DOKTORI ÉRTEKEZÉS. Szerves mikroszennyezők gázkromatográfiás-(tandem) tömegspektrometriás meghatározása környezeti vízmintákban. Írta: Helenkár András

DKTRI ÉRTEKEZÉS Szerves mikroszennyezők gázkromatográfiás-(tandem) tömegspektrometriás meghatározása környezeti vízmintákban Írta: Helenkár András Témavezető: Zsigrainé Dr. Vasanits Anikó Egyetemi adjunktus Eötvös Loránd Tudományegyetem Kémiai Intézet, Analitikai Kémiai Tanszék Környezettudományi Doktori Iskola Vezető: Dr. Kiss Ádám Környezetkémia program Vezető: Dr. Turányi Tamás Budapest 2011

Köszönetnyilvánítás Köszönetemet szeretném kifejezni mindazoknak, akik disszertációm elkészítésében segítségemre voltak: Zsigrainé Dr. Vasanits Anikó egyetemi adjunktusnak, témavezetőmnek, iránymutatásaiért, a kutatás elméleti és kísérleti részeiben, a publikációk és a jelen értekezés elkészítésében nyújtott önzetlen segítségéért és hasznos tanácsaiért, bátorításáért, valamint a sok szeretetért, amelyet a munkám során kaptam. Perlné Dr. Molnár Ibolya egyetemi tanárnak, a kutatásokban, a publikációk megírásában és a jelen értekezésben kapott hasznos tanácsokért, önzetlen segítségéért, bátorításáért, a mély szeretetéért, amelyben az évek során részesültem. Dr. Záray Gyula egyetemi tanárnak, az Analitikai Kémiai Tanszék egykori tanszékvezetőjének, hogy kutatómunkámat lehetővé tette és támogatta. A lehetőségért, hogy doktori tanulmányaimat elkezdhessem és befejezhessem a Környezettudományi Kooperációs Kutató Központ keretein belül. Valamint, hogy a tanulmányaim befejezése után tudományos segédmunkatársként az egyetem tanszékén dolgozhassam a kutatócsoportjában. Köszönet illeti Dr. Sebők Ágnes egykori-, Andrási Nóra és Dobor József doktorandusz társaimat, a mintavételezésben és a kísérletekben nyújtott segítségükért. Szeretném megköszöni azt az átható szeretetet, témavezetőimnek, kollégáimnak, egykori és jelenlegi doktorandusz társaimnak, amelyet a doktori tanulmányaim alatt kaptam. Köszönettel tartozom a Nemzeti Erőforrás Minisztériumnak, hogy a Magyar Köztársaság Deák Ferenc ösztöndíjasa lehettem. Hálával tartozom Gombár Mária és id. Helenkár András szeretett szüleimnek, akik odaadó szeretetére és támogatására a tanulmányaim alatt mindvégig számíthattam. -2-

Tartalomjegyzék 1. Bevezetés... 5 2. Rövidítések jegyzéke... 7 3. Irodalmi áttekintés... 9 3.1. Környezeti hatások... 9 3.2. Gyógyszerészeti- és higiéniás termékek eredete és sorsa a környezetben (PPCPs)... 10 3.3. Gyógyszerészeti termékek... 14 3.3.1. A nem-szteroid gyulladáscsökkentő és fájdalomcsillapító gyógyszerek... 15 3.3.1.1. Az NSAID vegyületek jellemzése... 15 3.3.1.2. Az ibuprofen, a naproxen, a ketoprofen és a diklofenak meghatározásának lehetőségei... 17 3.4. Sok összetevős rendszerek analízise... 24 4. Célkitűzés... 28 5. Kísérleti rész... 30 5.1. A kémszerek... 30 5.2. A minták... 31 5.3. Az alkalmazott eszközök... 34 5.3.1. A minták előkészítése... 34 5.3.2. Az alkalmazott gázkromatográfiás körülmények... 34 5.3.3. Az alkalmazott tömegspektrométer főbb jellemzői... 35 5.4. A kísérletek során használt módszerek... 35 5.4.1. A reagens oldatok... 35 5.4.2. A modell oldatok... 35 5.4.3. Származékká alakítás körülményei modell oldatok esetén... 36 5.4.4. A minták előkészítése Duna- és ivóvízminták esetén... 36 5.4.5. A lebegőanyag-tartalom gázkromatográfiás meghatározása... 38 5.4.6. A minták származékká alakítása és mérése... 38 6. Kísérleti eredmények értékelése... 40 6.1. Külső- és belső ionizációs módszerek összehasonlítása ioncsapda használatával... 40 6.2. A SIM és az MS/MS technika összehasonlítása... 41 6.3. Az NSAID-k tömegspektrometriás tanulmánya... 43 6.3.1. Az adatgyűjtési módszerek főbb jellemzői... 43 6.3.1.1. Az FS módszer... 44 6.3.1.2. A SIM módszer... 44 6.3.2. Az NSAID-k tandem tömegspektrometriás tanulmánya... 45 6.3.2.1. Az MS/MS módszer fejlesztésének lépései... 45-3-

6.3.2.2. A szülő ionok fragmentációjának optimálása... 46 6.3.3. Az FS, SIM és MS/MS módszerek összehasonlítása a validálási paraméterek alapján... 51 6.3.4. Visszanyerés... 55 6.4. Duna vízminták elemzése... 55 6.4.1. Ivóvízminták elemzése... 60 6.5. Az NSAID tanulmány eredményeinek összefoglalása... 60 6.6. Sok összetevő (multiresidue) vizsgálatára alkalmas módszer fejlesztése... 62 6.6.1. Az MS/MS módszer vizsgált szennyezői... 62 6.6.1.1. Aromás karbonsav származékok... 62 6.6.1.2. A nem-szteroid gyulladáscsökkentő és fájdalomcsillapító gyógyszerek... 64 6.6.1.3. Egyéb gyógyszerhatóanyagok... 64 6.6.1.4. Műanyag- és kozmetikai adalékanyagok... 65 6.6.1.5. A koffein és a ferulasav... 66 6.6.1.6. Telített-, telítetlen zsírsavak és dikarbonsavak... 67 6.6.1.7. Szteránvázas vegyületek... 68 6.6.2. A multiresidue analízis tömegspektrometriás tanulmánya... 70 6.6.2.1. Az FS 42 komp. program optimális paraméterei... 70 6.6.2.2. A szennyezők fragmentum-analitikai tanulmánya FS módszer esetén... 70 6.6.2.3. Az MS/MS 42 komp. program optimális paraméterei... 73 6.6.3. Az üresek kérdésköre... 76 6.6.4. Az elemző MS módszerek validálása... 78 6.6.4.1. Visszanyerés... 81 6.6.4.2. Az optimális mintatérfogat kiválasztása... 83 6.6.5. Duna vízminták elemzése... 86 6.6.6. Irodalmi összehasonlítás... 97 6.6.7. Duna vízminták lebegőanyag-tartalmának elemzése... 99 6.6.8. Gyógyszermaradványok az ivóvízben... 100 6.6.8.1. Ivóvizek vizsgálati eredményei... 100 6.6.8.2. Irodalmi kitekintés... 101 6.7. A sokkomponensű elemzőrendszer eredményeinek összefoglalása... 104 7. Az értekezésben foglalt új tudományos eredmények; Összefoglalás... 105 8. Summary... 106 9. Közlemények, szakmai előadások és poszterek... 107 10. Irodalmi hivatkozások... 110-4-

1. Bevezetés A folyó olyan régen indult el, hogy arra senki nem emlékezhetett. Ha tavasszal a hegyeken olvadni kezdett a hó, és a patakok csattogva nyargaltak a sziklák között, annyi szemetet hordtak a folyóba, hogy az szinte rosszul lett, s a szemetet kihányta a partra. (Fekete István: Lutra) Az emberiség egyik legnagyobb kincse, amit unokáinktól kaptunk kölcsön, a víz. Az ENSZ kimutatása szerint a Földön közel egymilliárd ember nem jut egészséges ivóvízhez, és közelítőleg a fele nem él higiéniailag megfelelő körülmények között, amely naponta csaknem 6000 gyermek halálához vezet. Az elmúlt évek alatt egyre több tanulmány hívja fel a figyelmet a vizeinket veszélyeztető természetes és mesterségesen előállított kémiai anyagokra, amelyek a vízi élővilág minden elemére hatást gyakorolhatnak, a mikroorganizmusoktól kezdve az emberekig. Így válhatott a környezetvédelmi analitika aktívan kutatott területévé a gyógyszerek (antibiotikumok, gyulladásgátlók, fájdalomcsillapítók, antiepileptikumok, koleszterin- és lipidszint szabályozók, stb.), kozmetikumok és a háztartásban használt egyéb vegyszerek, illetve higiéniás termékek (Pharmaceutical and Personal Care Products, PPCPs) környezeti jelenlétének vizsgálata (1. ábra). Mintegy harmincöt évvel ezelőtt kezdtek el először felszíni vizekben gyógyszermaradványok után kutatni, amely vizsgálatok során a leggyakrabban használt gyógyszereket határozták meg környezeti vizekben [1,2]. Ezen gyógyszerek egy része változatlan formában, más része metabolitjaival együtt választódik ki az emberi és állati szervezetekből. A vízoldhatóbb metabolitokból a szennyvíztisztítás során - a mikroorganizmusok lebontási mechanizmusának köszönhetően - újra fel is szabadulhatnak az eredeti anyagok [3,4]. A szennyvíztiszítási eljárásban az ülepítés és a biodegradáció jelenti a két legfontosabb eltávolítási lépést. Ternes és munkatársai részletesen elemeztek németországi kezeltés kezeletlen szennyvízmintákat, amely vizsgálatok során átlagosan 60%-os tisztítási hatékonyságot állapítottak meg, ami azonban egyes vegyületeknél csak 7%-ot (karbamazepin), míg másoknál 99%-ot (szalicilsav) jelentett [5]. -5-

Nagyon hasonló eredményeket hozott az a nemzetközi felmérés is, melyet az Európai Unió kezdeményezésére végeztek a Poseidon együttműködés keretében [6]. Az országok közötti összehasonlító vizsgálatsorozat általános tapasztalata az volt, hogy a szennyvíztisztítókból kikerülő víz, vegyülettípustól függően 100-3500 ng/l koncentrációban tartalmaz gyógyszermaradványokat [3,7,8]. Ezen anyagok bejutnak a felszíni vizekbe, és a hígulás miatt körülbelül egy-két nagyságrenddel csökken a koncentrációjuk, 2-400 ng/l-re [3,5,8]. A parti szűrésű kutakon áthaladva ezen anyagok az ivóvízbe is bekerülhetnek, főleg ha nem kellően hatékony a tisztítás, nem áll rendelkezésre ozonizálás, vagy granulált aktív szenes eljárás [9,10]. Jóllehet, ezen vegyületek ivóvízben előforduló mennyiségei messze elmaradnak a terápiásan hatékony dózisoktól, a hosszú távú, krónikusan mérgező hatásuk még nem kellőképpen tisztázott, főleg a sokféle aktív vegyület egyidejű jelenléte miatt. Így nem tudhatjuk, hogy pontosan milyen reakciókat válthatnak ki az élő szervezetekben [9]. 1. Ábra Gyógyszermaradványok vizsgálatával foglalkozó publikációk száma az elmúlt évtizedben, különböző környezeti mátrixokban (talaj- + ivóvizek; felszíni vizek és szennyvizek) (forrás: Science Direct; keresett kifejezések: gyógyszerek/ előfordulás/ szennyvíz, felszíni víz, talaj- és ivóvíz [pharmaceuticals/ occurrence/ wastewater, surface water, groundwater, drinking water]) -6-

2. Rövidítések jegyzéke AMD ---------------------- automata módszerfejlesztő program BSTFA -------------------- N,-bisz(trimetil-szilil)-trifluor-acetamid C 18 -polimer --------------- 18-as szénatomszámú polimer CE-MS -------------------- kapillárelektroforézis-tömegspektrometria CID ------------------------ collision induced dissociation, ütközéssel indukált disszociáció D --------------------------- diklofenak DVB ----------------------- divinil-benzol EDCs ---------------------- Endocrine Disrupting Chemicals, hormonháztartást befolyásoló vegyületek EI -------------------------- elektronütköztetéses ionizáció FS -------------------------- full scan, pásztázó üzemmód GC ------------------------- gázkromatográfia GC-MS -------------------- gázkromatográfia-tömegspektrometria GC-MS/MS--------------- gázkromatográfia-tandem tömegspektrometria HLB ----------------------- hidrofil-lipofil egyensúly HMDS -------------------- hexametil-diszilazán HPLC --------------------- nagyhatékonyságú folyadékkromatográfia HRGC --------------------- nagyfelbontású gázkromatográfia I ---------------------------- ibuprofen ILQ ------------------------ instrumental limit of quantitation, készülék meghatározási határa IPM ------------------------ ion preparation method, ion preparációs módszer JDS ------------------------ Joint Danube Survey K --------------------------- ketoprofen L/L ------------------------- folyadék/folyadék extrakció LC ------------------------- folyadékkromatográfia LC-MS -------------------- folyadékkromatográfia-tömegspektrometria LC-MS/MS --------------- folyadékkromatográfia-tandem tömegspektrometria LD ----------------------- kimutatási határ LQ ----------------------- meghatározási határ M -------------------------- molekulaion MRM ---------------------- multiple reaction monitoring, sokszoros reakció monitorozás MS ------------------------- tömegspektrometria MS/MS -------------------- tandem tömegspektrometria MSTFA ------------------- N-metil-N-trimetil-szilil-trifluor-acetamid MTBSTFA --------------- N-metil-N-terc-butil-dimetil-szilil-trifluor-acetamid N --------------------------- naproxen NSAIDs ------------------- non-steroidal anti-inflammatory drugs, nem-szteroid gyulladáscsökkentők PA ------------------------- poliakrilát -7-

PDMS --------------------- polidimetil-sziloxán PFBBr --------------------- pentafluor-benzil-bromid PI -------------------------- parent ion, szülő ion PPCPs --------------------- Pharmaceutical and Personal Care Products, gyógyszermaradványok és higiéniás termékek ppt ------------------------- part per trillion R 2 -------------------------- regressziós koefficiens négyzete RSD ----------------------- relatív standard deviáció S/N ------------------------ jel/zaj viszony SBSE ---------------------- keverőbabás extrakció SFI ------------------------- szelektív fragmens ion SIM ------------------------ selected ion monitoring, szelektív ion monitoring SIS ------------------------- selective ion storage, szelektív iontárolás SPE ------------------------ szilárdfázisú extrakció SPME --------------------- szilárdfázisú mikroextrakció SRM ----------------------- single reaction monitoring, egyszerű reakció monitorozás TBA-HS 4 ------------------------ tetrabutil-ammónium-hidrogén-szulfát TFA ----------------------- trifluor-ecetsav THF ----------------------- tetrahidro-furán TIC ------------------------ összion-áram TMS ----------------------- trimetil-szilil TMSH --------------------- trimetil-szulfónium-hidroxid UV ------------------------- ultraibolya WFD ---------------------- Water Framework Directive, Víz Keretirányelv -8-

3. Irodalmi áttekintés Napjainkban a világ lakosságának fele városokban él. Ez az arány fokozatosan változik, a következő két évtized alatt várhatóan 10%-kal emelkedik. Az egyre népesedő városok példátlan kihívással néznek szembe az ivóvíz beszerzés és a vízhigiénia területén. Fenntartásukhoz temérdek mennyiségű vízre van szükségük, ezáltal hatalmas nyomást is gyakorolnak az édesvízi rendszerekre. A fejlődő országokra jellemző kiépítetlen ivóvízés csatornahálózat is aggasztó következményekkel járhat. Az egészséges és tiszta víz társadalmunk alapvető igénye. A vízellátás zavarai pedig egyre több régióban mutatkoznak, és míg az elmúlt évtizedek küzdelmei az olajért folytak, addig a jövő harcait a jó minőségű vízért vívják majd. A felszíni- és az ezzel kapcsolatban lévő felszín alatti vízkészletek környezetünk egyik legsokoldalúbban hasznosított veszélyeztetett elemei, ezért kiemelten fontos szennyezőinek azonosítása, mennyiségük változásának nyomon követése térben és időben. Adatok birtokában lehetőségünk adódik a szennyező források felderítésére, és azok megszüntetésére, illetve ha ez nem tehető meg, akkor a szennyező, főképp antropogén eredetű vegyületek határértékeinek megállapítására, a különböző környezeti mátrixok esetén. 3.1. Környezeti hatások Az Európai Unió jelenleg közel 100.000 különböző kémiai anyagot tart nyilván, amelyekből 30.000 vegyület termelése meghaladja az évi egy tonnát [11]. Közülük a gyógyszerészeti- és higiéniás termékek jelentenek egyre növekvő problémát vizeink szempontjából. 1976-ban jelent meg az első olyan tudományos beszámoló, amely a gyógyszerek és metabolitjaik környezeti vizekben való jelenlétével foglalkozott [1,2], majd a modern műszeres analitika fejlődésével a 90-es évek második felében fedezték fel újra a jelenséget [12]. Azóta számos, viszonylag nagyobb mennyiségben előforduló és toxikus vegyület vizsgálatát ma már rutinszerűen végzik szenny- és felszíni vizekben, valamint ezek üledékeiben, illetve talaj- és ivóvizekben. Ezeken kívül még számtalan, kis koncentrációban jelen lévő, környezeti-, és humán egészségügyi kockázatot jelentő szennyezőanyag fordul elő vizeinkben, amelyek rendszeres vizsgálata még nem teljesen megoldott, bár ezen úgynevezett mikroszennyezők elemzését már számos nemzetközi szervezet ajánlja, illetve előírja. -9-

Egyelőre kevés információval rendelkezünk arról is, hogy ezen mikroszennyezők milyen hatással lehetnek az élő szervezetekre. Tanulmányok szerint a nyomnyi mennyiségben előforduló szennyezők toxikológiai hatást igen ritkán fejtenek ki az emberi szervezetben, viszont potenciális veszélyforrást jelenthetnek [13,14]. Kockázati tényezőként figyelembe kell venni az egyes molekulák specifikus hatásait (pl. a hormonháztartás zavarása és/vagy bioaktivitás), illetve ökológiai szempontból a vízi élővilágra kifejtett lehetséges hatásaikat. 3.2. Gyógyszerészeti- és higiéniás termékek eredete és sorsa a környezetben (PPCPs) Az elmúlt évek alatt számos publikációt közöltek gyógyszerek és higiéniás termékek analíziséről, különböző természetes mátrixok esetében [7,15-18]. Gyógyszerek, kozmetikumok, mosószerek, napvédő krémek, bőr-, haj- és fogápolási termékek hatóanyagai mindennapos használatuk miatt folyamatosan szennyezik vizeinket. Az állat- és embergyógyászatban használt szabadforgalmú és vényköteles gyógyszerek, vitaminok, táplálékkiegészítők hatóanyagai, valamint a természetes folyamatok során képződő bioaktív metabolitjaik elsősorban a kiválasztódás, míg a higiéniás termékek főként a tisztálkodás folyamán kerülnek a szennyvízbe. A lejárt szavatosságú, vagy fel nem használt gyógyszerek jelentős többsége a helytelen megsemmisítés miatt szintén a szennyvízbe jut [19]. A beteg, vagy elhullott állatok nem megfelelő kezelése és elhelyezése is egészségügyi és környezetszennyezési problémákat vet fel (2. ábra, 1a-1c). A tiltott szerek használata is súlyos, globális probléma. Az ismertebb kábítószerek, mint morfin, kokain és heroin mellett naponta újabb és újabb drogok kerülnek a piacra, amelyekről a legtöbb esetben semmilyen, vagy kevés információval rendelkezünk. Kokaint, kodeint és morfint nemcsak kezeletlen szennyvizekben (kokain: 37-472 ng/l; kodein: 115-2121 ng/l; morfin: 69-1007 ng/l), hanem folyóvizekben (kokain: 0,4-30 ng/l; kodein: 2,9-149 ng/l; morfin: 2,2-89 ng/l) is mértek. Ezekből az adatokból akár meg is becsülhető egy adott térség kábítószer-fogyasztása [20-22]. -10-

2. Ábra Gyógyszerek és higiéniás szerek (PPCPs) eredete és sorsa a környezetben Ábra forrása: http://www.epa.gov/ppcp/; letöltés: 2011.06.10.

Az egészségügyi intézmények fertőző és gyógyszerekkel nagyobb mennyiségben szennyezett szennyvizei gyakran különösebb helyi tisztítás nélkül kerülnek a kommunális szennyvízhálózatba [23-25]. A gyógyszeripari létesítmények is rendszerint a városi csatornahálózatot terhelik [26], (2. ábra, 2). A lakossági és a kezelt/kezeletlen ipari szennyvízcsatornák szerencsés esetben szennyvíztisztító telepekre vezetnek, ahol a szennyvizet megfelelően tisztítják, és a kezelt szennyvizet vagy újrahasznosítják (mint pl. öntözés), vagy döntő többségében felszíni vizekbe engedik. Az eltávolított szennyvíziszapot gyakran mezőgazdasági célokra használják fel (2. ábra, 3a,3b és 6). Bár a szennyvíztisztítás, főképp, ha biológiai tisztítás is történik, igen hatékony, ellenben az is tény, hogy a szennyvíztisztító telepek szennyvizeit tartják a PPCP-k elsődleges forrásainak a környezetbe való bevezetést illetően [27]. Röviden összefoglalva az 1. táblázatban láthatóak a szennyvíztisztítás fokozatai. Szennyvíztisztítás lépcsői I. fokozat (mechanikai) II. fokozat (biológiai) III. fokozat (kémiai utókezelés) Alkalmazott technológia célja durva, mechanikai szennyeződések eltávolítása finom lebegő szemcsék eltávolítása (olajok, zsírok) főképp oldott szerves anyagok eltávolítása, nitrifikáció lebegőanyag-mentesítés maradék szerves és szervetlen anyagok megkötése eutrofizáció gátlása: főképp szervetlen foszfor tartalmú vegyületek eltávolítása Eszközök, folyamatok homokfogók, horizontális-, vertikális ülepítők, derítők, szeparátorok, előszűrők, flokkuláció, majd ülepítés, stb. biológiai oxidáció (helyenként anaerob lebontás), eleveniszapos technológia homokszűrés, mikroszűrés fizikai-kémiai módszerek: ioncsere, adszorpció, reverzozmózis, stb. foszfor: Ca-, Al- és Fe-sók csírátlanítás klórozás, ozonizálás (Cl 2, 3 ) 1. Táblázat A szennyvíztisztítás főbb lépései -12-

A szerves mikroszennyezők eltávolítása főképp a biológiai szennyvíztisztítás folyamatában történik, ahol a különböző mikroorganizmusok táplálékforrásként hasznosítják a rendelkezésükre álló kémiai vegyületeket, és elsősorban a nagy mennyiségben jelenlévő, természetes eredetű anyagokat fogyasztják. A döntően mesterséges, számukra életidegen csoportokat tartalmazó gyógyszermolekulák lebontása háttérbe szorul, mivel ezek egyrészt lényegesen kisebb koncentrációban vannak jelen, másrészt sokszor lebontásukra nem áll rendelkezésre megfelelő mikrobiális biokémiai mechanizmus, arról nem is beszélve, hogy a baktériumok egy részét bizonyos hatóanyagok el is pusztíthatják. Előfordulhat ezáltal, hogy e perzisztens gyógyszervegyületek kis mennyisége is képes felhalmozódni a növényekben és az állatokban, beépülhetnek az élő szervezetekbe. A jelenleg használt szennyvíztisztítási technológiák tehát nem alkalmasak minden gyógyszermaradvány teljes mértékű eltávolítására, így azok a szennyvíztisztító telepeket elhagyva közvetlenül továbbjuthatnak az élővizekbe. A mezőgazdaság is számottevő mennyiségű vegyszert juttat vizeinkbe, amelyek egy része elszivároghat a talajvizekig, vagy patakokba, folyókba kerülve felszíni vizeinket veszélyeztetik. A földművelés során többnyire a permetezés (peszticidek, rágcsálóirtó szerek, antibiotikumok, egyéb biocidok), valamint a műtrágyázás jelenti a fő problémát, míg az állattenyésztés esetén a helyiségek fertőtlenítése és az állatoknak adott nagymennyiségű táplálékkiegészítők, vitaminok és gyógyszerek (2. ábra, 4 és 9) a fő veszélyforrások. Egy új ágazat az agráriumban, a mezőgazdasági gyógyszertermelés ( molecular pharming ) is károsíthatja vízrendszereinket. E technológia, amelynek lényege, hogy génmódosított növények segítségével gyógyszereket állítanak elő, igen új, alig 25 évre tekint vissza, amikor is emberi szérum-albumint nyertek ki génmódosított dohány- és burgonyanövényekből. Jelentősége abban rejlik, hogy az igen drága, sokszor nehezen előállítható terápiás fehérjék előállítási költsége számottevően csökken, így megfizethetővé válnak a szegényebb, fejlődő országoknak is, ahol nincs lehetőség a költséges gyógyszerek beszerzésére [28], (2. ábra, 8). A higiéniás termékek egyik csoportját alkotják a fényvédő készítmények. Ezek hatóanyagai képesek elnyelni az ultraibolya (UV) -sugárzást. Leggyakrabban a kozmetikai iparban alkalmazzák őket, ahol egyrészt a fényvédő szerekhez (pl.: naptej) mint aktív hatóanyagot, másrészt egyéb kozmetikumokhoz és háztartásban használt higiéniás termékekhez (pl.: samponok, parfümök, arckrémek, rúzsok, hajlakkok) használják, hogy a terméket védjék a napfény degradáló hatásától. Hatóanyagaik főleg mosás, fürdés, -13-

strandolás alkalmával kerülnek vizeinkbe. A leggyakrabban vizsgált és kimutatott UV-szűrő vegyületek a 4-metilbenzilidén kámfor, a benzofenonok (elsősorban a benzofenon és egyik vízoldhatóbb származéka a 2-hidroxi-4-metoxibenzofenon), a 2-etilhexil-4-metoxicinnamát és az oktokrilén, amelyeket többféle környezeti mintából is kimutattak már. Természetes vizekben, így folyókban több tanulmány is említi e vegyületek előfordulását alacsony, 6-68 ng/l koncentrációban [29,30], (2. ábra, 5). Az ellenőrzött és illegális szemétlerakók, a szennyvízaknák, a sérült szennyvízcsatornák és a közvetlen szennyvízbevezetések gyakran súlyosan pusztítják az élővilágot, elszennyezve talaj- és vízrendszereinket (2. ábra, 7). Az előbb említett számos példán keresztül a vizeinkbe került PPCP vegyületek egy része biotranszformáció, vagy a napfény hatására átalakulhatnak, mely folyamatokban metabolitok és fotodegradációs termékek keletkeznek. Más részük azonban hosszú időre az iszapra adszorbeálódva kiülepedhetnek, ezáltal feldúsulhatnak a környezetünkben. Bármelyik is történik, potenciális kockázatot jelentenek élővilágunk számára (2. ábra, 10). Egyes tanulmányok leírták, hogy néhány PPCP egyaránt felhalmozódhat homárokban, kagylókban és az anyatejben bioakkumuláció révén [31]. Megfigyelték továbbá, hogy az egyes vízi szervezetek egyre növekvő hermafroditizmusa, elnőiesedése és populációcsökkenése főként a szintetikus fogamzásgátlókban megtalálható női nemi hormonok hatásának köszönhető [32]. Számos baktériumtörzs esetében bizonyították, hogy az egyre növekvő antibiotikum rezisztencia kialakulásáért a széles körben alkalmazott antibakteriális szerek is felelősek (mint pl. a triklozán) [33,34]. 3.3. Gyógyszerészeti termékek A gyógyszerek és maradványaik, mint például a nem-szteroid gyulladáscsökkentő és fájdalomcsillapító gyógyszerek (non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs)) csoportjába tartozó vegyületek (ibuprofen, naproxen, ketoprofen és diklofenak), valamint a PPCP-k meghatározására, mind nagyhatékonyságú folyadékkromatográfiás/(tandem) tömegspektrometriás (HPLC-(MS)/MS), mind gázkromatográfiás/(tandem) tömegspektrometriás (GC-(MS)/MS) módszereket egyaránt használnak [35,36]. A folyadékkromatográfiás (HPLC) meghatározások előnye, hogy nincs szükség származékképzési reakcióra, viszont a nagyszámú szennyezőanyag jelenléte miatt megbízható eredményt csak a tandem tömegspektrometriás (MS/MS) detektálás nyújt. További problémát jelent, hogy a nagymértékű ion elnyomás jelensége miatt a vizsgált komponensek -14-

ionizálhatósága sok esetben csak kismértékű, így a kimutatási határok általában nagyobbak, mint a gázkromatográfiás-tömegspektrometriás (GC-MS) technika alkalmazása esetén, illetve nagyszámú belső standardra van szükség a jelenség kompenzálására [37]. Mindkét módszer esetén a minták megfelelő előkészítése nélkülözhetetlen. Leggyakrabban szilárd fázisú extrakciót alkalmaznak, amelyhez más és más töltetet használnak; legjellemzőbb a C 18 -as polimerrel módosított szilikagél és a hidrofil-lipofil egyensúly (HLB = hydrophyl-lipophyl balance) alapján működő, 1-vinil-2-pirrolidon divinil-benzol kopolimer [38]. 3.3.1. A nem-szteroid gyulladáscsökkentő és fájdalomcsillapító gyógyszerek 3.3.1.1. Az NSAID vegyületek jellemzése Az NSAID készítmények az egyik leggyakrabban alkalmazott szerek. Kutatócsoportunk elsőként vizsgált négy gyulladásgátló gyógyszere az ibuprofen, a naproxen, a ketoprofen és a diklofenak voltak. Vegyület Ibuprofen 2-[4-(2-metil- propil-fenil]- propánsav Képlet C 13 H 18 2 H CAS szám 15687-27-1 Molekulatömeg (g/mol) ldhatóság vízben (25 C ) (mg/l) [39] Log K ow [7] pk a [7] 206,29 21 3,97 4,51 Naproxen 2-(6-metoxi- naftalin-2-il)- propánsav C 14 H 14 3 H 22204-53-1 230,27 51 3,18 4,20 C 16 H 14 3 H Ketoprofen 2-(3-benzoilfenil)-propánsav 22071-15-4 254,28 159 3,12 4,45 C 14 H 11 Cl 2 N 2 Cl NH Cl H Diklofenak 2-[2-(2,6-diklórfenil)-aminofenil]-etánsav 15307-86-5 296,15 2,37 4,51 4,15 2. Táblázat A négy vizsgált gyulladásgátló gyógyszer főbb jellemzői -15-

E vegyületek szerkezetileg nem szteránvázasak, és gyengén savas karakterűek (pk a ~4). Hatékonyan csökkentik a gyulladást, csillapítják a fájdalmat és a lázat. Használhatóak akut és krónikus ízületi gyulladásos megbetegedésekben, mint köszvényes roham, reumatoid gyulladások során, degeneratív ízületi és gerinc bántalmak, lágyrészek reumás betegségei, valamint sérüléseket, műtéteket követő gyulladásos, fájdalmas duzzanatok esetében. Migrén, fog-, fej- és hátfájás esetén is kiválóan alkalmazhatóak, világszerte közkedvelt gyógyszerek. Az európai fogyasztási adatok összehasonlítását az 3. táblázat tartalmazza. Hatóanyag 3.Táblázat Éves fogyasztási adatok (tonnában kifejezve) Fogyasztásuk évről-évre növekszik. Például az ibuprofen gyógyszerhatóanyag-eladás Németországban 1995 és 2001 között több mint háromszorosára [5], Magyarországon 2004 és 2008 között négy és félszeresére növekedett [10]. A diklofenak éves eladása ugyanakkor szinte stagnált a két országban. Ez utóbbi vegyület a környezetben perzisztens és kimutatták, hogy a szennyvíztisztítás során alig bomlik le (18-35% az eltávolítás hatékonysága, míg ibuprofenre 71-95%, naproxenre 50-88%, ketoprofenre pedig 36-77%) [48-50]. Méréseink is ezt bizonyították, valamint számos esetben a kezelt szennyvízben több diklofenakot mutattunk ki, mint a kezeletlenben [18]. Ezzel összhangban van az Európai Unió által kiadott technikai útmutató sorozat (EU-TGD, 1996) azon megállapítása, hogy ha a vegyület logk ow értéke nagyobb, mint 3, akkor valószínűsíthető a molekuláról, hogy nagy bioakkumulációs hajlammal rendelkezik (1,5-3 között közepes, az alatt kicsi). A nagy logk ow értéken kívül a bioakkumuláció még akkor feltételezhető, ha rokon vegyületeiről már ismert a bioakkumulációs hajlam, valamint ha a biodegradáció mértéke kicsi [51]. 1998 [43,44] 2001 [45] Az elmúlt években több országban jelezték, hogy aggasztó mértékben csökkent azoknak a dögkeselyűknek a populációja, amelyek elhullott, diklofenakkal kezelt jószágokat fogyasztottak (India, Pakisztán, Nepál és Egyiptom) [52-58]. Franciaország Ausztria Anglia Dánia 2003 [40] 2000 [41] 1998 [42] Németország Svédország 2002 [46] Magyarország 2008 [47] Ibuprofen 6,7 162 34 167 345 68 39 Naproxen - 35-39 5,1 14 9,2 Ketoprofen - - - - 1,61 63 0,11 Diklofenak 6,1 26-16 86 4,0 6,8-16-

A keselyűk pusztulását valószínűleg különböző mérgező mechanizmusok okozzák, mint például növekszik a reaktív oxigén vegyületek termelése (szuperoxid anion, hidrogénperoxid, hidroxil gyök), csökken a húgysav transzportja [59] és a vese prosztaglandin termelése [60]. Az adatok alapján a közelmúltban betiltották a diklofenak használatát az állatgyógyászatban az Indiai-szubkontinensen [59], valamint Svédországban a környezetre veszélyes gyógyszernek minősítették [46]. 3.3.1.2. Az ibuprofen, a naproxen, a ketoprofen és a diklofenak meghatározásának lehetőségei A karboxilcsoportot tartalmazó gyulladáscsökkentő vegyületekre a savas drogok elnevezés is használatos. GC-MS elválasztásukat legtöbbször származékkészítési lépés előzi meg [61,62], míg folyadékkromatográfiás módszerek esetén erre többnyire nincs szükség. Mérgező hatása ellenére gyakran alkalmazzák a diazometánt, metil-észterek előállítására [3,5,8]. Sokkal kevésbé mérgező és szélesebb körben elterjedt módszer a szililezés, amely minden aktív hidrogént tartalmazó szerves vegyület esetén alkalmazható. Az így keletkezett származékok kellő illékonysággal, nagyobb termikus stabilitással, kevésbé poláros karakterrel, illetve szelektív fragmentálódási tulajdonságokkal jellemezhetők [50]. Az 4. táblázatban foglaltam össze az ibuprofen (I), a naproxen (N), a ketoprofen (K) és a diklofenak (D) GC- és LC-MS-sel történő meghatározásának főbb lehetséges körülményeit, 21 irodalmi tanulmány alapján. A táblázat tartalmazza a vizsgált vegyületek rövidített neveit, a mintaelőkészítések körülményeit, az alkalmazott analitikai módszer(eke)t, a kimutatási, illetve a meghatározási határt (LD, limit of detection; LQ, limit of quantitation), a visszanyerést (lehetőség szerint modell oldatok vagy/és felszíni vizek addicionálásával), %-ban kifejezve, és a vizsgált mátrixot. A tanulmányok alapján elmondható, hogy: 1. a négy választott vegyület közül a vizsgálatok több mint felében mind a négyet [8,50,63,69,72-75,77,80,81], két esetben hármat [76,78], valamint harmadában csak kettőt [64,66,67,68,70,71,79] határoztak meg; 2. mintaelőkészítésként szilárdfázisú extrakciót alkalmaztak [8,50,63-81], két kivétellel, amikor is szilárd fázisú mikroextrakciót (SPME) [67], illetve folyadék-folyadék extrakciót is használtak (L/L) [67]; 3. az extrakció során kilenc esetben az asis HLB oszlopon dúsították a mintát [8,50,66,70,71,74,75,78,80]; -17-

4. gázkromatográfiás méréseknél a választott vegyületeket főképp metil- és trimetil-szilil- (TMS) származékokként határozták meg [8,50,63-65,67-69,71-73,77], három eset kivételével, amikor is származékká alakítás nélkül [66,70], vagy butil-származék [74] formájában mértek; 5. a legtöbb esetben gázkromatográfiás-tömegspektrometriás elemzéseket alkalmaztak [8,50,63-74,77]; 6. a gázkromatográfiás mérések során hét-hét esetben mértek pásztázó üzemmódban (FS) [50,63,71-74,77], illetve szelektív ion monitoring (SIM) üzemmódban [8,50,65,67-70], valamint 4 esetben MS/MS technika használatával [63-66] elemeztek; 7. a kimutatási-, illetve a meghatározási határ értékei 0,05 és 401 ng/l között változtak, az alkalmazott módszertől függően (a minták származékká alakítása nélkül [66,70], vagy SPME [67] használatával az LD és LQ értékek általában nagyobbak voltak); 8. a visszanyerés hatékonyságának értékei vegyülettől függően 63-121% közé estek; 9. a különböző mátrixokban mért koncentráció értéktartományok ibuprofenre 0,6 ng/l-től 168 µg/l-ig, naproxenre 0,2 ng/l-től 17,2 µg/l-ig, ketoprofenre 2,5 ng/l-től 1,75 µg/l-ig és diklofenakra 0,2 ng/l-től 3,60 µg/l-ig terjedtek; 10. a vizsgálatok jelentős részében az elemzéseket szenny- [8,50,63,65-70,72,74,75, 77,78,80,81; (összesen 16 eset)] és folyóvíz [8,63,65,67-69,71,72,73-77,79; (összesen 14 eset)], számos esetben ivó- [68,69,73,74,79; (összesen 5 eset)] és tóvíz [8,63,65,68; (összesen 4 eset)], valamint egy esetben tengervíz mintákon végezték [65]. -18-

Mért vegyület I, N, K, D I, D SPE (Supelclean LC-18, 500mg/6mL) SPE (LiChrolut EN, 200mg) BF 3 /metanol (metil-származék) TMSH/metanol (metil-származék) I SPE metil-származék I, D I, N, K, D I, N SPE (asis HLB, 200mg/6mL) SPE (asis HLB, 60mg/3mL) SPE (LiChrolut keverék) SPME (PA 85μm, PDMS- DVB 65μm) L/L 50 ml n-hexán Származékká alakítás nélkül/ etil-acetát oldószerben Diazometán (metil-származék) BSTFA (trimetil-szilil-származék) GC-FS, GC-MS/MS LD: 0,5-1,0 64-112 6718 7098 268 448 <LD GC-MS/MS - - - GC-MS-SIM, GC-MS/MS GC-MS/MS GC-MS-SIM GC-MS-SIM LD: 0,2 LD: 1,1-120 LQ: 4-401 LD: 0,3-4,5 LD: 200 50-90 79-80 65-102 - Mintaelőkészítés LD Visszanyerés, (ng/l) Mátrix Ref. Mért koncentráció Analitikai /LQ módszer Extrakció Származékképzés (ng/l) % I N K D 990-3300 2-81 <LD- 7,8 <LD 921-4572 5-1500 <LD- 80 5-15 200-400 - - - 37-510 100-3500 10-400 <LD- 10 <LD- 200 <LD- 5 <LD - 100-700 Kezelt szennyvíz Folyóvíz Tóvíz Biofilm reaktor Kezeletlen szennyvíz Kezelt szennyvíz Folyó- és tóvíz Tengervíz Kórházi szennyvíz Szennyvíz 20-150 Folyóvíz <LD- 10 Tóvíz Szennyvíz Folyóvíz [63] [64] [65] [66] [8] [67] -19-

I, N I, N, K, D I, D I, D I, N, K, D SPE (SDB-XC Empore korong) SPE (asis MCX, 60mg/3mL) SPE (asis HLB, 200mg/6mL) SPE (asis HLB, 200mg/6mL) SPE (RP-C 18 1g/6mL) BSTFA (trimetil-szilil-származék) MSTFA (trimetil-szilil-származék) Származékká alakítás nélkül/ etil-acetát oldószerben Metil-klórformiát (metil-származék) Metil-klórformiát (metil-származék) GC-MS-SIM GC-MS-SIM GC-MS-SIM GC-MS-FS LD: 3-13 LD: 0,1-0,9 LD: 23-100 LQ: 0,05-0,08 63-103 80-106 83-88 GC-MS-FS - - <LD <LD 81-106 37-39 - Kezelt szennyvíz Folyóvíz <LD 22-107 Tóvíz <LD Ivóvíz 18-219 42-289 34000-168000 240-28000 - 22-1081 211-486 <LD- 4,5 <LD- 0,6 <LD- 9,1 <LD- 0,2 <LD- 14 <LD- 3,0 1,36-33 <LD- 2,5 200-3600 140-2200 Kezelt szennyvíz Folyóvíz Ivóvíz Kezeletlen szennyvíz* Kezelt szennyvíz* [68] [69] [70] 98-102 5,1-32 - 31-67 Folyóvíz [71] 150 250 330 120 Kezelt szennyvíz [72] 80 90 20 10 Folyóvíz I, N, K, D SPE (asis HLB, 200mg/6mL) HMDS (trimetil-szilil-származék) GC-MS-FS, GC-MS-SIM LQ: 1,0-2,6 97-100 2010 2333 1750 2650 580 1190 1120 3270 Kezeletlen szennyvíz Kezelt szennyvíz [50] I, N, K, D I, N, K, D SPE (Strata-X 60mg/3mL) SPE (asis HLB, 60mg/3mL) MSTFA (trimetil-szilil-származék) TBA-HS 4 (butil-származék) GC-MS-FS GC-MS-FS LD: 1,96-5,55 LQ: 1,0-2,0 84-104 77-102 <LD 18-80 <LD 9-49 Folyóvíz <LD 30 170 <LQ <LQ Ivóvíz, forrásvíz Kezelt szennyvíz <LQ 30 <LQ <LQ Folyóvíz <LQ Ivóvíz, talajvíz [73] [74] -20-

I, N, K, D I, N, D I, N, K, D I, N, D I, D SPE (asis HLB, 60mg/3mL, 200mg/6mL) SPE (Bondesil DS 500mg/6mL) SPE (Lichrolut EN, 200mg/6mL) SPE (asis HLB, 500mg/6mL) SPE (Isolute C18, 500mg) - LC-MS/MS - - BF 3 /metanol (metil-származék) HPLC-MS, CE-MS LC-MS, HRGC-MS-FS - LC-MS/MS - LC-MS/MS LD: 7-30 LD: 0,3-0,6 LD: 5-43 LD: 0,14-0,23 LD: 7,5-12 70-121 <LD- 900 40-800 <LD- 150 84-96 - 69-91 83-96 87-92 <LD- 190 <LD- 160 <LD- 50 <LD- 38 868 1540 <LD - 1600 2270-68700 <LD - 41 <LD - 1500 4480-17200 <LD - 53 160-970 130-620 <LD 50-540 <LD- 390 <LD- 60 Kezeletlen szennyvíz Kezelt szennyvíz Folyóvíz [75] - 29-392 Folyóvíz [76] <LD - 381 Kezelt szennyvíz 56-484 Folyóvíz <LD <LD- 45 Kezeletlen szennyvíz, Kalifornia Kezelt szennyvíz, Korea <LD - <LD- Folyóvíz 134 1200 - <LD <LD Ivóvíz [77] [78] [79] I, N, K, D SPE (asis HLB, 500mg/6mL) - LC-MS/MS LD: 10-25 92-107 119 698 9,6 328 Kórházi szennyvíz [80] I, N, K, D SPE (Lichrolut 100 RP- 18, 500mg/6mL) - LC-MS/MS LD: 5-20 68-84 5-10 10-300 <LD 25-60 Kezelt szennyvíz [81] 4. Táblázat Az ibuprofen, a naproxen, a ketoprofen és a diklofenak meghatározásának kromatográfiás lehetőségei Jelmagyarázat: a Rövidítések jegyzékében; Ref.: felhasznált irodalom, - = nincs adat; * kórház található a szennyvíztisztító közelében. -21-

Az irodalmat áttekintve látható, hogy a mintaelőkészítés paramétereit, mint például a szilárd fázisú extrakciót, illetve a származékképzési reakciókat és körülményeket, már számos tanulmány mélyrehatóan vizsgálta, viszont kevesebb figyelmet fordítottak a tömegspektrometriai meghatározás lehetséges alternatíváira. Az 5. táblázat az elmúlt évtized irodalmi kitekintése környezeti víz- és talajminták meghatározásának lehetséges módszereire, figyelembe véve mind a minták előkészítését, mind a GC-MS meghatározásának lehetőségeit. MS technika FS SIM MS/MS Irodalmi hivatkozások (IH) száma: [Ref.] Mintaelőkészítés lehetséges formái Metilezett Szililezett PFBBr * Származékképzés nélkül 11: [63,71,72,82-89] 7: [5,8,65,90-93] 5: [63,64,65, 94,95] 7: [18,50,61,62,73, 96,97] 17: [16,48,50, 67-69,98-108] 4: [74] ** [109-111] 5: [49,109,112-114] - - MS módszer IH -nak a száma 3: [115-117] 25 2: [70,115] IH száma 21 23 8 5 1: [66] 31 6 5. Táblázat Irodalmi kitekintés környezeti víz- és talajvíz minták lehetséges meghatározásaira, figyelembe véve mind a minták előkészítését, mind az MS üzemmód lehetőségeit Jelmagyarázat: Ref.: felhasznált irodalom, PFBBr * = pentafluor-benzil származék; ** = észterezve tetrabutil-ammónium-hidrogén-szulfáttal; - = nem áll rendelkezésre adat; az aláhúzott és félkövérrel szedett hivatkozások két meghatározási módszer összehasonlítása Mintegy 57 tudományos munkát értékelve látható, hogy igen széleskörűen alkalmazzák mintaelőkészítésként a metilezést [5,8,63-65,71,72,82-95] és a szililezést [16,18,48,50, 61,62,67-69,73,96-108], amíg ritkábban a pentafluor-benzil- [49,109-114] és a butil-észter [74] származékképzést. A tanulmányozott 57 cikk közül csak 5 esetben mértek [66,70,115-117] származékká alakítás nélkül. Az MS adatgyűjtési üzemmódok közül leggyakrabban a SIM technikát alkalmazták [5,8,16,48-50,65,67-70,90-93,98-109,112-115], annak ellenére, hogy bonyolultabb, mint az FS, különösen, ha több célvegyületet szeretnénk elemezni. A fő hátránya az FS technikához -22-

képest, hogy a kapott kromatogram csak a vizsgálni kívánt célvegyületek (target) adatait tartalmazza és elveszik annak a lehetősége, hogy teljes tömegspektrumot vegyünk fel, és más vegyületeket is meghatározhassunk (non target) ugyanezen felvétel alatt. Újabban megjelentek olyan készülékek a tömegspektrometria piacán, amelyek képesek egyidejűleg SIM és FS adatgyűjtési módban mérni, ami a HPLC-MS technikáknál már régóta alkalmazott eljárás. M. J. Gómez és munkatársai 14 célvegyületet és 12 egyéb szerves szennyezőt azonosítottak egy injektálás során SIM / FS üzemmódban, szenny- és felszíni vizekben [30]. A fentebb vázolt problémák miatt gyakran alkalmazzák az FS mérést, főleg ha sok összetevőt tartalmazó mintákat szeretnének egy felvételből meghatározni [18,50,61-63, 71-74,82-89,96,97,109-111,115-117]. A tandem tömegspektrometriát eddig igen ritkán használták a GC-s méréseknél, mivel jóval bonyolultabb módszerfejlesztést igényel, mint az FS, vagy a SIM technika [63-66,94,95], és a rendszer csak ioncsapdás, vagy hármas kvadrupól analizátorral ellátott készülékkel működik. Az MS/MS elemzések során az NSAID vegyületeket vagy metilezték [63-65,94,95], vagy származékolás nélkül mérték [66]. A mérések single reaction monitoring (SRM) [63-66,94,95], vagy multiple reaction monitoring (MRM) [63,66] módban történtek. Továbbá megállapítható, hogy: 1. a négy NSAID-t TMS (oxim) éter/észter származékokként MS/MS módszerrel még nem elemezték; 2. a különböző adatgyűjtési módszereket (FS, SIM, MS/MS) ugyanazon kísérleti körülmények között és ugyanazon készüléken eddig még nem hasonlították össze, míg öt esetben két módszert vetettek csak össze [50,63,65,109,115], lsd. a további pontokban; 3. az MS/MS technika előnyét az FS módszerhez képest eddig csak kvalitatív módon, az ibuprofen-, a naproxen- és a diklofenak metil-észtereinek egymásra vetített kromatogramján mutatták be [63]. A szerzők a minták mátrix hátterének hatékony elnyomásával magyarázták az MS/MS adatgyűjtéssel elérhető alacsony kimutatási határokat (0,8-1,0 ng/l); 4. a SIM és az MS/MS technika hatékonyságának összehasonlítását eddigiekben csak az ibuprofennek a szennyvíztisztítási folyamatok során keletkező bomlástermékeinek elválasztásában mutatták be, királis tulajdonságaiktól függően [65]; 5. az ibuprofen- és a diklofenak pentafluor-benzil származékként [109], vagy az ibuprofen eredeti formájában történő szennyvízminták elemzésénél hasonlították össze az FS és SIM -23-

üzemmódokat [115]. A SIM előnyét tekintve az FS módszerhez képest, az eredmények eltérőek voltak. A származékképzés nélküli ibuprofen esetén a LD FS /LD SIM = 4-nek adódott [115], míg az ibuprofen- és a diklofenak pentafluor-benzil származékainak elemzése során sokkal nagyobb értékek adódtak (LD FS / LD SIM = 38-60) [109]. 3.4. Sok összetevős rendszerek analízise Az utóbbi években egyre több szerepet kaptak azon meghatározások, ahol sok összetevőt elemeztek (multiresidue analízis). Ezen módszerek előnye, hogy egy felvétel alatt lényegesen több információhoz juthatunk az adott mintával kapcsolatban. Az eljárások mind GC [63,69,72,97,98,111,118,120,121], mind LC [72,76,111,118-121] elválasztásokon alapulnak. Bendz és munkatársai 31 gyógyszert és egyéb szerves szennyezőt határoztak meg szilárdfázisú extrakciót követően szenny- és folyóvízből HPLC és GC módszerek használatával [72]. Zuccato és társai szintén e két technika segítségével 16 gyógyszervegyületet mértek folyó- és ivóvízmintákból. A vegyületek egy részét mind folyóvízben, mind ivóvízben megtalálták, igen jó analitikai jellemzők mellett. A visszanyerés a vizsgált anyagokra több mint 70% volt [118]. Pár évvel később 16 illegális kábítószert határoztak meg folyóvízben HPLC-MS/MS módszer segítségével, amikor is 0,2-183 ng/l között mérték a megtalált drogokat [119]. Verenitch kutatócsoportja koffeint, és egyúttal 7 gyógyszer metil-származékát mérték szenny- és felszíni vízben, 0,1-20 ng/l-es kimutatási határ és 64-112%-os visszanyerés mellett, GC-MS/MS technikával [63]. Negyvenhat savas jellegű, poláros szennyezőanyag terc-butil-dimetil-szilil-származékának elemzését végezték el többféle vízmintában (folyóvíz, csapvíz, forrásvíz és szennyvíz), SBSE-GC-MS módszerrel, nagytérfogatú injektálást alkalmazva. A mért 37 szennyezőanyag meghatározására optimált eljárás kimutatási határai az 1-800 ng/l értékek közé, a legtöbb esetben azonban 25 ng/l alá estek [97]. Irodalmi áttekintésképp még további hat publikáció adatait dolgoztam fel táblázat formájában. A sok összetevős elemzések tanulmányozása során külön figyelmet fordítottam a vegyületek számára, a vizsgált mátrixra, a mintaelőkészítés lépéseire, az alkalmazott analitikai módszerekre, valamint azok LD és LQ értékeire, a visszanyerések hatásfokára %-ban kifejezve, valamint a megtalált vegyületek mért koncentráció tartományaira (6. táblázat). A felsorolt tizenegy, főképp gyógyszerek vizsgálatára alkalmazott kutatás tanulságai a következők: -24-

1. A választott kutatások közül két esetben a meghatározott vegyületek száma 10 alatt [63,76], a vizsgálatok felében 10-30 között [69,98,118-120], harmadában 30 felett volt [72,97,111,121]. 2. A vizsgálatok jelentős részében felszíni- [63,69,72,76,97,118,119,121; (8 eset)] és szennyvíz [63,69,72,97,98,120,121; (7 eset)], pár esetben ivó- [69,97,118; (3 eset)], forrás- [97,98; (2 eset)] és talajvíz [111,121; (2 eset)] mintákat elemeztek. 3. Szilárdfázisú extrakciót alkalmaztak a minták dúsítására egy kivétellel, amikor is keverőbabás extrakciót (SBSE) végeztek [97]. 4. Az extrakció során négy esetben asis HLB típusú oszlopon dúsították a mintát [63,69,98,120]. 5. A gázkromatográfiás mérések során a választott vegyületeket főképp metil- [63,72] és szilil-származékká [69,97,98] alakítás után határozták meg, pár eset kivételével, amikor is származékká alakítás nélkül [120,121], trifluor-etil-észter- [118], vagy pentafluor-benzil származék [111] formájában mérték. 6. A gázkromatográfiás elemzések során öt esetben FS [63,72,97,98,111], három esetben MS/MS [63,118,120] és két esetben SIM [69,121] adatgyűjtési üzemmódban mértek. 7. A tizenegy tanulmány közül kilenc esetben gázkromatográfiás-tömegspektrometriás elemzéseket alkalmaztak [63,69,72,97,98,111,118,120,121], ebből öt esetben számos vegyületet folyadékkromatográfiásan határoztak meg [72,111,118,120,121]. A kimutatási határ értékei az alkalmazott technikától függően igen széles tartományt öleltek fel (0,005-800 ng/l). 8. A visszanyerés hatékonysága a mérendő komponenstől függően széles skálán, 12-163% között változott. 9. A mért vegyületeket felszíni vizekben 0,01 ng/l-től 6166 ng/l-ig terjedő koncentráció tartományban mutattak ki. -25-

Mért vegyületek Mátrix Extrakció Mintaelőkészítés Származékképzés Analitikai módszer LD értékek Visszanyerés, % Mért koncentráció Ref. 7 gyógyszer és koffein Szennyvíz Felszíni víz SPE (asis HLB, 200mg/6mL, Supelclean LC-18, 500mg/6mL) BF 3 /metanol (metil-származék) GC-FS, GC-MS/MS LD: 0,1-20 ng/l 64-112 8-7962 ng/l 2,9-371 ng/l [63] 17 gyógyszer Szennyvíz, felszíni víz, ivóvíz SPE (asis HLB, C18, MCX) MSTFA (trimetil-szilil- -származék) GC-MS-SIM LD: 0,1-28,6 ng/l 54-120 0,2-11309 ng/l [69] 31 gyógyszer és egyéb szennyező Szennyvíz Folyóvíz SPE (RP-C 18, 1g/6mL, Isolute C2/ENV+) Metil-klórformiát (metil-származék) GC-MS-FS, LC-MS/MS - - 0,01-41 μg/l 0,001-1,21 μg/l [72] 46 szerves szennyező Szennyvíz, folyóvíz, csapvíz, SBSE (PDMS) MTBSTFA (terc-butil-dimetil- -szilil-származék) GC-MS-FS LD: 1-800 ng/l 30-135 13-7851 ng/l [97] forrásvíz 17 gyógyszer és egyéb szennyező Szennyvíz SPE LD: 0,5-100 ng/l 27-124 0,018-702 μg/l BSTFA, MTBSTFA (asis HLB, GC-MS-FS (szilil-származék) Forrásvíz 200mg/6mL) LD: 0,005-1,0 ng/l 76-139 0,01-25 ng/l [98] 60 gyógyszer Talajvíz SPE (RP-C 18, 1g, Bond Elut, 200mg, LiChrolut EN, 200mg, Isolut ENV+, 100mg) PFBBr (pentafluor-benzil- -származék) - GC-MS-FS, HPLC-MS/MS LD: 1,0-13 ng/l 28-151 25-1100 ng/l [111] -26-

Mért vegyületek Mátrix Extrakció Mintaelőkészítés Származékképzés Analitikai módszer LD értékek Visszanyerés, % Mért koncentráció Ref. 9 gyógyszer Folyóvíz SPE (Bondesil DS, 500mg/6mL) - HPLC-MS CE-MS LD: 0,05-20 µg/l LD: 18-134 µg/l ~60 1,6-392 ng/l [76] 16 gyógyszer Folyóvíz Ivóvíz Folyóvíz üledéke SPE (Lichrolut EN, asis MCX) Trifluor-etil-észterszármazék - GC-MS/MS, HPLC-MS/MS LD: 0,02-4,30 ng/l LD: 0,8-375 ng/kg >70 0,4-242 ng/l 0,2-23 ng/l 10-2900 ng/kg [118] 16 illegális kábítószer Folyóvíz SPE (asis MCX) - HPLC-MS/MS LD: 0,02-0,35 ng/l 69-114 0,2-183 ng/l [119] 28 háztartási vegyület Szennyvíz SPE (asis HLB, 200mg/6mL) Származékká alakítás nélkül / izooktán oldószerben - GC-MS/MS, LC-MS/MS LD: 0,1-100 ng/l 12-163 0,25 ng/l - 22 μg/l [120] 33 szerves szennyező Szennyvíz Felszíni víz Talajvíz SPE (Strata C-18, 500mg/3mL) Származékká alakítás nélkül / THF oldószerben - GC-MS-SIM, LC-MS/MS LD: 0,2-220 ng/l 50-118 2,1 ng/l- 645 μg/l 26-6166 ng/l 33-6901 ng/l [121] 6. Táblázat Sok összetevős rendszerek meghatározásának kromatográfiás lehetőségei környezeti vízminták esetén Jelmagyarázat: a Rövidítések jegyzékében; Ref.: felhasznált irodalom, - = nincs adat -27-

4. Célkitűzés Budapest szennyvizének több mint 50%-a tisztítás nélkül került a Dunába 2010-ig, amelynek parti szűrésű kútjaiból nyerjük a főváros és az agglomeráció ivóvízszükségletének jelentős részét. Az ELTE Környezettudományi Koordinációs Kutató Központja széles körű vizsgálatokat indított annak tisztázása érdekében, hogy milyen mértékű a környezet terhelése a gyógyszermaradványok szempontjából, és milyen módszerekkel lehetne a károsító hatásokat csökkenteni. Doktorandusz hallgatóként 2006 szeptemberétől kapcsolódtam a kutatócsoporthoz, ahol a nemzetközi törekvéseket figyelembe véve a hazai környezeti vizekben, mint kezelt- és kezeletlen szennyvízben, Duna vízben és ivóvizekben található gyógyszermaradványok minőségi- és mennyiségi meghatározását elsőként végeztük el Magyarországon. Vizsgálatainkat a négy (ibuprofen, naproxen, ketoprofen és diklofenak) leggyakrabban használt nem-szteroid gyulladáscsökkentő és fájdalomcsillapító gyógyszerrel kezdtük, mivel ezen anyagok - forgalmazott éves mennyiségüket tekintve, előzetes kalkulációk szerint - mérhető koncentrációban lesznek jelen nemcsak a szennyvízben, de a Duna vizében is, potenciálisan pedig akár az ivóvízben is [10]. Későbbiekben a vizsgált célmolekulák köre jelentősen bővült számos gyógyszerhatóanyaggal, PPCP -kel, EDC -kel (Endocrine Disrupting Chemicals, hormonháztartást befolyásoló vegyületek), hormonokkal, epesavakkal, amelyeket származékká alakítás után egy injektálásból határoztunk meg. (Jelenleg, több mint 100 vegyület analízisét végezzük el egy mintából, egy felvétel alatt.) Bár a szennyvízminták esetén jól alkalmazható a módszerünk, kutatásaink során világossá vált, hogy a Duna- és ivóvízminták szerves szennyezőinek ng/l -es koncentrációi esetén szükséges a tömegspektrometria kínálta összes lehetőséget kipróbálni és alkalmazni. Így a doktori munkám céljai a következők voltak: a) a négy leggyakoribb, nem-szteroid gyulladáscsökkentő és fájdalomcsillapító: az ibuprofen, a naproxen, a ketoprofen és a diklofenak vizsgálata trimetil-szilil (oxim) éter/észter származékokként, szelektív ion monitoring tömegspektrometriás módszerrel, a Duna vizében és az ivóvízben; b) ezen négy trimetil-szilil (oxim) éter/észter származék tandem tömegspektrometriás analízis rendszerének kidolgozása; -28-

c) a módszer szisztematikus összehasonlítása a szelektív ion monitoring és a pásztázó üzemmóddal; d) a négy nem-szteroid gyulladáscsökkentő és fájdalomcsillapító tandem tömegspektrometriás elemzése a Duna vizében és ivóvízben; e) az MS/MS módszer továbbfejlesztése egyéb gyógyszermaradványok és más szerves szennyezők elemzésére trimetil-szilil (oxim) éter/észter származékokként, illetve eredeti formáikban (összesen 42 vegyület egy oldatból, egy injektálással való meghatározására); f) a környezeti vízminták szerves mikroszennyezőinek minőségi-mennyiségi meghatározása az elemző MS/MS módszer segítségével. -29-

5. Kísérleti rész 5.1. A kémszerek A mérésekhez kizárólag analitikai tisztaságú vegyszereket használtam. A Reanal cégtől (Budapest, Magyarország) vásároltam a hidroxilamin-hidrokloridot, a piridint és a sósavat. A n-hexán, a metanol, az etil-acetát, a diklór-metán, a hexametil-diszilazán (HMDS) és a trifluor-ecetsav (TFA), valamint az alábbi 7. táblázatban található standard vegyszerek a Sigma (St. Louis, M, USA) termékei voltak. (Amennyiben a molekula kiralitással rendelkezik, és nincs külön feltüntetve, mely enantiomert használtam, a vásárolt standard anyag racém elegyet tartalmazott.) Vegyület -30- IUPAC név 1. benzoesav benzoesav 2. fenil-ecetsav fenil-ecetsav 3. 2-fenil-propionsav 2-fenil-propánsav 4. kaprinsav dekánsav 5. szalicilsav 2-hidroxi-benzoesav 6. 4-hidroxi-metil-benzoát 4-hidroxi-metil-benzoát 7. 2,4-di-terc-butil-fenol 2,4-di-terc-butil-fenol 8. 3-hidroxi-benzoesav 3-hidroxi-benzoesav 9. 4-hidroxi-etil-benzoát 4-hidroxi-etil-benzoát 10. klofibrinsav 2-(4-klór-fenoxi)-2-metil-propánsav 11. ibuprofen 2-[4-(2-metil-propil-fenil]-propánsav 12. 4-hidroxi-benzoesav 4-hidroxi-benzoesav 13. 4-hidroxi-fenil-ecetsav 4-hidroxi-fenil-ecetsav 14. laurinsav dodekánsav 15. 3-(4-H-fenil)-propionsav 3-(4-hidroxi-fenil)-propánsav 16. paracetamol N-(4-hidroxi-fenil)-acetamid 17. azelainsav nonándisav 18. mirisztinsav tetradekánsav 19. szebacinsav dekándisav 20. koffein 1,3,7-trimetil-xantin 21. gemfibrozil 5-(2,5-dimetil-fenoxi)-2,2-dimetil-pentánsav 22. dibutil-ftalát dibutil-ftalát 23. fenoprofen 2-(3-fenoxi-fenil)-propánsav 24. palmitolajsav cisz-9-hexadecénsav 25. palmitinsav hexadekánsav 26. metoprolol 1-[4-(2-metoxi-etil)-fenoxi]-3-propan-2-ilamino-2-propanol 27. ferulasav transz-3-(4-hidroxi-3-metoxi-fenil)- 2-propénsav 28. naproxen 2-(6-metoxi-naftalin-2-il)-propánsav

Vegyület IUPAC név 29. propranolol 1-(izopropil-amino)-3-(1-naftil-oxi)- 2-propanol 30. olajsav cisz-9-oktadecénsav 31. ketoprofen 2-(3-benzoil-fenil)-propánsav 32. sztearinsav oktadekánsav 33. karbamazepin 5H-dibenzepin-5-karboxamid 34. diklofenak 2-[2-(2,6-diklór-fenil)-amino-fenil]-etánsav 35. arachinsav eikozánsav 36. dioktil-ftalát, (dietil-hexil-ftalát) dioktil-ftalát, (bisz-2-etil-hexil-ftalát) 37. fenofibrát 2-propanil-2-{4-[(4-klór-fenil)-karbonil]- fenoxi}-2-metil-propanoát 38. metotrimeprazin (2R)-3-(2-metoxifenotiazin-10-il)-N,N,-2- trimetil-propán-amin 39. ösztron 3-hidroxi-13-metil- 6,7,8,9,11,12,13,14,15,16- dekahidro-ciklopenta[a]-fenantren- 17- on 40. β-ösztradiol (17β)-ösztra-1,3,5(10)-trién-3,17-diol (10R,13R)-10,13-dimetil-17-(6-metil-heptan- 41. koleszterin 2-il)-2,3,4,7,8,9,11,12,14,15,16,17- dodekahidro-1h-ciklopenta[a]-fenantren-3-ol (4R)-4- ((3R,5S,7R,8R,9S,10S,12S,13R,14S,17R)- 42. kólsav 3,7,12-trihidroxi-10,13-dimetilhexadekahidro-1Hciklopenta[a]-fenantren-17-il)-pentánsav 7. Táblázat A kísérletek során felhasznált standard vegyületek 5.2. A minták A Duna Európa második leghosszabb folyója. Forrása a Németországbeli Fekete-erdőben található, ahonnan tíz országon keresztül jut el a Fekete-tengerig. Hossza 2857 km és körülbelül 817.000 km 2 vízgyűjtő terület tartozik hozzá [122], amelyen nagyjából 76 millió ember él. A Duna mélysége a budapesti szakaszon 3-10 méter között váltakozik, átlagos vízhozama 2350 m 3 /s, sebessége 0,5 m/s, ami árvízkor a 2,5 m/s -ot is elérheti [123]. Budapest az ivóvízkészletének jelentős részét parti szűrésű kutak által nyeri, amelyek többsége a Szentendrei-sziget és a Csepel-sziget partjai mentén találhatóak (3. ábra; a, b). -31-

Munkám során a Duna vízmintákat a 1: Petőfi-híd budai hídfőjénél az ELTE-TTK épülete előtt (1646. folyamkilométer) 2,3: a Duna 1642. és 1635. folyamkilométerénél vételeztem (3. ábra). A vízmintákat minden esetben a parttól számított maximálisan 2 m távolságban és 25 cm-es mélységben vettem. Az ivóvízmintákat az ELTE Lágymányosi campusának- (1. mintavételi pont), valamint Dunaharaszti városának ivóvízhálózatából gyűjtöttem (4. mintavételi pont). A főváros és egyben az egyetem ivóvízét a Fővárosi Vízművek szolgáltatja, és főleg kevert ivóvizet juttat el a felhasználókhoz, ami azt jelenti, hogy az ivóvíz mind a Szentendrei-, mind a Csepel-szigeti parti szűrésű kutakból származhat. Dunaharaszti város szintén a Fővárosi Vízművektől vásárolja ivóvízkészletét, amelyet a Csepel-szigeti ivóvízmű állít elő. Amíg a Szentendrei-szigeten csak a nyers ivóvíz klórozása folyik, addig a Csepel-szigeti vízmű tisztításának technológiája a következő lépésekből áll: 1. A parti szűrésű kutakból összegyűjtött nyers ivóvizet nyersvíz-fogadó medencében gyűjtik. 2. A vizet ezután kaszkádos medencében levegőztetik, amelynek célja az oldott vasés mangánvegyületek oxidálása, az agresszív szén-dioxid kihajtása. 3. A vizet ozonizálják a szerves anyagok oxidálása céljából. 4. A pehely formájában kicsapódó vas- és mangánvegyületeket, valamint az oxidált szerves anyagokat homokszűrővel távolítják el. 5. A már előzetesen tisztított vizet aktív szenet tartalmazó medencéken keresztül áramoltatják, hogy eltávolítsák a kellemetlen szag-, íz- és színanyagokat, illetve mikroszennyeződéseket. 6. A tisztított vizet egy medencében gyűjtik, ahonnan klóros utófertőtlenítés után jut a városi vízhálózatba. A 3. ábrán látható a szennyvíztisztító telepek elhelyezkedése is (A: Észak-pesti, B: Dél-pesti, C: Központi Szennyvíztisztító Telep). A Központi Szennyvíztisztító Telepet 2010-ben helyezték üzembe, amely 29 hektáros területen, mintegy 70.000 m 2 alapterületen helyezkedik el. A három szennyvíztisztító telep műtárgyai együttesen biztosítják, hogy 2010. év nyarától, Budapest és agglomerációja szennyvizének 95%-a biológiai tisztítást követően kerüljön a Dunába. A 2. és a 3. mintavételi pontok a Budapesti Központi Szennyvíztisztító Telep alatti és feletti szakaszán találhatóak. -32-

3. Ábra Mintavételi pontok (1: ELTE-TTK előtt, 2: Kvassay-zsilip mellett, 3: Csepel vízmű mellett) a Duna mentén (A: Észak-pesti, B: Dél-pesti, C: Központi Szennyvíztisztító Telep; a,b: Fővárosi Vízművek parti szűrésű kútjai a Szentendrei- és a Csepel-szigeten; 4: Dunaharaszti vízhálózata) -33-

5.3. Az alkalmazott eszközök 5.3.1. A minták előkészítése A minták szűrésénél 125 mm átmérőjű, 1,6 µm pórusméretű GF/A üvegszűrőpapírt (Whatman Maidstone, UK), a szilárd fázisú extrakcióhoz 12 mintafeltétes vákuumkádat (Supelco, Bellefonte, PA, USA) és asis HLB 200mg/6mL szorbenst tartalmazó oszlopokat használtam (Waters, Milford, MA, USA). A minták oldószer-mentesítését Büchi Rotavapor R-200 (Flawil, Switzerland) készüléken, Büchi vákuumpumpa V-700 segítségével végeztem. A származékká alakítás termosztálható, a kémcsövekkel/reakciócsövekkel egyező méretű fémbetétű kályhákban (Kutesz, Magyarország) történt. 5.3.2. Az alkalmazott gázkromatográfiás körülmények A méréseket Varian gyártmányú (Walnut Creek, CA, USA) gázkromatográftömegspektrométeren végeztem. A készülékegyüttes egy automata mintaadagolóval és programozható injektorral (Varian 1079) felszerelt Varian 3800-as gázkromatográfból és egy Varian 4000 GC-MS/MS típusú, ioncsapda analizátorral ellátott tömegspektrométerből áll. n column injektálást alkalmazva, az elválasztásokhoz SGE forte capillary (Victoria, Ausztrália) BPX5 jelzésű 30 m 0,25 mm, 0,25 μm filmvastagságú kromatográfiás oszlopot, vivőgázként konstans 1 ml/perc áramlási sebesség mellett 6.0 ás tisztaságú (99.9999%) héliumgázt alkalmaztam. A gázkromatográf öt különböző módszerének paraméterei a 8. táblázatban láthatóak. FS, SIM, MS/MS 4 komp. program FS, MS/MS 42 komp. program Injektor Injektor Idő/perc C C/perc Idő/perc C C/perc 0,10 100 0,0 0,50 100 0,0 1,00 300 200 1,00 300 200 3,00 300 0,0 3,00 300 0,0 szlop szlop Idő/perc C C/perc Idő/perc C C/perc 1,00 100 0,0 1,00 100 0,0 10,0 300 20,0 20,0 300 10,0 5,5 300 0,0 10,0 300 0,0 elemzési idő: 16,5 perc elemzési idő: 31 perc 8. Táblázat Az injektor és a kromatográfiás oszlop hőmérsékletprogramjai -34-

5.3.3. Az alkalmazott tömegspektrométer főbb jellemzői A Varian 4000-es MS készülék tömegtartománya 50-1000 amu. A tömegspektrométer külső és belső ionizációs módokban használható, mind elektronütköztetéses (EI), mind kémiai ionizáció folyamán. A specifikációi közé tartozik továbbá, hogy a tömegpásztázási sebessége 5.000-10.000 amu/s, valamint a filament áramerőssége 10-100 µa között változtatható, 65.000 μs maximális ionizációs időtartam mellett. A különböző MS módszerek használata során alkalmazott azonos jellemzők a következők voltak: - a transfer line, az ioncsapda és a manifold hőfoka rendre 300 C, 210 C és 80 C volt; - ionizációs feszültségként EI üzemmódban 70 ev-t alkalmaztam; - az ioncsapda detektor optimális mérési paramétereit a készülék-szoftver (Varian MS Workstation software, version 6.5.) segítségével ellenőriztem és vezéreltem. 5.4. A kísérletek során használt módszerek 5.4.1. A reagens oldatok Az oximálási reakció során a 2,5 vegyes%-os hidroxilamin-hidrokloridot tartalmazó piridin oldat készítéséhez 1,25 g hidroxilamin-hidrokloridot oldottam 50 ml piridinben. A szililezési reakcióhoz az analitikai tisztaságú hexametil-diszilazánt és trifluor-ecetsavat további tisztítás nélkül használtam. 5.4.2. A modell oldatok Az analitikai tisztaságú standard vegyületek 10-25 mg/100 ml bemérése analitikai pontossággal, feloldása etanolban, desztillált vízben, vagy desztillált víz:etanol = 1:1 (V/V) arányú elegyében történt. A ftalátok feloldásához diklór-metánt használtam. Az egyedi törzsoldatok mellett, a 42 modell vegyületből két közös törzsoldatot is készítettem, az egyik a zsírsavakat tartalmazta (10 vegyület, 17-33 mg/100 ml), a másik a többi 32 komponenst (5-157 mg /100 ml). A két közös törzsoldat standard anyagainak bemérései a várható Duna vízminta-koncentrációk figyelembevételével készültek. A két törzsoldatot több lépcsőben, az eredetihez képest 50-szeresre hígítottam, majd az így készített oldatok 10-500 μl-ét, amelyhez 250 µl telített ammóniás metanolt adtam, vákuumlepárló készülékhez csatlakoztatható, teflonnal fedett, csavarmenettel ellátott reakciócsövekbe -35-

(szükség szerint 2 és 4 ml térfogatúak) mértem és 35 C hőfokú vízfürdőn, vákuumlepárló készüléken szárazra pároltam. A benzoesav típusú, illékony komponensek megfelelő visszanyerését, a telített ammóniás metanol adagolása biztosította, sóképzés útján. 5.4.3. Származékká alakítás körülményei modell oldatok esetén A származékká alakítás során az előző pontban leírt módon előkészített és tömegállandóságig szárazra párolt modell vegyületeket tartalmazó kémcsövekbe először 125 µl 2,5 vegyes% -os hidroxilamin-hidrokloridos piridint mértem, amelyet az oximálási reakciólépéshez 30 percig 70 C -on tartottam. Lehűtve a mintákat a szililezés során 225 µl hexametil-diszilazánt (HMDS), majd 25 µl trifluor-ecetsavat (TFA) adtam hozzá. A szililezési reakció teljessé tételéhez ismételten 90 percig 70 C -on termosztáltam az oldatokat. Az elemzések során külső kalibrációt alkalmazva, minden egyes méréssorozathoz három párhuzamos modell oldatot és egy műveleti üres mintát készítettem, amely utóbbi a standardokkal azonosan készült. 5.4.4. A minták előkészítése Duna- és ivóvízminták esetén Az ivó- és Duna vízminták egyedi minták voltak, véletlenszerű mintavételezéssel. Minden esetben feljegyeztem a Duna vízállását, a víz- és levegőhőmérsékletet. A mintákat üvegedényben tároltam, elkerülve a vizsgálandó anyagok esetleges adszorpcióját a mintatároló edény falához, vagy a minta szennyeződését a mintavevő vagy a mintatároló edény anyagától. A minták előkészítését még a mintavétel napján elkezdtem. A szűrés előtt és után a mintákat alaposan homogenizáltam. Minden esetben 3 párhuzamos, valamint egy vak, úgynevezett SPE üres mintát készítettem. A mintaelőkészítés lépései a 4. ábrán láthatóak. -36-

4. Ábra Mintaelőkészítés folyamatábrája Duna- és ivóvízminták esetén A vízminták (1,5L és 3L) szűréséhez GF/A 1,6 µm pórusátmérőjű üvegmikroszűrőt alkalmaztam. Az üvegmikroszűrő lapokat előzetesen analitikai pontossággal lemértem. A szűrés után a lapokat 100 C -on szárítottam, majd ismételten visszamértem a lebegőanyag tömegének kiszámításához. Ivóvízminták esetén lebegőanyag nem volt kimutatható, így a későbbiekben e szűrőpapírokat nem vizsgáltam. Az extrakciót asis HLB 200mg/6 ml -es tölteteken végeztem, amelyhez Visiprep DL vákuummal segített, nagy térfogatú adagolóval ellátott mintaelőkészítő egységet használtam. A kondicionálás során az oszlopokra egymás után a következő oldószereket vittem fel: 5 ml n-hexán, 5 ml etil-acetát, 10 ml metanol, 10 ml desztillált víz. A szűrt vízminták ph-ját, ami Duna vízminta esetén átlagosan 8,19 ±0,04 -es, ivóvízminta mérése során 7,53 ±0,10 volt, kalibrált ph mérő segítségével ph = 4,00 ±0,05 -ra állítottam 0,1 M sósav és 0,1 M nátrium-hidroxid oldattal. -37-

A beállított ph -jú és kimért mennyiségű vízminták (1,5L vagy 3L) szerves szennyezőit SPE módszerrel dúsítottam. A vákuum létrehozásához vízlégszivattyút alkalmaztam. A minták ideális felvitelének sebessége 4-5 ml/perc (kb. 1 csepp/másodperc), amely vákuum segítségével kb. 10-12 órán át tart, 3L vízminta esetén. Az SPE módszerrel való dúsítás után az oszlopokat 1 órán keresztül szárítani kell (vákuumszivattyú segítségével levegőt szívattam át az oszlopokon). A szárítás után történhet az SPE oszlopok leoldása. A leoldás folyamán az oszlopokra egymás után a következő oldószereket vittem fel: 5 ml n-hexán, 5 ml etil-acetát, 10 ml metanol. Az oldószereket oszloponként egy 25 ml -es mérőpohárba gyűjtöttem. Leoldás után a 250 µl telített ammóniás metanolt adtam a már mintákat is tartalmazó oldószerekhez, majd a vegyifülkében maximális elszívás alatt pároltam. Mikor a mérőpohárban már csak 1-2 ml folyadék volt, kvantitatíve mostam át a mintákat 4 ml-es, csiszolattal ellátott kémcsövekbe (4*200µL metanollal, majd 1*100µL desztillált vízzel, végül 2*100µL metanollal), ügyelve, hogy a mérőpohár falát gondosan átöblítsem. Ismételten 250 µl telített ammóniás metanolt adva hozzá, a fülke alatt hagytam párolódni a mintákat kevesebb, mint 1 ml-re. Az eluátumokat tartalmazó kémcsöveket tömegállandóságig, rotációs vákuum-berendezésen 32 C-on szárazra pároltam. 5.4.5. A lebegőanyag-tartalom gázkromatográfiás meghatározása A szűrőpapírok feldolgozása során, a lemért szűrőpapírokat 10 mm 2 -es darabokra vágva, főzőpohárban extraháltam először 20, majd 3-szor 15 ml n-hexán:etil-acetát:metanol = 1:1:2 arányú oldószereleggyel, ultrahangos fürdőn. Az extrahált anyagot az egyes extrakciók között GF/A üvegszűrőn szűrtem át, és a szűrleteket az eljárás végén egyesítettem. Az előkészítés során egy vak mintát is készítettem ( szűrőpapír üres ). Ezután követve az SPE módszer leoldás utáni feladatait, 250 µl telített ammóniás metanolt adtam hozzá, majd vegyifülkében maximális elszívás alatt pároltam 1-2 ml-re. Ezt követően mindenben ugyanúgy jártam el, mint az SPE eluátumok esetén (lsd. 5.4.4-es fejezet). 5.4.6. A minták származékká alakítása és mérése A modell oldatok előkészítéséhez hasonlóan, először 125 µl 2,5 vegyes%-os hidroxilamin-hidrokloridot tartalmazó piridint adtam a mintákat tartalmazó kémcsövekhez, amelyet az oximálási reakciólépéshez 30 percig 70 C -on tartottam. A fél óra oximálási -38-

reakció után, lehűtve a kémcsöveket, először 225 µl HMDS t, majd 25 µl TFA -at adtam hozzá. Ezután ismételten 90 percig 70 C -on termosztáltam az oldatokat a szililezési reakció teljessé tételéhez. A származékká alakítás után a mintákból és a modell oldatokból egy 5-szörös hígítást készítettem 400µL-es, szűkítős GC mintabemérő edénykébe. A minták mérése a Varian 4000 típusú GC-MS/MS típusú tömegspektrométerrel kapcsolt gázkromatográfiás rendszerrel történt, belső ionizációs módban. 5. Ábra A mintaelőkészítés lépéseinek képei Duna- és ivóvízminták esetén -39-

6. Kísérleti eredmények értékelése A szerves mikroszennyezők GC-MS meghatározását felölelő irodalmat áttekintve kitűnt, hogy míg a mintaelőkészítés lépéseit sokoldalúan és részletesen tanulmányozták (SPE lépései, töltetek fajtái, a származékképzés körülményei), addig kisebb hangsúlyt fektettek az adatgyűjtési üzemmódok összehasonlítására, az MS detektor által nyújtott lehetőségek kihasználására. Doktori munkám első célja, a Varian 4000 GC-MS/MS készülék paramétereinek, adatgyűjtési technikáinak megismerése volt, felhasználva a már létező ismereteinket e tárgykörben. 6.1. Külső- és belső ionizációs módszerek összehasonlítása ioncsapda használatával A GC-MS ismert specifikációja, valamint irodalmi tanulmányok alapján is várható volt, hogy a készülék sokkal nagyobb válaszjelet produkál belső ionizációs módban, mint külső ionizáció alkalmazásakor. A leírás szerint a gyári állapotú készülék jel/zaj viszonya (S/N) belső ionizációs módban S/N 20, 200 fg oktafluor-naftalinra, a 272-es fajlagos tömegű iont extrahálva a tömegspektrumból, míg külső ionizációs technika használatával ehhez közeli érték mellett (S/N 30) 500 fg-ra nő az elemezhető mennyiség. A külső- és belső ionizációs mód összehasonlító sematikus rajzát a 6. ábra tartalmazza. 6. Ábra Külső és belső ionizáció összehasonlítása -40-

Mivel a készülék alkalmas mindkét technika használatára, így lehetőség nyílt a két módszer összehasonlítására. A külső ionizációt nagyobb terhelhetőség, valamint klasszikus tömegspektrum (főleg alifás molekulák esetében) jellemzi, mely nagymértékben kompatibilis a NIST adatbázisban szereplő spektrumokkal. Hátránya azonban, hogy az ionok sokkal hosszabb útja miatt a válaszjel jelentősen csökken. Belső ionizációt alkalmazva, az egyszerűbb szerkezeti felépítésnek köszönhetően, a csapdába jutó ionok száma nő, ezáltal nagyobb válaszjel érhető el, viszont az ioncsapda gyorsabban szennyeződik a megnövekedett ionok száma és főleg a mátrix zavaró komponensei miatt. Mivel ennél a technikánál a teljes GC eluátum a csapdába kerül, és csak ott ionizálódik, nagyobb az esélye annak, hogy a töltés nélküli komponensek kölcsönhatásba lépnek a mérendő ionokkal. Ez a jelenség a tömegspektrumban kisebb változásokat eredményezhet, mely főleg a kvadrupól analizátorral készített általános spektrum könyvtárak használatát nehezítheti meg [124]. Kutatócsoportunk korábbi eredményeinek tükrében a tömegspektrometriai elemzésekhez a továbbiakban a belső ionizációs módot választottam. A két technikát összehasonlítva megállapítható volt, hogy a belső ionizációs technika alkalmazásával jelentős, mintegy 15-25-szörös érzékenység növekedés érhető el vegyülettől függően, a külső ionizációs módszerhez képest [50]. 6.2. A SIM és az MS/MS technika összehasonlítása A tömegspektrometriai mérés történhet folytonos pásztázással, a teljes tömegspektrumok rögzítésével, és SIM módszerrel, amikor csak a molekulára jellemző, kiválasztott fajlagos tömegű (m/z) ionokat detektáljuk, valamint tandem tömegspektrometriai adatgyűjtéssel. Az MS/MS meghatározás során a kiválasztott ún. szülő iont az ioncsapdában, hélium gáz alkalmazásával, ütközéssel indukált disszociáció (CID) által tovább fragmentáljuk, és a keletkező, ún. leány ion(oka)t detektáljuk. Ez az ion-preparációs technika nemcsak a kimutatási határokat csökkenti, hanem a szelektivitást is nagyban javítja a másik két adatgyűjtési módszerhez képest. Az FS módszer előnye, hogy az idő függvényében teljes tömegspektrumot kapunk, így lehetőség nyílik arra, hogy új vegyületeket azonosítsunk (non target analízis), illetve visszamenőlegesen is értékelhessünk (főképp kvalitatívan). Ez a lehetőség a SIM és az MS/MS technikánál nem elérhető, hiszen ott, már csak a kiválasztott ionokat detektáljuk az adott idő szegmensben (target analízis). A 7. ábrán látható a SIM és az MS/MS módszer egyszerűsített elve. -41-

7. Ábra A SIM és az MS/MS módszer szemléltetése A SIM technika során a molekula fragmentációját követően a molekulára jellemző, legintenzívebb fragmensionokat kiválasztjuk, majd ezen ionokat detektáljuk. Az MS/MS mérés esetén a molekulára specifikus, általában a legintenzívebb fragmensiont tovább fragmentáljuk, és a keletkező ionokat mérjük. A három módszert összehasonlítva, a legtöbb esetben a szelektivitás az FS, SIM, MS/MS sorrendben nő. A mért ionok száma és a kapott válaszjelek viszont csökkennek, hiszen míg az FS módszernél az adott tömegtartományon belül minden iont detektálunk, addig a SIM technikánál szelektíven választjuk ki az ionokat, illetve az MS/MS módszernél a szülő iont, ahol az egy fragmentációra jutó ionizációs idő és az adatpontok száma is a legkevesebb. -42-

6.3. Az NSAID-k tömegspektrometriás tanulmánya A legtöbb európai és tengerentúli vízügyi hatóság különös figyelmet szentel a hagyományos szennyezőanyagokon túl a PPCP vegyületek azonosítására és mennyiségi meghatározására, többek között a világszerte használt nem-szteroid gyulladáscsökkentő szerek, mint az ibuprofen, a naproxen, a ketoprofen és a diklofenak vizsgálatára [12,125]. Ezen hatóanyag tartalmú termékek Magyarországi forgalmazása meghaladta a 10 millió dobozt 2006-ban [126]. Kutatócsoportunk e négy NSAID meghatározására fejlesztett GC-MS módszert, melyet Magyarországon elsőként alkalmazott szennyvizek és Duna vizek elemzésére [50]. A vizsgálatok kiterjedtek az SPE mintaelőkészítési körülmények, a származékká alakítás, a külső- és belső ionizáció, illetve a fragmentumanalízis részletes tanulmányozására. A tömegspektrometriai mérések FS és SIM technikával történtek. A kétlépcsős származékképzés beiktatásával (oximálás és az azt követő szililezés) jelentősen javult a ketoprofen mérhetősége. Az oximálás során a ketoprofen E- és Z-izomer alakja keletkezik, amely jellegzetes kettős csúcsként eluálódik a GC kromatogramban, növelve a meghatározás szelektivitását, továbbá az izomerek együttes válaszjele háromszorosa a ketoprofen TMS észterének [50]. Mivel e négy vegyület jó kémiai indikátora lehet a környezeti vizeket érő antropogén hatásoknak, vizsgálataink során világossá vált, hogy folyó- és ivóvízminták elemzésekor további szelektivitás és érzékenység növelésre van szükségünk a ppt (part per trillion) szintű koncentrációk megbízható mérésére. 6.3.1. Az adatgyűjtési módszerek főbb jellemzői Méréseim során az egyes adatgyűjtési módszerek paramétereit külön-külön kellett optimálnom. Többek között vizsgáltam a filament áramerősségének, az egy pásztázás alatt a csapdába jutó maximális ionok számának (target TIC), a pásztázás sebességének és az ionizációs időnek a hatását. A filament áramerősségét növelve a keletkező ionok száma nőtt, a filament átlagos élettartama azonban nagymértékben csökkent, ezáltal egy kompromisszumos, optimális értéket választottam a további mérésekhez. Az előbb felsorolt többi paraméter változtatásának semmi, vagy csak kevés hatása volt az eredményekre. Az egyes optimált technikák eltérő beállításait a megfelelő időablakokban (szegmensekben) az alábbiakban közlöm. -43-

6.3.1.1. Az FS módszer Az első 5 percben a filament és a multiplier védelme érdekében, adatokat nem gyűjtöttem. Ezt követően a filament áramerőssége 25 μa, a target TIC értéke 20.000, a maximális ionizációs időtartam 65.000 μs, a pásztázás sebességopciója gyors, az elektronsokszorozó automatikus hangolás beállítására adott plusz feszültség (multiplier offset) + 250 V volt. Az FS 4 komp. program esetén a módszer 3 szegmensből állt, úgymint: 1. szegmens: 0-5,00 perc: oldószerfront miatt adatgyűjtés nincs. 2. szegmens: 5,00-13,00 perc: a mért m/z tartomány: 76-400, kihagyva a 146, 147, 206-208 - as ionokat. Ezek főképp az oszlopról származó sziloxán csúcsok ionjai ( kolonna vérzés ), amelyek jelentősen emelték a zajszintet és így rontották a kromatográfiás kiértékelést, csökkentve a jel/zaj értékeket. A pásztázás átlagos sebessége 2 µscan (0,74 s/scan) volt ilyen beállítások mellett. 3. szegmens: 13,00-16,50 perc: adatgyűjtés nincs. 6.3.1.2. A SIM módszer Az első 5 percben adatokat nem rögzítettem. Ezután a multiplier offset + 300 V, a filament áramerőssége 25 μa, a csapdázott target TIC értéke 20.000, a maximális ionizációs időtartam 45.000 μs, az ionizációs tárolási szint 35 m/z, a pásztázás sebességopciója gyors, egységesen 1 µscan (0,37 s/scan) volt. A SIM 4 komp. program esetén a módszer 6 szegmensből tevődött össze. 1. és 6. szegmens: 0-5,00 perc: 10,50-16,50 perc: adatgyűjtés nincs. 2-5. szegmens: 5,00-10,50 perc: az ibuprofen, a naproxen, a ketoprofen és a diklofenak mérése során az időablakok és az m/z tartományok a 9. táblázatban találhatók. ibuprofen 5,00-8,00 perc sz. tömegtartomány (m/z) (m/z) 1 160 162 2 233 235 3 262 264 4 277 279 naproxen 8,00-9,25 perc sz. tömegtartomány (m/z) m/z) 1 184 186 2 242 244 3 286 288 4 301 303 9. Táblázat SIM 4 komp. program m/z tartományai Jelmagyarázat: sz. = szegmens ketoprofen 9,25-9,80 perc sz. tömegtartomány (m/z) (m/z) 1 103 105 2 323 325 3 397 399 4 411 413 diklofenak 9,80-10,50 perc sz. tömegtartomány (m/z) (m/z) 1 213 215 2 241 243 3 276 278 4 367 369-44-

6.3.2. Az NSAID-k tandem tömegspektrometriás tanulmánya A környezeti minták elemzése olyan modern műszeres nyomanalitikai módszereket igényel, amelyeknél a kimutatási- és a meghatározási határok a lehető legkisebbek. Vízminták GC-MS elemzésénél ezt a célt több módszerrel is elérhetjük: 1. Az SPE folyamatban a mintadúsítás nagysága az áteresztett vízmennyiséggel egyenesen arányos, ennek határt szabhat a töltet kapacitása, illetve eltömődése, amely azonban ivóés felszíni vizek esetén nem jelentős. 2. A nagymintatérfogatú GC-s mintaadagolás (10-100 µl) szintén gyakran alkalmazott technika [74,97]. Az eljárás viszont hosszadalmas optimálással jár és csak meglehetősen tiszta minták esetén alkalmazható kellően hatékonyan. 3. A tandem tömegspektrometriás analízisekkel nemcsak a kimutatási határok csökkenthetők, hanem a módszer szelektívebbé is tehető azáltal, hogy egy adott molekula-, vagy fragmensiont ütközéssel indukált disszociációban további jellemző fragmension képződésére késztetünk. Doktori munkám elején a szelektivitás növelése és a kimutatási határok csökkentése érdekében, a négy NSAID trimetil-szilil (oxim) éter/észter származék tandem tömegspektrometriás analízis rendszerét fejlesztettem, majd alapos és szisztematikus összehasonlítást végeztem az FS és a SIM üzemmódú adatgyűjtési módszerekkel. 6.3.2.1. Az MS/MS módszer fejlesztésének lépései A tömegspektrometria két alapvető lépése az ionképzés és a keletkezett ionok elválasztása. Az ioncsapdában a szelektív iontárolás (selective ion storage, SIS), valamint a CID, lehetőséget biztosít a két lépés időbeli folytonos váltására. Az ion preparációs módszer (ion preparation method, IPM) beállításai alapján dől el, mely ionokat mérjük, melyeket nem, valamint mely ion(ok) vesznek/vegyenek részt a CID lépésben. A CID megvalósítása során a szülő ion transzlációs kinetikus energiájának növelésére két fő eljárás létezik: a nem-rezonáns és a rezonáns üzemmód. A nem-rezonáns technika során kis-, míg rezonáns mód esetén nagy frekvenciájú elektromágneses teret hozunk létre a csapda két végén. A nem-rezonáns módszer előnyei közé tartozik, hogy kevésbé érzékeny a csapda állapotára, kevesebb paraméter optimálását igényli, viszont érzékenysége és szelektivitása kisebb, mint a rezonáns üzemmódnak. -45-

A két módszer kipróbálása után a rezonáns üzemmódot választottam a nagyobb szelektivitása miatt. Az általános, optimált MS/MS paraméterek a következők voltak: Az első 5 percben adatokat nem gyűjtöttem. Ezt követően az IPM paraméterei a következők voltak: multiplier offset + 300 V, a filament áramerőssége 40 μa, a target TIC értéke 5.000, az előpásztázás sebessége 1500 μs, a maximális ionizációs időtartam 45.000 μs, az ionizációs tárolási szint 35 m/z és a pásztázás sebességopciója gyors volt. Az izolációs ablak 300 m/z ig 3,0 m/z, 300 m/z felett 5 m/z volt. A szülő ionok gerjesztési és hasítási ideje 20 ms volt, 0,0 CID frekvencia offset-et alkalmazva. Modulált rádiófrekvenciát használva a frekvencia szám 1, a pásztázás átlagos sebessége 1 µscan volt rezonáns üzemmódban. A módszer 6 szegmensből állt az MS/MS 4 komp. program esetén, amelynek időablakai azonosak voltak a SIM 4 komp. programmal. 6.3.2.2. A szülő ionok fragmentációjának optimálása Az ibuprofen, a naproxen, a ketoprofen és a diklofenak MS/MS paramétereinek optimálása egyenként, SRM módban történtek. A módszerfejlesztés során az egyik legfontosabb lépés a megfelelő szülő ion kiválasztása, amely során nagy m/z értékkel, valamint intenzív ionárammal rendelkező karakterisztikus iont választunk ki további fragmentáció céljából. További feltétel a szülő ion megfelelő és reprodukálható fragmentációja, illetve, hogy a keletkező leány ion(ok) megfelelő szelektivitást és érzékenységet biztosítsanak a mennyiségi és minőségi meghatározásokhoz. Az optimált MS/MS módszer paramétereit, beleértve a kiválasztott szülő ion és a keletkezett leány ionok szelektív tömegeit és lehetséges tömegveszteségeik (fragmentálódásuk) magyarázatát a 10. táblázat tartalmazza. Az NSAID vegyületek TMS (oxim) éter/észter vegyületek molekulaionjai, valamint a trimetil-szilil vegyületekre jellemző metilgyök-vesztéssel ([M-15] + ) keletkező ionok kis intenzitásúak [50], (8. ábra), ezért előnytelen szülő ionokként alkalmazni őket. Az ibuprofen és a naproxen esetén egyaránt a szerves savakra igen jellemző dekarboxilezett [M-TMSC] + forma bizonyult a legkedvezőbb kiindulási szülő ionnak (I = 161 m/z, N = 185 m/z). Hasonló disszociációs út figyelhető meg mindkét vegyület esetén. Az ibuprofen fragmentációja során metán molekulavesztés (161-16 = 145 m/z), míg a naproxen esetén metil-gyök vesztés történik (185-15 = 170 m/z), (10. táblázat). Mindkét esetben a keletkező ionok a tandem tömegspektrum legnagyobb intenzitású ionjai, és további fragmentációjuk elhanyagolható. -46-

Vegyület t R, perc Szülő ion, m/z Gerjesztés tárolási szintje, m/z CID, V Leány ionok *, m/z (relatív százalék, %) Ibuprofen 6,51 161 [M-TMSC] + 70,9 1,05 145 (100) [PI-CH 4 ] + ; 131 (17) [PI-C 2 H 6 ] + Naproxen 9,09 185 [M-TMSC] + 81,5 0,40 170 (100) [PI-CH 3 ] + ; 153 (26) [PI-CH 3 -H] + Ketoprofen-1 9,42 324 [M-TMS] + 142,7 1,20 250 (100); 206 (50) [PI-TMSCH] + ; 207 (50) [PI-TMSC] + ; 308 (47) [PI-CH 4 ] + Ketoprofen-2 9,45 324 [M-TMS] + 142,7 1,20 207 (100); 250 (69); 206 (50); 308 (45) Diklofenak 10,09 242 [M-TMSH-Cl] + 106,6 1,60 178 (100) [PI-C-HCl] + ; 214 (81) [PI-C] + ; 206 (65) [PI-HCl] + 10. Táblázat Az NSAID trimetil-szilil (oxim) éter/észter vegyületek optimált MS/MS paraméterei, a minőségi és mennyiségi meghatározáshoz Jelmagyarázat: t R = retenciós idő, CID = ütközéssel indukált disszociáció, M = molekulaion, PI = parent ion, szülő ion; * A félkövérrel szedett ionokat használtam a mennyiségi analízisekhez -47-

Vizsgálataim elején, az ibuprofen TMS-észterének FS spektrumát elemeztem, amelynek legintenzívebb fragmensionja a 160-as m/z [M-TMSCH] + ion. Bár az ibuprofen eredeti- [66,70], metil- [63,65], butil- [74] és terc-butil-dimetil-szilil [48,50,98,100] származék formájának MS spektruma nem tartalmazza a 160-as m/z fragmensiont, addig az ibuprofen TMS-észterének ez az egyik karakterisztikus ionja [50,73], (8. ábra). 100% ( ) 160.1 546949 75% Si 50% 25% 91.0 142419 117.1 170905 116.1 46217 145.1 169501 149.0 35621 161.1 215834 166.0 34557 205.0 64977 234.1 145153 263.2 218948 262.2 87744 278.3 90881 0% 100 150 200 250 m/z 8. Ábra Az ibuprofen TMS-észterének FS tömegspektruma A 160-as m/z iont szülő ionként alkalmazva, a keletkező leány ionok kis intenzitásúak. A 161-es m/z ion intenzitása bár kisebb, mint a 160-as ioné, mégis jóval több fragmensiont produkált a CID során. Az ellentmondás lehetséges magyarázata, hogy a 160-as ion a molekulaionból egy McLafferty-típusú átrendeződés által keletkezik, egy semleges, TMSCH csoport (118 amu) vesztéssel, és a keletkező kation további fragmentációja már csak kismértékű. Kétlépcsős származékká alakítást követően a ketoprofen TMS (oxim) éter/észtere két csúcsban eluálódik (E- és Z- izomer, 10. táblázat: ketoprofen-1,2) [50]. A két csúcs tömegspektruma azonos, így ugyanazon paraméterek alkalmazhatóak mindkét izomer esetén. Szülő ionként az egyik legintenzívebb, 324-es m/z iont választottam, amely disszociációja azonos leány ionokat eredményez, de az ionok aránya eltérő a két izomer esetén. A kiértékelés során a négy leány iont (m/z: 206, 207, 250 és 308) együttesen értékeltem (10. táblázat). A diklofenak TMS-észterének 242-es m/z ([M-TMSH-Cl] + ) ionjának fragmentációja semleges molekulavesztéssel (C és/vagy HCl) szintén több leány iont produkált (m/z: 178, 206 és 214), (10. táblázat). -48-

A módszerfejlesztés során az automata módszerfejlesztő program (AMD) segítségével végeztem a CID amplitúdó értékek optimálását. A 9. és 10. ábrán a 4 NSAID vegyület TMS (oxim) éter/észterének CID amplitúdó optimálása látható, ahol a CID amplitúdó függvényében a szülő- és leány ion(ok) intenzitását ábrázoltam. A grafikonok alapján könnyen megállapítható az ideális disszociációs feszültség érték. A CID értékeket lépésről lépésre változtatva, minden esetben tanulmányoztam a szülő ion fragmentációját. A szülő ion maximális intenzitása disszociáció nélkül, nulla feszültség értéknél figyelhető meg. A feszültség értékét fokozatosan emelve intenzitása számottevően csökken, míg a leány ion(ok)é jelentősen növekszik. Egy bizonyos érték felett a leány ionok fragmentációja is bekövetkezik, amely a feszültség érték növelésével, egyre nagyobb mértékű lesz. Lehetőség szerint olyan CID értéket választunk ki az MS/MS módszerfejlesztés során, ahol a szülő ion intenzitása kellően lecsökken, a leány ion(ok) intenzitása viszont a maximális értéket éri el, minimális további fragmentáció mellett. A ketoprofen és a diklofenak MS/MS mérése során több leány ion keletkezése figyelhető meg. Ilyen esetekben CID értékként azt az értéket választjuk, ahol a keletkező leány ionok összesített intenzitása maximális. Az ibuprofen, a naproxen és a ketoprofen esetében a kidolgozott MS/MS módszer optimális disszociációs feszültség értékei rendre CID I = 1,05 V, CID N = 0,40 V és CID K = 1,20 V, míg diklofenak esetében nagyobb CID érték bizonyult kedvezőnek (CID D = 1,60 V), amit a klór atomok leszakításához szükséges nagyobb energiákkal és a molekula stabilitásával tudunk értelmezni [63], (10. táblázat és 10. ábra). -49-

9. Ábra CID amplitúdó optimálása: a, ibuprofen és b, naproxen esetén 10. Ábra CID amplitúdó optimálása: c, ketoprofen és d, diklofenak esetén -50-

6.3.3. Az FS, SIM és MS/MS módszerek összehasonlítása a validálási paraméterek alapján Az MS adatgyűjtési módszerek analitikai teljesítmény jellemzőit a 11. táblázatban foglaltam össze. Az FS és a SIM módszer, a korábban már leírt [50] MS módszerek továbbfejlesztett verziója volt (lsd. 6.3.1.1. és 6.3.1.2-es fejezetek). Az azonos készüléken, azonos modell oldatokkal, szűk időintervallumban készített mérések megbízható összehasonlíthatóságot eredményeztek. A táblázat rendre tartalmazza a regressziós koefficiens négyzeteket (R 2 ), a módszerek ismételhetőségét RSD%-ban (relatív standard deviáció, RSD%) kifejezve, meghatározási határait ng/l-ben (LQ) és pg -ban (instrumental limit of quantitation, ILQ), valamint a különböző jel/zaj viszony értékek képzett arányait (7. és 8. oszlop: SIM és FS adatok hányadosa modell és Duna vízmintáknál; 9. és 10. oszlop: MS/MS és SIM adatok hányadosa modell és Duna vízmintáknál). A validálás során 0,5-500 ng/l -es koncentrációtartományban hatpontos külső kalibrációt végeztem. Vegyület Ibuprofen Naproxen Ketoprofen Diklofenak Adatgyűjtési R 2 LQ ILQ S/N értékek arányai **** RSD% (ng/l) ** (pg) *** SIM/FS MS-MS/SIM üzemmód M M DR M DR FS * 0,9813 9,0 1,0 2,67 SIM 0,9959 9,8 0,43 1,15 7,0 1,2 1,7 5,5 MS/MS 0,9995 6,5 0,41 1,10 FS * 0,9962 1,57 1,1 2,93 SIM 0,9976 5,5 1,0 2,70 7,7 1,8 2,3 12 MS/MS 0,9989 6,9 0,42 1,12 FS * 0,9984 3,67 2,6 6,83 SIM 0,9989 9,1 1,0 2,73 8,0-1,7 23 MS/MS 0,9995 6,6 0,49 1,32 FS * 0,9982 4,20 1,4 3,73 SIM 0,9993 4,57 0,41 1,10 20 2,5 2,8 17 MS/MS 0,9993 8,3 0,21 0,55 11. Táblázat Analitikai teljesítményjelzők összehasonlítása GC-MS-FS, GC-MS-SIM és GC-MS/MS módszerek esetén, NSAID vegyületek TMS (oxim) éter/észter származékainak elemzésekor modell oldatban és a 2008. januári Duna vízmintában Jelmagyarázat: M = modell oldat, DR = Duna vízminta * FS = a leírt értékek a [18]-as hivatkozásban is megtalálhatók; ** LQ = S/N 10; *** ILQ = injektált pg/μl, figyelembe véve, hogy 1 μl-t injektáltam a hígítatlan 375 μl származékká alakított oldatból (LQ (ng/l) = injektált pg 375/1000); **** a jel/zaj (S/N) viszonyok hányadosainak számítása 6 párhuzamos injektálás átlagából történt; -51-

Az FS és a SIM értékelés az alábbi ionok alapján történt: 161+234+263+278 (m/z) ibuprofenre, 185+243+287+302 (m/z) naproxenre, 104+324+398+413 (m/z) ketoprofenre és 214+242+277+368 (m/z) diklofenakra; RSD% számítása: 0,5-500 ng/l koncentrációtartományban felvett 6 pontos kalibráció 2 párhuzamos mintájának 3 parallel injektálásának eredményeiből számoltam. Eredményeim alapján megállapítható, hogy a fejlesztett MS módszerek alkalmasak mind a minőségi, mind a mennyiségi meghatározásra. Az illesztett egyenesek R 2 értéke (R 2 0,996) és a módszer ismételhetősége (átlagos RSD% = 6,3) mindhárom technika esetén közel azonos, míg az LQ és az ILQ értékek jelentősen különböznek. A mennyiségi mérés alsó határának azon számított koncentrációértéket tekintettem, ahol teljesült a S/N 10 az adott kromatográfiás csúcsra. Az LQ értékek az FS, SIM és MS/MS sorrendben csökkenő tendenciát mutattak (ibuprofen- (1,0; 0,43; 0,41), naproxen- (1,1; 1,0; 0,42), ketoprofen- (2,6; 1,0; 0,49) és diklofenak esetén (1,4; 0,41; 0,21). A legnagyobb csökkenés a diklofenak esetében volt, az LQ FS /LQ MS/MS 7. Az adatokból kitűnik továbbá, hogy az ibuprofen kivételével fele akkora LQ értékeket kaptam az MS/MS módszerrel, mint a SIM módszerrel. A validálási paraméterek alapján az MS/MS bizonyult a legjobb és legérzékenyebb módszernek. Ezzel jó egyezést mutatott a különböző S/N értékarányok modell oldat és Duna vízminta esetén (11. táblázat). A SIM/FS és az (MS/MS)/SIM arányokat 6 párhuzamos mérés eredményeiből számoltam. Modell oldat esetén azonos mennyiséget, Duna vízminta elemzése során azonos hígítású mintákat mértem. Ezen arányok jól jellemezhetik az esetleges mátrixhatásokat is. Modell oldat esetén a SIM/FS arányok (M oszlop: 7,0; 7,7; 8,0; 20) jól tükrözik a SIM technika jobb érzékenységét az FS módszerhez képest, míg Duna vízminta esetén az FS és a SIM technikákkal szemben az MS/MS módszer bizonyult jobb technikának, amit az (MS/MS)/SIM hányadosok is alátámasztanak (DR oszlop: 5,5; 12; 23; 17). Az adatok birtokában megállapítható, hogy az MS/MS technikával lehet a legnagyobb szelektivitást, és főleg a mátrix jelenlétében a legkisebb LQ-kat elérni, a SIM és az FS módszerrel szemben. A naproxen TMS-észterének azonos mennyiségét mérve, a kapott kromatogramok jól szemléltetik modell oldat esetén a jel/zaj viszonyok számottevő növekedését az FS, a SIM és az MS/MS módszer sorrendjében (11. ábra). Evvel ellentétesen az integrált területek nagysága jelentősen csökken, hiszen míg a mérni kívánt ionok mellett az FS spektruma sok zavaró háttériont is tartalmaz, addig a SIM már jóval tisztább, kevesebb háttérionnal rendelkező tömegspektrumot ad. -52-

Az MS/MS technika szolgáltatja a legjobban kiértékelhető tömegspektrumot, hiszen a spektrum csak egy-két karakterisztikus iont tartalmaz, amik csak a mérni kívánt vegyület disszociációjából származhatnak, ezzel is bizonyítva a módszer szelektivitását és megbízhatóságát (11. és 12. ábra). FS S/N: 201 SIM S/N: 1548 MS/MS S/N: 3402 FS SIM MS/MS 11. Ábra Naproxen TMS-észterének kromatogramjai és spektrumai az FS, a SIM és az MS/MS módszerrel mérve, modell oldat felvétele során -53-

Az (MS/MS)/SIM jel/zaj viszony értékarányokat összehasonlítva, modell oldat és Duna vízminta elemzése esetén, az MS/MS módszer valós minták mérése során számottevően jobb S/N értékeket szolgáltat, ami a kiértékelést nagymértékben könnyíti és megbízhatóbb eredményeket ad. Jól szemlélteti ezt a jelenséget a naproxen meghatározása esetén a 12. ábra, valamint a ketoprofen mérésekor a 13. ábra, a 2008. januári Duna vízminta elemzésekor (1. mintavételi pont; vízállás: 153 cm; vízhőmérséklet: 1,5 C). 12. Ábra Naproxen TMS-észter származékának elúciós profilja és tömegspektruma Duna vízmintában (1. mintavételi pont, 3L vízminta extrahálva 2008. január 16-án) GC-MS-SIM (ábra 1. része, spektrum 1A, 107pg) és GC-MS/MS módszerrel felvéve (ábra 2. része, spektrum 2A, 99 pg); a megadott S/N értékeket 6 injektálás átlagából számoltam -54-

6.3.4. Visszanyerés Az NSAID vegyületek visszanyerési vizsgálatát az irodalmi tapasztalatok alapján szilárdfázisú extrakciót alkalmazva, asis HLB 200mg/6mL tölteten végeztem. A kísérlet során 3L Duna vízmintát (ph = 4) 30-66 ng/l koncentrációtartományban addicionáltam. Minden esetben (hozzáadás nélkül és hozzáadással) 3 párhuzamos mintát készítettem, és minden mintát háromszor injektáltam (n=9), így az eredményeket kilenc adat átlagából számoltam. A műveleti üres és az SPE üres MS/MS elemzése során kapott kromatogramok nem tartalmazták a vizsgált vegyületeket, így korrekciót a kiértékelés során nem alkalmaztam. A visszanyerés átlagos hatékonysága a 4 vegyületre 108% (ibuprofen: 103%, naproxen: 114%, ketoprofen: 96% és diklofenak: 119%), a módszer átlagos ismételhetősége 5,5 RSD% volt. A kapott értékek összhangban voltak korábbi kísérleteink eredményeivel [18,50], ahol az FS módban analizálva a mintákat a visszanyerés átlagos hatékonysága 99%, a módszer átlagos ismételhetősége 6,7 RSD% volt. A mintaelőkészítés lépései megfeleltek az 5.4.4-es fejezetben leírtaknak (4. és 5. ábra). 6.4. Duna vízminták elemzése A különböző adatgyűjtési módszerek összehasonlítása céljából, Duna- és ivóvízmintákat elemeztem (12. táblázat). A Duna vízminták három különböző helyről származtak (1. mintavételi pont: 2008. január; 2. mintavételi pont: 2009. május; 3. mintavételi pont: 2008. szeptember, november és 2009. április). A 3L Duna vízminták előkészítését az 5.4.4-es részben leírtakkal megegyezően végeztem (4. és 5. ábra), és a mennyiségi meghatározásokhoz külső kalibrációt alkalmaztam. Az eredményeket 9 adat alapján számoltam (3 párhuzamos minta, háromszor injektálva, n=9). Az 5 hónap elemzései közül két esetben hasonlítottam össze az FS, a SIM és az MS/MS módszerrel mért adatokat (2008. január és 2008. szeptember). A két hónap eredményei alapján a következők állapíthatóak meg: 1. A három eltérő módszerrel közel azonos eredményeket kaptam a diklofenak koncentrációjára (12. táblázat 2-7. oszlopa). -55-

2. A naproxen koncentrációja kismértékben függ az alkalmazott módszertől, bár az eltérések közelítik a mérési hibát (átlag 5,8 RSD%). A vizsgált két hónap esetén a mért koncentrációértékek csökkenő tendenciája figyelhető meg az FS, SIM és MS/MS sorrendben (2008. január: 74 ng/l, 67 ng/l, 62 ng/l; 2008. szeptember: 13 ng/l, 9,7 ng/l, 8,4 ng/l). 3. Az ibuprofen esetén lényegesen nagyobb koncentrációkat kaptunk az FS és a SIM módszerrel, mint az MS/MS technikával (12. táblázat, 2008. januári és szeptemberi adatok). Az ibuprofen és a 4-hidroxi-benzoesav már ismert koelúciója miatt [18] a közel 100% -os túlmérés nagymértékben indokolja az MS/MS üzemmód alkalmazásának létjogosultságát. 4. A 12. táblázat és a 13. ábra alapján elmondható, hogy a ketoprofen esetén az FS és a SIM technikák nem adnak megbízható eredményt. A SIM technikával mért közel 400%-os túlmérés a ketoprofen TMS (oxim) éter/észter izomerjeinek a C 18 -as telített és telítetlen zsírsavakkal [18], valamint az azóta az analízis rendszerünkbe vont biszfenol A-val mutatott koelúciójának köszönhető. A ketoprofen koncentrációja a 2008. januári Duna vízmintában 305 ng/l volt SIM-, míg 77 ng/l MS/MS módszer esetén. Összefoglalva a leírtakat, az MS/MS módszer használatával kevesebb és karakterisztikusabb ionokat tartalmazó tömegspektrumokat, megbízhatóbb eredményeket kaptam, főképp az ibuprofen és a ketoprofen esetében, míg a naproxen és a diklofenak mérésekor nem számottevő az eltérés a különböző MS módszerekkel mért eredmények között. -56-

13. Ábra Ketoprofen (Ketoprofen-1, Ketoprofen-2, E/Z izomerek) TMS (oxim) éter/észterének elúciós profilja GC-MS-SIM (1. és 2. ábra rész, 1A, 1B, 2A és 2B spektrumok) és GC-MS/MS módszerrel (3. és 4. ábra rész, 3A, 3B, 4A és 4B spektrumok) Az 1. és 3. ábrarészen a 71 pg -nak megfelelő ketoprofen standard felvétele látható. A 2. és 4. ábrarészen található a ketoprofen kromatogramja Duna vízminta mérése során. A kromatográfiás csúcsterület alapján a számított koncentrációértékek SIM módszer esetén 244 pg, ami közel 400% -os túlmérést jelent az MS/MS módszerhez képest (62 pg). -57-

A leírtak eredményeképp, MS/MS technikát választva, még további 3 alkalommal elemeztem Duna vízmintákat (2008. november, 2009. április és 2009. május), (12. táblázat). Az 5 hónap MS/MS eredményei alapján elmondható, hogy: 1. alacsony vízhőmérsékletek esetén a gyógyszerek koncentrációja magasabb (kivéve a 2009. áprilisban mért magas, 931 ng/l -es diklofenak koncentrációt, ami pontszennyezésre utal). További kísérleteket igényel, de feltételezhető, hogy ez a téli hónapokban megnövekedett gyógyszerfogyasztás, a bio- és fotodegradáció, valamint a mikroorganizmusok élettevékenységének csökkenésével van összhangban. Ezen jelenség a szezonális hatás néven vonult be az irodalomba és már több kutatócsoport is foglalkozott vele [127-129]; 2. a 4 vizsgált vegyület közül a diklofenak koncentrációja minden esetben a legmagasabb volt, ami a molekula stabilitásával magyarázható. Korábbi vizsgálataink is bizonyították, hogy a diklofenak a szennyvíztisztítás során nem, vagy csak kismértékben távolítható el (a kezelt szennyvíz átlagos diklofenak tartama 3,27 µg/l, 16 hónap elemzése alapján) [50], így a környezeti vizeket nagyobb mértékben szennyezi, mint az ibuprofen, a naproxen és a ketoprofen, amelyek eltávolítási hatékonysága 36-71% között változik; 3. az ajánlott, felszíni vizekre vonatkozó javasolt határértékeket (I = 200 ng/l; N, K = 100 ng/l), amelyet 27 európai ország 100 folyó vizének elemzése után állítottak fel [130], az ibuprofen- (3,7-50 ng/l), a naproxen- (5,7-62 ng/l) és a ketoprofen koncentrációja (<LQ-77 ng/l) egyetlen esetben sem lépte túl; 4. a diklofenak, amelynek koncentrációja 24 ng/l és 931 ng/l között változott, két esetben is számottevően meghaladta az ajánlott 100 ng/l -es határértéket [130], (2008. január: 224 ng/l és 2009. április: 931 ng/l). -58-

Vegyület Duna vízmintáiban mért NSAID koncentrációk, ng/l (RSD%) * Minta 2008. január 2008. 2009. Limit szeptember november április május ng/l ** Adatgyűjtési üzemmód FS SIM MS/MS FS SIM MS/MS Ibuprofen 109 (8,1) 96 (9,6) 50 (5,4) 13 (13) 9,3 (9,3) 4,4 (9,2) 25 (9,9) 6,4 (5,8) 3,7 (6,6) 200 Naproxen 74 (1,15) 67 (11) 62 (3,83) 13 (13) 9,7 (6,2) 8,4 (11) 27 (6,4) 8,7 (7,0) 5,7 (11) 100 Ketoprofen <LQ 305 (5,3) 77 (6,7) <LQ <LQ <LQ 11 (3,32) <LQ <LQ 100 Diklofenak 235 (3,72) 212 (5,8) 224 (4,21) 21 (26) 20 (7,2) 24 (6,8) 82 (4,26) 931 (3,89) 49 (10) 100 12. Táblázat Duna vízmintáiban mért NSAID vegyületek TMS (oxim) észtereinek koncentrációja (5 hónap eredményei), az alkalmazott GC-MS mérési módszertől függően (FS, SIM, MS/MS) Jelmagyarázat: * (RSD%) = 3 különböző SPE extrakció 3 párhuzamos injektálásának eredményeiből számolva; ** Limit = javasolt határértékek felszíni víz esetén [130]; A félkövérrel szedett értékek meghaladták az ajánlott határértékeket -59-

6.4.1. Ivóvízminták elemzése Budapest ivóvízkészletét a Fővárosi Vízművek Duna partvonala mentén található parti szűrésű kútjai szolgáltatják. Jelenleg több mint 700 ivóvízkút található a Szentendrei-sziget, a Csepel-sziget és a Margit-sziget partjai mentén, amelyek napi teljes kapacitása közel egymillió köbméter ivóvíz/nap. Az irodalmi tanulmányok alapján az ivóvizek NSAID tartalmát csak ritkán mérték. Az ivóvízben mért mennyiségek közel a kimutatási határhoz, a 0,2-10 ng/l -es koncentrációtartományban [69,100,126,131,132], vagy az LQ értékek alatt voltak [68,73,74,79], részletesen lsd. a 6.6.8-as fejezetben. Az ivóvízmintákat (3L) az 1. mintavételi ponton, az ELTE Lágymányosi campusán vételeztem, amelyek előkészítése az 5.4.4-es részben leírtaknak megfelelően történtek (4. és 5. ábra). Számos alkalommal elemeztem ivóvízmintákat a SIM és az MS/MS módszerrel, amelyek során egyetlen minta esetén sem találtam kimutatható mennyiségű NSAID szennyezettséget (<LQ). 6.5. Az NSAID tanulmány eredményeinek összefoglalása 1. A négy leggyakoribb, nem-szteroid gyulladáscsökkentő és fájdalomcsillapító: az ibuprofen, a naproxen, a ketoprofen és a diklofenak vizsgálatát végeztem el trimetil-szilil (oxim) éter/észter származékokként, SIM módszerrel, a Duna vizében és az ivóvízben. 2. A mennyiségi meghatározás szelektivitásának fejlesztése érdekében optimáltam és validáltam a négy NSAID trimetil-szilil (oxim) éter/észter származékok MS/MS módszerét. 3. Összehasonlítottam a három MS adatgyűjtési módszert az analitikai teljesítményjellemzők alapján, ugyanazon körülmények között (a készülék állapota és a minták előkészítése azonos volt). 4. A naproxen és a diklofenak elemzése során a különböző MS módszerek közel azonos eredményeket adtak, míg az ibuprofen és a ketoprofen esetében csak az MS/MS módszer szolgáltat kellően megbízható eredményeket. 5. A validált MS/MS módszerrel 5 havi Duna vízmintákat mértem (2008. január, szeptember, november és 2009. április, május). -60-

6. Az ibuprofen, a naproxen és a ketoprofen koncentráció értékei (I = 3,7-50 ng/l; N = 5,7-62 ng/l; K = <LQ-77 ng/l) a javasolt határértékek [130] alatt voltak. 7. A diklofenak koncentrációja két esetben meghaladta a 100 ng/l tervezett határértéket [130], (224 ng/l és 931 ng/l). Koncentrációja széles skálán változott az öt mérési hónap során (24-931 ng/l). 8. Ivóvízminták MS/MS elemzésekor, egyetlen minta esetén sem találtam kimutatható mennyiségű NSAID szennyezettséget (<LQ). -61-

6.6. Sok összetevő (multiresidue) vizsgálatára alkalmas módszer fejlesztése Korábbi Duna vízminták elemzései során azt tapasztaltuk, hogy a négy NSAID vegyületen kívül más szerves mikroszennyezők is jelentős mennyiségben vannak jelen a mintákban [18]. Doktori munkám második részében ezért célul tűztem ki az MS/MS módszer továbbfejlesztését, egyéb gyógyszermaradványok és más szerves szennyezők elemzésére, trimetil-szilil (oxim) éter/észter származékokként, illetve eredeti formáikban. 6.6.1. Az MS/MS módszer vizsgált szennyezői Korábbi vizsgálataink [18,50,133] és az irodalom áttekintése [63,69,72,76,97,98,111, 118-121] alapján összesen 42 vegyületet választottam ki az MS/MS módszer bővítése céljából. A kiválasztott vegyületek továbbiakban használt nevei és IUPAC nevei az 5.1-es fejezetben találhatók. A vizsgált komponenseket a kémiai szerkezet és/vagy a felhasználás célja szerint csoportosítottam. Az alábbi ábrákon (14-19. ábra) a vegyületek szerkezeti képletei szerepelnek. A vegyületek számozása a 7. táblázatnak megfelelően történt. 6.6.1.1. Aromás karbonsav származékok Az aromás karbonsav származékok felhasználása sokrétű, így az élet számos területén előfordulnak és igen nagy mennyiségben használjuk őket. Különböző ipari alapanyagokként, fertőtlenítőszerként, valamint az élelmiszeriparban tartósítószerként alkalmazzák őket. A benzoesavat felhasználják élelmiszeripari tartósítószerként és a gyógyászatban gombabetegségek gyógyítására. A fenil-ecetsavat parfümök illatanyagaként, illetve a penicillin G termelésekor alkalmazzák. A szalicilsav láz- és fájdalomcsillapító hatású, kozmetikumok és testápolószerek fontos összetevője, valamint tartósítószerként való felhasználása is jelentős. A jól ismert aszpirin (acetil-szalicilsav) metabolizmusa során is keletkezik, bár nem ez a gyógyszer elsődleges metabolitja. A 4-hidroxi-metil-benzoát és a 4-hidroxi-etil-benzoát, közismertebb nevükön metil- és etil-parabének elsősorban kozmetikai szerek tartósítószerei. Szennyvízelemzéseink során ezt a vegyületcsoportot többségében kezeletlen szennyvizekben is megtaláltuk és µg/l-es koncentrációban mértük [18]. A témában feldolgozott irodalmak egyikében sem találtam olyan közleményt, amiben ennyiféle aromás karbonsav származékot mértek volna, így a nemzetközi adatokkal történő összehasonlításra csak korlátozottan volt lehetőségem. Bár a szennyvíztisztítás igen jó hatásfokú -62-

e vegyületekre, a nagy mennyiségű felhasználásuk miatt potenciálisan előfordulhatnak felszíni- és ivóvizeinkben is. Az elemzett 10 vegyület szerkezeti képlete a 14. ábrán látható. Aromás karbonsav származékok 1. benzoesav 2. fenil-ecetsav 3. 2-fenil-propionsav H H H 5. szalicilsav 6. 4-hidroxi-metil-benzoát 8. 3-hidroxi-benzoesav H H H H H 9. 4-hidroxi-etil-benzoát 10. 4-hidroxi-benzoesav 13. 4-hidroxi-fenil-ecetsav H H H H H 15. 3-(4-H-fenil)- propionsav H H 14. Ábra Aromás karbonsav származékok -63-

6.6.1.2. A nem-szteroid gyulladáscsökkentő és fájdalomcsillapító gyógyszerek A doktori értekezésem első részében bemutatott 4 vegyületen kívül még további két, nemszteroid gyulladáscsökkentőt vontam be az MS/MS analízisrendszerbe, a paracetamolt, és a fenoprofent (15. ábra). Mindkét vegyület széles körben használt, hatásos láz- és fájdalomcsillapító anyagok. Az International Medical Services (IMS) adatai alapján csak a paracetamolból közel 2000 tonna fogyott világszerte a 2000-es évben (nem publikált adat). Nem-szteroid gyulladáscsökkentők 11. ibuprofen 16. paracetamol 23. fenoprofen H H H N H 28. naproxen 31. ketoprofen 34. diklofenak Cl H H NH Cl H 15. Ábra Nem-szteroid gyulladáscsökkentők és fájdalomcsillapítók 6.6.1.3. Egyéb gyógyszerhatóanyagok A vizsgált vegyületek körét bővítve, további gyógyszerhatóanyagokra dolgoztam ki az elemző MS/MS módszert. E vegyületek között egy herbicid (gyomirtó) is található, a klofibrinsav, amely a koleszterinszint-csökkentő klofibrát metabolizmusa során is keletkezik. Anyagcsere szabályozó továbbá a gemfibrozil és a fenofibrát is. A metoprolol szelektív, míg a propranolol nem szelektív β-receptor blokkoló. Hatásosan alkalmazzák őket magas vérnyomás és szívpanaszok kezelésére. A karbamazepint antiepilepsziás szerként és alkoholelvonási tünetek enyhítésére használják. A metotrimeprazin antipszichotikus hatású vegyület, alvászavarok esetén is használatos. -64-

Gyógyszerhatóanyagok 10. klofibrinsav * 21. gemfibrozil 26. metoprolol Cl H H N H H 29. propranolol 33. karbamazepin 37. fenofibrát N H Cl H NH 2 38. metotrimeprazin N N S 16. Ábra Gyógyszerhatóanyagok; * a klofibrát metabolitja 6.6.1.4. Műanyag- és kozmetikai adalékanyagok A 2,4-di-terc-butil-fenolt antioxidánsként alkalmazzák gumikhoz, műanyagokhoz, üzemanyagokhoz, valamint a gyógyszer- és az illatszergyártás egyik alapanyaga. A dibutilés a dioktil-ftalátot főképp műanyagokban, általános lágyítószerként használják. Valószínűsíthetően rákkeltő és EDC hatású vegyületek. Növényvédő szerekben, ragasztókban és kozmetikai készítményekben is alkalmaznak ftalátokat. A ftalátok magyarországi felhasználásáról nem találtam konkrét számadatokat, de Kínában dioktil-ftalátból kb. 600.000 tonnát állítanak elő évente. -65-

Műanyag és kozmetikai adalékanyagok 7. 2,4-di-terc-butil-fenol 22. dibutil-ftalát 36. dioktil-ftalát H 17.a. Ábra Műanyag és kozmetikai adalékanyagok 6.6.1.5. A koffein és a ferulasav A koffeintartalmú (pl. kávé, tea) növények kivonatát élvezeti szerként ősidők óta használja az emberiség. Élénkítő hatású üdítőitalok (kólák és energiaitalok) és kombinált fájdalomcsillapítók (pl. Saridon) előállításához is felhasználják. A gyógyászatban alkoholmérgezés és kimerültség kezelésére is alkalmazzák. Jelenléte a környezeti vízmintákban tipikusan antropogén hatásra vezethető vissza. A ferulasav a természetben is megtalálható, több aromás vegyület alapanyaga. A szervezetben antioxidáns hatású. Pszichostimuláns Természetes antioxidáns 20. koffein 27. ferulasav N N H N N H 17.b. Ábra A koffein és a ferulasav szerkezeti képlete -66-

6.6.1.6. Telített-, telítetlen zsírsavak és dikarbonsavak Az utolsó csoportban a telített- és telítetlen zsírsavak, valamint a dikarbonsavak kaptak helyet. E vegyületek előfordulása gyakori, hiszen mind természetes, mind antropogén forrásból származhatnak. Felhasználásuk széleskörű, alapanyagai lehetnek kozmetikumoknak, mosóporoknak és higiéniás termékeknek. Telített zsírsavak Dikarbonsavak C-9 17. azelainsav H H 4. kaprinsav 19. szebacinsav C-10 H H H Telített zsírsavak Telítetetlen zsírsavak 14. laurinsav C-12 H 18. mirisztinsav C-14 H 25. palmitinsav 24. palmitolajsav C-16 H H 32. sztearinsav 30. olajsav C-18 H 35. arachinsav H C-20 H 18. Ábra Telített-, telítetlen zsírsavak és dikarbonsavak -67-

6.6.1.7. Szteránvázas vegyületek Kémiai szerekezetükre egységesen jellemző a szteránváz. Két nemi hormont, az ösztront és a β-ösztradiolt, egy epesav- és hormon-prekurzort, a koleszterint, valamint egy epesavat, a kólsavat vizsgáltam. Ezen anyagokat a természetes vizekben előforduló gerinces élőlények is kibocsátják, ugyanakkor a koleszterin és a kólsav magasabb koncentrációban indikátora lehet a vizeket érő fekália-szennyezéseknek [134]. Szteránvázas vegyületek 39. ösztron 40. β-ösztradiol 41. koleszterin H H H H H H H H H H H H H 42. kólsav H H H H H H H H 19. Ábra Szteránvázas vegyületek A tanulmányozott 42 szennyezőanyag fizikai és kémiai tulajdonságai a 20. táblázatban találhatóak, amelynek fejléce a következőket tartalmazza: vegyület, összegképlet, CAS-szám, molekulatömeg (M t ), oldhatóság, LogK ow és pka érték. A táblázatból kitűnik, hogy a LogK ow és a pka értékek széles tartományban változnak, előbbi állandó tekintetében a hidrofil -0,07-től a lipofil 9,29-ig, utóbbi állandó esetén pedig a savas 2,97-től a bázikus 13,9-es értékig. Elmondható, hogy a vegyületek többsége gyengén savas karakterű. ldhatóságuk 0,3 µg/l és 60,7 g/l között változik. A legoldhatatlanabb vegyületek közé a zsírsavak, a koleszterin és a dioktil-ftalát tartoznak. Kiemelkedően jól oldódnak az aromás karbonsavak, a paracetamol, a metoprolol és a koffein. -68-

Vegyület Összegképlet CAS-szám M t ldhatóság Log (g/mol) (mg/l) K ow pk a 1. benzoesav C 7 H 6 2 65-85-0 122,12 3400 1,87 4,19 2. fenil-ecetsav C 8 H 8 2 103-82-2 136,15 16600 1,41 4,31 3. 2-fenil-propionsav C 9 H 10 2 492-37-5 150,17 4987 1,85 4,90 4. kaprinsav C 10 H 20 2 334-48-5 172,26 62 4,09 4,90 5. szalicilsav C 7 H 6 3 69-72-7 138,12 2240 2,26 2,97 6. 4-hidroxi-metil-benzoát C 8 H 8 3 99-76-3 152,15 2500 1,96 3,91 7. 2,4-di-terc-butil-fenol C 14 H 22 96-76-4 206,32 35 5,19 11,72 8. 3-hidroxi-benzoesav C 7 H 6 3 99-06-9 138,12 7250 1,50 4,30 9. 4-hidroxi-etil-benzoát C 9 H 10 3 120-47-8 166,17 885 2,47 3,85 10. klofibrinsav C 10 H 11 Cl 3 882-09-7 214,65 583 2,57 3,46 11. ibuprofen C 13 H 18 2 15687-27-1 206,29 21 3,97 4,51 12. 4-hidroxi-benzoesav C 7 H 6 3 99-96-7 138,12 5000 1,58 4,54 13. 4-hidroxi-fenil-ecetsav C 8 H 8 3 156-38-7 152,15 60700 0,75 4,80 14. laurinsav C 12 H 14 2 143-07-7 200,32 4,8 4,60 5,30 15. 3-(4-H-fenil)-propionsav C 9 H 10 3 501-97-3 166,17 18300 1,16 6,50 16. paracetamol C 8 H 9 N 2 103-90-2 151,17 14000 0,46 9,38 17. azelainsav C 9 H 16 4 123-99-9 188,22 2400 1,57 4,55 18. mirisztinsav C 14 H 28 2 544-63-8 228,37 1,1 6,11 4,82 19. szebacinsav C 10 H 18 4 111-20-6 202,25 1000 2,19 4,21 20. koffein C 8 H 10 N 4 2 58-08-2 194,19 21600-0,07 10,4 21. gemfibrozil C 15 H 22 3 25812-30-0 250,33 19 4,39 4,77 22. dibutil-ftalát C 16 H 22 4 84-74-2 278,34 11 4,50 3,79 23. fenoprofen C 15 H 14 3 31879-05-7 242,27 30 3,90 4,20 24. palmitolajsav C 16 H 30 2 2091-29-4 254,41 0,13 6,58 5,69 25. palmitinsav C 16 H 32 2 57-10-3 256,42 0,041 7,17 4,17 26. metoprolol C 15 H 25 N 3 37350-58-6 267,36 16900 1,88 8,50 27. ferulasav C 10 H 10 4 537-98-4 194,18 5970 1,51 4,58 28. naproxen C 14 H 14 3 22204-53-1 230,27 51 3,18 4,20 29. propranolol C 16 H 21 N 2 525-66-6 259,34 62 3,48 9,42 30. olajsav C 18 H 34 2 112-80-1 282,46 0,011 7,64 5,02 31. ketoprofen C 16 H 14 3 22071-15-4 254,28 159 3,12 4,45 32. sztearinsav C 18 H 36 2 57-11-4 284,48 0,60 8,23 5,60 33. karbamazepin C 15 H 12 N 2 298-46-4 236,27 112 2,45 13,90 34. diklofenak C 14 H 11 Cl 2 N 2 15307-86-5 296,15 2,4 4,51 4,15 35. arachinsav C 20 H 40 2 506-30-9 312,53 0,0003 9,29 4,82 36. dioktil-ftalát C 24 H 38 4 117-81-7 390,56 0,27 7,60 4,21 37. fenofibrát C 20 H 21 4 Cl 49562-28-9 360,83 0,20 5,19 4,46 38. metotrimeprazin C 19 H 24 N 2 S 60-99-1 328,47 20 4,68 9,19 39. ösztron C 18 H 22 2 53-16-7 270,37 30 3,13 10,77 40. β-ösztradiol C 18 H 24 2 50-28-2 272,38 3,6 4,01 10,71 41. koleszterin C 27 H 46 57-88-5 386,65 0,10 8,74 3,51 42. kólsav C 24 H 40 5 81-25-4 408,57 175 2,02 4,98 20. Táblázat A vizsgált vegyületek főbb jellemzői -69-

6.6.2. A multiresidue analízis tömegspektrometriás tanulmánya A felsorolt, összesen 42 vegyületet, trimetil-szilil (oxim) éter/észter származékokként, illetve eredeti formáikban mind az FS, mind az MS/MS módszerrel vizsgáltam. A cél olyan GC-MS technika kidolgozása volt, amely alkalmas a 42 vegyület egyidejű meghatározására. 6.6.2.1. Az FS 42 komp. program optimális paraméterei Az FS 42 komp. program a [18]-as hivatkozásban leírt FS módszer továbbfejlesztett verziója, alap paraméterei megfelelnek a 6.3.1.1-es fejezetben leírtaknak. A további beállítások a következők voltak: Az FS 42 komp. program esetén a módszer 4 szegmensből állt, úgymint: 1. szegmens: 0-4,50 perc: oldószerfront miatt adatgyűjtés nincs. 2. szegmens: 4,50-13,00 perc: a mért m/z tartomány: 76-450, kihagyva a 146, 147, 206-208 és 281-es ionokat. A pásztázás átlagos sebessége 2 µscan (0,97 s/scan) volt. 3. szegmens: 13,00-18,00 perc: a mért m/z tartomány: 76-550, kihagyva a 146, 147, 206-208, 221, 222, 281, 355 és 356-os ionokat. A pásztázás átlagos sebessége 2 µscan (1,44 s/scan) volt. 4. szegmens: 18,00-31,00 perc: a mért m/z tartomány: 102-750, kihagyva a 146, 147, 206-208, 221, 222, 281, 355 és 356-os ionokat. A pásztázás átlagos sebessége 2 µscan, ami 1,48 s/scan sebességet jelent ebben az esetben. 6.6.2.2. A szennyezők fragmentum-analitikai tanulmánya FS módszer esetén A választott vegyületek származékká alakítása megfelelt a modell oldatok esetén az 5.4.3-as és Duna vízminták esetén az 5.4.6-os fejezetben leírtaknak. Az oximálási reakciót (a ketoprofen, a fenofibrát és az ösztron esetében) követően a szililezés során általában 1-4 TMS-csoport kapcsolódhat a molekulához. A vizsgált vegyületek közül a koffeint, a dibutil- és dioktil-ftalátot, illetve a metotrimeprazint változatlan formában mértem, mivel ezek nem vettek részt a származékképzési reakcióban. Az analízishez kiválasztott szelektív fragmentum ionok (SFI) és a hozzájuk tartozó feltételezett összegképlet a 21. táblázatban található. A 42 vegyület fragmentációja eltérő, mégis a rokon kémiai szerkezeteknél hasonló disszociációs utak fordulnak elő. -70-

A szalicilsav (2-hidroxi-benzoesav), a 3-hidroxi benzoesav és a 4-hidroxi benzoesav fragmentációja azonos, hiszen a három molekula egymás konstitúciós izomerjei. A szilil-származékaik esetén jellegzetesen előforduló ionok, mint a molekulaion ([M].+ = 282) és az egy metil-csoport leszakadásával keletkező ion ([M-CH 3 ] + = 267) megfigyelhető a spektrumukban. Az egyéb fragmentációs utakon keletkező [M-TMS] + = 193-as és [C 6 H 5 Si(CH 3 ) 2 ] + = 135-ös, illetve az aromás rendszerekre jellemző, kevésbé szelektív [C 6 H 5 C] + = 105-ös ionok nagyobb intenzitással mérhetőek. A dialkil-ftalátok fragmentációja jellegzetes. Karakterisztikus, az észteresítő oldallánc kémiai szerkezetétől függetlenül, nagy intenzitással megjelenő [C 8 H 5 3 ] + = 149-es fajlagos tömegű fragmension. A zsírsavak TMS-észterei is oldallánctól függetlenül, speciális módon fragmentálódnak. A tömegspektrumban megjelenik a kis intenzitású molekulaion mellett a metil-csoportvesztéssel keletkező nagy intenzitású [M-15] + ion, valamint, egy négy ionból álló, igen jellemző ionköteg (117 m/z, 129 m/z, 132 m/z és 145 m/z). A legnagyobb + intenzitású 117-es m/z ion, a zsírsavak dekarboxileződésével keletkező, C 2 Si(CH 3 ) 3 összetételű ion. A pásztázó üzemmód során a kiértékeléseket a 21. táblázatban megadott szelektív fragmens ionok alapján végeztem. -71-

Vegyület [M].+ [M-CH 3 ] + Szelektív fragmentum ionok, (m/z) 1. benzoesav-1tms 194 179 [M-(C-CH 3 )] + =135, [M-TMS] + = 105 2. fenil-ecetsav-1tms 208 193 [M-(CH 3 -C)] + = 165, [M-TMSH] + = 118, [M-TMSC] + = 91 3. 2-fenil-propionsav-1TMS 222 207 [M-TMSC] + = 105, [M-(CH 2 CTMS)] + = 91 4. kaprinsav-1tms 244 229 [M-(C 7 H 16 +CH 3 )] + = 129, [M-C 9 H 19 ] + = 117 5. szalicilsav-2tms 282 267 [M-TMS] + = 193, [C 6 H 5 Si(CH 3 ) 2 ] + =135, [C 6 H 5 C] + = 105 6. 4-hidroxi-metil-benzoát-1TMS 224 209 [M-(CH 3 + CH 3 H)] + = 177, [M-TMS] + = 135, [C 6 H 5 C] + =105 7. 2,4-di-terc-butil-fenol-1TMS 278 263 [M-(TMS+CH 2 )] + = 175 8. 3-hidroxi-benzoesav-2TMS 282 267 [M-TMS] + = 193, [C 6 H 5 Si(CH 3 ) 2 ] + =135, [C 6 H 5 C] + = 105 9. 4-hidroxi-etil-benzoát-1TMS 238 223 [M-C 2 H 5 ] + = 193, [M-(TMS+CH 3 )] + = 134 10. klofibrinsav-1tms 287 272 [M-TMSCH] + = 169, [M-(TMSC+C 3 H 6 )] + = 128 11. ibuprofen-1tms 278 263 [M-C] + = 234, [M-TMSCH] + = 160 12. 4-hidroxi-benzoesav-2TMS 282 267 [M-TMS] + = 193, [C 6 H 5 Si(CH 3 ) 2 ] + = 135, [C 6 H 5 C] + = 105 13. 4-hidroxi-fenil-ecetsav-2TMS 296 281 [M-C] + = 252, [M-TMSC] + = 179, [M-(TMSC+CH 3 )] + = 164 14. laurinsav-1tms 272 257 [M-(C 9 H 20 +CH 3 )] + = 129, [M-C 11 H 23 ] + = 117 15. 3-(4-hidroxi-fenil)- propionsav-2tms 310 295 [M-(TMS-CH 4 )] + = 205, [M-TMSCH] + = 192, [M-(TMSCH+CH 3 )] + = 177 16. paracetamol-2tms 295 280 [M-TMS] + = 206 17. azelainsav-2tms 332 317 [M-(C 9 H 20 2 Si+CH 3 )] + = 129, [M-C 7 H 14 CTMS] + = 117 18. mirisztinsav-1tms 300 285 [M-(C 11 H 24 +CH 3 )] + = 129, [M-C 13 H 27 ] + = 117 19. szebacinsav-2tms 346 331 [M-(C 10 H 22 2 Si+CH 3 )] + = 129 [M-C 8 H 16 CTMS] + = 117 20. koffein 194 * - [M-C 2 H 5 ] + = 165, [M-C 3 H 3 N 2 ] + = 109 21. gemfibrozil-1tms 322 307 [M-C 6 H 11 C] + = 195, [M-C 6 H 11 CTMS] + = 122 22. dibutil-ftalát 278 * - [M-C 4 H 7 ] + = 223, [M-C 4 H 9 ] + = 205, [M-C 8 H 17 ] + = 149 23. fenoprofen-1tms 314 299 [M-C 2 H 5 ] + = 269, [M-TMSCH] + = 196 24. palmitolajsav-1tms 326 311 [M-(C 13 H 26 +CH 3 )] + = 129, [M-C 15 H 29 ] + = 117 25. palmitinsav-1tms 328 313 [M-(C 13 H 28 +CH 3 )] + = 129, [M-C 15 H 31 ] + = 117 26. metopropol-1tms 339 324 [M-TMS] + = 266, [M-(TMS+C 3 H 7 )] + = 223 27. ferulasav-2tms 338 323 [M-(CH 3 ) 2 ] + = 308, [M-TMS] + = 249 28. naproxen-1tms 302 287 [M-(C+CH 3 )] + = 243, [M-TMSC] + = 185 29. propranolol-1tms 331 316 [M-(TMS+C 2 H 4 )] + = 230, [M-(TMS+C 3 H 7 )] + = 215, [M-(TMS+C 6 H 12 N)] + = 144 30. olajsav-1tms 354 339 [M-(C 15 H 30 +CH 3 )] + = 129, [M-C 17 H 33 ] + = 117 31. ketoprofen-oxim-2tms 413 398 [M-TMS] + = 324, [M-(TMS+TMSC)] + = 207 32. sztearinsav-1tms 356 341 [M-(C 15 H 32 +CH 3 )] + = 129, [M-C 17 H 35 ] + = 117 33. karbamazepin-1tms 308 293 [M-TMSNC] + = 193 34. diklofenak-1tms 367 352 [M-TMSH] + = 277, [M-(TMS+HCl)] + = 242, [M-(TMSC+HCl)] + = 214 35. arachinsav-1tms 384 369 [M-(C 17 H 36 +CH 3 )] + = 129, [M-C 19 H 39 ] + = 117 36. dioktil-ftalát 390 * - [M-C 8 H 15 ] + = 279, [M-C 16 H 33 ] + = 149 37. fenofibrát-oxim-1tms 447 432 [M-C 7 H 11 3 ] + = 304, [M-(TMS+C 7 H 12 3 )] + = 230 38. metotrimeprazin 328 * - [M-(CH 3 +CH 3 )] + = 282, [M-C 5 H 12 N] + = 242, [M-C 6 H 13 N] + = 229, [M-(C 6 H 14 N+H 2 )] + = 210 39. ösztron-oxim-2tms 429 414 [M-(TMS+C 8 H 10 )] + = 218 40. β-ösztradiol-2tms 416 401 [M-TMSH] + = 326, [M-(TMSH+C 3 H 5 )] + = 285 41. koleszterin-1tms 458 443 [M-TMSH] + = 368, [M-(TMSH+CH 3 )] + = 353, [M-(TMS+C 3 H 4 )] + = 329 42. kólsav-4tms 696 681 [M-2TMSH] + = 516, [M-3TMSH] + = 426 21. Táblázat A vizsgált vegyületek TMS (oxim) éter/észter származékainak szelektív fragmentum ionjai és azok feltételezett összetétele Jelmagyarázat: M.+ = molekulaion, * = alapállapotban mérhető vegyület -72-

6.6.2.3. Az MS/MS 42 komp. program optimális paraméterei Az MS/MS 42 komp. program alap beállításai megfeleltek a 6.3.2.1-es részben leírtaknak, részletes leírása ott található. A módszer optimálása vegyületenként, lépésről lépésre történt, a 6.3.2.2-es fejezetnek megfelelően. Az ideális szülő ion és a megfelelő CID érték kiválasztását SRM módban végeztem el. A 22. táblázat tartalmazza a 42 vegyületre optimált MS/MS módszer jellemzőit (retenciós időket, optimális disszociációs feszültség értékeket, szülő ionokat és a belőlük keletkezett leány ion(oka)t, amely(eket) a minőségi és mennyiségi értékelésekhez használtam). A gázkromatográfiás elválasztások során a retenciós időket az FS- és az MS/MS 42 komp. program 5.3.2-es fejezetben leírt injektor és kromatográfiás oszlop hőmérsékletprogramja mellett határoztam meg. A retenciós idők sok esetben közelítik egymást, így az SRM használata a legtöbb vizsgált vegyület esetében nem célszerű, ezért a komponensek egyenkénti optimálását követően, 18 aktív (22. táblázat) és 2 passzív (a 0-4,50 perc és a 25,00-31,00 perc között adatgyűjtés nincs) szegmensre bontottam az MS/MS 42 komp. programot. Méréseim során bizonyítást nyert, hogy bár a készülék a műszerkönyvi ajánlások alapján tíz vegyület egyidejű MS/MS mérésére alkalmas (MRM), egy idő szegmensben nem érdemes négynél több vegyületet vizsgálni az MS/MS technikával, mivel ellenkező esetben az egy vegyületre jutó válaszjel jelentősen csökken. A szülő ionok kiválasztása során azt tapasztaltam, hogy a várt fajlagos tömegű ion alkalmazása helyett gyakran sokkal eredményesebb az (m/z + 1 amu) tömeg/töltésű szülő ion használata (22. táblázat). Mivel a fenti jelenségre, mely leginkább a kémiai ionizáció során keletkező protonált ionok képződéséhez hasonlít, sem a műszerkönyvben, sem az ioncsapda analizátorral készített irodalmi elemzésekben nem találtam utalást, ezért a Varian készülékek fejlesztőmérnökeitől kértem magyarázatot. Válaszukban a következő lehetséges okokra hivatkoztak: 1. a csapda nem megfelelően lett kalibrálva; 2. a csapda túlterhelt; 3. az MS alacsony felbontású (egységnyi) és a mért tömegeket állandóan felfelé kerekíti. -73-

Ezen magyarázatok egyikét sem tudtam elfogadni, mivel: 1. rendszeres tömegkalibrálást és úgynevezett auto tune -t végeztem, egy erre a célra rendszeresített kalibráló anyaggal, amely során a diagnosztika minden esetben hibátlanul lefutott; 2. a program Automatic Gain Control (AGC) része próbaszkennelést hajt végre, ami alapján kiválasztja a megfelelő ionizációs időt, ez hivatott a csapda túlterhelését elkerülni, valamint a kalibrálás során az alsó koncentráció tartományokban mért válaszjelek is lineárisnak bizonyultak az m+1-es tömegekre; 3. a tömegspektrumokban látszólag tizedes pontossággal tud különbséget tenni az MS (1000 körüli felbontás érték). Bár a magyarázatot nem sikerült megtalálnom a jelenségre, a további méréseim során 81% -ban bizonyult előnyösebbnek a plusz egy tömegegységgel nagyobb szülő ionok alkalmazása. Az optimált fragmentációs feszültség értékek széles tartományban, 0,35-2,85 V között változtak. -74-

Sz. * t Vegyület R, Szülő ion CID perc (m/z) (V) Leány ion(ok) (m/z) 1. benzoesav 4,80 180 0,50 135 2. fenil-ecetsav 5,53 194 1,45 137+165 2-fenil-propionsav 5,58 106 0,50 79+103 3. kaprinsav 7,22 130 0,60 85 szalicilsav 7,83 268 0,85 249 4. 4-hidroxi-metil-benzoát 7,85 225 0,35 209 2,4-di-terc-butil-fenol 8,13 264 0,75 207+235 3-hidroxi-benzoesav 8,49 268 1,39 223 5. 4-hidroxi-etil-benzoát 8,63 239 0,75 210 klofibrinsav 8,71 170 0,65 141 ibuprofen 9,17 161 1,05 145 6. 4-hidroxi-benzoesav 9,19 267 0,65 223 4-hidroxi-fenil-ecetsav 9,32 297 0,50 252 laurinsav 9,43 130 0,60 85 3-(4-H-fenil)-propionsav 10,64 193 1,05 177 7. paracetamol 10,66 296 0,82 179 azelainsav 10,96 150 1,35 133 mirisztinsav 11,49 130 0,75 85 8. szebacinsav 11,94 150 1,35 133 koffein 12,21 195 1,75 149+178 gemfibrozil 12,40 195 1,75 179 9. dibutil-ftalát 12,85 150 2,85 121 fenoprofen 13,15 271 0,45 255 10. palmitolajsav 13,23 130 0,60 85 palmitinsav 13,40 130 0,60 85 metoprolol 13,81 325 1,61 207+239 11. ferulasav 13,93 339 0,35 323 naproxen 14,04 185 0,40 170 propranolol 14,80 231 1,18 185+213 12. olajsav 14,95 130 0,60 85 ketoprofen-oxim 15,02 (15,12) 324 1,20 207+250+308 sztearinsav 15,16 130 0,60 85 karbamazepin 15,38 194 1,90 165+191 13. diklofenak 15,90 242 1,60 178+206+214 arachinsav 16,80 130 0,60 85 14. dioktil-ftalát 17,70 150 1,50 121 15. fenofibrát-oxim 17,96 305 1,70 230 metotrimeprazin 18,24 328 0,65 229+283 16. ösztron-oxim 18,70 218 0,89 201+203 β-ösztradiol 18,80 416 0,80 285+326 17. koleszterin 21,98 369 0,65 339+353 18. kólsav 22,95 428 0,70 253 22. Táblázat A vizsgált vegyületek TMS (oxim) éter/észter származékainak MS/MS paraméterei Jelmagyarázat: a Rövidítések jegyzékében; Sz. * = szegmens, t R = retenciós idő -75-

6.6.3. Az üresek kérdésköre Az analitikai eredmények megbízhatósága nagymértékben függ a helyes laboratóriumi munkától. A nyomelemezés során az érzékenység egy igen fontos szempont, de a vak minták, továbbiakban üresek kérdése sem elhanyagolható ilyen kicsi koncentrációk mérése esetén. Annak eldöntése pedig, hogy a szennyezés valóban létezik-e, vagy a minták vételezése, előkészítése esetleg mérése során kerül be a rendszerbe, a jó analitikai munka egyik kulcskérdése. Az üres minták sokféleségét leginkább a mintaelőkészítés lépcsői szabják meg, mivel minden egyes folyamatot külön-külön üressel tudunk jellemezni. A gyakorlatban azonban három üres típus terjedt el leginkább: 1. háttér üres (field blank), mely a mintavételezés során keletkezik, és így a legkomplexebb összehasonlító forrás; 2. laboratóriumi üres (laboratory blank), megfelel az általam használt SPE üresnek (lsd. 5.4.4-es fejezet). Ez a teljes mintaelőkészítést jellemzi, és sokszor tartalmazza a belső standard vegyületeket is; 3. injektálási üres (injection blank), mely az injektálások közötti kereszt-szennyezést vizsgálja [135]. A munkám során használt második üres fajta, melyet műveleti üresnek hívunk (lsd. 5.4.3-as fejezet) magában foglalja az injektálási ürest és a származékképzés során alkalmazott anyagok és eszközök szennyezéseit is. A harmadik típusú üres a szűrőpapírok extrakciója során készült (lsd. 5.4.5-ös fejezet), és megfelel a laboratóriumi üres kritériumainak. A szakirodalmat részletesen áttekintve látható volt, hogy a legtöbb tanulmány egyáltalán nem foglalkozott az üres lehetséges problémáival. Csak igen kevesen tértek ki a lehetséges szennyezések kérdéskörének fontosságára [98,109,120,125,135-139]. Kutatócsoportunk azonban mélyrehatóan vizsgálta az üresek kérdését is [18]. Az üres értékek figyelembe vételét minden kutatócsoport más-más módszerrel próbálja megoldani, egységes álláspont nem figyelhető meg. Vannak, akik kivonják az így kapott értékeket a mért értékekből, mások nem alkalmazzák ezt a módszert, mondván, hogy túl nagy a változatossága ezen értékeknek. Szintén bevált módszernek számít, hogy az LD értékek megállapításánál az üresből származó érték tízszeresét adják meg, mint határt, és csak akkor -76-

történik minőségi-mennyiségi meghatározás, ha ezt az értéket meghaladja a kérdéses komponens [135]. A méréseim során minden egyes alkalommal, minden vegyület esetében vizsgáltam az üres lehetséges szennyezőit, és ha kellett, a kiértékelés során figyelembe vettem (levonással) az üres mennyiségét. A fő műveleti üres és SPE üres szennyezők a 2,4 di-terc-butil-fenol, a dibutil-ftalát, a C 16 - (palmitolajsav és palmitinsav), illetve a C 18 zsírsavak (olajsav és sztearinsav) voltak. Ezeken kívül még további szennyezőkkel kell számolni, mint a zsírsavak többsége és a dioktil-ftalát. Utóbbi vegyület nem csak a labor légköréből és az oldószerekből származhat, de megtalálható magában a GC-MS készülék egyes alkatrészeiben is. A nyomanalitikai munkák megkövetelik a minták állandó összehasonlítását az analitikai munka hátteréből eredő, és még a leggondosabb mintakezelés során is jelentkező, zavaró szennyezőkkel. Ezen adatok hiányában, a legprecízebben kivitelezett nyomanalitikai elemzések eredményei sem fogadhatók el. -77-

6.6.4. Az elemző MS módszerek validálása Az MS/MS 42 komp. program optimálása után elvégeztem a módszer validálását is. Az FS 42 komp. program egy általunk már korábban publikált módszerünk [18] továbbfejlesztett változata volt. A validálás eredményeit a 23. táblázat tartalmazza. Az FS értékelés során a 21. táblázatban szereplő SFI-k, míg az MS/MS módszer esetén a 22. táblázat leány ionjai alapján értékeltem. A táblázat rendre tartalmazza az elemző MS/MS módszer regressziós koefficiens négyzeteit (R 2 ), az MS/MS és az FS módszer meghatározási határait ng/l-ben (LQ) és pg -ban (ILQ) kifejezve, modell oldat mérése esetén, valamint a visszanyerés vizsgálata során a Duna vízhez addicionált mennyiségeket. Az MS/MS linearitási tartományát 0,2 ng/l és 4200 ng/l között vizsgáltam, az R 2 értéke minden esetben nagyobb volt, mint 0,991 (R 2 = 0,9915-0,9997). A kalibráció során a módszer ismételhetősége modell oldat esetén 0,32-12 RSD% (átlag: 4,67 RSD%) között változott, míg az FS módszer során 0,71-13,9 RSD% (átlag: 4,02 RSD%) között volt. Az RSD% -ok és az LQ értékek számítása a 6.3.3-as fejezet szerint történtek. Az MS/MS módszer LQ értékei 0,21 ng/l és 26 ng/l közé estek, míg az FS technika esetén az LQ értékek 0,92-97 ng/l között voltak. Az LQ értékek a legtöbb esetben MS/MS módszerrel kisebbek, mint az FS módszer LQ értékei. Az arányok 0,5-79 között változtak. A legnagyobb csökkenés ösztron esetében volt, az LQ FS /LQ MS/MS 79. Az adatokból számolható továbbá, hogy az LQ MS/MS értékei átlagosan 3,2-szer kisebbek, mint az LQ FS (a 2 legkisebb és a 2 legnagyobb arányértéket nem vettem figyelembe az átlag számításakor) értékei. Az ILQ értékek MS/MS módszer validálása során 0,55-69 pg/µl közé estek, addig az FS módszernél 2,45-258 pg/µl között voltak. -78-

Vegyület R 2 LQ (ng/l) ** ILQ (pg/µl) *** LQ MS/MS FS * MS/MS FS * arány **** Addíció (ng/l) 1. benzoesav 0,9971 2,2 5,5 5,9 15 2,5 996 2. fenil-ecetsav 0,9993 1,0 5,2 2,67 14 5,2 498 3. 2-fenil-propionsav 0,9994 3,1 16 8,3 42 5,2 1045 4. kaprinsav 0,9988 2,4 2,2 6,4 5,9 0,9 1065 5. szalicilsav 0,9993 2,5 5,8 6,7 16 2,3 127 6. 4-hidroxi-metil-benzoát 0,9984 0,58 2,2 1,55 5,9 3,8 29 7. 2,4-di-terc-butil-fenol 0,9997 1,7 2,0 4,53 5,3 1,2 1009 8. 3-hidroxi-benzoesav 0,9990 0,54 1,0 1,44 2,67 1,9 50 9. 4-hidroxi-etil-benzoát 0,9970 0,66 3,3 1,76 8,8 5,0 40 10. klofibrinsav 0,9976 0,24 1,1 0,64 2,93 4,6 50 11. ibuprofen 0,9992 0,41 1,0 1,10 2,67 2,4 30 12. 4-hidroxi-benzoesav 0,9962 0,56 0,93 1,49 2,48 1,6 73 13. 4-hidroxi-fenil-ecetsav 0,9961 0,62 0,92 1,65 2,45 1,5 100 14. laurinsav 0,9984 7,7 19 21 50 2,5 1028 15. 3-(4-H-fenil)-propionsav 0,9927 0,77 2,2 2,05 5,9 2,9 31 16. paracetamol 0,9987 6,2 12 17 33 1,9 121 17. azelainsav 0,9995 9,9 19 26 50 1,9 995 18. mirisztinsav 0,9988 16 20 43 53 1,3 1058 19. szebacinsav 0,9982 8,8 22 24 59 2,5 1173 20. koffein 0,9983 1,6 4,0 4,27 11 2,5 103 21. gemfibrozil 0,9972 1,0 2,5 2,67 6,7 2,5 51 22. dibutil-ftalát 0,9993 2,6 6,6 6,9 18 2,5 113 23. fenoprofen 0,9966 1,9 4,9 5,1 13 2,6 76 24. palmitolajsav 0,9990 18 23 48 62 1,3 1204 25. palmitinsav 0,9958 22 21 59 56 1,0 1451 26. metoprolol 0,9915 8,6 27 23 71 3,1 498 27. ferulasav 0,9954 4,2 13 17 33 3,1 104 28. naproxen 0,9988 0,42 1,1 1,12 2,93 2,6 39 29. propranolol 0,9950 1,1 27 2,93 72 25 505 30. olajsav 0,9984 26 97 69 258 3,7 1734 31. ketoprofen 0,9989 0,49 2,6 1,32 6,8 5,3 48 32. sztearinsav 0,9984 19 22 51 60 1,2 1272 33. karbamazepin 0,9997 0,96-2,56 - - 507 34. diklofenak 0,9990 0,21 1,4 0,55 3,73 6,7 67 35. arachinsav 0,9924 8,0 20 21 53 2,5 1015 36. dioktil-ftalát 0,9949 12 16 32 43 1,3 1066 37. fenofibrát 0,9921 1,4 2,7 3,73 7,2 1,9 50 38. metotrimeprazin 0,9942 2,0 10 5,3 27 5,0 83 39. ösztron 0,9958 1,1 87 2,93 231 79 102 40. β-ösztradiol 0,9975 0,48 8,6 2,93 23 18 51 41. koleszterin 0,9925 5,4 11 14 29 2,0 253 42. kólsav 0,9955 6,5 3,2 17 8,6 0,5 249 23. Táblázat A vizsgált vegyületek TMS (oxim) éter/észter származékainak analitikai jellemzői FS és MS/MS módszer használatával -79-

Jelmagyarázat: a Rövidítések jegyzékében, - = nincs adat * FS = a leírt értékek a [18]-as hivatkozásban is megtalálhatók; ** LQ = S/N 10; *** ILQ = injektált pg/μl, figyelembe véve, hogy 1 μl-t injektáltam a hígítatlan 375 μl származékká alakított oldatból (LQ (ng/l) = injektált pg 375/1000). **** LQ arány = LQ FS /LQ MS/MS A kiértékelés számottevően megbízhatóbb eredményeket szolgáltat az MS/MS spektrális felbontása és elválasztása miatt a következő koelúciók esetében: 1. a szalicilsav és a 4-hidroxi-metil-benzoát, 2. az ibuprofen és a 4-hidroxi-benzoesav (lsd. 20. ábra), 3. a 3-(4-H-fenil)-propionsav és a paracetamol, 4. a ketoprofen-oxim, a C 18 zsírsavak és a biszfenol A esetén. Duna vízminták elemzésénél az ibuprofen és a 4-hidroxi-benzoesav koncentrációja között számottevő lehet a különbség (akár 28-szoros a 4-hidroxi-benzoesav javára, lsd. későbbi eredmények és 20. ábra). Ilyen koelúciók esetén a nagy koncentráció mellett a kis koncentráció mérése megbízhatóan az MS/MS technikával lehetséges. Továbbá, míg az FS módszerrel a klofibrinsav, a paracetamol és az ösztron kis mennyiségeinek megbízható értékelése nem lehetséges, addig az MS/MS technikával könnyen megoldható ez a feladat. 20. Ábra Ibuprofen és 4-hidroxi-benzoesav spektrális elválasztása MS/MS technika segítségével -80-