ASPERGILLUS ANTIGÉNEK 52942 ASPERGILLUS FUMIGATUS ANTIGÉNEK 52962 ASPERGILLUS FUMIGATUS POZITÍV KONTROLL SZÉRUM 61681 ASPERGILLUS POZITÍV KONTROLL SZÉRUMOK 61682 ASPERGILLOSIS SZERODIAGNOSZTIZÁLÁSA IMMUNPRECIPITÁCIÓS MÓDSZERREL
1- KLINIKAI JELENTŐSÉG A Bio-Rad többféle aspergillus antigént gyárt az aspergillosis immunprecipitációs szerodiagnosztizálásához. Az aspergillosist gyakran könnyebb a beteg szérumában található specifikus antitestek révén diagnosztizálni, mint a gomba közvetlen identifikálásával. 2- ALAPELV A Bio-Rad antigéneket különféle immunprecipitációs reakciókban használhatjuk. Különösen az alábbi két technikát javasoljuk : IMMUNELEKTROFORÉZIS (IEP) ELEKTROSZINERÉZIS (ES) Az immunprecipitációs technikák növelik az aspergillosis diagnózis pontosságát, mert az antigén kivonatokban található két enzim, a kimotripszin és a kataláz ellen termelődő specifikus antitesteket mutatják ki. Az enzimaktivitást precipitációs ívek jelzik. 3- KISZERELÉS Aspergillus fumigatus antigének, kódszám 52962 2 üvegcse liofilizált antigén, amelyet 1 ml steril desztillált vízben kell feloldani (kb. 10 reakcióra elegendő). - Aspergillus fumigatus metabolikus antigén - Aspergillus fumigatus szomatikus antigén Aspergillus antigének, kódszám 52942 4 üvegcse liofilizált antigén, amelyet 1 ml steril desztillált vízben kell feloldani (kb. 10 reakcióra elegendő). - Aspergillus flavus metabolikus antigén - Aspergillus nidulans metabolikus antigén - Aspergillus niger metabolikus antigén - Aspergillus terreus metabolikus antigén Aspergillus fumigatus pozitív kontroll szérum, kódszám 61681 1 üvegcse liofilizált Aspergillus fumigatus-ellenes nyúlszérum, amelyet 1 ml steril desztillált vízben kell feloldani. Aspergillus pozitív kontroll szérum, kódszám 61682 4 üvegcse liofilizált Aspergillus-ellenes nyúlszérum, amelyet 1 ml steril desztillált vízben kell feloldani. - Aspergillus flavus pozitív kontroll szérum - Aspergillus nidulans pozitív kontroll szérum - Aspergillus niger pozitív kontroll szérum - Aspergillus terreus pozitív kontroll szérum 4- ÖSSZETÉTEL Antigének (két típus): Metabolikus antigén, 10 napig tartó, 30 C-on történő inkubálás után a tenyészet szűrésével nyert antigén. 2
Szomatikus vagy sejtes antigén, fiatal micéliumkultúrából (3 nap, spóra nélküli) nyert antigén, amelyet 30 C-on roncsoltunk és homogenizáltunk. 5- TÁROLÁS Liofilizált formában a +2-8 C-on és száraz helyen tárolt reagensek a termék dobozán feltüntetett szavatossági ideig stabilak. Feloldás után az antigéneket több hónapig is lehet tárolni -20 C-on. Ne fagyasszuk le és engedjük fel többször az antigént. 6- MINTÁK 1. A vizsgálatot csak natív, alvadásában nem gátolt szérummintán szabad elvégezni. 2. A szérumminták kezelésének, feldolgozásának és tárolásának tekintetében az alábbi ajánlásokat kövessük: - A szérummintákat a rutinelőírások szerint vegyük. - Centrifugálás előtt hagyjuk teljesen megalvadni a mintákat. - Mindig tartsuk zárva a kémcsöveket. - Centrifugálás után válasszuk el a szérumot és tároljuk szorosan lezárt mintatartó csőben. - A minták +2-8 C között tárolhatók, amennyiben a szűrést 24 órán belül elvégezzük. Ha ez nem lehetséges ezen az időn belül, vagy a mintákat szállítani kell, akkor fagyasszuk le 20 C-on, vagy alacsonyabb hőmérsékleten. - Lehetőleg csak egyszer engedjük fel a mintákat fagyott állapotból. A korábban lefagyasztott mintákat felengedés után alaposan keverjük át a vizsgálat előtt. 3. A magas albumin-, bilirubin-, lipid-, vagy hemoglobinszintnek tulajdonítható esetleges kölcsönhatásokat nem vizsgáltuk. 4. Ne melegítsük a mintákat. 7- HASZNÁLATI ÚTMUTATÓ A) A MÉRÉSHEZ SZÜKSÉGES, DE A FORGALMAZÓ ÁLTAL NEM SZÁLLÍTOTT ANYAGOK Nátrium-barbiturát 1 N sósav Desztillált víz Barbitursav Glicin Tris puffer, 0,05 M, ph 7 Agaróz 30%-os H 2 O 2 N-acetil-DL-fenilalanin naftil-észter Dimetilformamid Diazokék B B) IMMUNELEKTROFORÉZIS (1. felvétel) Az immunelektroforézist (Grabar) a mikroszkopizáláshoz használt üveg tárgylemezeken lehet végezni. Tisztított agarból vagy agarózból 1%-oskoncentrációban 8,2-es ph-jú barbitál pufferoldattal készítsünk gélt (adjunk hozzá 1/10.000 koncentrációban mertiolátot). 3
Vágjunk a gélbe egy 60 mm hosszú és 2 mm széles vályút, és 2 db, 2-2 mm átmérőjű lyukat a vályú két oldalán, attól 4-4 mm távolságra (l. ábra). Mérjünk be 20 µl hígítatlan antigént a két oldalsó lyukba. Másfél órára kapcsoljunk 5 V/cm feszültséget a lemez két végére. Mérjük be a szérumot a középső vályúba, s hagyjuk, hogy párás levegőn, szobahőmérsékleten (18-30 C) 48 órán keresztül bediffundálhasson a gélbe. A harmadik napon 24 órára merítsük mosóoldatba a lemezeket. A negyedik napon olvassuk le a lemezeket. A különösen vékony vonalak leolvasásához szükségünk lehet Coomassie-kék festésre. C) ELEKTROSZINERÉZIS (1. ábra) Az elektroszinerézis (Bussard), avagy reverz elektroforézis agaróz géllel vagy cellulózacetáttal végezhető. Egyszerű technika, nagyon érzékeny és gyors, ami nagy számú szérum szűrésekor igen hasznos. Ha agaróz gélt és mikroszkóp tárgylemezeket használunk, akkor az ábra szerint lyukakat vághatunk a gélbe : az antigének a katód felöli oldalra kerülnek (-), a szérumok pedig az anód felöli oldalra (+). A 2 mm átmérőjű lyukak között 6 mm távolságnak kell lennie. Az antigéneknek szánt lyukakba ½- és és ¼-es hígítású tiszta oldatokat töltsünk. A szérumnak fenntartott lyukakba 20 mikroliter kerüljön. 1,5 óráig helyezzük 5 V/cm feszültség alá a lemezt. A reakciót rendszerint már a vándorlás befejeződése után leolvassuk. Ha Coomassie-kékkel is festenünk kell, akkor előtte kétszer mossuk a lemezt : először fiziológiás sóoldattal (1 éjszakán át), majd desztillált vízzel (24 órán át). Ezután szárítsuk meg. Ajánlatos pozitív kontrollokkal párhuzamos mérést végezni ugyanazon lépések szerint, mint amelyeket az antigéneknél alkalmaztunk. D) ENZIMAKTIVITÁS AZONOSÍTÁSA EGYES PRECIPITÁCIÓS ÍVEKBEN Az immunelektroforézis után leggyakrabban megfigyelhető íveket C-vel és J-vel jelöltük (l. ábra). Ezek az enzimaktivitást mutatják (C : kimotripszin, J : kataláz). Az enzimek jelenlétére utalnak továbbá még a specifikus reakciók (BIGUET et al., l. Hivatkozások). E) A REAGENSEK ELKÉSZÍTÉSE 1) Pufferek - VERONÁL, ph 8,2 Nátrium-barbiturát...15,85 g 1N HCl...23 ml H 2 O q.s.p... 1000 ml - BARBITÁL-NÁTRIUM-BARBITURÁT TRIS GLICIN (BBNa TG) ph 8,8 A....Nátrium-barbiturát 65 g Barbitursav...10,35 g H 2 O q.s.p... 5000 ml B....Glicin 281 g Tris...226 g H 2 O q.s.p... 5000 ml 4
Ha az A és B oldatból azonos mennyiséget összekeverünk egymással, akkor 8,8-as ph-jú, 0,08-as ozmolaritású puffert kapunk. 2) 1%-os agaróz (súly/térfogat) Agaróz...10 g H 2 O... 500 ml Forraljuk fel, majd hűtsük le (kb. 60 C-ra). Adjunk hozzá : Barbitál puffert (ph 8,2).500 ml vagy BBNa TG puffert (ph 8,8)... 500 ml (desztillált vízzel 50%-kal hígítva). 3) Kataláz 30% H 2 O 2 Tris (0,05 M, ph 7) pufferben hígítva (0,3 ml H 2 O 2 + 50 ml puffer) immunelektroforézises agarózon. Pozitív reakció: buborékok jelentkeznek a megfelelő ív körül. 4) Kimotripszin - A OLDAT N-acetil-DL-fenilalanin naftil-észter5 mg Dimetilformamid...2 ml - B OLDAT Diazokék B...10 mg Tris puffer (0,05 M, ph 7,4)..18 ml Felhasználás előtt keverjük össze az A és a B oldatot, és az elektroszinerézises membránt 30 percig 37 C-on inkubáljuk ebben az elegyben. Öntsük le az elegyet, s egy éjszakán át inkubáljuk 37 C-on 18 ml B reagensben. Mossuk le vízzel a membránokat. Pozitív reakció : a bíborra színeződött ívek felelnek meg a kimotripszin aktivitásnak. F) ÖSSZEFOGLALÓ TÁBLÁZAT P.J. SVENDSEN A KVANTITATÍV IMMUNELEKTROFORÉZIS KÉZIKÖNYVE, FURLAGET UNIVERSITY, OSLO. SZERK: EXELSEN KROLL-WEEXE. ASPERGILLUS ANTIGÉNEK elemzése (Táblázat). 5
Immunelektroforézis Pufferek Veronál puffer (ph 8,2) BBNa-TG puffer (ph 8,8) Feszültsé Időtartam g 5 V / cm 90 perc 25 V / cm 60 perc Festék Coomassie-kék Elektroszinerézis Veronál puffer (ph 8,2) BBNa-TG puffer (ph 8,8) 5 V / cm 90 perc 10 V / cm 60 perc Coomassie-kék Kataláz Kimotripszin Veronál puffer (ph 8,2) BBNa-TG puffer (ph 8,8) Veronál puffer (ph 8,2) BBNa-TG puffer (ph 8,8) * L. 6. Használati útmutató (D reagensek elkészítése) 5 V / cm 90 perc 25 V / cm 60 perc 5 V / cm 90 perc 25 V / cm 60 perc Hígított H 2 O 2 * Pozitív reakció: buborékok a specifikus ív körül A* és B* reagens Pozitív reakció: a specifikus C ív bíbor színű lesz 8- KIÉRTÉKELÉS Ha aspergillus antigén kimutatására használjuk az immunprecipitációs technikát, akkor a csapadékívek jelenléte aspergillosis jelenlétére utal. Mivel az elektroszinerézis gyorsabb az immunelektroforézisnél, ezért alkalmasabb a szűréshez. Mindazonáltal ha ezzel a technikával pozitívnak találunk egy mintát, akkor azt még immunelektroforézissel konfirmálni kell. Az egyes precipitációs ívekben mutatkozó kimotripszin és kataláz aktivitás további bizonyítékot jelent. Bronchopulmonaris vagy diffúz aspergillosisnál a vizsgálatok 80 90%-a pozitív, és általában megfigyelhetők a specifikus ívek. Aspergillománál a reakció erősen pozitív : rendszerint 5-10 ívet és C-ívet láthatunk. Allergiás aspergillusos bronchitisnél az esetek 50%-ában pozitív a reakció. A kicsapódó antitest a fertőzés késői szakaszában jelentkezik: bizonyos esetekben a második szűréskor tapasztalható, egy hónappal az első vizsgálat után. 9- MINŐSÉG / A TERMÉK MINŐSÉGÉNEK ELLENŐRZÉSE a) Aspergillus antigének Az Aspergillus antigének minőségét aspergillosis-pozitív kontroll szérumokkal ellenőrizzük (anti-aspergillus nyúlszérum, az állatot kevert, standardizált A. fumigatus antigénekkel és metabolikus standardizált A. flavus, A. niger, A. nidulans és A. terreus antigénekkel immunizálják). 6
Immunelektroforetikus precipitációs ívek (ph = 8,2) jelentkezése A. fumigatus szomatikus Ag A. fumigatus A. flavus A. nidulans A. niger A. terreus Anti-A. fumigatus pozitív kontroll szérum Anti-A. flavus pozitív kontroll szérum Anti-A. nidulans pozitív kontroll szérum Anti-A. niger pozitív kontroll szérum Anti-A. terreus pozitív kontroll szérum + 4 8 ív - - - - + - - - - 3 5 ív - + - - - 3 5 ív - - + - - 3 5 ív - - - + - 3 5 ív - - - - + 3 5 ív Kataláz enzimaktivitás jelentkezése Kimotripszin enzimaktivitás jelentkezése Immunelektroforézis (ph = 8,2) Electroszinerézis (ph 8,2) Szomatikus Ag + H 2 O 2 hozzáadása után buborékok keletkeznek a J- ív körül, kataláz aktivitás jele + Az A és B reagensekkel történő inkubálás után a C-ív bíborszínű lesz, kimotripszin aktivitás jele 10- A GYÁRTÓNÁL FOLYÓ MINŐSÉGELLENŐRZÉS Az összes termékünk a saját minőségellenőrző rendszerünk szerint készült, a nyersanyag átvételétől kezdve a termék forgalmazásáig. Minden egyes gyártási sorozat minőségét ellenőrizzük, és csak akkor hozzuk forgalomba, ha az megfelel az előre felállított kritériumoknak. Minden sorozat gyártási és minőségellenőrzési jegyzőkönyve megtalálható a Bio-Radnál. 11- AZ ALKALMAZÁS KORLÁTAI Az aspergillosis diagnózist csak azután lehet fölállítani, hogy elvégeztük a klinikai, radiológiai és biológiai (mikrobiológiai, szövettani, szerológiai) vizsgálatokat is. A külön-külön kapott eredményeket elővigyázattal kell értelmezni. 12- HIVATKOZÁSOK 1. BIGUET J.; TRAN VANKY P.; FRUIT J.; ANDRIEU S. : Identification d une activité chymotrypsique au niveau de fractions remarquables de l extrait antigénique d Aspergillus fumigatus. Répercussion sur le diagnostic immunologique de l Aspergillose. REV. IMMUNOL. (1967) 31, pp. 317-328. 2. DROUHET E.; CAMEY L. ; SEGRETAIN G. : Valeur de l immunoprécipitation et de l immunofluorescence indirecte dans les Aspergilloses bronchopulmonaires. ANN. INST. PASTEUR (1972) 123, pp. 379-395. 3. DROUHET E. ; DUPONT B. : Infections mycosiques et parasitaires au cours des traitements immunosuppresseurs. PATHOL. BIOL. (1976) 24, pp. 99-116. 4. LONGBOTTOM J.L. : Immunological aspects of infection and allergy due to Aspergillus Species. MUKOSEN (1978), supp. 1 pp. 207-217. 7
5. SEGRETAIN G.; DROUHET E. ; MARIAT F.; Diagnostic de laboratoire en mycologie médicale (1979 4e édition), MALOINE Edt. PARIS. 150 pages. - CE jelzés (Európai direktíva 98/79/CE az in vitro diagnosztikai célú orvosi eszközökről) - Csak in vitro diagnosztikai felhasználásra! - Katalógusszám - Gyártó - Meghatalmazott Képviselet - Gyártási szám - Szavatossági idő - Tárolási hőmérsékleti határok - Lásd a használati utasítást A tesztleírás az Európai Direktíva által előírt egyéb idegen nyelveken a Bio-Rad helyi képviseleteinél megtalálható. 8
The other languages which are required in conformity to the European Directive can be obtained from your local Bio-Rad agent. Les autres langues requises par la Directive Européenne sont disponibles auprès de votre représentant Bio-Rad local. Los otros idiomas que se requiren para la conformidad de la Directiva Europea puede ser obtenida en su oficina local Bio-Rad. Die anderen Sprachen, die in Übereinstimmung mit der europäischen IVD Direktive benötigt werden, erhalten Sie über Ihre lokale Bio-Rad Niederlassung. Le altre lingue che sono richieste in conformità con le Direttive Europee possono essere ottenute dal locale agente Bio-Rad. As restantes línguas, obrigatórias em conformidade com a Directiva Europeia, podem ser obtidas através da subsidiária Bio-Rad mais próxima de si. Övriga språk som krävs i enlighet med EG-direktivet kan erhållas från din lokala Bio-Rad-representant. De øvrige sprog som kræves i henhold til EU direktiv kan fås ved henvendelse til den lokale Bio-Rad leverandør. Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincaré 92430 Marnes-la-Coquette France Tel. : +33 (0) 1 47 95 60 00 11/2003 Fax.: +33 (0) 1 47 41 91 33 code: 880011 83