Közeli infravörös spektroszkópia és mikroszkópia

Átírás

1 Közeli infravörös spektroszkópia és mikroszkópia black box grey box (N)IR elfogadtatása Gergely Szilveszter Budapesti Műszaki és Gazdaságtudományi Egyetem Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudományi Tanszék Optikai spektroszkópia október 29.

2 Newton kísérletei I. a fehéren túl Már korábban más is megcsinálta, de ő le is írta... (1704) 2

3 Newton kísérletei II. a fehéren túl (1704) 3

4 Herschel kísérletei a vörös alatt (no meg az Uránusz és a marslakók...) Uránusz felfedezése: márc. 13-án háza udvaráról február 11. 4

5 IR hő energia (egy régi trükk mai kivitelben) IR sugárzással a hőkövető rakéták ellen A kis csillagok melegebbek a hajtóműnél. An AC-130U gunship fires flares to emit masses of infrared and confuse heat seeking missiles. 5

6 Rezgések és hullámok (USA vs. Magyarország) (Tacoma Narrows Bridge, Gallopin Gertie, november 7.) BME: Schönherz Qpa vs. 4-6 villamosok. (egy budapesti villamos, sárga szöcske, 2011) 6

7 A molekulák rezgései deformációs rezgés változás a kötésszögben szimm. vegyértékrezgés változás a kötéshosszban aszimm. vegyértékrezgés változás a kötéshosszban A spektrum a molekuláris állapotváltozások összessége: kémiai és fizikai ujjlenyomat. 7

8 Egy gyors példa a (M)IR-re NIR : IR 1 : 100 8

9 És egy másik gyors példa NIR-re OD 3 2 víz (H 2 O) 10 mm 4 mm 1 mm 1 OD Wavelength (nm) etanol (CH 3 CH 2 OH) 10 mm 4 mm 1 mm OD bor 10 mm 4 mm 1 mm Wavelength (nm) Wavelength (nm) Gergely S., Farkas K., Forgács A., Salgó A.: Quantitative and qualitative differentiations of alcoholic beverages by near infrared spectroscopy. 9 In Near Infrared Spectroscopy: Proceedings of the 11th International Conference, Ed by Davies A.M.C., Garrido-Varo A., NIR Publications, Chichester, pp (2004).

10 Jellemző NIR elnyelési sávok Minden, ami nekünk kell: víz, fehérjék, lipidek, szénhidrátok. Murray I.: Scattered information: philosophy and practice of near infrared spectroscopy. In Near Infrared Spectroscopy: Proceedings of the 11th International Conference, Ed by Davies A.M.C., Garrido-Varo A., NIR Publications, Chichester, pp (2004). 10

11 Puttonyszám meghatározása? dry wines medium dry wines medium sweet wines sweet wines aszú wines Frequency < 11 Invert sugar (g/l)

12 Bor PQS után PLS I factor 7 Frequency < R SEC MSECV Total alcohol (% V/V) Frequency < factor R SEC MSECV Total extract (g/l) 12

13 Bor PQS után PLS II factor 7 Frequency < R SEC MSECV Invert sugar (g/l) Frequency < factor R SEC MSECV Sugar-free extract (g/l) 13

14 Tankpezsgő: technológia nyomon követése. brut and extra dry champagne dry champagne medium dry champagne sweet champagne Frequency Reducing sugar (g/l) 14

15 Pezsgő PQS után PLS 6 5 factor 7 Frequency Total alcohol (% V/V) R SEC MSECV (refilling 3 ) Frequency Reducing sugar (g/l) factor R SEC MSECV (refilling 3 ) 15

16 Töményebb szeszek PQS liqueurs alcohol content low vermouths high extract content low high 16

17 Borban az igazság ez nem a reklám helye OBI (hatóság), Törley (ipar),... konferencia poszter (NIR ápr ) Törley-díj (diplomaátadás júl. 18.) 17

18 Borban az igazság ez nem a reklám helye... Villány (gazda bolt)

19 Borban az igazság de hogy jön ez ide? gyógyszer = bor? 19

20 Borban az igazság fiziológiai és fermentációs folyamatok Szőlőszem, mint bioreaktor? (PhD) A hordóról már inkább elhisszük... FOSS: Wine segment brochure. P/N , Issue 1 GB, Jan

21 Borban az igazság léptéknövelés... a rozsdamentes tartályokról nem is beszélve. bor = gyógyszer FOSS: Wine segment brochure. P/N , Issue 1 GB, Jan

22 Borban az igazság technológia, mintavétel, analitika : : bor = gyógyszer FOSS: Wine segment brochure. P/N , Issue 1 GB, Jan

23 PAT (Process Analytical Technology) = a folyamat kézben tartása A PAT eszközei: hagyományos in-line érzékelők (ph, po 2, pco 2, T szondák) a folyamat monitorozó eszközeinek kibővítése egyéb real-time technikákkal (in-/on-line NIR/Raman/IR, in-/on-line HPLC, stb.) Korszerű és gyors at-line mérések Korszerű adatgyűjtő rendszer (SCADA) Kemometriai (MVA) szoftverek (PCA, PLS stb.) 23

24 Hogyan mérjük? NIT és NIR NIT NIR *!!! RAJZ!!! Abs. vs. Scat. ~ nm kisebb hullámhossz nagyobb energia ~ nm nagyobb hullámhossz kisebb energia (*... UV, VIS, NIR, (M)IR, FIR,...) 24

25 Hogyan mérjük? diszperzió Belső standardok, ha elromolna. 25

26 Hogyan mérjük? FT ATR: pl. gyémánt (vizes old.- ok; sav/lúg; 5,7 t/mm 2 ). 26

27 PAT (Process Analytical Technology) = a folyamat kézben tartása A PAT eszközei: hagyományos in-line érzékelők (ph, po 2, pco 2, T szondák) a folyamat monitorozó eszközeinek kibővítése egyéb real-time technikákkal (in-/on-line NIR/Raman/IR, in-/on-line HPLC, stb.) Korszerű és gyors at-line mérések Korszerű adatgyűjtő rendszer (SCADA) Kemometriai (MVA) szoftverek (PCA, PLS stb.) 27

28 ...-line,...-line, de melyik? I. [...] These measurements can be: at-line: Measurement where the sample is removed, isolated from, and analyzed in close proximity to the process stream. on-line: Measurement where the sample is diverted from the manufacturing process, and may be returned to the process stream. in-line: Measurement where the sample is not removed from the process stream and can be invasive or noninvasive [...] 28

29 ...-line,...-line, de melyik? II. William Whitford W., Julien C.: Analytical Technology and PAT. BioProcess International January 2007,

30 Az in-/on-line eszköze a száloptika I. Igen, törhetnek. :( 30

31 Az in-/on-line eszköze a száloptika II. 31

32 Az in-/on-line eszköze a száloptika III. 32

33 Technológiába illeszthető (egyéb) eszközök I. Valósidejű: keverő dobon (fix t helyett adott minőség). Többcsatornás elrendezés. 33

34 Technológiába illeszthető (egyéb) eszközök II. 34

35 Mobil, hordozható (handheld) eszközök Pl. Los Angeles-i rendörség, futószőnyeg szeméttelep. NIR FT-IR Raman 35

36 Ha egyedül nem megy Áram drót nélkül... A NIR kesztyű összetevői: NIR oldható cukrok hangimpulzus keménység, Vis érettség (klorofil) potenciométer méret Lee K.A.: Review of applications of near infrared spectroscopy to food analysis. The NIR Spectrum 2(2), (2004) 36

37 Klasszikus API vs. biomolekulák 37

38 Kikkel termeltetünk? Tabletta 1-2 paraméter, de E. coli, CHO? E. coli emlőssejtek 38

39 Na akkor, modellezzünk... 39

40 A végső cél 40

41 Off-line-tól a real-time-ig 41

42 Fermentáció (E. coli) off-line nyomon követése: PQS módszer Ha megvan még a puttonyszám... 42

43 Fermentáció (E. coli) off-line nyomon követése: PQS módszer 43

44 Fermentáció (E. coli) off-line nyomon követése: PQS módszer 44

45 Fermentáció (E. coli) off-line nyomon követése: PQS módszer 45

46 Fermentáció (E. coli) off-line nyomon követése: PQS módszer 46

47 Fermentáció (E. coli) off-line nyomon követése: PQS módszer 47

48 Fermentáció (E. coli) off-line nyomon követése: PQS módszer 48

49 Fermentáció (E. coli) off-line nyomon követése: PQS módszer 49

50 Fermentáció (E. coli) off-line nyomon követése: PQS módszer 50

51 Fermentáció (E. coli) off-line nyomon követése: PQS módszer 51

52 A változékonyság leírása: PCA Méret (PC1) nagy (kapu) átlagos (ajtó) kicsi (asztal) Kulcs feje (PC2) kerek ovális sokszögű téglalap Szín (PC3) oxidált fém kék ciklámen sárga 52

53 PC2 vs. PC1 Kulcs feje (PC2) sokszögű téglalap kicsi (asztal) átlagos (ajtó) nagy (kapu) Méret (PC1) ovális kerek 53

54 PC2 vs. PC3 Kulcs feje (PC2) sokszögű téglalap oxidált fém kék ciklámen sárga Szín (PC3) ovális kerek 54

55 G E hatás vs. PCA I. Mert: bio. Gabona minták termesztési helyei Franciaország (Clermont-Ferrand) betakarítás éve: 2007 Magyarország (Martonvásár) betakarítás éve: 2005, 2006, 2007 Lengyelország (Dankow/Choryn) betakarítás éve: 2007 Egyesült Királyság( Bury St. Edmunds) betakarítás éve:

56 G E készülék G E hatás vs. PCA II. 56 évjárat fajta

57 Polimorf transzformációs vizsgálat: fénymikroszkópos felvételek Forma 1 Forma 2 Forma 3 Forma 4 Forma 5 Forma μm Forma 1 Forma 5 57

58 Polimorf transzformációs vizsgálat: in-line Raman-száloptika (PCA)

59 Fermentáció (E. coli) in-line nyomon követése: kevertetés, fizikai helyzet A = log (1/T) [l = 2 mm] A = log (1/T) [l = 2 mm] Wavelength (nm) Wavelength (nm) rpm 59

60 Fermentáció (E. coli) in-line nyomon követése: diszp. NIR-rel PCA, PLS 10 Habzásgátló, glükóz adagolása... Gly (g L -1 ) Time (hour) Ace (mmol L -1 ) Time (hour) 60

61 API meghatározása simítás hatása a derivált képzésére Az első és második deriváltak képzése a kezeletlen spektrumokból más-más beállításokkal történik: Diszperziós NIR esetén: 2, 4, 8, 12, 16, 20 nm-es (1, 3, 5, 7, 9, 11 pontos) kapu [ gap-segment derivált] FT-NIR esetén: 5, 9, 13, 19, 25, 37, 49, 149 pontos kapu [Savitzky-Golay derivált] 1. derivált log (1/R) [2 0 nm] 1. derivált log (1/R) [20 0 nm ] 0,0225 0,0175 0,0125 0,0075 0,0025-0,0025-0, ,1200 0,1000 0,0800 0,0600 0,0400 0,0200 0,0000-0, derivált 2 nm 1. derivált 20 nm NIR hullámhossz (nm) -0, hullámhossz (nm) 61 61

62 API meghatározása diszperziós vs. FT (pl. detektorok) NIR 0,0045 6,00E derivált 0,0025 0,0015 0,0005-0,0005-0,0015-0,0025-0, nm -0, derivált 4,00E derivált log (1/R) [5 pont] 0, derivált log (1/R) [2 0 nm] FT-NIR ,00E-05 0,00E+00-2,00E-05-4,00E-05-6,00E-05-8,00E-05 5 pont -1,00E-04-1,20E ,0700 3,00E derivált 2. derivált log (1/R) [49 pont] 2. derivált log (1/R) [20 0 nm] 0,0900 0,0500 0,0300 0,0100-0,0100-0,0300-0,0500-0,0700-0, nm hullám hossz (nm ) hullámhossz (nm ) hullám hossz (nm) derivált 2,00E-05 1,00E-05 0,00E+00-1,00E-05-2,00E pont -3,00E hullámhossz (nm ) 62

63 F a k t o r ,9 8 0,9 6 0,9 8 0,9 6 0,9 8 0,9 6 0,9 7 0,9 6 0,9 7 0,9 6 0,9 7 0,9 6 0,9 8 0,9 7 0,9 9 0,9 5 0,9 8 0,9 7 0,9 8 0,9 6 0,9 8 0,9 6 0,9 7 0,9 6 0,9 7 0, ,9 0,8 0,7 0,6 0, Élelmiszer botrányok: mert jobb az analitika + a híráramlás Faktor S D 1 _ 2 n m D 1 _ 4 n m D 1 _ 8 n m D 1 _ 1 2 n m D 1 _ 1 6 n m D 1 _ 2 0 n m D 2 _ 2 n m D 2 _ 4 n m D 2 _ 8 n m D 2 _ 1 2 n m D 2 _ 1 6 n m D 2 _ 2 0 n m 0,6 5 0,6 8 0,9 7 0,9 5 0,9 8 0,8 8 0,9 8 0,8 9 0,9 8 0,9 0,9 7 0,9 1 0,9 8 0,9 3 0,9 8 0,9 5 0,9 7 0,9 5 0,9 7 0,9 5 0,9 0 0,8 9 1,0 0 0,7 7 1,0 0 0,8 5 0,9 8 0,8 7 0,9 7 0,8 9 0,9 7 0,9 1 0,9 6 0, ,4 1 0,6 1 0,7 6 0,5 6 0,7 5 0,6 0 0,7 8 0,6 2 0,7 9 0,6 3 0,8 1 0,6 4 0,8 2 0,5 8 0,7 2 0,5 4 0,7 1 0,5 8 0,7 5 0,8 4 0,6 0,7 8 0,6 2 0,8 0 0,6 4 0,8 4 2,5 2 1,5 1 0,5 0 API meghatározása teljesítménymutatók (figure of merit) NIR FT-NIR S D 1 _ 2 n m D 1 _ 4 n m D 1 _ 8 n m D 1 _ 1 2 n m D 1 _ 1 6 n m D 1 _ 2 0 n m D 2 _ 2 n m D 2 _ 4 n m D 2 _ 8 n m D 2 _ 1 2 n m D 2 _ 1 6 n m D 2 _ 2 0 n m S D1_5pt D1_9pt D1_13pt D1_19pt D1_25pt D1_37pt D1_49pt D1_149pt D2_5pt D2_9pt D2_13pt D2_19pt D2_25pt D2_37pt D2_49pt D2_149pt 0,24 0,24 0,50 0,63 0,54 0,59 0,65 0,61 0,57 0,48 0,62 0,65 0,66 0,69 0,73 0,89 0,87 0,87 0,87 1,01 0,94 1,37 1,31 1,24 1,15 1,21 1,13 1,27 1,28 1,48 1,42 1,88 2,30 2, Kritikus - kontrollált példa: Down-kor 35 év alatt alap spektrum első derivált spektrum második derivált spektrum RMSE ( ) R 2

64 A feltárás lépései (IQ)Q = IQ 2 Identification azonosítás Ki vagy te? éles spektrális különbségek keresése korreláció, euklédeszi távolság stb. Qualification minősítés Hová tartozol? szubpopulációk definiálása finomabb eltérések alapján főkomponens analízis (PCA), Mahalanobis-távolság stb. Quantification mennyiségi meghatározás Mennyi az annyi? referencia paraméterekkel kalibrációk részleges legkisebb négyzetek (PLS) módszere stb. 64

65 Spektrumkönyvtár anyagazonosítás (NIR) censored nyers 18 termék, 27 tétel censored SNV censored MSC 65

66 Spektrumkönyvtár anyagazonosítás (analitikai IR) 10 / 10 vs. 100 / 10 + géprombolás. 65 anyag, 390 tétel 66

67 Spektrumkönyvtár anyagazonosítás (analitikai IR) Hatóanyagbeszállító: Kína, India (tetrakain). 65 termék, 390 tétel 67

68 Spektrális hiperkocka vs. tudomány Spektrális hiperkocka near-infrared AND imaging AND pharma kulcsszóra történő keresés ( ) Web of Science ScienceDirect Progresszív fejlődés közlemény (db) Web of Science ScienceDirect év De mi volt 1994 előtt? 68

69 Az eszközök fejlődése (hideg) háborúkon keresztül (II. világháború) Éjjellátók kezdete: vámpír egység (németek). WunderWaffe 1 - vampire vision: could be used by the snippers at night because of its infrared vision. 69

70 Az eszközök fejlődése (hideg) háborúkon keresztül (hideg háború) Harc a hadizsákmányért (USA vs. Szu.). Sok új USA / Szu. fegyver német alapokon 70

71 Az eszközök fejlődése (hideg) háborúkon keresztül (Korea, Vietnam) Még ma is megvásárolható az interneten. 71

72 Az eszközök fejlődése (hideg) háborúkon keresztül (pl. Irak) Mai cél: kisebb berendezés, jobb felbontás. DARPA: lásd még a robotkutyát is 72

73 Civil alkalmazások hideg/meleg I. Energiaosztályba sorolás: hol szökik a hő 73

74 Civil alkalmazások hideg/meleg II. Kutyalihegés = hőleadás. (Bőrén nincsenek pórusok.) A fej leghidegebb pontja: fülünk. (Égett ujj ) Melegvérű ember vs. hidegvérű gekkó vagy skorpió. 74

75 Civil alkalmazások hideg/meleg III. Törött középső ujj gyógyulása Szomato infra: + : gyulladás vagy több ér (daganat) - : lipóma 75

76 Egér a Marsról I. Itt már aktív: IR besugárzás, DE roncsolásmentes Sokszor csak a boncasztalon látjuk az Alzheimerkór állapotát. Korai észlelés és terápia: jobb esélyek. NIR kamera segít. Golde T.E., Bacskai B.J.: Amyloid deposits can be rapidly detected in the brains of living mice using a novel ligand and near-infrared fluorescence imaging. Nat. Biotechnol. 23(5), (2005) 76

77 Egér a Marsról II. Hintersteiner M. et al.: In vivo detection of amyloid-β deposits by near-infrared imaging using an oxazine-derivative probe. Nat. Biotechnol. 23(5), (2005) 77

78 Szexálás I. Tenyésztés szempontjából fontos, hogy mi van a bábban. Bábot megbontani nem lehet, mert akkor elpusztul Sumriddetchkajorn S., Chakkrit Kamtongdee C.: Optical penetration-based silkworm pupa gender sensor structure. Appl. Optics 51(4), (2012) 78

79 Szexálás II. Nézzünk bele a NIR segítségével a selyemhernyó bábjába! Sumriddetchkajorn S., Chakkrit Kamtongdee C.: Optical penetration-based silkworm pupa gender sensor structure. Appl. Optics 51(4), (2012) 79

80 Szexálás III. Lányoknál semmi extra de a fiúknak világít a farkuk. Sumriddetchkajorn S., Chakkrit Kamtongdee C.: Optical penetration-based silkworm pupa gender sensor structure. Appl. Optics 51(4), (2012) 80

81 Mikro/makroszkópos képalkotás I. Pár/tíz mikrométeres nagyságrendek(től) Látható kép: vizsgálandó terület megkeresése, majd (N)IR mérés Nem, vagy csak kis mintaelőkészítést igényel: kevesebb hiba Különböző mérési módok: heterogén minták könnyebb vizsgálata Meddig tart? Más megoldás lehet jó (bemozdult fénykép) egy pont több pont terület 81

82 Mikro/makroszkópos képalkotás II. pont kép 82

83 Mikro/makroszkópos képalkotás III. A 16 elemből álló detektorsor a mintát 100 µm 6,25 µm vagy 400 µm 25 µm blokkokban látja (NIR esetén, IR: 1,56 µm...) 10 lépés másodpercenként, avagy 170 spektrum egy másodperc alatt (16 cm mellet)

84 Mikro/makroszkópos képalkotás IV. FPA (Focal Plane Array) videotelefon fejlesztése (AT&T): 1969! 84

85 Mikro/makroszkópos képalkotás V. T (transzmisszió) 85

86 Mikro/makroszkópos képalkotás VI. E spekuláris reflexió R E diffúz reflexió gyengített teljes reflexió (ATR) R (reflexió) R mintafelszín mintafelszín mintafelszín 86

87 Mikro/makroszkópos képalkotás VII. 87

88 Mikro/makroszkópos képalkotás VIII. Cassegrain objektív elmozdulás (x,y) ATR kristály ÉS minta 31

89 Képalkotás tablettavizsgálatok Technológia nyomon követése I. bevonás bevonat (Opadry Pink): idő előrehaladtával erősödő jel 1390 nm-en korpusz: idő előrehaladtával gyengülő jel 2120 nm-en bevonás ideje Maurer L., Leuenberger H.: Terahertz pulsed imaging and near infrared imaging to monitor the coating process of pharmaceutical tablets. International Journal of Pharmaceutics 370(1-2), 8 16 (2009) 89

90 Képalkotás tablettavizsgálatok Technológia nyomon követése II. keverés Eredetiségvizsgálat Hamis Eredeti Pl. hamis Viagrában a kék színt patkányméreg adta. VIS NIR Gendrin C. et al.: Content uniformity of pharmaceutical solid dosage forms by near infrared hyperspectral imaging: A feasibility study. Talanta 73(4), (2007) Nem kell eltörni, a NIR belelát. (Megmarad a Gendrin C. et al.: bizonyíték.) Pharmaceutical applications of vibrational chemical imaging 90 and chemometrics: A review. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 48(3), (2008)

91 Eredetiségvizsgálat vs. imaging: makro (VIS) Edzőteremben izomnövelő helyett barkács cucc. Eredeti Hamis 91

92 Eredetiségvizsgálat vs. imaging: makro (NIR) Mátrixhatás. Eredeti Hamis Abs. PCA 92

93 Technológiai probléma vs. imaging Probléma a tabletta felületén: mi az oka? Spórolás miatt más alapanyag, bevonathiányt okozott. Képalkotás NIR tartományban: nincs roncsolás μm méretű mérési tartomány, 6,25 6,25 μm méretű képpontokkal pont, azaz összesen 4096 pont, pontonként 128 spektrum átlagolásával Átlagos abszorbancia értékek alapján színezett ábrák 93

94 Technológiai probléma vs. imaging: korrelációs térképek (2D és 3D) Hatóanyag R 2 =0,88-0,96 Filmbevonat (Opadry ) R 2 =0,41-0,54 94

95 Képes képtelenségek Szerkezet, összetétel megállapítása roncsolás nélkül. lószúnyog szárnya: 18,5 mm 4,5 mm = spektrum Anyagok azonosítása (vegyszer, lőpor) az ujjlenyomaton. ujjlenyomat: 20 mm 13,5 mm = spektrum 95

96 A (N)IR módszerek, technológiák előnyei Roncsolásmentes (fermentáció, anyagazonosítás, homogenitás, bevonat, hamisítás, visszáru, csomagolóanyag stb.) Gyors (jelsorozatok (másod)perces nagyságrendben képezhetők) Rengeteg rejtett információ megfejthető (adatbányászat, oknyomozások) Gyors visszacsatolás a technológiába, minőségellenőrzésbe, minőségbiztosításba FDA alternatív módszere Költséghatékony, nagy áteresztőképességű Tudásintenzív módszerek A nemtudás tudása a tudás kezdete... 96

97 Köszönetnyilvánítás Párta László 1, Ballagi András 1 Kiss Violetta 2, Finta Zoltán 2 Horgos József 3,4, Zelkó Romána 4 Jekő József 5, Csorvássy István 5 Lakatos László 6, Axel Rau 7 Izsó Eszter 8, Tieger Eszter 8, Lőrincz Áron 8, Kontsek Endre 8 1 Richter Gedeon Nyrt. 2 sanofi-aventis Zrt. 3 Hungaropharma Zrt. 4 SE Egyetemi Gyógyszertár, Gyógyszerügyi Szervezési Intézet 5 Nyíregyházi Főiskola, Kémia Intézeti Tanszék / Alkaloida Vegyészeti Gyár Zrt. 6 PER-FORM Hungária Kft., Analitikai Divízió 7 PerkinElmer, Rodgau 8 BME Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudományi Tanszék