Az algák 10 fajból 103 darabot tesznek a szabványos méretű tesztedénybe induláskor, a többi állatfajt a 4. napon helyezik a rendszerbe. Daphnia magna, Hyalella azteca, t Cypridopsis (kagylósrák), Hypotrichs (állati egysejtű=protozoa) és Philodina (kerekesféreg) fajok. Egyedszámaik a fenti sorrendben: 16, 12, 6/mikrokozmosz, 0,1 és 0,03/ml. Page 80

81 SAM - Standardized Aquatic Microcosm = szabványosított vízi mikrokozmosz A teszt: 4 literes üvegedények, legalább 12 cm-es szájjal ml tesztközeg. A vizsgált koncentrációk száma 4, az ismétléseké 6. Inkubátorban vagy szabályozott hőmérsékletű szobában dolgoznak, o C között. Meleg fehér fénnyel világítják meg. 12 órás megvilágítást 12 órás sötétség követ. A vizes fázis mellé mesterséges üledéket tesznek, melyet kvarchomokból (200g), őrölt kitinből (0,5 g) és cellulózporból (0,5 g) állítanak össze. Ebből 201 g-ot adnak minden tesztedénybe. A ph: 7,0. Végpont: algaszám, gerinctelen fajeloszlás, ph, oldott oxigénkoncentráció és tápanyagszint. Értékelés: Többváltozós statisztikai módszerekkel. Page 81

82 Kevert vízi mikrokozmosz (MFC) Homogén rendszerben, viszonylag kis térfogatban (1 liter) vizsgál. (Mixed Flask Culture) 6 hetet szánnak a vízi közösség kialakulására, ezt az időszakot hét vizsgálati szakasz követi. A beoltásához: egy természetes eredetű törzstenyészet. Ennek a törzstenyészetnek az előállítása 6 hónap alatt történik megadott módon, természetes eredetű közösségből indulva. Megadják, hogy a törzstenyészetnek milyen típusú és számú organizmust kell tartalmaznia: zöld algákat és kovamoszatokat, legalább egy fonalas zöld algát, legalább egy nitrogénkötő kék algát, protozoákat és makrogerincteleneket. A törzstenyészettel hetenként oltják a kísérleti mikrokozmoszt. Page 82

83 Kevert vízi mikrokozmosz Az 1 literes tesztedény: 900 ml Taub-féle tesztoldat és 50 ml savval mosott homok. 4 vizsgálati edényt használnak, 5-5 ismétléssel. 20 o C-on, 12 órás periódusokban megvilágítás. Végpont: oldott oxigéntartalom, algasűrűség, mikrobaszám, légzésaktivitás, biomasszaprodukció és a protozoa populáció összetétele. Értékelés: Többváltozós statisztikai módszerekkel. Az eljárás ellentmondása: az inokulum céljára létrehozott törzstenyészet viszonylag nagy méret törzsfenntartás körülményei miatt kialakuló összetett közösség a vizsgálat során nagymértékben redukálódhat (tesztedény kis méret, limitált fizikai-kémiai komplexitás). Page 83

84 FIFRA - szabadföldi vízi mikrokozmosz Eredetileg peszticidek engedélyezéséhez (1991) A mikrokozmosz és a mezokozmosz keveréke: 6 m 3. Mód van vízi növények és halak betelepítésére és tesztelésére is, ezzel a vizsgálatba bevont trófikus szintek száma is nő. További előnye, hogy párhuzamosok és ismétlések is végezhetőek. Az adatértékelés : a szabadtéri kísérleti edények kevésbé kontrollálhatóak (az időjárás és a környezet behatások). Szinte megoldhatatlan a különböző évszakokban végzett kísérletek azonos hőmérsékleten tartása. (földbe süllyesztett tartályok) Organizmusok: fitoplankton, zooplankton makrogerinctelenek, köztük rovarok, vízi növények, halak. A halak alkalmazható mennyisége limitálva van 2 g/m 3 értékben. Page 84

85 FIFRA 2. A kísérleti edény szabad vízfelülete legalább 5 m 2 legyen, mélysége 1,25 m, térfogata 6 m 3. Halak nélküli rendszer esetén lehet kisebb méretű is. 6-8 hetes akklimatizálási vagy érlelési idő a vizsgálandó vegyi anyag adagolása előtt. A vizsgálandó anyag vízbe juttatása: spray formájában a felszínre, törzsoldatként feloldani, majd homogénen elkeverni, vagy talajhoz keverve iszap formájában adni a tesztrendszerbe. A tesztelendő anyagot a mikrokozmosz létrehozása után több alkalommal Page 85 adagolják, a problémához illő gyakorisággal.

86 FIFRA 3. A mikrokozmosz fizikai-kémiai paramétereit is kontrolláltan kell kialakítani. A hőmérséklettartás miatt a felszín alá süllyesztett, lapos fenekű tartályt alkalmaznak, a természetes forrásból származó üledéket legalább 5 cm vastagságban rétegezik a tartály aljára helyezett tálcákba. A víznek szennyezetlen, természetes tározóból vagy tóból kell származnia, olyanból, amely ökológiailag aktív. Mennyisége nem változhat a vizsgálat során nagy mértékben, maximum +/-10%-ot. Az időjárási viszonyokat folyamatosan kell követni és regisztrálni a kísérlet tartama alatt. Page 86

87 Talajmikrokozmoszok A talaj saját aktivitásainak mérése mikrokozmoszban Nitrogén anyagcsere vizsgálatok Talajenzimek aktivitásának vizsgálata A talaj teljes ATP tartalmának meghatározása Rezisztencia vizsgálatok: rezisztens fajok, adaptálódás Stabilizáció vizsgálata fémmel szennyezett talajokban Feltáródás vizsgálata fémmel szennyezett talajokban Kioldódás vizsgálata fémmel szennyezett talajokban Biodegradáció vizsgálata: biodegradációs tesztek, szénanyagcsere vizsgálatok: CO 2 -termelés és az O 2 -felvétel mérésére Page 87

88 Feltáródási mikrokozmosz Aktív talajba kerülő toxikus fémtartalmú hulladék, kőzet, ásvány, üledék, stb. viszonylag gyors feltáródásnak van kitéve, hiszen az aktív talajban a mállási folyamatok gyorsak, a ph- és redoxviszonyok, a biota hatása nagyban elősegíti azokat. A feltáródási kísérletek: 5 literes edényekben. A feltáródás szempontjából vizsgált, potenciális talaj szennyezőanyaggal és a referencia talajjal 40, 20, 10 és 5 %-os keverékeket készítünk. A céltól és a folyamat sebességétől függően hetenként vagy havonta mintát veszünk és komplex fizikai-kémiai-biológiai-ökotoxikológiai tesztelésnek vetjük alá. Az eredmények időbeni változását értékeljük. Page 88

89 Talajmikrokozmosz fémkioldás vizsgálata A fémek mobilizálódása mind a kockázat (talajvízre), mind pedig a fémek kioldással történő remediációja során fontos folyamat. Ennek vizsgálatát szolgálják a szakaszos, vagy folytonos kioldást modellező mikrokozmosz kísérletek. Szerves v. szervetlen savakkal kioldás (fermentlé) Egylépcsős, szakaszos fémkioldási eljárás rázatott Erlenmeyer lombik Többlépcsős, szakaszos kioldási eljárás - rázatott Erlenmeyer lombik Folyamatos fémkioldás töltött oszlop v. cserép Mérés: ph, redoxpotenciál, fémtartalom Page 89

90 Talajmikrokozmoszok biodegradáció követésére és jellemzésére Statikus és dinamikus rendszerek Page 90

91 Talajlégzés mérés átlevegőztetett rendszerben Termelődött CO 2 mennyiségének meghatározása: elnyeletés NaOH-ban mérés: sav-bázis titrálással, sósavval BME ABÉT-n kifejlesztett rendszer 91 Page 91

92 CO2[%] CO2 [%] Szénhidrogének biodegradációjának jellemzése és követése talajlégzés mérésével talajmikrokozmoszban CO2 [%] CO2 [%] 0,5 0,45 0,4 0,35 0,3 0,25 0,2 Kontroll talaj Dízelolaj, folyamatos levegőztetés Dízelolaj, napi fél órás levegőztetés 0,45 0,4 0,35 0,3 0,25 0,2 0,15 Kontroll talaj Nyersolaj, ppm Nyersolaj, ppm Nyersolaj, ppm 0,15 0,1 0,1 0, idő [nap] 0, idő [nap] 0,45 0,35 0,25 0,15 0,05 Page 92 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 Kontroll talaj Dízelolaj Nyersolaj idő [nap] 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 Kontroll talaj Dízelolaj, 1 hét adaptáció Dízelolaj, 6 hét adaptáció idő [nap]

93 Biodegradáció jellemzése statikus rendszerben Talajlégzés mérésére zárt palack tesztben 50 p [hpa] kontroll dízel friss dízel régi pakura friss pakura régi Page idő [min]

94 Page 94 A mikrokozmosz alkalmazási területei Mikrokozmosz kísérletek alkalmazási területei: Ex situ és in situ talajtisztítási biotechnológiák modellezése, Szerves szennyezőanyagok mikrobiológiai működés hatására bekövetkező degradációja, a befolyásoló paraméterek, a toxicitás változása a remediáció során, A hozzáférhetőséget segítő adalékok, a levegőztetés, a hőmérséklet, a tápanyagadagolás (N- és P-forrás) hatása, Talajtípusok: mennyiben befolyásolják a szennyezőanyag a hozzáférhetőségét, a mikroflóra aktivitását, és ezek növelhetőségét, A már adaptálódott mikroflóra működése vagy előzetesen felszaporított mikróbákkal valamint kereskedelemben forgalmazott mikróba-keverékekkel történő beoltás hatása, A technológiai paraméterek változtatásával a különböző technológiák összehasonlíthatók.

95 Page 95 A mikrokozmosz alkalmazási területei Mikrokozmosz tesztekkel kísérletekkel eldönthető: milyen összetételű és hatású (toxikus, mutagén, stb.) szennyeződéssel van dolgunk, biodegradálható-e a szennyezőanyag, milyen a megoszlása a talaj egyes fázisai között, fizikai, kémiai vagy biológiai remediációt alkalmazzunk-e, mennyire kockázatos a szennyezőanyag mobilizálódása, alkalmazható-e in situ remediáció, mekkora ennek a kockázata, anaerob vagy aerob technológiát alkalmazzunk-e, milyen organizmusok segítségével folytassuk a remediációt (mikroorganizmus, növény),

96 A mikrokozmosz alkalmazási területei Mikrokozmosz tesztekkel kísérletekkel eldönthető: milyen technológiai paramétereket alkalmazzunk a technológia során, mobilizáción vagy immobilizáción alapuljon-e a technológia, szükségesek-e tápanyagok, adalékanyagok és hozzáférhetőség-növelő szerek, szükséges-e mikrobiológiai oltóanyag, serkentőanyag, milyen lesz a technológia idő- és költségszükséglete, milyen paraméterek monitorozása szükséges a technológia alkalmazása közben és után? Page 96

97 MEZOKOZMOSZ

98 Mezokozmosz Jellemzői Átmenet a laboratóriumi mikrokozmosz és a szabadföldi vizsgálatok között Szabadföldön létrehozott mesterséges rendszerek Vizsgált kemikáliával szennyezik követik az ökológiai változásokat nyomon Page 98

99 Mezokozmosz Jellemzői Minden trófikus szint képviselve van Komplexebb, mint a mikrokozmosz környezeti realitása nagy Mért eredményei közvetlenül felhasználhatók az ökoszisztéma jellemzésére Gyakran a természetes ökoszisztéma izolált és kontrollált részeként Természetes behatások érik (a csapadék, a sugárzások, a napfény és az atmoszférából leülepedő anyagok) Page 99

100 Mezokozmosz A mezokozmoszban folyhat megfigyelés vagy kísérlet. Alkalmazzák: 1. ökológiai kutatásokra, 2. ökotoxikológiai vizsgálatokra és 3. biodegradáción vagy fitoremediáción alapuló ökológiai technológiaként. Édesvízi folyamok mesterséges kialakítására szabadtéri édesvízi mezokozmoszt alkalmazhatunk. Talaj és szennyezett talaj vizsgálatára talajból kiemelt zavartalan mintát vagy egy terület elhatárolt részét használják. Das Helmholtz-Zentrum für Umweltforschung (UFZ) -Mesterséges folyam -Makrozobentosz tanulmányozása -20 m, 1000 l, 20 párhuzamos -Folyamatos működés -Zárt vízrendszer Page 100

101 Mezokozmosz mesterséges tó, édesvízi folyam Leggyakoribb megoldásai a következők: a mesterséges édesvízi folyam, általános édesvíz, mesterséges mocsár, szimulált mezőgazdasági víztározó, mesterséges kert, mesterséges erdő, stb. Page 101

102 Mezokozmosz tengeri ökoszisztéma Mezokozmosz Norvégia (tengerkutatás) A légköri CO 2 -szint emelkedés közvetlen hatása a tengeri ökoszisztémákra Page 102

103 Mezokozmosz tengeri ökoszisztéma Mezokozmosz Norvégia (tengerkutatás) Page 103

104 Épített ökoszisztéma felhasználása szennyvizek, szennyezett felszín alatti vagy élővizek tisztítására. Aktív mezokozmosz, mely jól tűri a szennyezettségből adódó körülményeket, azok között működni képes élőközösséget hordoz (mikroorganizmusok, állatok, növények). A növények képesek felhasználni a szerves anyagok mineralizációjával nagy feleslegben előállott szervetlen anyagokat (nincs eutrofizáció (nitrát és foszfát élővízbe kerülése) és anaerobitás (oxigénhiány)). Mezokozmosz élőgépes szennyvíztisztítás ORGANICA ZRT Page 104

105 Mikrokozmosz és mezokozmosz tesztek jellemzői Méret: 0,1 litertől literig Történelmük van: az ökoszisztémákhoz hasonlóan időben irreverzibilisek. Trofikus szintek: trofikus szerkezete van, egyszerűtől a valóságosig Evolúciós események szintere: pl. rezisztencia fellépése Új metabolikus útvonalak fejlődhetnek ki: pl. xenobiotikumok biodegradációjára Redukált komplexitás jellemzi a reális környezethez képest (pl. fajok száma) Dinamika: a kis térfogatba kényszerítés megváltoztatja a dinamikát. Ezeket a hatásokat meg kell különböztetni a toxikus hatásoktól Heterogenitás: természetes ökoszisztémákban a hely és idő szerinti heterogenitás következménye a fajok változatossága és gazdagsága. A mesterséges ökoszisztémáknál viszont törekszünk a homogenitásra, hogy megőrizzük a statisztikai értékelhetőséget. Page 105

106 Szabadföldi vizsgálatok