A FAD transzportjának szerepe az oxidatív fehérje foldingban patkány máj mikroszómákban PhD értekezés Varsányi Marianne 2005 Témavezető: Dr. Bánhegyi Gábor Semmelweis Egyetem Orvosi Vegytani, Molekuláris Biológiai és Pathobiokémiai Intézet Semmelweis Egyetem Doktori Iskola Molekuláris Orvostudományok Tudományági Doktori Iskola Szigorlati bizottság: Dr. Enyedi Péter Dr. Monostori Katalin Dr. Somogyi Anikó Hivatalos bírálók: Ifj. Dr. Gallyas Ferenc Dr. Geiszt Miklós
TARTALOMJEGYZÉK Összefoglalás 4 Summary 5 Bevezetés 6 A szekréciós fehérjék oxidatív foldingja 6 A FAD szerepe, szintézise és membrántranszportja eukariótákban 15 Célkitűzések 17 Alkalmazott módszerek 18 A patkány máj mikroszómák előállítása 18 A fényszórásos (light scattering) technika 18 A gyorsszűréses (rapid filtrációs) technika 19 Az intravezikuláris FAD tér mérése 20 A transzport mérése a gyorsszűréses technikával 21 A mikroszómális fehérje tiol oxidáció mérése 22 Vegyszerek 22 Eredmények 23 Patkány máj mikroszómák FAD által hozzáférhető intravezikuláris 23 terének meghatározása 2
A FAD transzportja patkány máj mikroszómális vezikulákban 24 A szabad FAD előmozdítja az intravezikuláris oxidatív folyamatokat 28 patkány máj mikroszómákban Megbeszélés 32 Következtetések 37 Irodalomjegyzék 38 Függelék 47 3
ÖSSZEFOGLALÁS Az eukarióta sejtekben a szekréciós és membránfehérjék oxidatív foldingja az endoplazmás retikulum luminális kompartimentumában megy végbe. A felszabaduló elektronokat egy elektronszállító lánc juttatja el a végső akceptor oxigénig. Míg a lánc fehérjéi viszonylag jól ismertek, keveset tudunk a kis redox molekulák lehetséges részvételéről. Munkánkban elsősorban a FAD és az aszkorbinsav ilyen szerepét vizsgáltuk. Patkány máj mikroszómális vezikulákon tanulmányoztuk a FAD transzportját és a transzport hatását a diszulfidhíd képződésre. Az intravezikuláris FAD által hozzáférhető tér meghatározásával megállapítottuk, hogy a FAD átjut a mikroszómális membránon és felhalmozódik a lumenben. Gyorsszűréses technikával kimutattuk a FAD kétirányú transzportját, mely gátolható volt atraktiloziddal és 4,4 diizotiocianostilbén 2,2 diszulfonsavval. A lumenbe belépő FAD elősegítette a fehérje tiolok oxidációját és fokozta a glukóz 6 foszfát intraluminális oxidációját. Az intraluminális oxidatív folyamatokhoz a FAD felvétele szükséges: a transzport gátlása csökkentette a FAD függő tiol oxidációt és a glukóz 6 foszfát intraluminális oxidációját. A mikroszómális transzport jellegzetességei eltérnek a mitokondriális FAD transzport tulajdonságaitól. Az eredmények szerint az élesztőben leírtakhoz hasonlatosan a szabad FAD meghatározó szerepet játszik az oxidatív fehérje folding mechanizmusában emlős sejtek endoplazmás retikulumában is. 4
SUMMARY The oxidative folding of secretory and membrane proteins takes place in the luminal compartment of the endoplasmic reticulum in eukaryotic cells. The electrons generated in the process are transferred to molecular oxygen by an electron transfer chain. Although the protein components of the chain are well known, the role of low molecular weight redox active compounds is less elucidated. The aim of our work was to investigate the role of FAD and ascorbate in the process. The transport of FAD and its effect on disulfide bond formation was investigated in rat liver microsomal vesicles. By measuring the intravesicular FAD accessible space we observed that FAD permeates across the microsomal membrane and accumulates in the lumen. Rapid filtration experiments also demonstrated the uptake and efflux of the compound, which could be inhibited by atractyloside and 4,4 diisothiocyanostilbene 2,2 disulfonic acid. FAD entering the lumen promoted the oxidation of protein thiols and increased the intraluminal oxidation of glucose 6 phosphate. The uptake of FAD was necessary for the intraluminal oxidation of thiols and glucose 6 phosphate; the inhibition of the transport prevented the oxidative effects of FAD. The main characteristics of microsomal FAD transport are different from those described in mitochondria. These findings support the notion that, similarly to yeast, free FAD may have an important role in the mechanism of oxidative protein folding in the endoplasmic reticulum lumen of mammalian cells. 5
BEVEZETÉS A szekréciós fehérjék oxidatív foldingja A szekréciós fehérjék egyik legfeltűnőbb jellegzetessége a nagyszámú diszulfid kötés jelenléte, mely szükséges megfelelő foldingjukhoz, stabilitásukhoz a változó extracelluláris környezetben, illetve megfelelő működésükhöz (1, 2). A diszulfidkötések az eukarióta sejt endoplazmás retikulumának luminális kompartimentumában képződnek; a rendszer kapacitása olyan nagy lehet, hogy bizonyos sejtek saját tömegüknek megfelelő mennyiségű fehérjét szekretálhatnak naponta (3). In vivo, az összes sejtben, a fehérjékben található diszulfidkötések általában tiol diszulfid kicserélődési reakcióval jönnek létre egy már meglévő diszulfid tartalmú fehérje és a szubsztrát fehérje között. A ciszteinil oldalláncok oxidációja során felszabaduló elektronokat egy elektron transzfer lánc szállítja el a végleges elektronakceptor oxigénig. A láncot fehérjék és kis molekulatömegű redox vegyületek alkotják (4 8). Az elektron transzfer lánc fehérje összetevőit többé kevésbé már ismerjük, az esetlegesen résztvevő kis molekulák szerepét kevésbé tárták fel. Egyebek között a K vitamin (9), E vitamin (10), glutation diszulfid (11) és dehidroaszkorbát (12 15) közreműködését feltételezték. Ezek a vegyületek mind magas koncentrációban vannak jelen az endoplazmás retikulum lumenében, illetve membránjában, részvételüket leírták különböző, az endoplazmás retikulumhoz kötött reakciókban. Másrészt az utóbbi években több redox kofaktorról kiderült, hogy nem szükséges a diszulfidhíd képződéshez. Így például tisztázódott, hogy az endoplazmás retikulum legfontosabb redox pufferét képező glutation (11) mégsem vesz részt a folyamatban (16, 17), mint ahogy a bakteriális oxidatív foldingban kulcsszerepet játszó ubikinon sem (5, 18 20). 6
Munkacsoportunk korábbi vizsgálatai feltárták két kismolekulasúlyú redox aktív vegyület, a C és E vitamin lehetséges szerepét az oxidatív foldinghoz kötött elektrontranszferben. Intakt sejtekben az endoplazmás retikulumban lévő oxidatív környezet lehetővé teszi, hogy az újonnan szintetizált fehérjékben diszulfidhidak alakuljanak ki. Ez azonban nincs így az endoplazmás retikulum eredetű izolált mikroszómában, ami arra utal, hogy a folyamat egy citoplazmában lévő faktor vagy egy membránpermeábilis összetevő részvételét igényli, mely a mikroszómák preparálása során elvész. Felvetődött tehát a második legnagyobb koncentrációban jelen lévő vízoldékony antioxidáns, az aszkorbát szerepe. Az aszkorbát prooxidáns funkciója a dehidroaszkorbát képződéséhez kapcsolódik. Növényekben ismertek aszkorbát oxidáz enzimek, amelyek aszkorbil szabad gyököt képeznek az aszkorbátból. Ez az intermedier aztán a második elektron leadásával akár egy másik aszkorbil szabad gyöknek (diszproporcionálódás) alakul dehidroaszkorbáttá. Állati szervezetben azonban jóval kevésbé ismert a folyamat, sőt, általában ezt nem enzimatikus reakcióként tartják számon, amit például fémionok vagy szabad gyökök katalizálhatnak. Patkánymáj mikroszóma jelenlétében az aszkorbát folyamatosan átalakul aszkorbilgyökké majd dehidroaszkorbáttá. A keletkező dehidroaszkorbát már néhány perc után detektálható, és szintje állandó marad egészen addig, amíg az aszkorbát el nem fogy. Az aszkorbilgyök jelenléte is kimutatható elektronspin rezonanciaspektroszkópia segítségével. Mikroszóma nélküli pufferben inkubálva az aszkorbátot, autooxidáció révén detektálható mennyiségű aszkorbilgyök keletkezik. Mikroszóma jelenlétében azonban lényegesen nagyobb aszkorbilgyökszint mérhető, és ez az inkubáció teljes ideje alatt állandó marad. Mivel mind az aszkorbilgyök, mind a dehidroaszkorbát nagyon instabil, állandó szintjüket csak a folyamatos aszkorbát oxidáció tarthatja fenn. 7
A mikroszóma jelenlétében többszörösére fokozódó aszkorbát oxidáció egy korábban ismeretlen mikroszómális aszkorbát oxidáz enzim aktivitására utal. A mikroszómák előkezelése akár hővel, akár proteázzal az aszkorbilgyök keletkezését jelentősen csökkenti, s az aszkorbát oxidáz aktivitását akár meg is szünteti, jelezve, hogy valóban enzimatikus, fehérjemediált folyamatról van szó. Az azonosítatlan mikroszómális aszkorbát oxidázról további információk nyerhetők gátlószerek felhasználásával. Sem a gyökfogók (mannitol, dimetilszulfoxid), sem az antioxidáns enzimek (szuperoxid dizmutáz, kataláz) nem befolyásolják az aszkorbilgyök képződését. Ugyancsak hatástalan a flavoproteint gátló difenilén jodónium és a hemoproteint gátló nátrium azid. Ezzel szemben a citokróm inhibitorai (ekonazol és quercetin) jelentősen gátolják az aszkorbilgyök képződését, de az autooxidációt (mikroszóma nélkül) is, így feltehetőleg nem az enzimre hatnak, hanem közvetlenül reagálnak az aszkorbilgyökkel (redukálják azokat). Valószínűsíthető tehát, hogy hemo és flavoproteinek nem vesznek részt a folyamatban, valamint hogy az aszkorbátoxidáció nem reaktív oxigéngyökök által kiváltott másodlagos folyamat. A megvizsgált fémkelátorok (dipiridil, 1,10 fenantrolin, neokuproin) közül a legerősebb gátlást a rézspecifikus neokuproin váltja ki. Ez mikroszóma nélkül, vagy hőinaktivált mikroszóma esetén hatástalan, csak ép mikroszóma jelenlétében hat, és szinte az autooxidáció szintjére csökkenti az aszkorbilgyökök keletkezését. A mikroszómához adott aszkorbát fogyása mellett megfigyelhető a fehérjék tioljainak kifejezett oxidációja, ami aszkorbát nélkül elhanyagolható. Az aszkorbát és a tiol oxidációja korrelál egymással. A citokróm P450 inhibitorai (ekonazol, quercetin) vagy neokuproin jelenlétében mind az aszkorbátfogyás, mind a tioloxidáció csökken (13). Mivel a tioloxidáció az aszkorbát oxidációhoz kötött, feltehetőleg a dehidroaszkorbát is részt vesz a folyamatban. 8
A dehidroaszkorbát valóban kiváltja a fehérjék tioljainak oxidációját, bár kisebb mértékben, mint az aszkorbát (12). Ez különösen azért fontos, mert az endoplazmás retikulum membránja nem egyformán permeábilis az aszkorbát/dehidroaszkorbát redoxpár két tagjára nézve. Míg az oxidált alak jól mérhető sebességgel halad át a membránon, addig a redukált forma transzportja elhanyagolható (14). Ennek megfelelően, az aszkorbát transzportját az aszkorbát oxidáz gátlása akadályozza, azaz csak dehidroaszkorbáttá alakulva képes bejutni a lumenbe (13). A lumenbe jutott dehidroaszkorbát lévén a protein diszulfid izomeráz (21) enzim egyik szubsztrátja mint kis molekulatömegű elektronakceptor, részt tud venni a fehérjéknek ebben a kompartimentumban zajló oxidatív hajtogatódásában (folding). A PDI a dehidroaszkorbátot redukálja, miközben az enzimen lévő tiolcsoportok oxidálódnak. Az immár oxidált protein diszulfid izomeráz reagál a tiolcsoportokat tartalmazó fehérjékkel, azokon diszulfidhidakat hozva létre, miközben az enzim regenerálódik és visszaalakul katalízisre képes állapotába. Ennek az enzimreakciónak az eredményeként aszkorbát keletkezik (és felhalmozódik) a lumenben. A folyamat végbemenetelének bizonyítéka, hogy diabéteszes állat májából készült mikroszómában, amelynek lumenében nem hajtogatott (unfolded) fehérje vagyis sok redukált tiolcsoport halmozódik fel, az aszkorbát intraluminális akkumulálódása jelentősen megnő (15). Az a megfigyelés, hogy az aszkorbát a dehidroaszkorbátnál hatékonyabban fokozza a fehérjék tiolcsoportjainak oxidációját a mikroszómában, arra utal, hogy az aszkorbát oxidációja valamilyen közvetett módon is kifejti hatását. Ez egy lipidoldékony, az endoplazmás retikulum membránjában elhelyezkedő molekula jelenlétére utal, mely a két folyamatot a membrán külső felszínén lejátszódó aszkorbátoxidációt és a lumenben végbemenő protein tioloxidációt összekapcsolja. A legvalószínűbb lipofil elektronszállítók (ubikinon, K vitamin, E vitamin) közül a K vitamin ilyetén 9
szerepét már korábban felvetették (9). Az E vitamin az endoplazmás retikulum legnagyobb mennyiségben előforduló membránhoz kötött antioxidánsa. Szerepe E vitamin hiányos patkányok májából preparált mikroszómákon végzett kísérletekben igazolódott be. Az E vitamin hiánya részlegesen szétkapcsolja az extra és intraluminális redoxfolyamatokat, vagyis az aszkorbát és a fehérjetiolok oxidációját. Ez azt jelenti, hogy az ilyen mikroszómában jelentősen csökken az aszkorbát által kiváltott diszulfidképződés, holott az aszkorbát maga gyorsabban oxidálódik. Ezt a szétkapcsolást a membránlipidek fokozott peroxidációja is kíséri, ami nyilván az aszkorbát oxidációjakor keletkező ROS hatása. A különböző vízoldékony gyökfogók csak nagyon kis mértékben vagy egyáltalán nem védik ki a lipidperoxidációt, ami arra utal, hogy a ROS a membrán közvetlen közelében keletkeik lipidkörnyezetben ami leginkább lipofil antioxidánsok számára hozzáférhető. Vagyis feltételezhető hogy az E vitamin közvetlenül ennek a ROS nak az oxidáló hatását közvetíti a lumenbe; ami így nem a membrán lipdjeit, hanem végső soron a fehérjék tiolcsoportjait oxidálja. A tokoferol utólagos pótlására a két folyamat kapcsolata újra helyreáll és a lipidperoxidáció mértéke is lecsökken. A leírt megfigyelések alapján modellt állítottuk fel az aszkorbát/dehidroaszkorbát és az E vitamin oxidatív fehérje hajtogatódásban betöltött szerepére. A citoplazmában az aszkorbát aszkorbilgyökké alakul enzimatikus folyamat segítségével, ami az endoplazmás retikulum membránjának külső felszínén játszódik le. Ezt a folyamatot reaktív oxigéngyökök keletkezése kíséri. Ezután az aszkorbilgyök oxidációval vagy diszproporcionálódással továbbalakul dehidroaszkorbáttá. A dehidroaszkorbát bejut az endoplazmás retikulum lumenébe, ahol a PDI szubsztrátjaként részt vesz a fehérjék (és a glutation) ciszteinjein lévő tiolcsoportok oxidálásában. Ilymódon a dehidroaszkorbát ismét aszkorbáttá alakul, amely nem tud több 10
diszulfidhidat létrehozni, hacsak le nem ad két elektront, és vissza nem alakul dehidroaszkorbáttá. Erre ad lehetőséget a membránban jelen lévő tokoferol, amely összeköttetést teremt a membrán külső felszínén lévő oxigénszabadgyökök és a lumenben lévő aszkorbát között. A membrán közvetlen közelében keletkező reaktív oxigéngyökök oxidálják az E vitamint E vitamingyökké. Ez pedig képes visszaoxidálni az aszkorbátot dehidroaszkorbáttá a lumenben. Ennek a reakcióláncnak a végső eredménye az elektronok folyamatos áramlása a ciszteincsoportoktól, mint primer elektrondonoroktól az oxigénig, mint végső elektronakceptorig. Az E vitamin hiányában az elektrontranszfer lánc egy fontos komponense esik ki, ami azért okoz megnövekedett lipidperoxidációt, mert a ROS E vitamin helyett a közeli membránban lévő egyéb lipidekkel reagál; azért okoz megnövekedett aszkorbátfogyást, mert hiányzik az E vitamingyök, amely az aszkorbátot újraoxidálja; és ugyanezért okoz csökkent tioloxidációt. Fontos megjegyezni, hogy az aszkorbát az E vitaminhiányos mikroszómákban is kivált némi tioloxidációt. Így valószínű, hogy más lipidoldékony antioxidánsok, mint a K vitamin vagy az ubikinon, valószínűleg hasonló funkciót töltenek be az endoplazmás retikulum membránjában. Ezenkívül más vízoldékony elektronszállítók is szerepet kaphatnak, feltéve, hogy bejutnak az endoplazmás retikulum lumenébe. Az, hogy a vázolt mechanizmus in vivo körülmények között milyen mértékben vesz részt az oxidatív fehérje hajtogatódásban, még kiderítésre vár. Az aszkorbát és a tokoferol itt összefoglalt funkcióit részletesen tárgyaljuk az értekezés alapjául szolgáló review ban (Bánhegyi, G., Csala, M., Szarka, A., Varsányi, M., Benedetti, A., and Mandl, J. (2003) Role of ascorbate in oxidative protein folding. Biofactors 17, 37 46). A kis molekulák mellett makromolekulák is részt vesznek az oxidatív fehérje foldinghoz csatlakozó elektron transzferben. A diszulfidkötések 11
létrejöttében az endoplazmás retikulum luminális kompartimentuma két fő fehérjéjének tulajdonítanak szerepet. Az egyik ezek közül a tiol diszulfid oxidoreduktázok prototípusa, a protein diszulfid izomeráz (PDI). A PDI dajkafehérje az endoplazmás retikulum fehérjék mintegy 2% át teszi ki, két tioredoxinszerű doménnel rendelkezik, melyekben az aktív helyeken ciszteinil oldallánc párok találhatók. A PDI gyenge oxidáns (redoxpotenciálja 150 mv), a környezet redoxpotenciáljától, illetve a szubsztrát fehérje tulajdonságaitól függően képes a diszulfid hidak kialakítására, illetve a nem megfelelően képződött diszulfid hidak izomerizációjára (21). Tekintettel arra, hogy a PDI gyenge oxidáns, ahhoz, hogy a fő funkcióját, az oxidációt el tudja látni elektronfelvétel után a PDI t is vissza kell oxidálni. Ezt egy másik enzim, az oxidatív fehérje folding másik alapvető fehérjéje, az élesztőkből megismert, az endoplazmás retikulum membrán belső oldalán elhelyezkedő endoplazmatikus oxidoreduktin, az Ero1p végzi. (16, 22, 23). Az Ero1p funkciózavara a sejtet érzékennyé teszi redukálószerek, például ditiotreitol iránt, és a szekréciós fehérjék, valamint a protein diszulfid izomeráz (PDI) redukált formában halmozódnak fel (16, 22, 24). Az Ero1p a flavoproteinek közé tartozó oxidáz, a diszulfidképződés tehát egy flavin függő reakció (5). A riboflavinnak, a FAD prekurzorának hiánya gyorsan foldingzavarokhoz vezet (5). Az Ero1p specifikusan oxidálja a PDI t; a PDI ezután oxidálja az oxidatív folding szubsztrát fehérjéit (5, 24). Az átmeneti diszulfidképződés is kimutatható a két fehérje között. Az Ero1p és a PDI által katalizált oxidáció tehát egy elektron relé rendszer révén valósul meg (1. ábra), ami relatíve függetlenné teheti a folyamatot a környezet redox viszonyaitól (5) és lehetővé teheti a hibásan képződött diszulfidok redukcióját és újrarendeződését. 12
M. Schröder and R. J. Kaufman, 2005 1. ábra. Az oxidatív fehérje folding mechanizmusa élesztőben Az Ero1p mellett két másik, az endoplazmás retikulumban található FADfüggő oxidáz részvétele merült fel az oxidatív fehérje foldingban. Az Erv2p expressziója képes részben ellensúlyozni az Ero1p defektusát, ezért feltételezik, hogy egy alternatív diszulfidgeneráló útvonalat katalizálhat (25, 26). Az Erv2p a szulfhidril oxidázok családjába tartozik, FAD kofaktort és molekuláris oxigént felhasználva direkt módon katalizálja a diszulfidképződést a fehérjékben (25 28). A flavin tartalmú monooxigenázok közé tartozó Fmo1p O2 és NADPHfüggő reakcióban oxidálhat kis molekulatömegű tiolokat, mint például a glutationt; az oxidált glutation azután egy második reakcióban oxidálhatja a fehérje tiolokat (29 31). Az Erv2p és az Fmo1p relatív hozzájárulása az in vivo diszulfidképződéshez egyelőre ismeretlen. A prokarióták periplazmájában (az endoplazmás retikulum lumenével analóg funkciójú kompartimentum) a diszulfidképződésért a DsbB és DsbA fehérjék felelősek, melyek hasonló szerepet játszanak, mint az Ero1p és a PDI (32 35). A DsbB oxidálja a DsbA t, mely aztán létrehozza a diszulfid hidakat az extracelluláris fehérjékben. A DsbB t kinonok oxidálhatják vissza (19, 20), majd a keletkező kinolokat a légzési lánc oxidálja el O2 t vagy alternatív 13
elektronakceptorokat felhasználva (18, 19). Így a kis molekulasúlyú redox vegyületek közvetlen összeköttetést hoznak létre az újonnan szintetizálódó fehérjék és a sejtlégzés között. Hasonló összeköttetés az eukarióta sejtek esetében is fontos lehet, mivel a szabályozatlan oxidatív folding foldinghibás, túloxidált fehérjéket eredményezhet. Tu és Weissman (36) kombinált genetikai és biokémiai megközelítés segítségével élesztő Ero1p t, PDI t és szubsztrátfehérjéket tartalmazó rendszert hoztak létre, mely molekuláris oxigén felhasználásával oxidálta a szekréciós fehérjék tioljait. Megállapították, hogy a szorosan kötődő FAD mellett az Ero1p aktivitása igen érzékeny a szabad FAD koncentrációjának változására. A FAD hatásos koncentrációja azonos nagyságrendben volt az élesztő citoszolban leírt szabad FAD koncentrációval (néhány um). Szabad FAD jelenlétében az Ero1p hatékonyan redukálta a molekuláris oxigént, körülbelül két diszulfidkötést létrehozva egy O2 molekula redukciója mellett. A reakció során hidrogén peroxid elhanyagolható mértékben keletkezett, mint végtermék. A hidrogén peroxid és a szuperoxid anion köztitermékként sem vett részt a katalízisben, mivel kataláz vagy szuperoxid dizmutáz adása nem befolyásolta az Ero1pfüggő diszulfidképződést. A FAD transzportot egy radioaktív, fotóaktiválás hatására kovalens kötést képező FAD analóg, az azido FAD (FAD 2 N3[β 33 P]) felhasználásával tanulmányozták. Az azido FAD a FAD hoz hasonlóan stimulálta az Ero1pkatalizált foldingot. Az élesztő mikroszómákhoz adott azido FAD 15 perces inkubálás és fotóaktiválás után az Ero1p hez kötve jelent meg, amit Western blottal igazolni lehetett. ATP jelenléte nem befolyásolta a felvételt. Emlős sejtekben a folyamat kevésbé ismert. Az Ero1p analógjai, az Ero1 L izoformái jelen vannak az emberi endoplazmás retikulumban is, és elektron transzferben játszott szerepük is bizonyítást nyert (37, 38). Az elektronok további útja az Ero1 L után ismeretlen. Feltételezhető, hogy a FAD itt is hasonló 14
szerepet tölthet be, mint az élesztőben. Ezt az a tény is alátámasztja, hogy riboflavin deficiencia az interleukin 2 intracelluláris felhalmozódásához vezet a selejtfehérje válasz (unfolded protein response, UPR) génjeinek fokozott expressziójával Jurkat sejtekben (39). Hasonlóképpen, humán hepatocelluláris (HepG2) sejtvonalon a riboflavin hiány az apolipoprotein B 100 szekréciójának csökkenését okozza, ugyancsak az UPR gének fokozott expressziójával (40). Azonban sem a FAD transzportját, sem az azzal kapcsolatos oxidatív folyamatokat nem írták le eddig emlős sejtek endoplazmás retikulumában. A FAD szerepe, szintézise és membrántranszportja eukariótákban A 6,7 dimetil 10 alkilizoalloxazin szerkezettel jellemezhető sárga színű vegyületeket flavinoknak nevezzük. A legismertebb természetben előforduló flavin a riboflavin vagy B2 vitamin. A flavoenzimek prosztetikus csoportja, a flavin mononukleotid (FMN) és a flavin adenin dinukleotid (FAD) riboflavinból képződik. A flavokoenzimek általában nem kovalensen kötődnek az apoenzimekhez, bár ritkábban kovalens kapcsolatra is van példa. A flavin molekulák háromféle redox állapotban fordulhatnak elő: oxidált, egy elektronnal redukált és két elektronnal redukált állapotban, így igen sokféle elektron transzferben képesek részt venni (41). A flavin nukleotidok standard redox potenciálja közepes értékű, így oxidációkat és redukciókat is eredményesen facilitálhatnak. A flavin kofaktorok szintéziséért két enzim a felelős. Első lépésben a riboflavin kináz ATP felhasználásával foszforilálja a riboflavint és FMN + ADP keletkezik. A második reakcióban a FAD szintetáz FMN ból ás ATP ből kialakítja a FAD ot. Az enzimek a citoszolban és a mitokondriális mátrixban is jelen vannak; az utóbbi lokalizáció nem meglepő, hiszen a legtöbb flavoenzim a 15
mitokondriumban található. A mitokondriumban megtalálták a FAD katabolizmusáért felelős FAD pirofoszfatázt és FMN foszfohidrolázt is (42; 2. ábra). A mitokondrium belső membránjában megtalálhatók a flavin nukleotidok transzportját facilitáló aktivitások. Patkány mitokondrium felveszi a riboflavint, FMN t és FAD ot, a felvételt mersalyl gátolja (43). Feltehetőleg egy második transzporter végzi a mitokondriumban szintetizálódott FAD exportját; ezt az aktivitást atraktilozid és lumiflavin gátolja (43; 2. ábra). A rendszer elemei az élesztősejt mitokondriumában is jelen vannak. Az élesztő mitokondrium is felveszi a riboflavint és képes a FAD szintézisére (44, 45). A képződött FAD fehérjemediált transzport segítségével jut ki az extramitokondriális térbe (44, 46, 47). Flavoproteinek jelen vannak más intracelluláris organellumok lumenében is; a flavin nukleotidok transzportját azonban eddig ott nem tanulmányozták. Barile M. et al., 2000 nyomán 2. ábra. FAD metabolizmus és transzport a mitokondriumban (Rövidítések: BM, belső membrán; KM, külső membrán; IT, intermembrán tér.) 16
CÉLKITŰZÉSEK Mint a bevezetésben látható, élesztőben kimutatták a FAD transzportját az endoplazmás retikulum membránján keresztül, illetve a lumenbe bejutó szabad FAD szerepét az oxidatív fehérje folding mechanizmusában. Célul tűztük ki a folyamat egyes elemeinek tanulmányozását emlős sejtekben, ezen belül vizsgálni kívántuk a FAD transzportját endoplazmás retikulumból származó mikroszómális vezikulákon. A transzport jellegzetességeinek megállapításán kívül össze kívántuk hasonlítani a mikroszómális és a már kissé jobban ismert mitokondriális FAD transzport jellemzőit. Meg akartuk állapítani, hogy a szabad FAD képes e serkenteni az oxidatív fehérje folding mechanizmusát emlős sejteken is. A protein tiol oxidáció mellett más intraluminális oxidatív folyamatok FAD függését is meg kívántuk vizsgálni. Kíváncsiak voltunk arra is, hogy az intraluminális oxidatív hatások és a FAD transzmembrán transzportja között milyen összefüggés van. Kísérleteinket patkány máj endoplazmás retikulumból származó mikroszómális vezikulákon végeztük. 17
ALKALMAZOTT MÓDSZEREK A patkány máj mikroszómák előállítása A máj mikroszómákat ad libitum táplált hím Sprague Dawley patkányokból (180 230 g testsúly; Charles River Hungary) preparáltuk standard differenciál centrifugálással (48). A mikroszómális frakciókat A pufferben (KCl, 100 mm; NaCl, 20 mm; MgCl2, 1 mm; Mops, 20 mm; ph 7,2) reszuszpendáltuk (50 100 mg fehérje/ml). A mikroszóma szuszpenziót folyékony nitrogénben gyorsan lefagyasztottuk és felhasználásáig folyékony nitrogénben tároltuk. A mikroszómális vezikulák intaktságát a mannóz 6 foszfatáz aktivitás (49) látenciájának mérésével, valamint a light scattering technikával ellenőriztük. Az intaktság/látencia minden felhasznált preparátumban nagyobb volt, mint 90%. A mikroszómák fehérjetartalmát BioRad protein assay vel határoztuk meg, standardként bovin szérum albumint alkalmazva. A fényszórásos (light scattering) technika A light scattering technika kisméretű vezikulákból álló rendszer fényszórási képességének mérésén alapul. A rendszer fényszórását mesterséges egységekben mérjük. Ozmotikus hatású anyaggal való kezelés hatására a vezikulák vizet veszítenek, zsugorodnak, fényszórási képességük fokozódik. Ez kezdeti emelkedett light scattering értékekben nyilvánul meg. Ha a vezikula membránja az adott anyagra nézve impermeábilis, a kezdeti fokozott light scattering szignál hosszú ideig fennmarad. Abban az esetben, ha a vezikula az adott molekulára nézve áteresztő, az ozmotikus grádiens megszűnik, a 18
vezikulák tágulnak, a görbe fokozatosan a kiindulási értékre tér vissza. Ha olyan szerrel kezeljük a membránt, ami a vezikulát permeabilizálja, például alameticinnel, a fényszórás gyorsan a kiindulási értékre tér vissza. Az alameticin pórusképző hatású oligopeptid, a vezikula permeabilitását számos hidrofil anyagra nézve, például UDP glukuronsav, szaharóz, glukóz 6 foszfát, redukált és oxidált glutation, stb. fokozza. Detergenssel kezelve a rendszert a membránszerkezet megszűnik, a vezikulák szétesnek, a fényszórás jelentősen csökken (50). Kísérleteinkben a módszert a mikroszómális vezikulák intaktságának vizsgálatára használtuk fel; az ilyen vezikulákban a nempermeábilis szaharóz, citrát vagy UDP glukuronsav hosszan fennmaradó fényszórási szignál emelkedést okoz. A gyorsszűréses (rapid filtrációs) technika A rapid filtrációs technika a mikroszómális transzportmechanizmusok és intravezikuláris pool ok detektálására alkalmas módszer. A módszer lényege, hogy a mikroszómális vezikulákat radioaktívan (vagy esetleg más módon) jelzett molekulákkal rövid ideig inkubáljuk, vákuum segítségével gyorsan átszűrjük, majd a felvett radioaktivitást szcintillációs számlálóval meghatározzuk (51). A szubsztrát, így a radioaktívan jelzett szubsztrát is aspecifikusan kötődhet a mikroszómális membránhoz, így a valós akkumuláció és transzport meghatározásához figyelembe kell vennünk ezt az esetlegesen membránhoz kötött aktivitást is. A teljes felvett aktivitás meghatározásakor ezért minden esetben permeabilizált vezikulákon is mérést kell végezni, mert így csak a membránhoz kötött ligandok radioaktivitását mérjük. 19
Az intravezikuláris FAD tér mérése A patkány máj mikroszómákat (10 mg protein/ml) reszuszpendáltuk az A pufferben. A mikroszómális szuszpenziót 1 mm FAD vagy [ 3 H]víz (0,2 μci/ml) vagy [ 3 H(C)]inulin (0,17 μci/ml) jelenlétében inkubáltuk 30 percig szobahőmérsékleten. Az inkubálás végén a mikroszómákat ultracentrifugáltuk (100000 g, 1 h), és a pellethez tapadó radioaktivitást mértük. Az intravezikuláris FAD tér meghatározásához a 100000 g pelletet reszuszpendáltuk és FAD tartalmát fluorimetrikusan mértük egy Cary Eclipse fluoreszcens spektrofotométerrel (Varian) 450 nm excitációs és 530 nm emissziós hullámhosszon. A háttér mikroszómális fluoreszcenciát minden esetben mértük és az adatokat ezzel az értékkel korrigáltuk. fluoreszcencia (mesterséges (A.U.) egység) 15 10 5 0 0 500 1000 FAD koncentráció (nm) 3. ábra. A FAD koncentráció és a fluoreszcencia összefüggése A 2% os Triton X 100 ban feloldott, a jelzett koncentrációjú FAD ot tartalmazó mikroszómák (1 mg fehérje/ml) fluoreszcenciáját 450 nm excitációs és 530 nm emissziós hullámhosszon mértük. A háttér (0 nm FAD) mikroszómális fluoreszcenciát levontuk a kapott értékekből. 20
A kötődés meghatározására párhuzamos kísérleteket végeztünk a pórusképző alameticin jelenlétében is (0,05 mg alameticin/mg protein; 52). Az alameticin távollétében és jelenlétében mért értékek különbségét tekintettük intravezikuláris tartalomnak. (Néhány kísérletben az alameticint felhasználtuk a FAD felszabadítására a pelletből, ilyenkor az alameticinnel kezelt pelletet reszuszpendáltuk, majd újra centrifugáltuk (100000 g, 1 h). A transzport mérése a gyorsszűréses technikával A glukóz 6 foszfát felvétel és akkumuláció mérésére a máj mikroszómákat (2 mg protein/ml) 10 μm glukóz 6 foszfátot és 8 10 mci/ml [ 14 C]glukóz 6 foszfátot tartalmazó A pufferben inkubáltuk 22 C on. Az inkubáció végén a mintákhoz alameticint adtunk (0,1 mg/ml), hogy megkülönböztessük az intravezikuláris és a kötött radioaktivitást (51, 53). A radioaktivitásnak alameticinnel felszabadítható részét tekintettük intravezikulárisnak. A jelzett időpontokban 0,1 ml es mintákat vettünk, melyeket gyorsan leszűrtünk cellulóz acetát/nitrát filter membránon keresztül (pórusméret 0,22 μm) és jéghideg, 1 mm 4,4 diizotiocianostilbén 2,2 diszulfonátot tartalmazó A pufferrel mostuk. A filteren fennmaradt radioaktivitást folyadékszcintillációs módszerrel mértük. A FAD felvétel mérése során a kísérleti körülmények hasonlóak voltak, kivéve a mikroszómális fehérjekoncentrációt (1 mg/ml). A filteren visszamaradt vezikulákat 2% os Triton X 100 zal szolubilizáltuk és a FAD ot fluorimetrikusan mértük (lásd fentebb). A transzport esetleges gátlószereit a FAD előtt 5 perccel adtuk az inkubációs médiumhoz. A kifelé irányuló FAD transzportot a vezikulák FAD dal való feltöltése után mértük (10 mg protein/ml, 1 mm FAD, 30 perces inkubálás szobahőmérsékleten). Az effluxot 21
úgy váltottuk ki, hogy a feltöltött mikroszómák médiumát FAD mentes A pufferrel tízszeresére hígítottuk. A mikroszómális fehérje tiol oxidáció mérése A Tris HCl pufferben (50 mm Tris, ph 7,2) felvett mikroszómákat (2,5 mg/ml) szabad FAD dal, illetve anélkül inkubáltuk 37 C on. 20 percnyi inkubálás után a fehérjéket 10% os triklórecetsavval kicsaptuk, háromszor mostuk 70% os acetonnal, majd Tris HCl pufferben reszuszpendáltuk (50 mm Tris, 8 M urea és 2% nátrium dodecil szulfát, ph 7,0). Az újra feloldott fehérje tiol tartalmát az Ellman módszerrel mértük Hitachi U 1500 spektrofotométerben. Vegyszerek Az alameticin, a glukóz 6 foszfát (dikálium só), a FAD, a 4,4 diizotiocianostilbén 2,2 diszulfonát és a flufenamát a Sigma tól származott. A [ 3 H]vizet (1 mci/g) és az [ 3 H(C)]inulint (500 mci/g) a DuPont New England Nuclear tól szereztük be. A D [14C (U)]glukóz 6 foszfát (0,1 mci/ml; 300 mci/mmol) az American Radiolabelled Chemicals Inc. (St. Louis, MO) terméke. Cellulóz acetát/nitrát filter membránjainkat (pórusméret 0,22 μm) a Milliporetól vettük. 22
EREDMÉNYEK Patkány máj mikroszómák FAD által hozzáférhető intravezikuláris terének meghatározása Első kísérleteinkben arra kerestünk választ, hogy a FAD egyáltalán képese bejutni a mikroszómális vezikulák lumenébe. Ezért meghatároztuk a FAD számára hozzáférhető intravezikuláris térfogatot. A patkány máj mikroszómák látszólagos intra és extravezikuláris terét [ 3 H]vízzel, mint teljesen membránpermeábilis molekulával és[ 3 H(C)]inulinnal, mint nem permeábilis vegyülettel határoztuk meg. I. TÁBLÁZAT Patkány máj mikroszómák látszólagos intravezikuláris FAD tere Látszólagos tér (μl/mg protein) teljes intravezikuláris [ 3 H(C)]inulin 9,41 [ 3 H]víz 13,77 4,36 FAD 15,86 6,45 A mikroszómákat (10 mg protein/ml) A pufferben reszuszpendáltuk, majd 1 mm FAD, [ 3 H]víz (0,2 μci/ml) vagy [ 3 H(C)]inulin (0,17 μci/ml) jelenlétében 30 percig szobahőmérsékleten inkubáltuk. Az izotóp terek mérésére a mikroszómákat centrifugáltuk (100000 g, 1 h) és a pellethez tapadó radioaktivitást mértük. Az intravezikuláris FAD tér mérésére a 100000 g s pelletet reszuszpendáltuk és FAD tartalmát fluorimetrikusan mértük 450 nm excitációs és 530 nm emissziós hullámhosszon. 23
A FAD nagyobb intravezikuláris teret foglalt el, mint a víz, ami már jelezte, hogy a molekula számára a membrán átjárható (I. táblázat). Az intraluminális FAD felhalmozódás valóban felvétel és nem membránhoz való kötődés eredménye volt, hiszen a pórusképző antibiotikum alameticin jelenlétében végzett kísérletekben nem észleltünk mikroszómális FAD akkumulációt. Az alameticint utólag (a felvétel után) adva a rendszerhez, a FAD túlnyomó része elhagyta a lument, a membránhoz és a fehérjékhez való kötődés a teljes mikroszómális FAD tartalom kevesebb, mint 15% a volt. A FAD intraluminális felhalmozódása tehát a felvétel és az esetleges mikroszómális metabolizmus következménye. A FAD transzportja patkány máj mikroszómális vezikulákban A fenti eredmények már valószínűsítették a mikroszómális FAD transzport létezését. A FAD felvételét a továbbiakban a laboratóriumunkban konvencionálisan alkalmazott gyorsszűréses eljárással vizsgáltuk. (A transzport mérésére szintén széleskörűen használt fényszórásos módszer a FAD esetében nem jött számításba, mivel a molekulának a teljes látható tartományban erőteljes fényelnyelése van.) A FAD felvétele egy gyors kezdeti fázis után 10 perc körül érte el maximumát (4. ábra, A). A számított intravezikuláris FAD tér ebben az esetben körülbelül 5 μl/mg protein volt, ami jól egyezik az előző kísérleti rendszerben nyert adattal. A mikroszómával asszociálódott FAD ot alameticin adásával fel lehetett szabadítani, tehát a FAD valóban intravezikulárisan helyezkedett el. A transzport kétirányú volt: az előzetesen FAD jelenlétében inkubált mikroszómális vezikulákból gyors FAD kiáramlás történt, ha az inkubációs elegyet FAD mentes pufferrel hígítottuk (4. ábra, B). 24
6 A B FAD (nmol/mg protein) 4 2 0 0 10 20 30 30 40 50 60 idő (perc) 4. ábra. FAD felvétel (A) és efflux (B) patkány máj mikroszómális vezikulákban A, a FAD felvétel időfüggése: a mikroszómákat (1 mg protein/ml) 1 mm FAD ot tartalmazó A pufferben inkubáltuk szobahőmérsékleten. A jelzett időpontokban 0,1 ml es mintákat vettünk, a mintákat szűrtük és 2 ml, 1 mm 4,4 diizotiocianostilbén 2,2 diszulfonátot (DIDS) tartalmazó jéghideg A pufferrel mostuk. A filteren fennmaradt mikroszómákat 2% os Triton X 100 zal szolubilizáltuk, és a FAD tartalmat fluorimetrikusan mértük ( ). Párhuzamos mintákat alameticin (0,05 mg/mg protein; Δ) jelenlétében inkubáltunk, vagy DIDS mentes pufferrel mostunk ( ). B, a FAD efflux mérésére a mikroszómákat (10 mg protein/ml) 1 mm FAD ot tartalmazó A pufferben inkubáltuk szobahőmérsékleten 30 percig. Ezután az oldatot FAD mentes, DIDS et tartalmazó ( ) vagy nem tartalmazó ( ) A pufferrel tízszeresére hígítottuk. A mintavétel, a minták szűrése és mosása ugyanúgy történt, mint a felvétel mérése esetén. Az adatok két független kísérlet három három mérési pontjának átlagai, vagy átlagok ± S.D., n = 6. 25
Bizonyítandó a transzport fehérje mediált természetét, megvizsgáltuk néhány általános anion transzport gátlószer, valamint a mitokondriális FAD transzport inhibitor atraktilozid (43) hatását a mikroszómális FAD felvételre. A mikroszómák előinkubálása 4,4 diizotiocianostilbén 2,2 diszulfonsav vagy atraktilozid jelenlétében gátolta a FAD felvételt, míg az N etilmaleimid alig volt hatásos és a flufenamát teljesen hatástalannak bizonyult (5. ábra). Mind a 4,4 diizotiocianostilbén 2,2 diszulfonsav, mind az atraktilozid hatása koncentrációfüggő volt (6. ábra). 5. ábra. A FAD felvétel inhibitorainak hatása A mikroszómákat (1 mg protein/ml) A pufferben inkubáltuk szobahőmérsékleten 5 percig a jelzett gátlószer jelenlétében. 1 mm FAD adása után a vezikulákat további 5 percig inkubáltuk, majd a felvételt az előbbiekkel azonosan mértük. Átlag ± S.D., n = 4 6. Rövidítések: ctrl, kontroll; atr, atraktilozid; DIDS, 4,4 diizotiocianostilbén 2,2 diszulfonsav; flu, flufenamát; NEM, N etilmaleimid. 26
A 4,4 diizotiocianostilbén 2,2 diszulfonsav a FAD effluxot is gátolta, ezért a vegyületet a gyorsszűrés során a mosáshoz használt pufferben is felhasználtuk. Amint az a 4. ábrán látható (4. ábra A), a 4,4 diizotiocianostilbén 2,2 diszulfonsav kihagyása a mosó pufferből a FAD felvétel következetes alulbecsléséhez vezet, amit a mosási fázis alatti FAD kiáramlás okoz. 6. ábra. A FAD felvétel koncentrációfüggő gátlása atraktiloziddal és 4,4 diizotiocianostilbén 2,2 diszulfonsavval A mikroszómákat (1 mg protein/ml) A pufferben szobahőmérsékleten inkubáltuk 5 percig a jelzett koncentrációjú atraktilozid ( ) vagy 4,4 diizotiocianostilbén 2,2 diszulfonsav ( ) jelenlétében. 1 mm FAD adása után a vezikulákat további 5 percig inkubáltuk, majd a felvételt az előbbiekkel azonosan mértük. Átlag ± S.D., n = 6. 27
A szabad FAD előmozdítja az intravezikuláris oxidatív folyamatokat patkány máj mikroszómákban Ha a FAD bejut a mikroszóma lumenébe, fokozhatja a lokális oxidatív folyamatokat. Két közismert intraluminális oxidatív reakciót a glukóz 6 foszfát és a protein tiolok oxidációját vizsgáltunk meg, hogy a FAD e hatását bizonyíthassuk. Ismert, hogy a glukóz 6 foszfát mikroszómális oxidációját, melyet az intraluminális hexóz 6 foszfát dehidrogenáz katalizál, az intraluminális NADPH eloxidálásával fokozni lehet. Erre a célra használható a membrán permeábilis metirapon, mely egy intravezikuláris reduktáz (54) szubsztrátjaként visszaoxidálja a NADPH t (55). A metirapon [ 14 C]glukóz 6 foszfát adása után fokozza az intraluminális radioaktivitás akkumulációját. A hatásért az intravezikuláris 6 foszfoglukonát koncentrációjának emelkedése a felelős, mely a hexóz 6 foszfát dehidrogenáz terméke (55). Ennek alapján feltételeztük, hogy más membrán permeábilis NADPH oxidáló vegyületek így a FAD is képesek lehetnek kiváltani a radioaktivitás intraluminális akkumulációját [ 14 C]glukóz 6 foszfát adása után. A feltételezésnek megfelelően 1 mm FAD jelenlétében inkubált mikroszómákban a radioaktivitás felhalmozódása a steady state fázisban 1,6 szer magasabb volt a kontrollénál [ 14 C]glukóz 6 foszfát adása után ( 7. ábra ) Élesztőben a szabad FAD szerepét az oxidatív fehérje foldingban már igazolták. Ezért a következő lépésben mi is megvizsgáltuk a FAD hatását a diszulfid kötések képződésére. A mikroszómális fehérje tiolok koncentrációja FAD nélkül 37 C on végzett inkubálás során alig változik. FAD adása viszont a tiolok szintjének gyors csökkenéséhez vezet. A maximális hatáshoz 0,2 mm FAD koncentrációra volt szükség. A teljes mikroszómális protein tiolok körülbelül egyharmadát lehetett eloxidálni (8. ábra). A hatás koncentrációfüggő volt, 10 μm FAD már hatékonynak bizonyult, de 0,2 mm nál magasabb FAD 28
koncentrációk vagy 20 percnél hosszabb inkubálás már nem okozott kifejezettebb hatást. alameticin 300 felvétel (pmol glukóz-6-foszfát ekvivalens/mg protein) 200 100 0 0 3 6 9 12 idő (perc) 7. ábra. A FAD hatása az intravezikuláris glukóz 6 foszfát oxidációra patkány máj mikroszómákban A glukóz 6 foszfát oxidációját az intraluminális radioaktivitás [ 14 C]glukóz 6 foszfát adását követő felhalmozódása alapján követtük nyomon. A mikroszómális vezikulákat (2 mg protein/ml) 1 mm FAD jelenlétében ( ), illetve FAD nélkül ( ) 5 percig szobahőmérsékleten inkubáltuk. A radioaktivitás intraluminális felhalmozódását 10 μm [ 14 C]glukóz 6 foszfát adását követően gyorsszűréssel mértük. 10 perces inkubálás után pórusképző alameticint (0,1 mg/ml; nyíl) adtunk az inkubációhoz. Átlag ± S.D., n = 4 6. 29
Protein tiol tartalom (a kontroll %-ában) 100 90 80 70 60 0 100 200 FAD (μm) 500 8. ábra. A FAD hatása a fehérje tiolok oxidációjára patkány máj mikroszómákban A mikroszómákat (2,5 mg protein/ml) különböző koncentrációjú FAD dal inkubáltuk 20 percig 37ºC on. A fehérje tiol mennyiségeket Ellman módszerével mértük az inkubálás elején és végén. Az eredményeket a kontroll % ában fejeztük ki, átlag ± S.D., n = 5. A FAD felvétel gátlása atraktiloziddal kivédte a protein tiolok oxidációját (II. táblázat). Az atraktilozid önmagában nem befolyásolta a mikroszómális 30
protein tiolok redox státuszát. A transzport másik gátlószere, a 4,4 diizotiocianostilbén 2,2 diszulfonsav zavarta a tiol meghatározást, így ezekben a kísérletekben nem használhattuk. II. TÁBLÁZAT A FAD transzport gátlásának hatása a fehérje tiol oxidációra patkány máj mikroszómákban kezelés kontroll FAD (50 μm) atraktilozid (0,5 mm) FAD (50 μm) + atraktilozid (0,5 mm) mikroszómális fehérje tiol tartalom (nmol/mg protein) 239,8 ± 12,0 211,0 ± 22,5** 238,0 ± 27,0 230,6 ± 9,9* A mikroszómákat (3 mg protein/ml) 30 percig inkubáltuk 37ºC on. A protein tiol tartalmat az inkubálás elején és végén határoztuk meg. Átlag ± S.D., n = 6. **P<0,001 FAD vs kontroll; *P<0,05 FAD + atraktilozid vs FAD. 31
MEGBESZÉLÉS A szekréciós fehérjék diszulfid kötéseinek kialakításához szükség van egy elektron transzfer láncra az eukarióta sejt endoplazmás retikulumában, mely az elektronokat a fehérje tioloktól az oxigénig szállítja. A rendszer modelljét legalaposabban élesztőben írták le, ahol az elektron transzfert fehérjék végzik, a protein diszulfid izomeráz és a flavoprotein Ero1p. Az utóbbi fehérje a szorosan kötött FAD mellett képes szabad FAD kötésére is, és ez a kötés alapvető a fehérje működésében. A FAD a citoszolban (és a mitokondriumban) szintetizálódik, de az élesztőben (és mint jelen kísérleteink igazolják, emlős sejtekben is) könnyen bejut az endoplazmás retikulum lumenébe, ahol előmozdítja az Ero1p által katalizált oxidációt. Mivel az emlős sejtek expresszálják az Ero1p analógjait (23, 37, 38, 56), feltételezhetjük, hogy a mikroszómális FAD transzportnak ezekben a sejtekben is fiziológiás szerepe lehet az oxidatív foldingban. Hipotézisünknek megfelelően sikerült a FAD transzportját kimutatni patkány máj mikroszómális vezikulákban. A gyorsszűréses kísérletek igazolták, hogy a transzport kétirányú (4. ábra A,B). Az intravezikuláris FAD koncentráció az egyensúlyi állapotban magasabb az extravezikulárisnál, amit esetleg a FAD luminális metabolizmusa okozhat. A mikroszómális minták HPLC s analízise valóban kimutatta a FAD egyelőre azonosítatlan metabolitjainak megjelenését (Szarka A. publikálatlan megfigyelése). A transzportot mindkét irányban koncentrációfüggő módon gátolni tudtuk az anion transzport blokkoló 4,4 diizotiocianostilbén 2,2 diszulfonsavval, és a mitokondriális FAD transzport gátlószerével, az atraktiloziddal (4. ábra A, B; 5. és 6. ábra). Az eredmények tehát alátámasztják egy fehérjemediált FAD transzport jelenlétét a máj endoplazmás retikulumában. 32
A FAD megjelenését a lumenben indirekt módon is bizonyítottuk. A mikroszómális vezikulákhoz adott FAD fokozta a glukóz 6 foszfát és a fehérje tiolok intraluminális oxidációját (7. és 8. ábra). A transzport és az intraluminális oxidatív hatás közötti direkt összefüggést is bizonyítani lehetett: a transzport gátlása atraktiloziddal kivédte a fehérje tiolok oxidációját (II. táblázat). Az intravezikuláris FAD akkumuláció (I. táblázat) szintén azt támasztja alá, hogy a FAD ot intraluminális reakciók hasznosítják. A FAD szerepe az endoplazmás retikulum intraluminális redox reakcióiban a piridin nukleotidok és a tiolok oxidációja mellett más is lehet. A standard redoxpotenciál értékek például megengedik az elektron transzfert a FAD és az aszkorbát/dehidroaszkorbát redox páros között. Ez az összefüggés a direkt, PDI által közvetített tiol oxidációval együtt magyarázhatja az aszkorbát és a tokoferol általunk leírt szerepét az oxidatív fehérje folding mechanizmusában. A FAD transzportja az egyes organellumok membránján át alig ismert; egyetlen FAD transzportert sem írtak le eddig molekuláris szinten. FAD transzport aktivitást az élesztő endoplazmás retikulumán kívül csak emlős sejtek mitokondriumának belső membránjában észleltek eddig (43). Az élesztő endoplazmás retikulum FAD transzportját az aktivitás leírói nem jellemezték részleteiben, de a transzlokon peptid csatorna esetleges szerepét vetették fel. (Kísérleteinkben a puromicin nem fokozta a FAD transzportját, így a patkány máj endoplazmás retikulumában a transzlokon részvétele a FAD transzportban legalábbis valószínűtlen.) A mitokondriális transzporter feltehetőleg egy antiporter, melyet az atraktilozid mikromoláris koncentrációban gátol (43). A mikroszómális FAD transzport általunk leírt jellegzetességei (gátlás 4,4 diizotiocianostilbén 2,2 diszulfonsavval, relatíve csekély érzékenység atraktiloziddal szemben, enyhe gátlás N etilmaleimiddel) hasonlóak az endoplazmás retikulum ATP/ADP antiporteréihez (57 59). Feltételezhető, hogy 33
a FAD transzport az ATP/ADP antiporterek feladata mind a mitokondriumban, mind az endoplazmás retikulumban. endoplazmás retikulum mitokondrium oxidatív fehérje folding FADH 2 FADH 2 FAD FAD Termális oxidáció 8. ábra. Hipotézis: sejtorganellumok közti elektrontranszport a FAD részvételével A FAD transzporterek jelenléte az endoplazmás retikulum és a mitokondrium membránjában felvetheti annak a lehetőségét, hogy az oxidatív folding során felszabaduló elektronok ezzel a mechanizmussal eljuthatnak a mitokondriális légzési láncig, ami energetikai szempontból a sejt számára előnyös. Egy ilyen feltételezett mechanizmus szabályozási szerepet is elláthat. A FAD transzport kulcsszerepet játszhat az endoplazmás retikulum membránján keresztül történő elektrontranszferben, hiszen a legtöbb redox aktív vegyületre 34
nézve az endoplazmás retikulum membrán permeabilitása igen korlátozott. A piridin nukleotidok például a citoszoltól teljesen elkülönülő intraluminális poolt képeznek (60, 61). Transzhidrogenáz aktivitást szintén nem mutattak ki eddig az organellumban. A glutation transzportjának is igen alacsony a sebessége (62). Így a FAD transzportján kívül eddig csak a dehidroaszkorbát transzport volt ismert, mint a lumen redoxpotenciálját befolyásolni képes folyamat (14), illetve a mikroszómális membrán tokoferoljáról tételeztük fel és bizonyítottuk be, hogy a transzmembrán elektrontranszfer fontos komponense lehet (10). A FAD transzport in vivo jelentőségének megítéléséhez azonban még nagyon sok információra lenne szükség. Kérdés például, hogy az emlős sejt citoszoljának szabad FAD szintje egyáltalán lehetővé teszi e a FAD transzporterek hatékony működését. A FAD oxidatív fehérje foldingban betöltött szerepét támasztják alá Papp és munkatársai (63) legújabb kísérleti eredményei, melyek szerint a FAD hatékonyan oxidálja az Ero1 és PDI fehérjék tiol csoportjait, és a FAD transzport gátlása megszünteti ezt az oxidációt. A mikroszómális membrán épsége szükséges volt az Ero1 től kiinduló oxidációs lépésekhez, permeabilizálás hatására a FAD oxidatív hatása megszűnt. Ez az eredmény azt jelenti, hogy a lumen tartalmazhat egy kismolekulasúlyú redox aktív vegyületet, mely szerepet játszik a további elektrontranszferben. Ez a megfigyelés alapot jelenthet a FAD, a tokoferol és az aszkorbinsav eddig leírt szerepének egységes mechanizmusba foglalására. Egy igen friss közlemény (64) beszámol arról, hogy a redukált Ero1p a molekuláris oxigén mellett számos más kis és makromolekulát is felhasználhat, mint elektron akceptort. Ezek között szerepel a szabad FAD is, mely ugyan nem elengedhetetlen a diszulfid képződéshez aerob viszonyok között, de azzá válik anaerob feltételek mellett, illetve gyorsíthatja a folyamatot még oxigén mint elektronakceptor jelenlétében is. 35
Összefoglalva elmondhatjuk, hogy a citoszol szabad FAD ja bejuthat az endoplazmás retikulum lumenébe és hozzájárulhat a diszulfid kötések kialakulásához emlős sejtekben is. Az endoplazmás retikulum membránján keresztül történő FAD transzportnak fontos szerepe lehet a diszulfidképződésnek a sejt energetikai, metabolikus és tápláltsági állapotával való összehangolásában. 36
KÖVETKEZTETÉSEK Munkánk célja a FAD transzport kimutatása és annak jellemzése volt patkány máj endoplazmás retikulumból származó mikroszómális vezikulákon. Legfontosabb új eredményeink a következők: A FAD átjut a mikroszómális membránon, és felhalmozódik a lumenben. A FAD transzportja kétirányú, gátolható atraktiloziddal és 4,4 diizotiocianostilbén 2,2 diszulfonsavval. A lumenbe belépő FAD reagál a piridin nukleotid és a tiol/diszulfid redox rendszerekkel. A FAD felvétele előmozdítja az intraluminális fehérje tiolok oxidációját, a transzport gátlása kivédi a hatást. Az eredmények szerint tehát az élesztőben leírtakhoz hasonlatosan a szabad FAD meghatározó szerepet játszik az oxidatív fehérje folding mechanizmusában emlős sejtek endoplazmás retikulumában is. 37
IRODALOMJEGYZÉK 1. Gilbert, H.F. (1990) Molecular and cellular aspects of thiol disulfide exchange. Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol. 63, 69 172. 2. Fewell, S.W., Travers, K.J., Weissman, J.S. and Brodsky, J.L. (2001) The action of molecular chaperones in the early secretory pathway. Annu. Rev. Genet. 35, 149 191. 3. Helenius, A., Marquardt, T. and Braakman, I. (1992) The endoplasmic reticulum as a protein folding compartment. Trends Biochem. Sci. 2, 227 231. 4. Bardwell, J.C. (2002) Disulfide bond formation, a race between FAD and oxygen. Dev. Cell. 3, 758 760. 5. Tu, B.P., Ho Schleyer, S.C., Travers, K.J. and Weissman, J.S. (2000) Biochemical basis of oxidative protein folding in the endoplasmic reticulum. Science 290, 1571 1574. 6. Frand, A.R., Cuozzo, J.W., and Kaiser, C.A. (2000) Pathways for protein disulphide bond formation. Trends Cell. Biol. 10, 203 210. 7. Debarbieux, L., and Beckwith, J. (1999) Electron avenue: pathways of disulfide bond formation and isomerization. Cell 99, 117 119. 8. Fassio, A., and Sitia, R. (2002) Formation, isomerisation and reduction of disulphide bonds during protein quality control in the endoplasmic reticulum. Histochem. Cell. Biol. 117, 151 157. 38