Signal Transducers and Activators of Transcription-3/Pim1 Axis Plays a Critical Role in the Pathogenesis of Human Pulmonary Arterial Hypertension

Signal Transducers and Activators of Transcription-3/Pim1 Axis Plays a Critical Role in the Pathogenesis of Human Pulmonary Arterial Hypertension Roxane Paulin, MSc; Audrey Courboulin, MSc; Jolyane Meloche, BSc; Vincent Mainguy, MSc; Eric Dumas de la Roque, MD; Nehmé Saksouk, PhD; Jacques Côté, PhD; Steeve Provencher, MD; Mark A. Sussman, PhD; Sébastien Bonnet, PhD Downloaded from http://circ.ahajournals.org/ by guest on April 23, 2018 Background Pulmonary artery hypertension (PAH) is a proliferative disorder associated with enhanced pulmonary artery smooth muscle cell proliferation and suppressed apoptosis. The sustainability of this phenotype required the activation of a prosurvival transcription factor like signal transducers and activators of transcription-3 (STAT3) and nuclear factor of activated T cell (NFAT). Because these factors are implicated in several physiological processes, their inhibition in PAH patients could be associated with detrimental effects. Therefore, a better understanding of the mechanism accounting for their expression/activation in PAH pulmonary artery smooth muscle cells is of great therapeutic interest. Methods and Results Using multidisciplinary and translational approaches, we demonstrated that STAT3 activation in both human and experimental models of PAH accounts for the expression of both NFATc2 and the oncoprotein kinase Pim1, which trigger NFATc2 activation. Because Pim1 expression correlates with the severity of PAH in humans and is confined to the PAH pulmonary artery smooth muscle cell, Pim1 was identified as an attractive therapeutic target for PAH. Indeed, specific Pim1 inhibition in vitro decreases pulmonary artery smooth muscle cell proliferation and promotes apoptosis, all of which are sustained by NFATc2 inhibition. In vivo, tissue-specific inhibition of Pim1 by nebulized sirna reverses monocrotaline-induced PAH in rats, whereas Pim1 knockout mice are resistant to PAH development. Conclusion We demonstrated for the first time that inhibition of the inappropriate activation of STAT3/Pim1 axis is a novel, specific, and attractive therapeutic strategy to reverse PAH. (Circulation. 2011;123:1205-1215.) Key Words: apoptosis hypertension, pulmonary proliferation Pulmonary artery (PA) hypertension (PAH) is a proliferative vascular remodeling disease characterized by enhanced inflammation, 1 vasoconstriction, and PA smooth muscle cell (PASMC) proliferation and resistance to apoptosis. 2 This leads to an increase in pulmonary vascular resistance and eventually to right heart failure. 3 The sustainability of this proproliferative and antiapoptotic phenotype is due in part to the activation of a transcription factor, nuclear factor of activated T cells (NFAT). 4,5 Nonetheless, the mechanism by which NFAT expression and activation are increased remains elusive. Clinical Perspective on p 1215 The signal transducers and activators of transcription (STAT) protein family regulates diverse cellular processes, including growth and survival, and is frequently deregulated in cancer. The family is composed of 7 isoforms (STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5A, STAT5B, and STAT6), with STAT3 being the most important in cardiovascular diseases. 6,7 STATs are activated (ie, phosphorylated [P-STAT] and translocated to the nucleus) in response to cytokines (such as interleukin-6), 8 growth factors (such as platelet-derived growth factor), 8 or agonists (such as endothelin-1 and angiotensin II), 9 all of which are implicated in PAH. 10 12 Interestingly, several STAT binding sites have been identified within the promoter regions 13 of NFATc1, NFATc2, and NFATc3 (the 3 major NFAT isoforms implicated in PAH 5 ). Although the role of STAT3 in PAH has been suggested, 14 its exact function and its effects on NFAT remain to be established. In cancer, STAT3 promotes the expression of the provirus integration site for Moloney murine leukemia virus (Pim1), a Received August 25, 2010; accepted January 10, 2011. From the Department of Medicine, Université Laval and Centre de Recherche du CHUQ Hôtel-Dieu de Québec, Québec City, Québec, Canada (R.P., A.C., J.M., N.S., J.C., S.B.); Faculté de Medecine, Université Laval, Centre de Recherche CRIUCPQ, Québec City, Québec, Canada (V.M., S.P.); Université Bordeaux 2 and INSERM U 885, Bordeaux, France (E.D.d.l.R.); and SDSU Heart Institute, San Diego State University, Biology Department, San Diego, CA (M.A.S.). The online-only Data Supplement is available with this article at http://circ.ahajournals.org/cgi/content/full/circulationaha.110.963314/dc1. Correspondence to Dr Sébastien Bonnet, Centre de recherche de L Hôtel-Dieu de Québec, 10 Rue McMahon, Québec, QC G1R 2J6, Canada. E-mail sebastien.bonnet@crhdq.ulaval.ca 2011 American Heart Association, Inc. Circulation is available at http://circ.ahajournals.org DOI: 10.1161/CIRCULATIONAHA.110.963314 1205

1206 Circulation March 22, 2011 Downloaded from http://circ.ahajournals.org/ by guest on April 23, 2018 proto-oncogene encoding a serine/threonine protein kinase. 15 Overexpression of Pim1 is linked to the development and progression of several cancers by increasing cell proliferation/survival and resistance to apoptosis. 16 18 Finally, Pim1 activation enhanced NFATc1 through NFATc4 activity in rat PC12 cells and lymphoid cells, 19,20 suggesting a potential role for Pim1 in PAH. The present study aimed to elucidate the role of STAT3 and Pim1 in the origin of PAH, particularly with regard to the sustainability of the proproliferative and antiapoptotic phenotype mediated by NFAT. Methods The online-only Data Supplement gives details on all methods. For human tissue samples, see Table I in the online-only Data Supplement. For supplies and chemicals, see Table II in the online-only Data Supplement. All human tissues were obtained from the Laval Hospital tissue bank. PAH tissues were from 8 subjects with nonfamilial PAH, all classified within the group 1 of the latest World Health Organization classification with a mean PA pressure 25 mm Hg. Normal lung tissues were obtained from 8 individuals without PAH undergoing lung resection for benign nodules (n 3) and malignant tumor (n 5). Buffy coat samples were obtain from 7 healthy donors, 13 nonfamilial PAH patients (9 idiopathic PAH and 4 scleroderma-pah), and 7 patients with scleroderma. All experiments were performed in accordance with Laval University and Laval Hospital biosafety and ethics committee (protocol 20142). All patients gave informed consent before the study. Cell Culture For all PASMCs (control and PAH), we used cells in the fourth to sixth passage. PAH PASMCs were isolated from 1500- mdiameter small pulmonary arteries from 3 male patients with PAH defined by a mean PA pressure 25 mm Hg (Table I in the online-only Data Supplement) as previously described. 21 Control PASMCs from 5 patients were purchased (Cell Application Group, San Diego, CA). See the Methods section in the online-only Data Supplement. sirna and Adenovirus Efficiencies sirna and adenovirus efficiencies were evaluated by both quantitative reverse-transcription polymerase chain reaction (qrt-pcr) and immunoblot (see Figure XIC in the online-only Data Supplement). Statistics Averaged data are mean SEM. Normality of our data was assessed by the Shapiro-Wilk normality test. For comparisons between 2 means, we used unpaired Student t test. For comparison between 2 means, we used 1-way ANOVA followed by the Dunn test. For correlation studies, Spearman 2-tailed test was used. In cultured cell based experiment, n indicates the number of patients; in the in vivo studies, n indicates the number of animals. For survival analysis, a cohort of 20 knockout (KO) and 20 wild-type (WT) mice exposed to chronic hypoxia (CH) or injected with pyrrole-modified monocrotaline (MCTP) were prospectively followed up for 25 days and euthanized after hemodynamic studies on day 25 after MCTP injection or CH exposure. Spontaneous deaths were counted as events, and mice undergoing planed hemodynamic studies and euthanasia were censored. Time-to-event data were plotted with the Kaplan-Meier method, with differences evaluated through the use of the log-rank test. Values of P 0.05 were considered significant. Results STAT3 Activation Is Increased in Human PAH PASMCs STAT3 activation (nuclear translocation of Y705-phosphorylated STAT3) was measured in whole PAs of 8 PAH patients and 8 healthy donors (Table I in the online-only Data Supplement) and in PASMCs isolated from 8 individuals (3 PAH and 5 healthy donors). Compared with control, the percentage of cells presenting a colocalization between P-STAT3 and DAPI was significantly increased in PAs from PAH patients and in PAH PASMCs (Figure 1A). This finding was confirmed in PASMCs by immunoblots measuring the PY705-STAT3/STAT3 ratio normalized to smooth muscle actin (Figure 1A). Pim1 Expression Is Increased in Human PAH PASMCs and Correlates With PAH Severity To investigate the role of Pim1 in PAH, Pim1 expression was measured in both lungs (from 8 PAH and 8 control patients) and PASMCs isolated from distal PAs (3 PAH and 5 control patients). Compared with control, 8-fold and 2.5-fold increases in Pim1 mrna levels (qrt-pcr) were observed in PAH lung tissue and PAH PASMCs, respectively (Figure 1B). This was confirmed at the protein level in distal PAs by immunofluorescence (Figure IA in the online-only Data Supplement) in lung sections with Pim1 in green, smooth muscle actin in red, and nucleus in blue (DAPI). As shown, green fluorescence was significantly increased in PAH. In addition, the rise in Pim1 was localized mainly within the PASMCs as shown by a greater colocalization between smooth muscle actin and Pim1, giving a yellow staining (Figure IA in the online-only Data Supplement). This finding was confirmed in isolated PASMCs with immunoblots (Figure 1B) showing a 2-fold increase in Pim1 protein expression in PAH PASMCs compared with control. To determine whether Pim1 expression correlates with PAH severity, Pim1 mrna expression was measured in human lungs with various degrees of PAH, evaluated by pulmonary vascular resistance. As shown, Pim1 mrna levels correlate positively with pulmonary vascular resistance (Figure 1B). Because PAH is characterized by increased circulating levels of activated T cells 5 and endothelial progenitor cells 22,23 in which Pim1 is expressed, 24,25 Pim1 expression could be used as a PAH marker. Thus, Pim1 mrna levels were measured in human buffy coat (containing both T cells and endothelial progenitor cells) isolated from healthy donors, patients with idiopathic PAH, patients with scleroderma only, and patients with PAH associated with scleroderma (Table I in the online-only Data Supplement). As in lungs and PAH PASMCs, Pim1 expression was significantly increased in buffy coats of patients with PAH associated or not with scleroderma (Figure IB in the online-only Data Supplement). As in lungs, Pim1 mrna levels in buffy coats correlate with PAH severity evaluated by both the mean of PA pressure and pulmonary vascular resistance (Figure IB in the online-only Data Supplement). These results further

Paulin et al Pim1 Inhibition Reverses Pulmonary Hypertension 1207 Downloaded from http://circ.ahajournals.org/ by guest on April 23, 2018 Figure 1. The signal transducers and activators of transcription-3 (STAT3)/Pim1 axis is activated in human pulmonary artery (PA) hypertension (PAH). A, STAT3 activation measured by PY705-STAT3 nuclear localization is significantly increased in both whole PAs and PA smooth muscle cells (SMCs) isolated from PAH patients compared with control. This was confirmed by immunoblots showing a 2.8- fold increase in the PY705-STAT3/STAT3 ratio in PAH PASMCs compared with control PASMCs. B, Pim1 mrna levels measured by quantitative reverse-transcription polymerase chain reaction (qrt-pcr) are significantly increased in both lungs and PASMCs isolated from PAH patients compared with control patients. This was confirmed by immunoblots in isolated PASMCs. Finally, Pim1 mrna levels in lungs correlate with PAH severity assessed by pulmonary vascular resistance (PVR). C, PAH PASMCs treated with sistat3 had a significant reduction in Pim1 expression (qrt-pcr) compared with the scrambled-treated cells. Endothelin-1 (ET1; 10 nmol/l), angiotensin II (AngII; 200 nmol/l), platelet-derived growth factor (PDGF; 30 ng/ml), and tumor necrosis factor (TNF; 100 ng/ml) treated healthy PASMCs had an increased PY705-STAT3/STAT3 ratio associated with a proportional increase in Pim1 expression measured by immunoblots (P 0.05 vs control group). support a role for Pim1 in PAH and suggest that Pim1 may be a good biomarker for the disease. STAT3 Activation in Human PAH PASMCs Triggers Pim1 Expression To investigate whether STAT3 plays a role in the regulation of Pim1 in PAH, Pim1 mrna levels were measured in PAH and control PASMCs in the presence or absence of STAT3 sirna (sistat3). Compared with the scrambled sirna, sistat3 significantly reduced Pim1 expression in PAH PASMCs (Figure 1C), suggesting that STAT3 activation regulates Pim1 expression in PAH PASMCs. To confirm this finding, healthy PASMCs were treated for 48 hours with factors known to activate STAT3 and that are increased in PAH 10 12 such as endothelin-1, angiotensin II, platelet-derived growth factor, and tumor necrosis factor. As expected, these factors increase STAT3 activation measured by immunoblots (PY705-STAT3/STAT3 ratio) by 2.8-, 3.2-, 2.5-, and 1.9-fold in endothelin-1, angiotensin II, platelet-derived growth factor, and tumor necrosis factor treated PASMCs, respectively (Figure 1C), which promoted Pim1 expression (Figure 1C). To determine whether STAT3 binds directly to the Pim1 gene and activates its transcription, we performed an in silico analysis using the ENCODE consortium database. 26 This analysis revealed the presence of several STATs binding sites in 3 of the Pim1 gene, conserved among several species (Figure IIA in the online-only Data Supplement). Chromatin immunoprecipitation coupled with PCR experiments were performed to demonstrate the direct binding of STAT3 in 3 of the Pim1 gene. The VEGF gene was used as a positive control (with established STAT3 binding sites 13 ), whereas the OR8J1 gene was used as negative control (without STAT3 binding sites 13 ). As predicted in silico, we showed that STAT3 binds directly to Pim1, whereas no bindings were indentified with OR8J1. On the basis of our positive control VEGF, the interaction between STAT3 and Pim1 (which showed greater binding signal) can be considered strong

1208 Circulation March 22, 2011 Downloaded from http://circ.ahajournals.org/ by guest on April 23, 2018 Figure 2. Pim1 is implicated in the regulation of both pulmonary artery (PA) smooth muscle cell (PASMC) proliferation and apoptosis. A, PA hypertension (PAH) PASMCs had increased proliferation (percent proliferating cell nuclear antigen [PCNA]) and decreased apoptosis (percent terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dutp nick-end labeling [TUNEL]) compared with healthy PASMCs. Both signal transducers and activators of transcription-3 inhibition and Pim1 inhibition significantly decrease PAH PASMC proliferation and promote apoptosis. B, Pim1 inhibition in PAH PASMCs reverses m hyperpolarization (tetramethylrhodamine methyl-ester [TMRM]), whereas Pim1 activation in healthy PASMCs with adenovirus overexpressing Pim1 promotes it. C, Pim1 inhibition in PAH PASMCs decreases the PS112-Bad/Bad ratio, allowing Bad translocation to the mitochondria (increased colocalization between Bad in green and mitochondria [mitotracker red[ in red giving a yellow pattern). (Figure IIB in the online-only Data Supplement). Among other putative Pim1 activators, STAT1, STAT5, 8 and Akt 27,28 did not appear to be activated in PAH PASMCs (Figure IIIA in the online-only Data Supplement). Therefore, STAT3 is likely responsible for Pim1 activation in PAH. Pim1 Promotes Proliferation and Resistance to Mitochondria-Dependent Apoptosis in PAH PASMCs We treated PAH PASMCs with either Pim1 or STAT3 sirna and their control-scrambled sirna and STAT3 inhibitor peptide (50 mol/l) or its negative control. Compared with healthy PASMCs, PAH PASMCs had a greater proliferation rate (increased percent of proliferating cell nuclear antigen positive cells) and were resistant to starvation (0.1% FBS)-induced apoptosis (decreased percent of terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dutp nick-end labeling [TUNEL] positive cells; Figure 2A). Similar to STAT3 inhibition (sirna and inhibitor peptide), Pim1 inhibition (sirna) in starved PAH PASMCs increased apoptosis by 8.2-fold, whereas PAH PASMC (10% FBS) proliferation was decreased by 2.4- fold (Figure 2A). These findings were confirmed in healthy PASMCs stimulated for 48 hours with plateletderived growth factor (30 ng/ml) or endothelin-1 (10 nmol/l; Figure IVA in the online-only Data Supplement), both known proproliferative factors. 29 31 Pim1 is implicated in mitochondrial membrane potential ( m) regulation 32,33 ; thus, the increase in apoptosis after Pim1 inhibition might result from the activation of mitochondria-dependent apoptosis. Because the mitochondria transition pore is voltage dependent, 34 m depolarization is an index of the threshold for mitochondriadependent apoptosis, and apoptosis is associated with decreased m. Using tetramethylrhodamine methyl ester, we measured m in PAH PASMCs transfected with Pim1 sirna and in control PASMCs infected by an adenovirus carrying the Pim1 gene (Ad-green fluorescent protein [GFP]-Pim1-WT). Transfections of PAH PASMCs with Pim1 sirna caused significant m depolarization compared with control scrambled-treated PAH PASMCs. In contrast, infection of control PASMCs with Ad-GFP- Pim1-WT caused a significant m hyperpolarization compared with Ad-GFP treated control PASMCs (Figure 2B). These data confirmed the role of Pim1 in m regulation in PAH PASMCs and thus mitochondria-

Paulin et al Pim1 Inhibition Reverses Pulmonary Hypertension 1209 Downloaded from http://circ.ahajournals.org/ by guest on April 23, 2018 Figure 3. The signal transducers and activators of transcription-3 (STAT3)/Pim1 axis accounts for nuclear factor of activated T cell-c2 (NFATc2) expression and activation in pulmonary artery hypertension (PAH) pulmonary artery smooth muscle cells (PASMCs). A, NFATc2 expression is increased in PAH PASMCs compared with control PASMCs. STAT3 inhibition decreases NFATc2 expression, whereas Pim1 inhibition has no effects. NFATc2 activation (luciferase assay) is increased in PAH PASMCs compared with control PASMCs. Pim1 inhibition decreases NFAT activation, whereas Pim1 overexpression in control PASMC promotes it. B, Pim1 inhibition in PAH PASMC decreases [Ca 2 ] i (FLUO3) and (C) Bcl-2 expression (immunofluorescence). dependent apoptosis. Similar results were obtained with the STAT3 peptide inhibitor (Figure IVB in the onlineonly Data Supplement). Note that Pim1 inhibition has no effect on control PASMCs (data not shown). Previous studies revealed that Pim1 inhibits the proapoptotic protein Bad (increased P-Bad), blocking its translocation to the mitochondria and causing m hyperpolarization. 35 In PAH PASMCs, Pim1 inhibition decreases the P-Bad/total Bad ratio (Figure 2C), promoting Bad (green) mitochondrial (stained with mitotracker red) translocation (greater colocalization in yellow). Control PASMCs infected with Ad-GFP-Pim1-WT showed the opposite effects (Figure 2C). These findings confirmed the implication of Pim1 in the resistance to mitochondria-dependent apoptosis seen in PAH PASMCs. STAT3 Regulates Pim1 and NFATc2 Expression, and Pim1 Regulates NFATc2 Activation in PAH PASMC We previously demonstrated that the sustainability of the proproliferative and antiapoptotic phenotype seen in PAH PASMCs is attributed in part to the activation of the transcription factor NFATc2. In PAH, NFATc2 activation leads to the downregulation of important K channels like Kv1.5, leading to PASMC depolarization, increasing [Ca 2 ] I, and promoting PASMC proliferation. 4,5,36 NFATc2 activation also triggers the upregulation of Bcl-2, leading to mitochondrial hyperpolarization and apoptosis inhibition. 4,5,36 Pim1 is a NFAT activator; thus, the Pim1- dependent NFAT activation could be implicated in PAH. NFATc2 expression (qrt-pcr) and activation (luciferase assay) are increased in PAH PASMCs compared with control PASMCs (Figure 3A). PAH PASMCs treated with sistat3 showed a significant decrease in both NFATc2 mrna and activation levels (Figure 3A), whereas PAH PASMCs treated with sipim1 revealed only a decrease in NFATc2 activation level (similar to that induced by sistat3) but not in NFATc2 mrna level (Figure 3A). This last finding was further confirmed with the NFATc2 nuclear translocation assay. As shown, Pim1 inhibition significantly decreased the amount of NFATc2 (green) colocalizing with DAPI (blue), reducing the yellow staining (Figure V in the online-only Data Supplement). Taken together, these findings suggest that STAT3 activation accounts for NFATc2 expression, whereas Pim1 is required only for the activation of NFAT in PAH PASMCs. These results were further confirmed with the Pim1 inhibitor quercetagetine 37 and Pim1 dominant-negative adenovirus (Figure 3A). Quercetagetine mimics Pim1 sirna (decreases NFAT activation) in PAH PASMCs, whereas

1210 Circulation March 22, 2011 Downloaded from http://circ.ahajournals.org/ by guest on April 23, 2018 overexpression of Pim1 by Ad-GFP-Pim1-WT in control PASMCs enhanced NFAT activation (Figure 3A). Finally, we provide further evidence that the STAT3/ Pim1-dependent NFAT activation in PAH PASMCs contributes to the proproliferative and antiapoptotic phenotype by increasing [Ca 2 ] i (Figure 3B), a well-accepted proproliferative factor, and the apoptotic factor Bcl-2 compared with normal PASMCs (Figure 3C). Note that Pim1 inhibition has no effects on [Ca 2 ] i in control PASMC (data not shown). STAT3/ Pim1/NFATc2 Axis Is Increased in Rat Experimental PAH Pim1 expression (qrt-pcr, immunoblots, and immunofluorescence) was quantified in both lungs and PAs isolated from monocrotaline (MCT)-injected rats, an accepted model of PAH. 5 Greater Pim1 expression was seen in PAs of rats with severe PAH ( 21 days after MCT injection). In contrast, light expression was seen in partially remodeled PAs, and no expression was seen in nonremodeled PAs from rats with mild early PAH (1 to 12 days after MCT; Figure 4A and Figure VIA and VIC in the onlineonly Data Supplement). As in humans, Pim1 expression is confined within the PASMCs (greater colocalization between Pim1 in green and smooth muscle-actin in red in Figure VIA in the online-only Data Supplement than Pim1 with the endothelial cell marker VE-cadherin in Figure VIB in the online-only Data Supplement) and correlates with PAH severity (Figure 4A). Moreover, Pim1 mrna levels were measured in rat buffy coats isolated from control rats (mean PA pressure 15 mm Hg), rats with mild PAH (mean PA pressure 30 mm Hg), and rats with severe PAH (mean PA pressure 30 mm Hg). As in distal PAs, Pim1 mrna levels in buffy coats correlate with PAH severity (Figure VIIA in the online-only Data Supplement). These results further support a role for Pim1 in PAH and suggest that Pim1 may be a good biomarker for the disease. Figure 4. Pim1 expression is increased in the monocrotaline (MCT)-injected rat pulmonary artery (PA) hypertension (PAH) model. A, Heavy Pim1 mrna expression is seen in PAs of rats with severe PAH ( 21 days after MCT injection). In contrast, light expression was seen in mild PAH, and no expression was seen in rats with early PAH. Moreover, Pim1 expression correlates with PAH severity assed by mean PA pressure. B, Signal transducers and activators of transcription-3 (STAT3) activation (nuclear translocation of PY705-STAT3) precedes both Pim1 expression (quantitative reverse-transcription polymerase chain reaction [qrt-pcr]) and nuclear factor of activated T cell-c2 (NFATc2) expression (qrt-pcr) and activation (nuclear translocation), which paralleled both increased PA wall remodeling (hematoxylin and eosin staining) and PA pressure. Finally, the fact that Pim1 is poorly expressed in other tissues like aorta, kidney, and liver (Figure VIIB in the online-only Data Supplement) makes it an attractive therapeutic target for PAH. To further study the implication of the STAT3/Pim1/NFAT axis activation in the progression of PAH, rats were euthanized at different time points after the subcutaneous injection of MCT. PA pressure and PA wall thickness (hematoxylin and eosin staining) were measured. STAT3 activation (P-STAT3 nuclear translocation in Figure 4B and P-STAT3/STAT3 ratio by immunoblots in Figure VIC in the online-only Data Supplement) increased between weeks 1 and 2 after MCT injection preceding both Pim1 expression and NFAT activation (qrt-pcr and NFATc2 nuclear translocation in Figure 4A and 4B and immunoblots in Figure VIC in the online-only Data Supplement), which increased between weeks 2 and 3 after MCT injection, paralleling the increase in both PA wall remodeling and PA pressure (Figure 4A and 4B). Although these findings do not demonstrate a direct causal link between STAT3 activation and Pim1/NFAT, they confirm the implication of the STAT3/Pim1/NFATc2 in PAH development. These results confirm the implication of a STAT3-dependent activation of Pim1 in the origin of PAH. Pim1 Inhibition Reverses MCT PAH Pim1 sirna (1 nmol) was selectively delivered to the lung of MCT-PAH rats 18 days after MCT injection (when endogenous expression of Pim1 peaks) by intratracheal nebulization. To verify the tissue distribution of our treatment, we nebulized an adenovirus carrying GFP (Figure VIIIA in the online-only Data Supplement) and measured the effect of Pim1 inhibition in several tissues (Figure VIIIB in the online-only Data Supplement). Both techniques revealed that Pim1 inhibition by nebulized sirna is localized to the PAs, therefore having limited detrimental effect. After confirming that Pim1 sirnatreated MCT PAH rats had decreased Pim1 expression in

Paulin et al Pim1 Inhibition Reverses Pulmonary Hypertension 1211 Downloaded from http://circ.ahajournals.org/ by guest on April 23, 2018 both PAs and lungs (qrt-pcr) (Figure VIIIB in the online-only Data Supplement), we showed, using noninvasive measurements (Doppler and echocardiography), 5 that Pim1 inhibition increases PA acceleration time and decreases right ventricular wall thickness compared with the scrambled-treated MCT PAH rats (Figure VIIIC in the online-only Data Supplement). These findings were confirmed invasively by PA pressure, PA wall remodeling, right ventricular hypertrophy (right ventricular/left ventricle septum), and general cardiac functions (exercise capacity on treadmill) measurements (Figure 5A). This finding was associated with a significant decrease in Pim1-dependent NFATc2 activation (decreased Pim1/ NFATc2 [yellow] and NFATc2/DAPI [purple] colocalization), decreasing PASMC proliferation (percent proliferating cell nuclear antigen) and resistance to apoptosis (percent TUNEL; Figure 5B). Pim1 Knockout Mice Are Resistant to PAH PAH was induced in mice by intravenous injection (5 mg/kg) of MCTP and by exposure to CH for 15 days (10% O 2 ) as previously described. 38 As in rats, the development of PAH was assessed both noninvasively and invasively. Compared with Pim1 KO mice, WT mice injected with MCTP or exposed to CH developed PAH (decreased PA acceleration time and increased right ventricular hypertrophy, PA wall thickness, PA pressure, and mortality) without affecting systemic pressure and cardiac output (Figure 6A and Figure IXA and IXB in the online-only Data Supplement). As in rats, the development of PAH in MCTP-WT and CH-WT mice was associated with the STAT3/Pim1- dependent activation of NFATc2. Interestingly, both STAT3 activation and NFATc2 mrna levels were also increased in MCTP and CH Pim1 KO mice. However, in the absence of Pim1, they were not sufficient to trigger PAH. This result Figure 5. Pim1 inhibition reverses monocrotaline (MCT) pulmonary artery (PA) hypertension (PAH). A, Pim1 inhibition (1 nebulization of 1 nmol) 18 days after MCT injection decreased mean PA pressure and right ventricular (RV) hypertrophy, improved exercise capacity, and diminished distal PA wall thickness. B, As in vitro, these effects were mediated by the inhibition of Pim1-dependent nuclear factor of activated T cell-c2 (NFATc2) activation showed by a decrease in Pim1/NFATc2 (yellow) and in NFATc2/DAPI (purple) colocalization, decreasing PA smooth muscle cell (PASMC) proliferation (percent proliferating cell nuclear antigen [PCNA]) and increasing apoptosis (percent terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dutp nick-end labeling [TUNEL]). suggests that the implication of STAT3 in PAH development is mainly Pim1 dependent and that STAT3 activation alone cannot induce PAH. Therefore, Pim1 represents the primary therapeutic target of the STAT3/Pim1 axis. Discussion Here, we show that the STAT3/Pim1/NFAT axis is associated with the development of PAH, and we believe we have opened a new avenue of investigation for PAH treatment. Pim1 expression is increased in human and experimental PAH and relies on STAT3 activation (Figure 3). Interestingly, Pim1 expression parallels NFAT activation, PA remodeling, and PA pressure and correlates with PAH severity (Figures 1 and 4). Unlike STAT3 and NFAT, which are constitutively expressed in several tissues, including normal PAs, Pim1 affects PASMC phenotype only in PAH, thus constituting an interesting therapeutic target for PAH. Notably, inhibition of endogenous Pim1 significantly improves PA pressure, PA medial hypertrophy, and right ventricular hypertrophy without affecting systemic pressure and cardiac output (Figures 5 and 6). We provide direct in vitro and in vivo evidence that the mechanisms by which Pim1 inhibition reverses PAH involve the inhibition of PASMC proliferation within the remodeled PAs (Figure 5) and the depolarization of PASMC mitochondria by promoting Bad activation (Figure 2) and decreasing Bcl-2, both of which increase apoptosis. We believe these effects are sustained by the Pim1-dependent activation of NFAT, a transcription factor that regulates both PASMC proliferation and resistance to apoptosis. 5 Because our goal was to identify a new way of reversing established PAH, we focused our research on PASMCs and not endothelial cells, which are affected at the onset of PAH and are downregulated in established PAH. Nonetheless, because previous studies reported that Pim1 is implicated in embryonic stem cell

1212 Circulation March 22, 2011 Downloaded from http://circ.ahajournals.org/ by guest on April 23, 2018 Figure 6. Pim1 knockout (KO) mice are resistant to pyrrole-modified monocrotaline (MCTP) and chronic hypoxia (CH) pulmonary artery (PA) hypertension (PAH). A, Compared with Pim1 KO mice (n 5), MCTP and CH wild-type (WT) mice (n 8) developed PAH (increased PA pressure, right ventricular/left ventricle septum ratio, PA wall thickness) without detrimental effects on both systemic pressure and cardiac output. B, PAH development in MCTP WT and CH WT mice is due to the signal transducers and activators of transcription-3 (STAT3)/Pim1-dependent activation of nuclear factor of activated T cell-c2 (NFATc2). Both STAT3 activation (nuclear translocation assay) and NFATc2 mrna levels (quantitative reverse-transcription polymerase chain reaction [qrt-pcr]) are increased in WT and KO MCTP and CH mice but, in the absence of Pim1, were not sufficient to trigger PAH. differentiation into endothelial cells,25 Pim1 might be also implicated in endothelium-related vascular lesions like plexiform lesions, which are seen in patients with PAH.39 Our study suggests that circulating vasoactive factors like angiotensin, endothelin-1, platelet-derived growth factor, or cytokines, which are elevated in both human and experimental PAH, activate STAT3. Once activated, STAT3 increases NFATc2 and Pim1 expression (Figure 7). Cross-talk between STAT3 and NFAT is currently a hot topic because both signaling pathways are involved in the pathogenesis of cancer and cardiovascular diseases.40,41 In the present study, we demonstrated for the first time in the pulmonary vasculature that STAT3 regulates NFATc2 expression and indirectly (via Pim1) NFATc2 activity. Indeed, we showed that STAT3 inhibition decreases NFATc2 expression in human PAH, whereas in experimental PAH, STAT3 activation precedes NFAT expression. Moreover, we showed that both STAT3 and Pim1 inhibition similarly inhibit NFAT activation and that in experimental PAH, Pim1 expression parallels NFAT expression and activation. Although further experiments are required to determine whether STAT3 directly regulates Pim1 and NFAT, these findings demonstrate the implication of the STAT3/Pim1 axis in the regulation of both NFAT expression and activation in PAH. These findings might not be limited to pulmonary vasculature because chromatin immunoprecipitation sequence studies in several cell lines demonstrated the presence of several STAT response elements within the NFATc1, NFATc2, and NFATc3 promoter regions.13 Although STAT3 is an accepted Pim1 activator,42 the Akt pathway has been demonstrated as the main Pim1 activator in cardiomyocytes.32 However, in our study, the Akt pathway was not activated in PAH PASMCs (Figure IIIA in the online-only Data Supplement), suggesting that in our model Pim1 activation is Akt independent and relies on STAT3. Once activated, Pim1 is able to interact with NFAT, triggering its activation independently of the calcium/calcineurin axis and without affecting its nuclear localization.19,20 Once activated, NFAT regulates multiple genes that might positively reinforce its activation. For example, the downregulation of Kv1.5 will lead to PASMC depolarization and opening of L-type Ca channels and will sustain the increase in [Ca ]i, and thus calcineurindependent NFAT activation. Therefore, once activated, the system will remain functional, explaining why only PAH PASMCs have activated NFAT and why this activation is sustained in cultured conditions. We demonstrated that STAT3 activation in PAH accounts for a Pim1-dependent activation of NFAT sustaining PAH PASMC proliferation and resistance to apoptosis (Figure 7). Interestingly, the fact that Pim1 activation remains high despite the activation of NFAT suggests that its role in PAH might not be limited to NFAT activation. In fact, we demonstrated that by inhibiting Bad, it decreases mitochondria-dependent apoptosis. In addition, by phosphorylating Cdc25 and its associated kinase C-TAK1 and by downregulating p27kip1, Pim1 enhances cell cycle progression at the G2/M phase.43 45 Thus, Pim1 is implicated in

Paulin et al Pim1 Inhibition Reverses Pulmonary Hypertension 1213 Downloaded from http://circ.ahajournals.org/ by guest on April 23, 2018 Figure 7. Proposed mechanism of the role of the signal transducers and activators of transcription-3 (STAT3)/Pim1 axis in pulmonary artery (PA) hypertension (PAH). Schematic representation of STAT3/Pim1 implication in PAH pathogenesis. Increased circulating growth factors, agonists, and cytokines trigger STAT3 activation, resulting in increased nuclear factor of activated T cell-c2 (NFATc2) expression and increased Pim1 activation. Once activated, Pim1 triggers NFATc2 activation (nuclear translocation), promoting [Ca2 ] i -dependent PA smooth muscle cell (PASMC) proliferation and inhibiting mitochondriadependent apoptosis through a Bcl2-dependent mechanism. The NFATc2-dependent effect on Bcl2 will be reinforced by Pim1-dependent inhibition of Bad. several mechanisms promoting cell proliferation and survival that might be implicated in PAH pathogenesis. Among the 3 components of the STAT3/Pim1/NFAT axis, we believe that Pim1 inhibition might represent a unique, specific, and novel way to reverse PAH without affecting physiological processes in which both STAT3 and NFAT are involved, such as the immune response. This is reinforced by our findings in Pim1 KO mice that showed that the implication of STAT3 in the origin of PAH relies mainly on Pim1 activation because STAT3 activation in Pim1 KO mice is not sufficient to induce PAH (Figure 6). This interesting finding needs to be confirmed in several other models, including human PASMCs, which will be the subject of a future study. Finally, the fact that the pulmonary circulation is selectively diseased in human PAH is a major therapeutic challenge. The majority of drugs targeting the vasculature will, if given systemically, affect the healthy normal circulation as well, thereby limiting efficacy. Discovery of factors selectively expressed in the PAs, in addition to methods of delivering treatment selectively to the pulmonary circulation (such as inhaled delivery of drugs or genes), is critical. The airway administration of a Pim1 sirna satisfies both requirements to ensure selective targeting of the diseased circulation. The concept that inducing apoptosis to remove the excess cells obstructing the PAs is beneficial in PAH is supported by other studies showing that serine-elastase inhibitors 46 and Rho-kinase inhibitors 47 cause regression of established PAH by inducing PASMC apoptosis. The novelty of our findings is that our therapeutic intervention is localized within the remodeled PAs and affects only the proliferative PASMCs expressing Pim1; quiescent PASMCs and surrounding cells are not affected. Because Pim1 is poorly expressed in healthy blood vessels and has limited and nonlethal implication in physiological processes (Pim1 KO mice are healthy and fertile; only erythrocyte microcytosis was reported 48 ), it represents an ideal therapeutic target. Therefore (and as suggested by our findings), Pim1 inhibition will have limited toxicity, unlike STAT3 and NFAT inhibitors, for example. Finally, in addition to being an interesting therapeutic target, we demonstrated that Pim1 could indeed be an interesting and specific PAH biomarker in humans. Elevated Pim1 expression in the buffy coat seems to be specific to PAH because Pim1 is not elevated in other inflammatory diseases alone like scleroderma (which is a common cause of PAH). Because of their close relationships with Pim1, both STAT3 and NFAT could be considered putative biomarkers as well. However, because of their expression in several other tissues and under multiple conditions, their activations are not specific to PAH. 49 Conclusions PAH is a rapidly lethal disease for which treatments are limited. We believe that our findings will open the door to new avenues of investigation and potential future therapies for PAH. Our results will also lead to a better understanding of the regulation of apoptosis and proliferation by STAT3 and Pim1, which will benefit many other human diseases like cancer. Therefore, we describe Pim1 as a novel and specific therapeutic target and potential biomarker for PAH. Acknowledgments Pim1 KO mice were provided by A. Berns from The Netherlands Cancer Institute, Amsterdam. We appreciate the contribution of Jacques Huot, Josée Lavoie, and Eric Paquet. We wish to thank Christine Racine and Sabrina Biardel from the Respiratory Health Network tissue bank for providing the patients lung tissue, serum, and buffy coats. Sources of Funding This work was supported by Heart and Stroke Foundation of Canada, Canadian Institute for Health Research, and Canadian Research Chair to Dr Bonnet. None. Disclosures References 1. Humbert M, Morrell NW, Archer SL, Stenmark KR, MacLean MR, Lang IM, Christman BW, Weir EK, Eickelberg O, Voelkel NF, Rabinovitch M. Cellular and molecular pathobiology of pulmonary arterial hypertension. J Am Coll Cardiol. 2004;43:13S 24S. 2. Archer S, Rich S. Primary pulmonary hypertension: a vascular biology and translational research work in progress. Circulation. 2000;102: 2781 2791. 3. Ahmad S. Pulmonary hypertension and right heart failure. Chest. 1995; 108:1773. 4. Bonnet S, Archer SL, Allalunis-Turner J, Haromy A, Beaulieu C, Thompson R, Lee CT, Lopaschuk GD, Puttagunta L, Bonnet S, Harry G,

1214 Circulation March 22, 2011 Downloaded from http://circ.ahajournals.org/ by guest on April 23, 2018 Hashimoto K, Porter CJ, Andrade MA, Thebaud B, Michelakis ED. A mitochondria-k channel axis is suppressed in cancer and its normalization promotes apoptosis and inhibits cancer growth. Cancer Cell. 2007;11:37 51. 5. Bonnet S, Rochefort G, Sutendra G, Archer SL, Haromy A, Webster L, Hashimoto K, Bonnet SN, Michelakis ED. The nuclear factor of activated T cells in pulmonary arterial hypertension can be therapeutically targeted. Proc Natl Acad Sci U S A. 2007;104:11418 11423. 6. Boengler K, Hilfiker-Kleiner D, Drexler H, Heusch G, Schulz R. The myocardial JAK/STAT pathway: from protection to failure. Pharmacol Ther. 2008;120:172 185. 7. Grote K, Luchtefeld M, Schieffer B. JANUS under stress: role of JAK/STAT signaling pathway in vascular diseases. Vascul Pharmacol. 2005;43:357 363. 8. Darnell JE Jr. STATs and gene regulation. Science. 1997;277: 1630 1635. 9. Banes-Berceli AK, Ketsawatsomkron P, Ogbi S, Patel B, Pollock DM, Marrero MB. Angiotensin II and endothelin-1 augment the vascular complications of diabetes via JAK2 activation. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2007;293:H1291 H1299. 10. Csiszar A, Labinskyy N, Olson S, Pinto JT, Gupte S, Wu JM, Hu F, Ballabh P, Podlutsky A, Losonczy G, de Cabo R, Mathew R, Wolin MS, Ungvari Z. Resveratrol prevents monocrotaline-induced pulmonary hypertension in rats. Hypertension. 2009;54:668 675. 11. Schermuly RT, Dony E, Ghofrani HA, Pullamsetti S, Savai R, Roth M, Sydykov A, Lai YJ, Weissmann N, Seeger W, Grimminger F. Reversal of experimental pulmonary hypertension by PDGF inhibition. J Clin Invest. 2005;115:2811 2821. 12. Frasch HF, Marshall C, Marshall BE. Endothelin-1 is elevated in monocrotaline pulmonary hypertension. Am J Physiol. 1999;276: L304 L310. 13. Chen X, Xu H, Yuan P, Fang F, Huss M, Vega VB, Wong E, Orlov YL, Zhang W, Jiang J, Loh YH, Yeo HC, Yeo ZX, Narang V, Govindarajan KR, Leong B, Shahab A, Ruan Y, Bourque G, Sung WK, Clarke ND, Wei CL, Ng HH. Integration of external signaling pathways with the core transcriptional network in embryonic stem cells. Cell. 2008;133: 1106 1117. 14. Brock M, Trenkmann M, Gay RE, Michel BA, Gay S, Fischler M, Ulrich S, Speich R, Huber LC. Interleukin-6 modulates the expression of the bone morphogenic protein receptor type II through a novel STAT3- microrna cluster 17/92 pathway. Circ Res. 2009;104:1184 1191. 15. Padma R, Nagarajan L. The human PIM1 gene product is a protein serine kinase. Cancer Res. 1991;51:2486 2489. 16. Beier UH, Weise JB, Laudien M, Sauerwein H, Gorogh T. Overexpression of Pim1 in head and neck squamous cell carcinomas. Int J Oncol. 2007;30:1381 1387. 17. Chiang WF, Yen CY, Lin CN, Liaw GA, Chiu CT, Hsia YJ, Liu SY. Up-regulation of a serine-threonine kinase proto-oncogene Pim1 in oral squamous cell carcinoma. Int J Oral Maxillofac Surg. 2006;35: 740 745. 18. Cibull TL, Jones TD, Li L, Eble JN, Ann Baldridge L, Malott SR, Luo Y, Cheng L. Overexpression of Pim1 during progression of prostatic adenocarcinoma. J Clin Pathol. 2006;59:285 288. 19. Glazova M, Aho TL, Palmetshofer A, Murashov A, Scheinin M, Koskinen PJ. Pim1 kinase enhances NFATc activity and neuroendocrine functions in PC12 cells. Brain Res Mol Brain Res. 2005;138: 116 123. 20. Rainio EM, Sandholm J, Koskinen PJ. Cutting edge: transcriptional activity of NFATc1 is enhanced by the Pim1 kinase. J Immunol. 2002; 168:1524 1527. 21. McMurtry MS, Archer SL, Altieri DC, Bonnet S, Haromy A, Harry G, Bonnet S, Puttagunta L, Michelakis ED. Gene therapy targeting survivin selectively induces pulmonary vascular apoptosis and reverses pulmonary arterial hypertension. J Clin Invest. 2005;115:1479 1491. 22. Diller GP, Thum T, Wilkins MR, Wharton J. Endothelial progenitor cells in pulmonary arterial hypertension. Trends Cardiovasc Med. 2010;20: 22 29. 23. Diller GP, van Eijl S, Okonko DO, Howard LS, Ali O, Thum T, Wort SJ, Bedard E, Gibbs JS, Bauersachs J, Hobbs AJ, Wilkins MR, Gatzoulis MA, Wharton J. Circulating endothelial progenitor cells in patients with Eisenmenger syndrome and idiopathic pulmonary arterial hypertension. Circulation. 2008;117:3020 3030. 24. Schmidt T, Karsunky H, Rodel B, Zevnik B, Elsasser HP, Moroy T. Evidence implicating Gfi-1 and Pim1 in pre-t-cell differentiation steps associated with beta-selection. EMBO J. 1998;17:5349 5359. 25. Zippo A, De Robertis A, Bardelli M, Galvagni F, Oliviero S. Identification of Flk-1 target genes in vasculogenesis: Pim1 is required for endothelial and mural cell differentiation in vitro. Blood. 2004;103: 4536 4544. 26. Rosenbloom KR, Dreszer TR, Pheasant M, Barber GP, Meyer LR, Pohl A, Raney BJ, Wang T, Hinrichs AS, Zweig AS, Fujita PA, Learned K, Rhead B, Smith KE, Kuhn RM, Karolchik D, Haussler D, Kent WJ. ENCODE whole-genome data in the UCSC Genome Browser. Nucleic Acids Res. 2010;38:D620 D625. 27. Morcinek JC, Weisser C, Geissinger E, Schartl M, Wellbrock C. Activation of STAT5 triggers proliferation and contributes to anti-apoptotic signalling mediated by the oncogenic Xmrk kinase. Oncogene. 2002;21: 1668 1678. 28. Matikainen S, Sareneva T, Ronni T, Lehtonen A, Koskinen PJ, Julkunen I. Interferon-alpha activates multiple STAT proteins and upregulates proliferation-associated IL-2Ralpha, c-myc, and Pim1 genes in human T cells. Blood. 1999;93:1980 1991. 29. Barst RJ. PDGF signaling in pulmonary arterial hypertension. J Clin Invest. 2005;115:2691 2694. 30. Tanaka H, Sukhova G, Schwartz D, Libby P. Proliferating arterial smooth muscle cells after balloon injury express TNF-alpha but not interleukin-1 or basic fibroblast growth factor. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 1996; 16:12 18. 31. Zhang F, Hu Y, Xu Q, Ye S. Different effects of angiotensin II and angiotensin-(1-7) on vascular smooth muscle cell proliferation and migration. PLoS One. 2010;5:e12323. 32. Muraski JA, Rota M, Misao Y, Fransioli J, Cottage C, Gude N, Esposito G, Delucchi F, Arcarese M, Alvarez R, Siddiqi S, Emmanuel GN, Wu W, Fischer K, Martindale JJ, Glembotski CC, Leri A, Kajstura J, Magnuson N, Berns A, Beretta RM, Houser SR, Schaefer EM, Anversa P, Sussman MA. Pim1 regulates cardiomyocyte survival downstream of Akt. Nat Med. 2007;13:1467 1475. 33. Sussman MA. Mitochondrial integrity: preservation through Akt/Pim1 kinase signaling in the cardiomyocyte. Expert Rev Cardiovasc Ther. 2009;7:929 938. 34. Zamzami N, Kroemer G. The mitochondrion in apoptosis: how Pandora s box opens. Nat Rev Mol Cell Biol. 2001;2:67 71. 35. Hu XF, Li J, Vandervalk S, Wang Z, Magnuson NS, Xing PX. PIM1- specific mab suppresses human and mouse tumor growth by decreasing PIM1 levels, reducing Akt phosphorylation, and activating apoptosis. J Clin Invest. 2009;119:362 375. 36. Bonnet S, Paulin R, Sutendra G, Dromparis P, Roy M, Watson KO, Nagendran J, Haromy A, Dyck JR, Michelakis ED. Dehydroepiandrosterone reverses systemic vascular remodeling through the inhibition of the Akt/GSK3-{beta}/NFAT axis. Circulation. 2009;120: 1231 1240. 37. Holder S, Zemskova M, Zhang C, Tabrizizad M, Bremer R, Neidigh JW, Lilly MB. Characterization of a potent and selective smallmolecule inhibitor of the PIM1 kinase. Mol Cancer Ther. 2007;6: 163 172. 38. Raoul W, Wagner-Ballon O, Saber G, Hulin A, Marcos E, Giraudier S, Vainchenker W, Adnot S, Eddahibi S, Maitre B. Effects of bone marrowderived cells on monocrotaline- and hypoxia-induced pulmonary hypertension in mice. Respir Res. 2007;8:8. 39. Toshner M, Voswinckel R, Southwood M, Al-Lamki R, Howard LS, Marchesan D, Yang J, Suntharalingam J, Soon E, Exley A, Stewart S, Hecker M, Zhu Z, Gehling U, Seeger W, Pepke-Zaba J, Morrell NW. Evidence of dysfunction of endothelial progenitors in pulmonary arterial hypertension. Am J Respir Crit Care Med. 2009;180:780 787. 40. Lagunas L, Clipstone NA. Deregulated NFATc1 activity transforms murine fibroblasts via an autocrine growth factor-mediated Stat3- dependent pathway. J Cell Biochem. 2009;108:237 248. 41. Manukyan I, Galatioto J, Mascareno E, Bhaduri S, Siddiqui MA. Cross-talk between calcineurin/nfat and Jak/STAT signaling induces cardioprotective alphab-crystallin gene expression in response to hypertrophic stimuli. J Cell Mol Med. 2010;14:1707 1716. 42. Zemskova M, Sahakian E, Bashkirova S, Lilly M. The PIM1 kinase is a critical component of a survival pathway activated by docetaxel and promotes survival of docetaxel-treated prostate cancer cells. J Biol Chem. 2008;283:20635 20644. 43. Bachmann M, Hennemann H, Xing PX, Hoffmann I, Moroy T. The oncogenic serine/threonine kinase Pim1 phosphorylates and inhibits the activity of Cdc25C-associated kinase 1 (C-TAK1): a novel role for Pim1 at the G2/M cell cycle checkpoint. J Biol Chem. 2004;279: 48319 48328.

Paulin et al Pim1 Inhibition Reverses Pulmonary Hypertension 1215 44. Bachmann M, Kosan C, Xing PX, Montenarh M, Hoffmann I, Moroy T. The oncogenic serine/threonine kinase Pim1 directly phosphorylates and activates the G2/M specific phosphatase Cdc25C. Int J Biochem Cell Biol. 2006;38:430 443. 45. Morishita D, Katayama R, Sekimizu K, Tsuruo T, Fujita N. Pim kinases promote cell cycle progression by phosphorylating and down-regulating p27kip1 at the transcriptional and posttranscriptional levels. Cancer Res. 2008;68:5076 5085. 46. Zaidi SH, You XM, Ciura S, Husain M, Rabinovitch M. Overexpression of the serine elastase inhibitor elafin protects transgenic mice from hypoxic pulmonary hypertension. Circulation. 2002;105:516 521. 47. Barman SA, Zhu S, White RE. RhoA/Rho-kinase signaling: a therapeutic target in pulmonary hypertension. Vasc Health Risk Manag. 2009;5: 663 671. 48. Laird PW, van der Lugt NM, Clarke A, Domen J, Linders K, McWhir J, Berns A, Hooper M. In vivo analysis of Pim1 deficiency. Nucleic Acids Res. 1993;21:4750 4755. 49. Wu Y, Borde M, Heissmeyer V, Feuerer M, Lapan AD, Stroud JC, Bates DL, Guo L, Han A, Ziegler SF, Mathis D, Benoist C, Chen L, Rao A. FOXP3 controls regulatory T cell function through cooperation with NFAT. Cell. 2006;126:375 387. Downloaded from http://circ.ahajournals.org/ by guest on April 23, 2018 CLINICAL PERSPECTIVE The contribution of vasoconstriction to the pathophysiology of pulmonary arterial hypertension (PAH) has been overemphasized, resulting in an excessive focus on vasodilator therapy. Only 20% of patients respond to vasodilator therapy. Recently, we have learned that PAH is due to remodeling of distal pulmonary arteries, leading to increased vascular resistance and right ventricular failure. The sustainability of this phenotype is attributed to the increased activation of transcription factor like nuclear factor of activated T cells. Its inhibition as a therapeutic approach to treat PAH is difficult because it regulates many physiological processes like immune response. In this article, using a multidisciplinary approach and large number of human tissues, we demonstrated that nuclear factor of activated T cell expression and activation are regulated by the proto-oncogene Pim1. Because Pim1 expression is restricted to PAH patients and is not present in normal conditions, it represents a safe and efficient way of inhibiting nuclear factor of activated T cells in PAH patients. We showed that suppression of Pim1 in human PAH pulmonary artery smooth muscle cells blocks nuclear factor of activated T cells and reverses the PAH phenotype, whereas Pim1 upregulation in normal pulmonary artery smooth muscle cells recapitulates it. In vivo, we showed that Pim1 knockout mice are resistant to multiple experimental models of pulmonary hypertension and that Pim1 inhibition reverses PAH in rodents. Finally, because Pim1 expression is restricted to PAH patients, we provide strong evidence that Pim1 expression correlates with PAH severity in humans. In conclusion, Pim1 is an attractive therapeutic target and a new biomarker of PAH.

Signal Transducers and Activators of Transcription-3/Pim1 Axis Plays a Critical Role in the Pathogenesis of Human Pulmonary Arterial Hypertension Roxane Paulin, Audrey Courboulin, Jolyane Meloche, Vincent Mainguy, Eric Dumas de la Roque, Nehmé Saksouk, Jacques Côté, Steeve Provencher, Mark A. Sussman and Sébastien Bonnet Downloaded from http://circ.ahajournals.org/ by guest on April 23, 2018 Circulation. 2011;123:1205-1215; originally published online March 7, 2011; doi: 10.1161/CIRCULATIONAHA.110.963314 Circulation is published by the American Heart Association, 7272 Greenville Avenue, Dallas, TX 75231 Copyright 2011 American Heart Association, Inc. All rights reserved. Print ISSN: 0009-7322. Online ISSN: 1524-4539 The online version of this article, along with updated information and services, is located on the World Wide Web at: http://circ.ahajournals.org/content/123/11/1205 Data Supplement (unedited) at: http://circ.ahajournals.org/content/suppl/2011/03/03/circulationaha.110.963314.dc1 http://circ.ahajournals.org/content/suppl/2016/04/13/circulationaha.110.963314.dc2 Permissions: Requests for permissions to reproduce figures, tables, or portions of articles originally published in Circulation can be obtained via RightsLink, a service of the Copyright Clearance Center, not the Editorial Office. Once the online version of the published article for which permission is being requested is located, click Request Permissions in the middle column of the Web page under Services. Further information about this process is available in the Permissions and Rights Question and Answer document. Reprints: Information about reprints can be found online at: http://www.lww.com/reprints Subscriptions: Information about subscribing to Circulation is online at: http://circ.ahajournals.org//subscriptions/

SUPPLEMENTAL MATERIAL: Supplemental methods: Supplemental Tables - Supplemental Tab.1: Patients information - Supplemental Tab.2: Supplies information Supplemental Figures - Supplemental Fig.1: Pim1 expression correlates with PAH severity in humans PAs and buffy coat. - Supplemental Fig.2: STAT3 binds to the 3 region of Pim1 gene. - Supplemental Fig.3: Role of the STAT and Akt pathways in human PAH. - Supplemental Fig.4: Role of STAT3/Pim1 in PASMC proliferation and apoptosis - Supplemental Fig.5: Pim1 inhibition decreases NFATc2 activation in PAH- PASMCs. - Supplemental Fig.6: Pim1 expression is increase in MCT-induced PAH in rat and is confined to the PASMCs. - Supplemental Fig.7: Pim1 expression in various tissues - Supplemental Fig.8: Pim1 inhibition affects only the pulmonary arteries reversing PAH. - Supplemental Fig.9: Pim1 K.O mice are resistant to PAH. - Supplemental Fig.10: STAT3 and NFATc2 activation in Pim1 K.O. - Supplemental Fig.11: Efficiency of Pim1 sirna, adenoviruses and STAT3 sirna. Supplemental Figure Legends Supplemental References

Supplemental Methods: Cell culture: PASMC (less than passage 6) were grown in high-glucose DMEM supplemented with 10% FBS (Gibco, Invitrogen, Burlington, ON, Canada) and 1% antibiotic/antimytotic (Gibco, Invitrogen, Burlington, ON, Canada) 1. Cell treatments: All treatments from EMD Bioscience, (Mississaga, ON, CANADA) were diluted in DMSO (DMSO final concentration <0.001%). Endothelin 1 (10nM), Angiotensin 2 (200nM), PDGF (30ng.mL -1 ), TNFα (100ng.mL -1 ) and Quercetagetine (1µM) were applied for 48h. sirna (from AMBION, Austin, TX, USA) were transfected at a final concentration of 20nM with CaCl 2. After 12h, medium was changed and experiments were performed 48h after the beginning of the transfection. Adenoviruses were used by simply infection (1 10 7 PFU) for 48h as previously described 1, 2. Efficiencies of sirna transfections and adenoviruses infections rates were assessed in Supplemental Fig.11. Measurement of the ΔΨm and [Ca 2+ ] i in live PASMCs (37 C) were performed using tetramethylrhodamine methyl-ester perchlorate (TMRM) and Fluo-3AM from Invitrogen (Branchburg, NJ, USA) at a final concentration of 5µM, as previously described 3, 4. Proliferation and apoptosis measurements: To study the effect of STAT3 and Pim1 on PASMC proliferation and apoptosis in vitro, we established a model where cultured human PAH-PASMCs were exposed to 10% FBS (a condition that is known to promote proliferation) 1, 4 or 0.1% FBS (a starvation condition that promotes apoptosis) 1, 4. PASMC apoptosis and proliferation were measured using Apoptag apoptosis detection kit (TUNEL; Millipore, Temecula, CA) and the proliferating cell nuclear antigen PCNA antibody from (DAKO, Carpinteria, CA) according to the manufacturer s instructions 3, 4. Percent of nuclei positive PASMCs for TUNEL or PCNA were determined. Nuclear translocation assay: nuclear localization was measured by immunofluorescence. In humans/rats and mice lungs biopsies PAs were previously stained with SM-Actin (Sigma, 1/5000), STAT3 and NFATc2 activation were measured only in SM-Actin

positive cells within distal PAs (<1500μm in human, <400μm in rats and <300μm in mice) in at least 5 to 10 PAs per patient/rat/mice at least in 5 patients/rats/mice. In PASMCs, STAT3 and NFATc2 activation were measured in at least 50 PASMCs per experiment per patient. At least 3 experiments were performed in 3 PAH and 5 healthy patients. Briefly, PY705-STAT3 (Cell Signaling, 1/250) and NFATc2 (ABCam, 1/250) staining were performed as previously described 4. Secondary antibodies used were Alexa Fluor 488 or 594 (Invitrogen, Branchburg, NJ, USA). Co-localization between the targeted protein stained in red or green and the nucleus stained in blue with DAPI was assessed using Volocity software from Perkin Elmer USA. Colocalization was assessed at least in 5 to 10 distal arteries (<1500μm in human, <400μm in rats and <300μm in mice) per patient/rat/mice at least in 5 patients/rats/mice. Number of positive cells (with clear co-localization between target and DAPI) was measured. Positive PASMCs/total number of cells ratio was quantified and presented as the percentage of target activation. NFAT luciferase assay: Cells were plated in 24-well plate, with 1 10 5 cells per well. NFAT luciferase adenovirus was transfected at 1 10 7 PFU. After 12h, medium was changed and treatments were applied for 48h. Cells were lysed, and luminescence was detected using the Luciferase Assay System (Promega) according to the manufacturer's instructions. Luminescence counts were standardized to protein content. Quantitative RT-PCR and immunoblots were performed as previously described 3, 4 qrt- PCR 2 ΔΔCt were calculated with 18s as housekeeping gene (Taqman Gene expression Assay, Applied Biosystem, Foster, CA, USA). For immunoblots, protein expression of PY705-STAT3, STAT3, PS473-Akt, Akt, PY701-STAT1, STAT1, PY694-STAT5, STAT5, PS112-Bad, Bad, NFATc2 were quantified and normalized to both smooth muscle actin (Santa Cruz Biotechnology, 1/500) and Amido Black as previously described 4. PY705-STAT3/STAT3, PS473-Akt/Akt, PY701-STAT1/STAT1, PY694-STAT5/STAT5 and PS112-Bad/Bad ratios evaluation were obtained from the same gel after 30min stripping at 50 degrees.

In vivo experiments: Rats were injected s.c. with 60mg.Kg -1 of MCT. Mice were injected i.v. with 5mg.Kg -1 of monocrotaline pyrrole (MCTP) as previously described 5. Monocrotaline was converted to MCTP using the methodology of Mattocks et al 6. Intra-tracheal nebulization was given on day 18, siscr (AMBION, 1nmol) and sipim1 (AMBION, 1nmol) were combined with Invivofectamine (Invitrogen, Canada) as described by manufacturer. Mice CH were placed for 2 weeks in normobaric hypoxic chambers maintained with 5.5 l min -1 flow of hypoxic air (10% O 2 and 90% N 2 ). Chambers were opened twice a week for cleaning and replenishment of food and water. Oxygen concentrations were continuously monitored with blood gas analyzers. Soda lime was used to lower carbon dioxide concentration. Hemodynamic measurements: All rats and mice underwent hemodynamic and echocardiography (vevo 2100 visualsonics) studies as previously described 4 7. Right catheterizations (closed chest) were performed using SciScence catheters. Direct PA pressures were measured in both rats and mice. Histology measurements: % media wall thickness was assessed in distal PAs in rats (<400μm) and mice (<300μm) as previously described 4, at least in 5 to 10 distal arteries per rats/mice in least in 5 rats/mice were considered. ChIP-PCR. The binding of STAT3 on 3 region of Pim1 gene was studied in ET-1 stimulated PASMCs from 3 control patients. The activation of STAT3 by ET-1 was confirmed by immunoblots as shown in (Fig.1). Cross-links were generated with 1% formaldehyde and chromatin was extracted in lysis buffer (50mM Tris-HCl ph8; 10mM EDTA; 0,2 % SDS and 5mM Na-Butyrate). Chromatin was then sheared by sonication (Diagenode Bioruptor) on ice to an average length of 750bp. After pre-clearing with a mix of protein A/G sepharose beads (4 C for 1 hour), 80µg of chromatin was used for immunoprecipitation with appropriate antibodies [Phospho-Sat3 (Tyr705) from Cell Signaling (9131; 10ml) and normal rabbit IgG from Vectors laboratories (I-1000; 10mg)] in a total volume of 300ml. After overnight incubation at 4 C, 25µl protein-a Dynabeads (Invitrogen) was added and incubate for more than 1 hour. Beads were

extensively washed and immunoprecipitated complexes were eluted in buffer E (50mM sodium bicarbonate; 1 % SDS). Cross-links were reversed overnight at 65 C. Samples were treated with proteinase K and the DNA was extracted using phenol-chloroform. Quantitative real-time PCR was performed using SYBR Green I (LightCycler 480, Roche). Enrichment for a specific DNA sequence was calculated using the comparative Ct method. The numbers presented with standard errors are based on two biological repeats (cells/chromatin/ip). Primers used in the PCR reactions were analyzed for specificity, linearity range and efficiency in order to accurately evaluate occupancy (percent of IP/input). VEGF primers were used as positive control, while OR8J1 primers were used as negative control.

Supplemental Tab.1. Patients providing blood (buffy coat) and lung tissue: ipah: idiopathic PAH; SSC-PAH: PAH associated with scleroderma; SSC: scleroderma; PAH class1: PAH defined as group 1 based on latest World health organization WHO classification. Buffy Coat Lung tissue Patient type Sex Age Mean PA pressure PVR (mmhg) (dyne*sec)/cm 5 1 Healthy F 35 ND ND No Yes 2 Healthy F 38 ND ND No Yes 3 Healthy M 45 ND ND No Yes 4 Healthy M 51 ND ND No Yes 5 Healthy M 48 ND ND No Yes 6 Healthy F 44 ND ND No Yes 7 Healthy F 47 ND ND No Yes 8 Healthy F 50 ND ND No Yes 9 Healthy F 30 ND ND Yes No 10 Healthy F 40 ND ND Yes No 11 Healthy F 25 ND ND Yes No 12 Healthy F 27 ND ND Yes No 13 Healthy M 72 ND ND Yes No 14 Healthy M 64 ND ND Yes 15 Healthy M 18 ND ND Yes No No 16 ipah M 67 30 219.35 Yes No 17 ipah F 34 62 770.37 Yes No 18 ipah F 24 69 884.21 Yes No 19 ipah F 25 32 279.36 Yes No 20 ipah F 48 29 381.32 Yes No 21 ipah M 57 36 885.71 Yes No 22 ipah F 29 55 1050 Yes No 23 ipah M 68 92 1276.92 Yes No 24 ipah F 58 56 1709 No Yes 25 ipah F 36 67 2274 No Yes 26 ipah F 44 40 755.55 Yes No 27 SSC-PAH F 57 56 569.23 Yes No 28 SSC-PAH F 59 41 558.49 Yes No 29 SSC-PAH F 66 123 1403.07 Yes No 30 SSC-PAH F 55 48 980 No Yes 31 SSC-PAH F 63 35 546.34 Yes No 32 PAH group1 F 64 59 926 No Yes 33 PAH group1 M 72 39 11.7 No Yes 34 PAH group1 M 58 42 991 No Yes 35 PAH group1 F 51 51 1199 No Yes 36 PAH group1 F 48 73 1800 No Yes 37 PAH group1 F 51 41 990 No Yes 38 PAH group1 F 68 37 544 No Yes 39 SSC only F 63 ND ND Yes No 40 SSC only F 69 ND ND Yes No 41 SSC only F 48 22 208.69 Yes No 42 SSC only F 46 ND ND Yes No 43 SSC only F 51 ND ND Yes No 44 SSC only M 55 28 177.77 Yes No 45 SSC only F 64 21 84.21 Yes No

Supplemental Tab.2: list of all the supplied used with catalog number. Supply Catalog number Pim1 Antibody Cell Signaling 2907 & 3247 Bad Antibody 9292 PS112-Bad Antibody 9291 STAT3 Antibody 9139 PY705-STAT3 Antibody 9131 Akt Antibody 9272 PS473-Akt Antibody 9271 STAT1 9172 PY701-STAT1 Antibody 9171 STAT5 Antibody SIGMA S6058 PY694-STAT5 Antibody Cell Signaling 9351 SM-Actin Antibody Santa Cruz M08851 Biotechnology SIGMA St Louis, MO, USA A2547 NFATc2 Antibody ABCAM ab2722 FLUO3AM Invitrogen Eugene, OR, F1242 TMRM USA H1399 Mitotracker Red M22425 STAT3 Inhibitor Peptide EMD Bioscience Mississaga, ON, 573096 STAT3 Inhibitor Peptide CANADA 573105 Inactive Control Quercetagetine 551590 PDGF 521200 TNF-α 654205 Angiotensin II 52-23-0111 Endothelin 1 05-23-3800 Silencer Pim1 Hs Applied Biosystem Foster, CA, s10527 Silencer Pim1 Rn USA s128205 Silencer STAT3 Hs s745 SiNegatif AM4638 18S 431083E Rn Pim1 284083 Hs Pim1 6581046 Mm Pim1 733876 Hs NFATc2 852882 Rn NFATc2 Mm NFATc2 787327 Monocrotaline SIGMA St Louis, MO, USA c2401 TUNEL Millipore S7110 PCNA Dako Cytomation Carpinteria, CA, USA Invivofectamine Invitrogen Eugene, OR, USA M0879 1377-901

A)33&060#$,&'B<8)%0'C'!"!"#$%&'()&**"+,%"*%",-)&.*&/%",%01#.,%/"*3.5%!6*%%+:%!67;(.3"&,3*% ST!' 1<6C'58%00#9'!"#$%"&' 127F' 1:H'DK.' 127' 1:H'DMR' 127' '1:H'CERD' 127' 1:H'KKEG' N%00#'*&)"%04;0#;0' <#$0#4<$+' O0&&"P'*&)"%04;0#;0' <#$0#4<$+' /0%80='' A/F2;$<#'5%0=9'U' S21T'5V&)09' 5CKRW9'!"&";,&<X,$<"#'' 1<6C?A/F2;$<#' 5+0&&"P9' 40 µm! B>Q' B>Q' #"!"#$%&'()&**"+,%"*%",-)&.*&/%",%01#.,%20"3&%45++/%-&55*%.,/%-+))&5.3&*%2"30%!67%*&8&)"39% ()**+'!",$' 1<6C'6HI2'&0J0&''5K LL!$ '$"'CMA9' ()**+'!",$' 1<6C'6HI2'&0J0&''5K LL!$ '$"'CMA9' ()**+'!",$' 1<6C'6HI2'&0J0&''5K LL!$ '$"'CMA9'!"#$%"&''()**+'!",$''#-.' 127'''()**+'!",$''#-D' AA''()**+'!",$''#-E' AAF127''()**+'!",$''#-G' /0,#'12'3%044)%0'566789' 1)&6"#,%+':,4;)&,%'%04<4$,#;0' 5=+#>4?;6 @ 9'

!"##$%&%'()$*+,-".%*/*!"!"#$%&'%()*+,+-)./#(/#0)$/1%)/#)-2)&%0/"#)"3)4/56)0%#%) #" *+,+-)./#($)-2)&%0/"#)"3)4/56) 0%#%7)!89474!:) *!,-')$**.%$)(,0%*(1*,'#"(* 9:;<3*'%-)(,0%*81'(.1$* 456+*#17,(,0%*81'(.1$* 2,&3*

"FGG14/4,)01+H2IF.4+%+!"!"#"$%&!"#"'&()*&#+,&-(,./(01&(23&)4,&(5,67(,3*&6)&8#9:8#!;<&!8$9:&";';:*";';:+,-./012345+)-+"6&'7)2,+!8$9:&";';:+++ <@:+=>0?+ ";';:+<@:=>0?+ "6&'7)2,+ <+#%=>0?+ A-,).-1+!'B+ H-15+-J+7-,).-1+,E%+!8C@#&";';D*";';D+,-./012345+)-+"6&'7)2,+!8C@#&";';D+ <@9=>0?+ ";';D+<@9=>0?+ "6&'7)2,+ <#%=>0?+ A-,).-1+!'B+ H-15+-J+7-,).-1+!"#$%&'()*'()+,-./012345+)-+"6&'7)2,+,E%+!"#$%&'()+ <C9=>0?+ '()+<C9=>0?+ "6&'7)2,++ +<#%+=>0?+ A-,).-1+!'B+ H-15+-J+7-,).-1+,E%+

!"##$%&%'()$*+,-".%*/* #"!"#$%"&'"(")"*&%+,-,+.,.%!/01%2&3%,&3*)',4"&5"&367,3%8+*4"9,+2)"*&%2&3%+,.".)2&7,%)*%28*8)*.".% 7*38*#.3$,8%.)(,9%*5%$$:** ;<=>?@* 7*38*)#3#(3(,5*5%$$:* ;AB>CD@* 7*38*#.3$,8%.)(,9%*5%$$:** ;<=>?@* 7*38*)#3#(3(,5*5%$$:* ;AB>CD@* '012*(3*422*,'** %)56*-.3"#* '012*(3*422*,'** %)56*-.3"#*!" :"#"42+4;%)*%!"#$%"&'"(")"*&<%:=>=?%"&'"(")"*&%+,.)*+,.% #")*7'*&3+"24%96&7)"*&.%(;%3,8*42+"@"&A%BC#%"&%!>D5!>:EF% <?EF:,!=I* AHIH*,'(%':,(J*;/2K@* <?EF:,!A?AG* <?EF!A?AG* >%-**<%#* <?EF!A?AG* L'6*<%#* +MB* '012*(3*422*,'** %)56*-.3"#* 20 µm!

!"##$%&%'()$*+,-".%*/* 9%.-%:** ;+3<=>*?-.%%'@* A32B*?C$"%@**?DEF@* 01$1=)$,H)(,1'** ;+3<=>IA32B*?J%$$1K@*!"#$%"&'"(")"*&%+,-.,/0,0%1234-5%/-)"6/)"*&% B&&"'16(),'','-*1'*23!906* 01'(.1$* 234* 23456,!08* 23456,2,&7* DEF* 7GEF* 10 µm! 2,5 µm! N*1O*23!906*K,(P*;+3<=>IA32B* =1$1=)$,H)(,1'*,'*23!906* 'L/*=1'(.1$** 'LM*234*

!"##$%&%'()$*+,-".%*/* #"!"!"#$%*+,-*&&"('%"'2-*1&*&%;")/%!49%.*<*0(,#*')%"'%5678!49%-1)%#(.*0:% 8LG* M:,&A*4-.%%'9*!"#$%"&%'()%*+,-*&&*.%"'%*'.()/*0"10%2*00&%(3%!4% 3-(#%5678!49%-1)%#(.*0:% 8LG* M:,&A*4-.%%'9* 0%.-%K* M82:L*4N$"%9* M!0*123(,'*4.%K9* 0%.-%K** M82:L*4N$"%9* MRS1G)KT%.,'*4.%K9* GB$B3)$,J)(,B'** :,&AI!0123(,'* 4P%$$BQ9* GB$B3)$,J)(,B'** :,&AIRS13)KT%.,'* 4P%$$BQ9* 40 µm! =* D* E%%FO*0G?1:2H* 5* 6* =* 5* E%%FO*0G?1:2H* =747>?!"#$?@A472B%,-()*"'%*+,-*&&"('%"'%5678!49%-1)&%0C'D&% :;<=>1!?2?6I!?2?6* CB.&)$,J%K*(B*!0123(,'* E%O(%.'*U$B(*B'*.)(O*$"'-*$PO)(%O* :,&AI!0123(,'* CB.&)$,J%K*(B*!0123(,'* 'W>* :;<=>1!?2?6*4@/78)9*!?2?6*4@/78)9* :,&A*466*(B*55*78)9* C+2?3D*4AD=78)9* +B$K*BV**3B'(.B$* +B$K*BV**3B'(.B$* "$" A* 40 µm!!0123(,'*45678)9* =* A* D* E%%F*0G?1:2H* 6* 5* E%%F*0G?1:2H* E%%F*0G?1:2H*

!"##$%&%'()$*+,-".%*/*!"!"#$%,0-1,**"23%"*%"3.1,9*,:%"3%19)*%;<"),%=>22:%.,>>*%93:%.211,>9),*%;")<%4567!(8%*,?,1")@% =,&?*&@A0*$%6%$* BC DD:( *(1*?E!F * 'GH*,'*%)IJ* -.1"#*. C GKLEM*NNN* :1'(.1$* 9,$3*9:;<=0>*!%6%.%*9:;<=0>* #"!"#$%#&'(%)"**+,%*-,."/".%,0-1,**"23%"3%4567!(8% =,&?*&@A0*$%6%$*BC DD:( *(1*?E!F * 01.()* 2,3'%4* 5,6%.* 'GH*(1*E*,'* %)IJ*-.1"#* 7%%8*9:;<=0>* 7%%8*9:;<=0>* 7%%8*9:;<=0>*

!"!"#"$%&"'()*$+"%&,-$ "../0/"#0*$ 7DR123%>#<4=<4=BC5=9% #58"9>S=<>@#% ()*% +,-./0% 123%+$455#0% 6(73)%+89"50%% '"::95;5#<=9%2>$"45%?% #" 1/+2$%/334"$3)"0/./0$/#&/5/%/,#$/#$67891:;$<"#"$%&"'()*$ 3>;,%;FN7%95O59%+- PP*< %<@%,?'0 % 37%!"#$% F&%!&'% %Q>D#5E% %7@4<=% #LM%>#%% 5=BC%$4@":% 40 µm! $" 1/+2$/#&/5/%/,#$/+)',="3$67891:;$ ABC@B=4D>@$4=:CE% 377K%;J% ABC@B=4D>@$4=:CE% F&%G455%H=99%<C>BI#5JJ%;;% #LM%>#%% 5=BC%$4@":% T55I%=G<54%<C54=:E% T55I%=G<54%<C54=:E%

!!"##$%&%'()$*+,-".%*/*!"#$%&'%#"()%*+)%+),",-*.-%-/%012!%*.3%14+/."(%456/7"*8".39()3%!:;% A2##$%.*BCCD*?&>@* A2##$%.*BCCD*?&>@* 64524).7,2-.)#58** 9:*;.%%*<)$$*(5,4='%>>*?&&@* 64524).7,2-.)#58* 9:*;.%%*<)$$*(5,4='%>>*?&&@* '01*(2*3**,'*%)45*-.2"#* E%%=>*FGDBHBCI* E%%=>*IJBHBCI* E%%=>*FGDBHBCI* E%%=>*IJBHBCI* "#!"#$%&'%#"()%4*<)%"#6+/<)3%,9+<"<*=%!".N,N,)$*?O@* #PQRQM*SS* *KL*B,&MHFGDB* ED**B,&MHFGDB* KL*B,&MHIJB* ED**B,&MHIJB** A)8>*2;*BCI*

Supplemental Figure 10 A STAT3 activation in Mice WT Pim1 WT Pim1- MCTP WT Pim1 -HYP KO Pim1 KO Pim1- MCTP KO Pim1 -HYP DIC 240X Merged PY705-STAT3 (green) +DAPI (bleu) Colocalization STAT3/DAPI 40 µm! B NFATc2 activation in Mice DIC 240X +DAPI (blue) WT Pim1 WT Pim1 -MCTP WT Pim1 -HYP KO Pim1 KO Pim1- MCTP KO Pim1- HYP Merged NFATc2 (green) +DAPI (blue) (120X) Colocalization NFATc2/DAPI 40 µm!

!"##$%&%'()$*+,-".%*//*!"#$%&'()*!+,-'".*&,++"-",*-/&!" #" 0"#$%&,++"-",*-/&.*&1(.',"*&,21(,!!".*& '01* '023*4%$$5* 6*78*4%$$5*#.%5%'(,'-*)*49(757$,4*:+;*-.%%'* #)((%.'*47'5,<%.%<*)5*,'8%4(%<* ;=>*?5,!@=@1* ;=>*?5,!AB* ;=>*?5,;,&/* ;=>*?5,!AB* ;,&/*C11*(7*DDEF)G*!HI=4(,'*CD1EF)G*!HI=4(,'*CD1EF)G*!@=@1*CJKEF)G* ;LM32I!@=@1*CJKEF)G* ;,&/*C11*(7*DDEF)G*!HI=4(,'*CD1*E<)G** HA@I;=>*** 5,!AB* HA@I;=>* **5,;,&/* ;,&/*C11*(7*DDEF)G*!HI=4(,'*CD1EF)G* A7'(.7$?=<I:+;* A7'(.7$*?=<I:+;I* N@*;,&/* 3,!',(*&45.'&.*&6%078!&5/!)',!& 3,!',(*&45.'&.*&()'!&59*:&-,55!&&5/!)',!& ;,&/*&BO=*$%P%$*CQ RRA( *(7*/J!G * %;,*.<"(9!,!&"*+,-'".*!&,++"-",*-/& $" 6*78*;,&/*)4(,P)(,7'*S9*=<IN@I;,&/* 47&#).%<*(7*=<I:+;** 6*78*,'T,S,(,7'*S9*5,BO=* (.)'58%4(,7'5*47&#).%<*(7*5,!AB* %" 0,-.*;)(/&:(,,*& )*'"=.;/&.*5/&!%47'<).9*)'(,S7<9* 7'$9* H%.-%<?F=;U* 40 µm!

Supplemental Figure Legends Supplemental Fig.1: Pim1 expression correlates with PAH severity in humans PAs and buffy coat. (A) Pim1 protein expression was measyred by immunofluorescence in human distal PAs of patients with various degrees of PAH (measured by PVR). As shown the greater is the PVR the greater is Pim1 expression (green p<0.05). Finally in PAs Pim1 co-localized with SM-actin (red) giving a yellow staining, confirming that Pim1 expression in PAs is mainly localized within PASMCs. As predicted by the amount of Pim1 (green), the amount of yellow was also proportional to PAH severity (p<0.05 compared to control group). (B) Similarly to human PAs, Pim1 mrna expression is increased in buffy coat of PAH patients and correlates with PAH severity (assessed by PVR and mean PA pressure). We demonstrated that the increase in Pim1 is specific to PAH as patients with scleroderma only showed significantly (p<0.05) less Pim1 mrna compared to both patients with PAH associated or not with scleroderma. Supplemental Fig.2: STAT3 binds to the 3 region of Pim1 gene. (A) In silico analysis using ENCODE Chip-Seq database confirmed the presence of highly conserved (among several species) STAT binding site in the 3 of Pim1 gene. (B) STAT3 binding in 3 of Pim1 gene was confirmed in ET-1 stimulated PASMCs by ChIP-PCR (n=3 ChIP/patient in 3 patients). Compared to both VEGF (positive control) and OR8J1 (negative control) STAT3 binding was increased in 3 region of Pim1 gene. Supplemental Fig.3: Role of the STAT and Akt pathways in human PAH. (A) STAT1 and STAT5, the 2 other STAT isoforms implicated in cardiovascular diseases are not activated in human PAH-PASMC. Immunoblots showed that compare to control-pasmc PY701-STAT1/STAT1 and PY694-STAT5/STAT5 ratios were not significantly changed in PAH-PASMC (n=3 western blot/patients in 3 PAH and 3 control

patients). In addition to the STAT pathway, Akt has been implicated in Pim1 activation. Nonetheless, Akt pathway is not activated in PAH-PASMC (no significant increase in PS473- Akt/Akt ratio). Supplemental Fig.4: Role of STAT3/Pim1 in PASMC proliferation and apoptosis (A) Pim1 inhibition reverses ET-1 and PDGF induced PASMC proliferation and resistance to apoptosis. ET-1 and PDGF treatment for 48h in control PASMC promotes (p<0.01) PASMC proliferation (%PCNA) and resistance (p<0.01) to serum starvation induced apoptosis (%TUNEL) as seen in PAH-PASMC. Similarly to STAT3 inhibition (sirna) Pim1 inhibition reverses this phenotype (n=50 to 100cells/patient in 5 control patients; p<0.05). (B) STAT3 inhibition by either sirnas or inhibitor peptide restores mitochondrial membrane potential measured by TMRM (p<0.05; n=50 to 100cells/patient in 3 PAH patients) in PAH-PASMCs. Supplemental Fig.5: Pim1 inhibition decreases NFATc2 activation in PAH- PASMCs. (A) Pim1 inhibition using sirnas decreases NFATc2 (green) nuclear translocation (DAPI blue) giving less yellow staining, in 10 to 20 cells /patient in 3 PAH and 5 control patients. Supplemental Fig.6: Pim1 expression is increase in MCT-induced PAH in rat and is confined to the PASMCs. (A) Pim1 expression was measured by immunofluorescence in distal PAs in lungs biopsies of both control and MCT-injected rats. Pim1 expression (green) increases with the development of PAH (i.e there is an increase in Pim1 expression (more green fluorescence) two weeks post MCT injection). Moreover, colocalization experiments between SM-Actin (red) and Pim1 (green) showed that the increased in Pim1 expression in mostly confined to PASMCs giving a greater yellow staining 2 weeks and beyond MCT-injection.

(B) Double staining technique with VE-cadherin a marker of endothelial cells, showed limited co-localization between Pim1 (green) and VE-cadherin (red), suggesting that Pim1 is primarily expressed in PASMCs and less in PA endothelial cells. (C) As in human, the increase in Pim1 expression is precede by a significant activation of STAT3 (p<0.05) (measured by the P-STAT3/STAT3 ratio using immunoblots) between 1 and 2 weeks post MCT injection. Similarly, NFATc2 protein expression follows the same expression pattern than Pim1. Supplemental Fig.7: (A) Pim1 expression is increased in rats white blood cells and correlates with MCT-PAH severity. Pim1 mrna levels were measured in buffy coat from control rats (mean PAP <15mmHg); and rats with MCT-induced mild-pah (mean PAP <30mmHg) and sever PAH (mean PAP greater than 30mmHg). As shown, Pim1 mrna levels are significantly increase in both mild and sever-pah rats compare to control. In addition a significant correlation was found between Pim1 mrna levels and PAH severity (n=5 to 8 rats per group). (B) Pim1 expression in various tissues. Pim1 mrna levels were measured in several tissues including aorta; kidney and liver by qrt-pcr. As shown, Pim1 is poorly expressed at mrna level in the tested tissues, and is not affected by development of PAH. Supplemental Fig.8: Pim1 inhibition affects only the pulmonary arteries reversing PAH. (A) To verify the tissue distribution of our treatment we also nebulized an adenovirus carrying GFP. We observed the expression of GFP using immunofluorescence staining on lung sections. Diffuse GFP immunofluorescence in the PAs confirmed the tissue specificity of our nebulization technique. This experiment doesn t show that our method of silencing is effective but allows verifying the instrumentation and that nebulization occurred. (B) In order to study the selectivity and safety of our gene silencing delivery method, we measured Pim1 expression in several tissues. We showed that sirna treated rats had decreased Pim1 mrna levels in lung, PAs and RV but not in other systemic vessels such as aorta, while

rats treated with scrambled sirna showed no modification in Pim1 levels. Note that Pim1 levels were very low in all other tested organs and their levels were similar in the sirna and scrambled treated rats showing the tissue specificity of our therapeutic intervention. (C) Longitudinal studies using echography and Doppler showed that Pim1 inhibition significantly increases PAAT (p<0,001) and decreases RV hypertrophy (p<0,05). Supplemental Fig.9: Pim1 K.O mice are resistant to PAH. (A) Longitudinal studies using echocardiography and Doppler showed that Pim1 K.O mice are resistant to both MCTP and chronic hypoxia induced PAH, as no changes in PAAT and RV hypertrophy were observed, while like in rats wild type mice injected with MCTP or exposed to CH had a significant (p<0.05) decrease in PAAT and significant increase in RVH. (B) Pim1 K.O mice have improved survival over 25 days period post MCTP injection or CH exposure (p<0.01). Supplemental Fig.10: STAT3 and NFATc2 activation in Pim1 K.O. (A) As in rats STAT3 activation (PY705-STAT3 in green nuclear translocation) is increased in both WT and Pim1 KO mice injected with MCTP or exposed to chronic hypoxia giving a greater yellow staining. (B). NFATc2 activation measure by NFATc2 (green) nuclear translocation, is increased only in WT animals injected with MCT or exposed to CH (increased yellow staining). As predicted lack of Pim1 in KO animals prevented NFATc2 activation. This finding suggests that STAT3 activation is not sufficient to activate NFAT and to promote PAH. Supplemental Fig.11: Efficiency of Pim1 sirna, adenoviruses, STAT3 sirna and antibody immunofluorescence specificity. (A) Using qrt-pcr we demonstrated that our concentration of Pim1 sirnas block over 80% of Pim1 mpna expression in PAH-PASMCs, while the same concentration of scrambled sirna has no effect.

(B) Adenoviruses infection at 1.10 7 PFU induce an infection rate of 60 to 80% in healthy PASMCs exposed to 48h. Wild type Pim1 adenovirus infection in healthy-pasmc promotes Pim1 expression by 80%. (C) Immunoblots performed in human PAH-PASMCs showed that both sistat3 and sipim1 blocks 80% of STAT3 and Pim1 the protein expression respectively. Similar results were found in the lungs of MCT-PAH rats nebulized with sipim1. (D) Staining with only the same secondary antibody (green signal) used for Pim1, NFATc2 and Bcl2 immunofluorescence showed no unspecific staining in human distal PA. Supplemental References 1. Bonnet S, Archer SL, Allalunis-Turner J, Haromy A, Beaulieu C, Thompson R, Lee CT, Lopaschuk GD, Puttagunta L, Bonnet S, Harry G, Hashimoto K, Porter CJ, Andrade MA, Thebaud B, Michelakis ED. A mitochondria-k+ channel axis is suppressed in cancer and its normalization promotes apoptosis and inhibits cancer growth. Cancer Cell. 2007; 11:37-51. 2. McMurtry MS, Archer SL, Altieri DC, Bonnet S, Haromy A, Harry G, Bonnet S, Puttagunta L, Michelakis ED. Gene therapy targeting survivin selectively induces pulmonary vascular apoptosis and reverses pulmonary arterial hypertension. J Clin Invest. 2005; 115:1479-1491. 3. Bonnet S, Paulin R, Sutendra G, Dromparis P, Roy M, Watson KO, Nagendran J, Haromy A, Dyck JR, Michelakis ED. Dehydroepiandrosterone reverses systemic vascular remodeling through the inhibition of the Akt/GSK3-{beta}/NFAT axis. Circulation. 2009; 120:1231-1240. 4. Bonnet S, Rochefort G, Sutendra G, Archer SL, Haromy A, Webster L, Hashimoto K, Bonnet SN, Michelakis ED. The nuclear factor of activated T cells in pulmonary arterial hypertension can be therapeutically targeted. Proc Natl Acad Sci U S A. 2007; 104:11418-11423. 5. Raoul W, Wagner-Ballon O, Saber G, Hulin A, Marcos E, Giraudier S, Vainchenker W, Adnot S, Eddahibi S, Maitre B. Effects of bone marrow-derived cells on monocrotalineand hypoxia-induced pulmonary hypertension in mice. Respir Res. 2007; 8:8. 6. Mattocks AR, Jukes R, Brown J. Simple procedures for preparing putative toxic metabolites of pyrrolizidine alkaloids. Toxicon. 1989; 27:561-567. 7. Sutendra G, Bonnet S, Rochefort G, Haromy A, Folmes KD, Lopaschuk GD, Dyck JR, Michelakis ED. Fatty acid oxidation and malonyl-coa decarboxylase in the vascular remodeling of pulmonary hypertension. Sci Transl Med. 2010; 2:44-58.

circulation_2011_02_5tord-imp:circulation 11/18/11 2:19 PM Page 172 Vascularis medicina A transzkripciós jelátvivő és aktivátor-3/pim1 tengely alapvető szerepet játszik az emberi pulmonalis artériás hypertonia patogenezisében Roxane Paulin, MSc; Audrey Courboulin, MSc; Jolyane Meloche, BSc; Vincent Mainguy, MSc; Eric Dumas de la Roque, MD; Nehmé Saksouk, PhD; Jacques Côté, PhD; Steeve Provencher, MD; Mark A. Sussman, PhD; Sébastien Bonnet, PhD A vizsgálat háttere A pulmonalis hypertonia (PAH) egy proliferatív rendellenesség, amelyben a pulmonalis artériák simaizomsejtjeinek (PASMC) fokozott proliferációja és csökkent apoptózisa mutatható ki. Ennek a fenotípusnak a fenntartásához egy sejttúlélést biztosító transzkripciós faktor aktiválódására van szükség, mint például a transzkripciós jelátvivő és aktivátor-3 (STAT3, signal transducers and activators of transcription-3) vagy az aktivált T-sejt nukleáris faktora (NFAT, nuclear factor of activated T cell). Mivel ezek a faktorok több élettani folyamatban is szerepet játszanak, gátlásuk a PAH-ban szenvedő betegekben káros hatású is lehet. Ezért terápiás szempontból nagy jelentőségű azon mechanizmusok feltérképezése, amelyek a PAH-ra jellemző pulmonalis artéria simaizomsejtjeiben történő expressziójukért és aktiválódásukért felelősek. Módszerek és eredmények Multidiszciplináris és transzlációs megközelítéseket alkalmazva kimutattuk, hogy a STAT3 aktiválódása a PAH mind emberi, mind kísérletes modelljeiben az NFATc2 és a Pim1 onkoprotein-kináz expressziójához vezet, amely az NFATc2 aktiválódását eredményezi. Mivel a Pim1-expresszió korrelál a PAH súlyosságával és csak a PAHban szenvedő betegek pulmonalis artériáinak simaizomsejtjeiben mutatható ki, a Pim1-et ígéretes terápiás célpontként írták le a PAH kezelésére. A Pim1 specifikus gátlása in vitro valóban csökkenti a pulmonalis artériák simaizomsejtjeinek proliferációját és fokozza az apoptózist, e folyamatokat pedig az NFATc2 gátlása tartja fenn. In vivo a Pim1 szövetspecifikus gátlása porlasztott sirns-sel (kis interferáló RNS) visszafordítja a monokrotalin által kiváltott PAH-t patkányokban, míg a Pim1-knock out egerek rezisztensek a PAH kialakulásával szemben. Következtetések Vizsgálatunkban elsőként mutattuk ki, hogy a STAT3/Pim1 tengely kóros aktiválódásának gátlása ígéretes, új és specifikus terápiás lehetőség a PAH visszafordítására. (Eredeti megjelenés: Circulation. 2011;123:1205 1215.) Kulcsszavak: apoptózis hypertonia, pulmonalis proliferáció Apulmonalis artériás hypertonia (PAH) proliferatív, érremodellációhoz vezető betegség, amelyet fokozott gyulladás 1 és vasoconstrictio, illetve a pulmonalis artériák simaizomsejtjeinek (PASMC) fokozott proliferációja és apoptó zissal szembeni rezisztenciája jellemez. 2 Ez a pulmonalis vascularis rezisztencia megnövekedéséhez, végül pedig jobbszívfél-elégtelenséghez vezet. 3 Ennek a proproliferatív és antiapoptotikus fenotípusnak a fenntartását többek között egy transzkripciós faktor, az aktivált T-sejtek nukleáris faktora (NFAT, nuclear factor of activated T cells) aktiválódása teszi lehetővé. 4,5 Ugyanakkor az NFAT expressziójának és aktiválódásának fokozódásához vezető mechanizmus még nem ismert. A transzkripciós jelátvivő és aktivátor (STAT, signal transducers and activators of transcription) fehérjecsalád sokféle sejtszintű folyamatot szabályoz, köztük a növekedést és a túlélést, és daganatos betegségekben szabályozásuk gyakran kórossá válik. A fehérjecsalád hét izoformát tartalmaz (STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5A, STAT5B és STAT6), amelyek közül a STAT3-nak van a legnagyobb szerepe a cardiovascularis megbetegedésekben. 6,7 A STAT-fehérjék a citokinek (mint például az interleukin-6), 8 a növekedési faktorok (mint a vérlemezke-eredetű növekedési faktor) 8 és agonisták (mint az endothelin-1 és az angiotenzin-ii) 9 hatására aktiválódnak (azaz foszforilálódnak [P-STAT] és a sejtmagba helyeződnek át). Ez utóbbi anyagok mindegyike szerepet játszik a PAH-ban. 10 12 Érdekes módon több STAT-kötő helyet azonosítottak az NFATc1, az NFATc2 és az NFATc3 (a PAH-ban szerepet játszó három fő NFAT-izoforma 5 ) promoter régiójában. 13 Bár feltételezik, hogy a STAT3 szerepet játszik a PAH-ban, 14 pontos funkciója és az NFAT-ra gyakorolt hatása még meghatározásra vár. Daganatos betegségekben a STAT3 fokozza a Moloney egér leukémiavírus-provírus integrációs génszakaszának (Pim1) expresszióját, amely egy szerin/treonin protein-kinázt kódoló protoonkogén. 15 A Pim1 túlzott expressziója számos daganat Érkezett: 2010. augusztus 25-én. Végső formában elfogadva: 2011. január 10-én. Munkahelyi háttér: Department of Medicine, Université Laval and Centre de Recherche du CHUQ Hôtel-Dieu de Québec, Québec City, Québec, Canada (R. P., A. C., J. M., N. S., J. C., S. B.); Faculté de Medecine, Université Laval, Centre de Recherche CRIUCPQ, Québec City, Québec, Canada (V. M., S. P.); Université Bordeaux 2 and INSERM U 885, Bordeaux, France (E. D. d.l.r.); és SDSU Heart Institute, San Diego State University, Biology Department, San Diego, CA (M. A. S.). A cikkhez tartozó, csak online formában hozzáférhető kiegészítő adatok a http://circ.ahajournals.org/cgi/content/full/ CIRCULATIONAHA. 110. 963314/ DC1 weboldalon érhetők el. Levelezési cím: Dr. Sébastien Bonnet, Centre de Recherche de L Hôtel-Dieu de Québec, 10 Rue McMahon, Québec, QC G1R 2J6, Canada. E-mail: sebastien.bonnet @crhdq.ulaval.ca 2011 American Heart Association, Inc. 1. évfolyam, 2 3. szám, 2011. június szeptember Circulation Magyar Kiadás 172 182 172

circulation_2011_02_5tord-imp:circulation 11/18/11 2:19 PM Page 173 Paulin és mtsai A transzkripciós jelátvivő és aktivátor-3/pim1 tengely 173 kialakulásában és progressziójában játszik szerepet, a sejtosztódás, a sejttúlélés és az apoptózissal szembeni rezisztencia fokozásával. 16 18 Végül, a Pim1 aktiválódása fokozta az NFATc1 aktivitását az NFATc4-en keresztül patkány-pc12-sejtekben és limfoid sejtekben, 19,20 amely alapján feltételezhető a Pim1 szerepe a PAH kialakulásában. Jelen tanulmány célja a STAT3 és a Pim1 PAH kialakulásában játszott szerepének tisztázása, különös tekintettel az NFAT által mediált proproliferatív és antiapoptotikus fenotípus fenntartására. Módszerek A csak on-line megjelenő Melléklet részletesen bemutat minden alkalmazott módszert. Az emberi szövetmintákat illetően lásd az on-line Melléklet I. táblázatát. Az eszközöket és vegyszereket illetően lásd az on-line Melléklet II. táblázatát. Minden emberi szövetmintát a Laval Hospital szövetbankjából szereztünk be. A PAH-ra jellemző szövetminták nyolc nem familiáris PAH-ban szenvedő betegtől származtak, akik mindegyike a WHO legújabb osztályozása szerinti első csoportba tartozott, 25 Hgmm fölötti átlagos pulmonalis artériás nyomással. Az egészséges tüdőszövetek nyolc, PAH-ban nem szenvedő betegtől származtak, akik jóindulatú nodulusok (n=3) vagy rosszindulatú daganat (n=5) miatt tüdőreszekción estek át. Határréteg- (buffy coat) mintákat vettünk hét egészséges donortól, 13 nem familiáris PAH-ban szenvedő betegtől (kilenc idiopathiás PAH és négy sclerodermához kapcsolódó PAH) és hét, sclerodermában szenvedő betegtől. Minden kísérletet a Laval University és a Laval Hospital biológiai biztonságért felelős és etikai bizottságának előírásai szerint végeztünk (20142-es protokoll). Minden beteg tájékozott beleegyezést adott a vizsgálat előtt. Sejtkultúra Minden pulmonalis artéria simaizomsejtjének vizsgálata esetében (kontroll és PAH) a negyediktől a hatodik átoltásig nyert sejteket használtunk. A PAH-ra jellemző pulmonalisartéria-simaizomsejteket 1500 μm-nél kisebb átmérőjű kis pulmonalis artériákból izoláltuk három olyan férfi betegből, akik a fent leírt 25 Hgmm-nél nagyobb átlagos pulmonalis artériás nyomással definiált PAH-ban szenvedtek (on-line Melléklet II. táblázat). 21 Az öt betegből nyert kontroll-pulmonalisartéria-simaizomsejteket megvásároltuk (Cell Application Group, San Diego, CA). A részletes leírás az on-line Melléklet Módszerek című szakaszában olvasható. Az sirns-ek és az adenovírusok hatékonysága Az sirns-ek és az adenovírusok hatékonyságát mind kvantitatív reverz transzkripciós polimeráz láncreakcióval (qrt-pcr), mind immunoblot eljárással elemeztük (lásd az on-line Melléklet XI. ábra C részét). Statisztika Az átlagolt adatokat átlag±sem (standard error of the mean = átlag szórása) formában adtuk meg. Adataink normalitását a Shapiro Wilk-féle teszttel vizsgáltuk. Két átlag összehasonlítására a Student-féle kétmintás t-próbát alkalmaztuk. Kettőnél több átlag összehasonlítására egyutas varianciaanalízist, majd Dunn-tesztet alkalmaztunk. A korrelációs vizsgálatok során Spearman-féle kétoldalas tesztet alkalmaztunk. A sejtkultúra felhasználásával végzett kísérletek esetében az n a betegek számát jelenti; az in vivo vizsgálatokban az n az állatok számát jelöli. A túlélési vizsgálat során egy 20 knockout és 20 vad típusú, krónikus hypoxiának kitett vagy monokrotalin-pirrollal (MCTP) injektált egérből álló kohorszot követtünk 25 napig, majd a monokrotalininjekciót követő 25. napon, illetve a krónikus hypoxia 25. napján a hemodinamikai vizsgálatok után elaltattuk az állatokat. A spontán halálozást vettük számba eseményként, és a tervezett hemodinamikai vizsgálatokon átesett, majd elaltatott egereket kizártuk. Az eseményig eltelt idő (time-to-event) adatokat Kaplan Meier-módszerrel ábrázoltuk, a különbségeket pedig log-rank-teszt alkalmazásával értékeltük. A p<0,05 értéket minősítettük szignifikánsnak. Eredmények A STAT3 aktivációja fokozott a PAH-ra jellemző emberi pulmonalis artéria simaizomsejtjeiben A STAT3 aktivációját (az Y705 foszforilált STAT3 sejtmagba történő transzlokációját) mértük nyolc, PAH-ban szenvedő beteg és nyolc egészséges donor ép pulmonalis artériáiban (on-line Melléklet I. táblázat), illetve nyolc egyénből izolált pulmonalisartéria-simaizomsejtekben (három PAH-ban szenvedő és öt egészséges donor). A kontrollal összehasonlítva a P-STAT3 és a DAPI (4,6-diaminido-2-fenilindol, egy fluoreszcens DNS-festék) együttes előfordulását (kolokalizációját) mutató sejtek százalékos aránya szignifikánsan magasabb volt a PAH-ban szenvedő betegek pulmonalis artériáiban és a PAH-ra jellemző pulmonalis artéria simaizomsejtjeiben (1. ábra A része). Ezt az eredményt megerősítették a pulmonalis - artéria-simaizomsejteken végzett immunoblot vizsgálatok, amelyek során a simaizomaktinra normalizált PY705-STAT3/ STAT3 arányt mértük (1. ábra A része). A Pim1 expressziója fokozott a PAH-ra jellemző emberi pulmonalis artéria simaizomsejtjeiben, és korrelál a PAH súlyosságával. A Pim1 PAH-ban játszott szerepének vizsgálata során a Pim1 expresszióját mértük nyolc, PAH-ban szenvedő beteg és nyolc kontrollalany tüdejében, illetve distalis pulmonalis artériákból izolált simaizomsejtekben (három PAH-ban szenvedő beteg és öt kontrollalany). A kontrollal összehasonlítva a PAHban szenvedő betegek tüdőszövetében nyolcszoros, a PAH-ra jellemző pulmonalis artéria simaizomsejtjeiben 2,5-szeres növekedést észleltünk a Pim1-RNS-ek mennyiségében (qrt- PCR) (1. ábra B része). Ezt az eredményt fehérjeszinten is megerősítettük a distalis pulmonalis artériák esetében, a tüdőmetszeteken elvégzett immunfluoreszcens vizsgálattal (on-line Melléklet I. ábra A része), ahol a Pim1 zöld, a simaizomaktin vörös, a sejtmag pedig kék színnel ábrázolódott (DAPI). Ahogy az ábrán látható, a zöld fluoreszcencia szignifikánsan nagyobb mértékű volt PAH fennállásakor. Továbbá a Pim1- expresszió fokozódása főleg a pulmonalis artéria simaizomsejtjein belül volt kimutatható, ahogy az a simaizomaktin és a Pim1 nagyobb mértékű kolokalizációjából látható, amely sárga festődést eredményez (on-line Melléklet I. ábra A része). Ezt az eredményt megerősítették az izolált pulmonalis artéria simaizomsejtjein végzett immunoblot vizsgálatok (1. ábra B része), amelyek során a Pim1-fehérje expressziójának kétszeres emelkedése volt kimutatható a PAH-ra jellemző pulmonalis artéria simaizomsejtjeiben a kontrollhoz viszonyítva. Ahhoz, hogy megállapítsuk, van-e összefüggés a Pim1- expresszió mértéke és a PAH súlyossága között, a Pim1 mrns-expresszióját különböző súlyosságú PAH-ban szenvedő betegek tüdejében mértük meg, ahol a súlyosságot a pulmonalis vascularis rezisztencia alapján értékeltük. Ahogy az ábrán látható, a Pim1-mRNS mennyisége pozitívan korrelál a pulmonalis vascularis rezisztenciával (1. ábra B része). Mivel a PAH-ra jellemző, hogy megnövekszik a Pim1-et expresszáló aktivált T-sejtek 5 és endothelialis progenitor sejtek 22,23 vérben keringő mennyisége, a Pim1-expressziót a PAH markereként lehetne felhasználni. 24,25 Ezért megmértük a Pim1-mRNS mennyiségét emberi buffy coat (a vér centrifugálása során nyert, fehérvérsejtekben és vérlemezkékben gazdag határréteg) mintákban, amelyeket egészséges donoroktól, idiopathiás PAH-ban szenvedő betegektől, csak sclerodermában szenvedő betegektől, illetve sclerodermához kapcsolódó PAH-ban szenvedő betegektől (on-line Melléklet I. táblázat) vettünk. Amint azt a tüdőszövetminták és a pulmonalis artéria simaizomsejtjeinek esetében is láttuk, a Pim1 expressziója szignifikáns mértékben emelkedett volt a sclerodermához asszociált és nem asszociált PAH-ban szenvedő betegek buffy coat mintáiban (on-line Melléklet I. ábra B része). Ahogyan a tüdőszövetminták esetében is megfigyelhető

circulation_2011_02_5tord-imp:circulation 11/18/11 2:19 PM Page 174 174 Circulation Magyar Kiadás 2011. június szeptember A STAT3 aktivációja fokozott emberi PAH-ban Az ép distalis pulmonalis artériákban észlelt PY705-STAT3/DAPI kolokalizációt mutató sejtek százalékos aránya A PY705-STAT3/DAPI kolokalizációt mutató pulmonalisartéria-simaizomsejtek százalékos aránya A simaizomaktinra normalizált PY705-STAT3/STAT3 arány a pulmonalisartéria-simaizomsejtekben n=8 beteg minden csoportban 15 pulmonalis artéria betegenként Kontroll PAH Pulmonalisartériasimaizomsejtek n=5 kontroll n=3 PAH Kontroll PAH PY705-SAT3 (86 kda) STAT3 (86 kda) simaizomaktin (43 KDa) A Pim1 expressziója fokozott az emberi PAH-ban, és korrelál a PAH súlyosságával Kontroll PAH Szorzószám a kontrollhoz képest Pulmonalisartériasimaizomsejtek n=5 kontroll n=3 PAH Kontroll PAH Pim1-mRNS-szint (2 Ct 18S) az egész tüdôkben Pim1-mRNS-szint (2 Ct 18S) a pulmonalisartériasimaizomsejtekben Pim1/simaizomaktin arány a pulmonalisartéria-simaizomsejtekben Az egész tüdôben mért Pim1-mRNS-szint korrelál a pulmonalis érellenállással n=8 Kontroll PAH Pim1 (33 44 kda) simaizomaktin (43 KDa) Kontroll PAH Szorzószám a kontrollhoz képest Pulmonalisartéria -simaizomsejtek n=5 kontroll n=3 PAH Kontroll PAH Kontroll Pulmonalis érellenállás 926 Pulmonalis érellenállás 980 Pulmonalis érellenállás 1709 Pulmonalis érellenállás 2274 A STAT3 aktiválódása PAH-ra jellemzô pulmonalisartéria-simaizomsejtekben fokozza a Pim1 expresszióját Pim1-mRNS-szint (2 Ct 18S) a pulmonalisartéria-simaizomsejtekben kontroll +ET1 +Angll +PDGF +TNFα A simaizomaktinra normalizált PY705-STAT3/STAT3 arány Pulmonalisartéria -simaizomsejtek n=5 kontroll n=3 PAH Kontroll PAH Kontroll sirns PAH sistat3 PY705-SAT3 (86 kda) STAT3 (86 kda) Pim1 (33 44 kda) simaizomaktin (43 KDa) Szorzószám a kontrollhoz képest n=5 1 kontroll 2 kontroll+et1 3 kontroll+angll 4 kontroll+pdgf 5 kontroll+tnf 1. ábra. A transzkripciós jelátvivô és aktivátor-3 (signal transducers and activators of transcription-3, STAT3)/Pim1 tengely aktiválódik emberi pulmonalis artériás hypertoniában (PAH). A: A STAT3-aktiváció, amelyet a PY705-STAT3 sejtmagon belüli elhelyezkedése alapján mértünk, szignifikáns mértékben emelkedett PAH-ban szenvedô betegekbôl izolált ép pulmonalis artériákban és pulmonalis artéria simaizomsejtjeiben a kontrollhoz képest. Ezt az eredményt immunoblot vizsgálatokkal is megerôsítettük, amelyek során a PAH-ra jellemzô pulmonalisartériasimaizomsejtekben a kontrollhoz képest 2,8-szeres emelkedést észleltünk a PY705-STAT3/STAT3 arányban. B: A kvantitatív reverz transzkripció-polimeráz láncreakcióval (quantitative reverse-transcription polymerase chain reaction, qrt-pcr) meghatározott Pim1-mRNSmennyiség szignifikánsan emelkedett PAH-ban szenvedô betegekbôl izolált tüdôszövetekben és a pulmonalis artéria simaizomsejtjeiben a kontrollbetegekhez képest. Ezt az eredményt izolált pulmonalis artéria simaizomsejtjein végzett immunoblot vizsgálatokkal is megerôsítettük. Végezetül, a Pim1-mRNS-ek tüdôben mért mennyisége korrelál a PAH-nak a pulmonalis érellenállás (pulmonary vascular resistance, PVR) alapján meghatározott súlyosságával. C: A sistat3-mal kezelt PAH-ra jellemzô pulmonalisartéria-simaizomsejtekben szignifikáns mértékben csökkent a Pim1-expresszió (qrt-pcr) a kontroll ( scrambled ) sirns-sel kezelt sejtekhez képest. Az endothelin-1-gyel (ET1; 10 nmol/l), az angiotenzin-ii-vel (AngII; 200 nmol/l), a vérlemezke-eredetû növekedési faktorral (PDGF; 30 ng/ml) és a tumornekrózis-faktorral (TNF; 100 ng/ml) kezelt egészséges pulmonalisartéria-simaizomsejtekben megnôtt a PY705-STAT3/STAT3 arány, párhuzamosan a Pim1-expresszió arányos növekedésével, amelyet immunoblot vizsgálatokkal határoztunk meg (p<0,05 vs. kontrollcsoport). volt, a Pim1-mRNS mennyisége a buffy coat-mintákban korrelált a PAH súlyosságával, amelyet mind az átlagos pulmonalis artériás nyomás, mind a pulmonalis vascularis rezisztencia alapján értékeltünk (on-line Melléklet I. ábra B része). Ezen eredmények megerősítik, hogy a Pim1 szerepet játszik a PAH kialakulásában, és arra utalnak, hogy a Pim1 a betegség jó biomarkere lehet. Az STAT3 aktiválódása PAH-ra jellemző humán pulmonalis artéria simaizomsejtjeiben a Pim1 expresszióját eredményezi Ahhoz, hogy megvizsgáljuk, van-e szerepe a STAT3-nak a Pim1 szabályozásában PAH fennállása esetén, megmértük a Pim1-mRNS mennyiségét PAH-ra jellemző és a kontroll pulmonalis artéria simaizomsejtjeiben, STAT3-siRNS (sistat3) jelenlétében és annak hiányában. A kontroll-sirns-hez ( scrambled sirns; olyan sirns, amely semmilyen ismert mrns-szekvenciával nem mutat homológiát) viszonyítva a sistat3 szignifikáns mértékben csökkentette a Pim1 expresszióját a PAH-ra jellemző pulmonalis artéria simaizomsejtjeiben (1. ábra C része), ami arra utal, hogy a STAT3 aktivációja szabályozza a Pim1-expressziót a PAH-ra jellemző pulmonalisartéria-simaizomsejtekben. Hogy megerősítsük ezt az eredményt, egészséges pulmonalisartéria-simaizomsejteket kezeltünk 48 órán át olyan anyagokkal, amelyekről ismert, hogy aktiválják a STAT3-at, és PAH fennállása esetén mennyiségük emelkedett, 10 12 mint például az endothelin-1, az angiotenzin II, a vérlemezke-eredetű növekedési faktor és a tumornekrózis-faktor. Amint vártuk, ezek az anyagok megnövelték a STAT3 immunoblot eljárással (PY705-STAT3/ STAT3 arány) mért aktivációját, az endothelin-1 esetében 2,8-szeresre, az angiotenzin-ii esetében 3,2-szeresre, a vérlemezke-eredetű növekedési faktor esetében 2,5-szeresre, a tumornekrózis-faktor esetében 1,9-szeresre; ez pedig fokozta a Pim1 expresszióját (1. ábra C része). Annak érdekében, hogy meghatározzuk, hogy a STAT3 közvetlenül kötődik-e a Pim1- génhez és aktiválja transzkripcióját, egy in silico analízist végeztünk az ENCODE konzorcium adatbázisának felhasználásával. 26 Ez az analízis több STAT-kötő hely jelenlétét mutatta ki a Pim1-gén 3 végén, amelyek számos faj között megőr-

circulation_2011_02_5tord-imp:circulation 11/18/11 2:19 PM Page 175 Paulin és mtsai A transzkripciós jelátvivő és aktivátor-3/pim1 tengely 175 A Pim1 gátlása csökkenti a sejtosztódást és fokozza az apoptózist a PAH-ra jellemzô pulmonalisartéria-simaizomsejtekben Az osztódó pulmonalisartéria-simaizomsejtek százalékos aránya (PCNA) Az apoptotikus pulmonalisartériasimaizomsejtek százalékos aránya (TUNEL) n=50 100 pulmonalisartériasimaizomsejt betegenként három, PAH-ban szenvedô betegbôl és öt kontrollalanyból Kontroll PAH PAH+Kontroll-siRNS PAHsiSTAT3 PAH+siPim1 PAH+STAT3Neg Pep PAH+STAT3 Inh Pep A Pim1 gátlása depolarizálja a mitokondriális membránpotenciált (ΔΨm) a PAH-ra jellemzô pulmonalisartéria-simaizomsejtekben TMRM-intenzitás n=50 100 pulmonalisartéria-simaizomsejt betegenként három, PAH-ban szenvedô betegbôl és öt kontrollalanyból Kontroll PAH PAH+KontrollsiRNS PAH+siPim1 F. U F. U Kontroll PAH PAH+Kontroll-siRNS PAH+siPim1 Kontroll+Ad-GFP Kontroll+Ad-GFP-WT Pim1 A Pim1 gátlása csökkenti a Bad proapoptotikus faktor foszforilációját a PAH-ra jellemzô pulmonalisartéria-simaizomsejtekben PS112-Bad (23 KDa) Bad (23 KDa) SM Actin (43 KDa) PAH+ kontrollsirns PAH +sipim1 A simaizomaktinra normalizált PS112-Bad/Bad arány n=3 Szorzószám a kontrollhoz képest PAH+ kontroll-sirns PAH +sipim1 Bad (zöld) Mitotracker (vörös) Fuzionált (60X) Bad/mitotracker kolokalizáció PS112-Bad (23 KDa) Bad (23 KDa) SM Actin (43 KDa) Kontroll+ Ad-GFP Kontroll+ Ad-GFP WT Pim1 A simaizomaktinra normalizált PS112-Bad/Bad arány n=5 Szorzószám a kontrollhoz képest 2. ábra. A Pim1 szerepet játszik a pulmonalisartéria-simaizomsejtek (PASCM) proliferációjának és apoptózisának szabályozásában. A: A pulmonalis artériás hypertoniára (PAH) jellemzô pulmonalisartéria-simaizomsejtek proliferációja (osztódó sejt sejtmagantigén- [pcna-] pozitivitás százalékos aránya) fokozott, apoptózisa (a TUNEL-próba- [terminális dezoxinukleotid-transzferáz-mediált dutp láncvég jelölés] pozitivitás százalékos aránya) pedig csökkent volt az egészséges pulmonalisartéria-simaizomsejtekhez képest. A transzkripciós jelátvivô és aktivátor-3, valamint a Pim1 gátlása is szignifikánsan csökkentette a PAH-ra jellemzô pulmonalisartéria-simaizomsejtek proliferációját és fokozta apoptózisukat. B: A Pim1 gátlása a PAH-ra jellemzô pulmonalis artéria simaizomsejtjeiben visszafordítja a mitokondriális membránpotenciál (ΔΨm) hiperpolarizációját (tetrametilrodamin-metilészter [TMRM]), míg a Pim1 aktiválása egészséges pulmonalisartéria-simaizomsejtekben a Pim1-et expresszáló adenovírussal kiváltja a hiperpolarizációt. C: A Pim1 gátlása a PAH-ra jellemzô pulmonalisartéria-simaizomsejtekben csökkenti a PS112-Bad/Bad arányt, lehetôvé téve a Bad transzlokációját a mitokondriumokba (a zöld színnel jelzett Bad és a vörös színnel [mitotracker red] jelzett mitokondriumok megnövekedett, sárga színben látható kolokalizációja). ződtek (on-line Melléklet II. ábra A része). A STAT3-nak a Pim1-gén 3 végén történő közvetlen kötődését kromatin-immunprecipitációt és PCR-t alkalmazó kísérletek elvégzésével mutattuk ki. A VEGF-gént (amelyről igazolták, hogy tartalmaz STAT3-kötő helyeket 13 ) alkalmaztuk pozitív kontrollként, az OR8J1 gént pedig (amelyben nincsenek STAT3-kötő helyek 13 ) negatív kontrollként. Amint az in silico vizsgálat alapján vártuk, a STAT3 közvetlenül kötődött a Pim1-hez, ugyanakkor az OR8J1-hez történő kötődést nem észleltünk. A pozitív kontrollként alkalmazott VEGF alapján a STAT3 és a Pim1 közötti kölcsönhatás (amely nagyobb kötődési jellel ábrázolódott) erősnek mondható (on-line Melléklet II. ábra B része). A Pim1 többi feltételezett aktivátora közül a STAT1- ről, a STAT5-ről 8 és az Akt-ról 27,28 nem igazolódott, hogy aktiválódnak a PAH-ra jellemző pulmonalis artéria simaizomsejtjeiben (on-line Melléklet III. ábra A része). A fentiek alapján feltehetően a STAT3 felelős a Pim1 aktiválásáért PAH-ban. A Pim1 fokozza a PAH-ra jellemző pulmonalis artéria simaizomsejtjeinek proliferációját és rezisztenciájukat a mitokondriumfüggő apoptózissal szemben PAH-ra jellemző pulmonalisartéria-simaizomsejteket kezeltünk Pim1, illetve STAT3-siRNS-ekkel és negatív kontrollsirns-ekkel, illetve STAT3-gátló peptiddel (50 µmol/l) és ennek negatív kontrolljával. Az egészséges pulmonalisartéria-simaizomsejtekkel összehasonlítva a PAH-ra jellemző pulmonalisartéria-simaizomsejtek nagyobb proliferációs rátája (az osztódó sejt sejtmagantigénre pozitív sejtek nagyobb aránya) volt kimutatható, és utóbbiak rezisztensek voltak az éhezés kiváltotta (0,1%-os FBS [fetal bovine serum = szarvasmarha magzati szérum]) apoptózissal szemben (a TUNEL [Terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dutp Nick End Labeling = terminális dezoxinukleotid-transzferáz mediálta dutp láncvég jelölés] -próba pozitív sejtek csökkent aránya; 2. ábra A része). A STAT3-gátláshoz (sirns és gátló peptid) hasonlóan a Pim1 gátlása (sirns) éheztetett PAH-ra jellemző pulmonalisartéria-simaizomsejtekben 8,2- szeresre növelte az apoptózist, míg a sejtosztódást (10%-os FBS-oldatban) 0,417 részére csökkentette (2,4-szeres csökkenés) (2. ábra A része). A fenti eredményeket megerősítettük 48 órán át vérlemezke-eredetű növekedési faktorral (30 ng/ml), illetve endothelin-1-gyel (10 nmol/l; on-line Melléklet IV. ábra A része) stimulált egészséges pulmonalisartériasimaizomsejtek felhasználásával (mindkét anyag ismert proproliferatív faktor). 29 31 A Pim1 szerepet játszik a mitokondriális membránpoten - ciál (ΔΨm) szabályozásában; 32,33 ennek alapján az apoptózis

circulation_2011_02_5tord-imp:circulation 11/18/11 2:19 PM Page 176 176 Circulation Magyar Kiadás 2011. június szeptember A STAT3/Pim1-tengely fokozza az NFATc2 expresszióját és aktivációját a PAH-ra jellemzô pulmonalisartéria-simaizomsejtekben (n=3 beteg) NFATc2 mrns (2 ΔΔCt 18S) Pulmonalisartériasimaizomsejtek n=5 kontroll n=3 PAH Kontroll PAH PAH+kontroll-siRNS PAH+siSTAT3 PAH+siPim1 Az aktivitásnövekedés szorzószáma A fehérjekoncentrációra standardizált NFATc2-aktiváció Pulmonalisartéria-simaizomsejtek n=5 kontroll n=3 PAH Kontroll PAH PAH+Q PAH+kontroll-siRNS PAH+siPim1 PAH+Ad-GFP PAH+Ad-GFP-DNPim1 Kontroll+Ad-GFP Kontroll+Ad-GFP-WT Pim1 A Pim1-gátlás csökkenti az intracelluláriskalcium-koncentrációt ([Ca 2+ ] i ) a PAH-ra jellemzô pulmonalisartéria-simaizomsejtekben (n=3 beteg) [Ca 2+ ] i FLUO3-intenzitás (40X) n=50 100 pulmonalisartériasimaizomsejt betegenként három, PAH-ban szenvedô betegbôl és öt kontrollalanyból Kontroll PAH PAH+ kontroll-sirns PAH+ sipim1 Kontroll PAH PAH+kontroll-siRNS PAH+siSTAT3 PAH+siPim1 PAH+siSTAT3 Neg Pep PAP+siSTAT3 Inh Pep A Pim1-gátlás csökkenti a Bcl-2-expressziót a PAH-ra jellemzô pulmonalisartéria-simaizomsejtekben Bcl-2 (zöld) DAPI (kék) (60X) Kontroll PAH PAH+ kontroll-sirns PAH+ sipim1 n=50 100 pulmonalisartériasimaizomsejt betegenként három, PAH-ban szenvedô betegbôl és öt kontrollalanyból Kontroll PAH PAH+kontroll-siRNS PAH+siPim1 3. ábra. A transzkripciós jelátvivô és aktivátor-3 (signal transducers and activators of transcription-3, STAT3)/Pim1-tengely felelôs az aktivált T-sejt nukleáris faktora-c2 (NFATc2) expressziójáért és aktiválásáért pulmonalis artériás hypertoniára (PAH) jellemzô pulmonalisartériasimaizomsejtekben (PASMCs). A: Az NFATc2 expressziója emelkedett a PAH-ra jellemzô pulmonalisartéria-simaizomsejtekben a kontroll pulmonalisartéria-simaizomsejtekhez képest. A STAT3 gátlása csökkenti az NFATc2-expressziót, míg a Pim1 gátlásának nincs hatása. Az NFATc2 aktivációja (luciferázteszt) emelkedett a PAH-ra jellemzô pulmonalisartéria-simaizomsejtekben a kontroll pulmonalisartériasimaizomsejtekhez képest. A Pim1 gátlása csökkenti az NFAT-aktivációt, míg a Pim1 fokozott expressziójának kiváltása kontroll pulmonalisartéria-simaizomsejtekben elôsegíti azt. B: A Pim1 gátlása a PAH-ra jellemzô pulmonalisartéria-simaizomsejtekben csökkenti az intracelluláriskalcium-koncentrációt ([Ca 2+ ]i) (FLUO3) és a Bcl-2-expressziót (immunfluoreszcencia) (C). Pim1-gátlást követő fokozódása a mitokondriumfüggő apoptózis aktiválódásának következménye lehet. Mivel a mitokondriális átmeneti pórus feszültségfüggő, 34 a ΔΨm depolarizációja a mitokondriumfüggő apoptózis kezdetének jelzője, az apoptózis pedig a csökkent ΔΨm következménye. Tetrametilrodamin-metilészter felhasználásával megmértük a ΔΨm-et Pim1-siRNS-sel transzfektált PAH-ra jellemző pulmonalis artéria simaizomsejtjeiben, illetve egy Pim1-gént hordozó adenovírussal (Ad-GFP [green fluorescent protein = zöld fluoreszcens fehérje] Pim1-WT) megfertőzött kontroll pulmonalis artéria simaizomsejtjeiben. A PAH-ra jellemző pulmonalisartéria-simaizomsejtek Pim1-siRNS-sel történő transzfekciója szignifikáns mértékű ΔΨm-depolarizációt okozott a kontroll-sirns-sel történő kezeléshez képest. Ezzel szemben a kontrollként szolgáló pulmonalisartéria-simaizomsejtek Pim1-gént hordozó adenovírussal történő megfertőzése szignifikáns mértékű hiperpolarizációt eredményezett az Ad-GFP-vel (Pim1-gént nem hordozó adenovírussal) történő kezeléshez képest (2. ábra B része). Ezek az adatok megerősítik, hogy a Pim1 szerepet játszik a ΔΨm szabályozásában a PAH-ra jellemző pulmonalis artéria simaizomsejtjeiben, és így a mitokondriumfüggő apoptózisban. Hasonló eredményekre jutottunk a STAT3-gátló peptid felhasználásával is (on-line Melléklet IV. ábra B része). Megjegyzendő, hogy a Pim1-gátlásnak nincs hatása a kontroll pulmonalis artéria simaizomsejtjeire (nem ábrázolt adat). Korábbi vizsgálatok során kimutatták, hogy a Pim1 gátolja a Bad proapoptotikus fehérjét (emelkedett P-Bad) azáltal, hogy csökkenti a mitokondriumokba történő transzlokációját, ez pedig a ΔΨm hiperpolarizációjához vezet. 35 A Pim1 gátlása PAH-ra jellemző pulmonalisartéria-simaizomsejtekben csökkenti a P-Bad/összes Bad arányt (2. ábra C része), ezáltal elősegíti a Bad (zöld szín) mitokondriumokba (vörös mitotrackerfestékkel jelölve) történő transzlokációját (fokozott kolokalizáció sárga színben). A Pim1-gént hordozó adenovírussal megfertőzött kontroll pulmonalis artéria simaizomsejtjeiben ellentétes hatást észleltünk (2. ábra C része). Ezek az eredmények megerősítik, hogy a Pim1 szerepet játszik a mitokondriumfüggő apoptózissal szembeni rezisztencia kialakulásában a PAH-ra jellemző pulmonalisartéria-simaizomsejtekben. A STAT3 szabályozza a Pim1 és az NFATc2 expresszióját és a Pim1 szabályozza az NFATc2 aktivációját a PAH-ra jellemző pulmonalis artéria simaizomsejtjeiben Korábban kimutattuk, hogy a PAH-ra jellemző pulmonalis artéria simaizomsejtjeiben észlelt proproliferatív és antiapoptotikus fenotípus fenntartása részben az NFATc2 transzkripciós faktor aktiválódásának tulajdonítható. PAH-ban az NFATc2 aktiválódása fontos káliumcsatornák, mint például a Kv1.5 downregulációjához vezet, amely a pulmonalis artéria sima-

circulation_2011_02_5tord-imp:circulation 11/18/11 2:19 PM Page 177 Paulin és mtsai A transzkripciós jelátvivő és aktivátor-3/pim1 tengely 177 A Pim1 expressziója fokozódik a PAH kialakulása során a monokrotalinnal injektált patkányokban. Pim1-mRNS-szint (2 ΔΔCt -18S) a distalis pulmonalis artériákban A STAT3/Pim1-tengely aktiválódása kiváltja az NFATc2 expresszióját és aktiválódását a monokrotalinnal injektált patkányokban. Az ép distalis pulmonalis artériákban észlelt PY705- STAT3/DAPI kolokalizációt mutató sejtek százalékos aránya n=5 8 patkány minden csoportban 15 pulmonalis artéria patkányonként A monokrotalininjekciót követôen eltelt idô (hetek) A monokrotalininjekciót követôen eltelt idô (hetek) NFATc2-mRNS-szint a distalis pulmonalis artériákban (2 ΔΔCt -18S) n=5 8 patkány minden csoportban A monokrotalininjekciót követôen eltelt idô (hetek) Átlagos pulmonalis artériás nyomás (Hgmm) A monokrotalininjekciót követôen eltelt idô (hetek) Az ép distalis pulmonalis artériákban észlelt NFATc2/DAPI kolokalizációt mutató sejtek százalékos aránya n=5 8 patkány minden csoportban Átlagos pulmonalis artériás nyomás (Hgmm) Pim1-mRNS-szint (2 ΔΔCt -18S) a distalis pulmonalis artériákban Átlagos pulmonalis artériás nyomás (Hgmm) n=5 8 minden csoportban A distalis pulmonalis artériák médiafal-vastagsága, % (hematoxilin-eozin festés) n=5 8 patkány minden csoportban 15 pulmonalis artéria patkányonként Átlagos pulmonalis artériás nyomás (Hgmm) 4. ábra. A Pim1 expressziója fokozott a pulmonalis artériás hypertonia (PAH) monokrotalinnal (MCT) injektált patkányokban létrehozott modelljében. A: A súlyos PAH-ban szenvedô (a monokrotalininjekciót követô 21. nap utáni) patkányok pulmonalis artériáiban nagyfokú Pim1-mRNS-expressziót észleltünk. Ezzel ellentétben mérsékelten súlyos PAH-ban csak kismértékû expresszió volt kimutatható, korai PAH-ban szenvedô patkányokban pedig nem volt észlelhetô expresszió. Továbbá, a Pim1-expresszió korrelál a PAH átlagos pulmonalis artériás nyomás alapján meghatározott súlyosságával. B: A transzkripciós jelátvivô és aktivátor-3 (STAT3) aktiválódása (a PY705 STAT3 sejtmagba történô transzlokációja) megelôzi a Pim1 expresszióját (kvantitatív reverz transzkripció-polimeráz láncreakció [qrt-pcr]) és az aktivált T-sejt nukleáris faktora-c2 (NFATc2) expresszióját (qrt-pcr) és aktivációját (sejtmagba történô transzlokáció), amely a pulmonalis artériafal remodellációjának fokozódásával (hematoxilineozin festés) és a pulmonalis artériás nyomás emelkedésével párhuzamosan volt kimutatható. izomsejtjeinek depolarizációját, az intracelluláris kalciumkoncentráció emelkedését és a pulmonalisartéria-simaizomsejtek proliferációjának fokozódását eredményezi. 4,5,36 Az NFATc2 aktiválódása a Bcl-2 upregulációját is kiváltja, amely a mitokondriumok hiperpolarizációjához és az apoptózis gátlásához vezet. 4,5,36 A Pim1 az NFATc2 aktivátora, így a Pim1-függő NFAT-aktiválódásnak szerepe lehet a PAH kialakulásában. Az NFATc2 expressziója (qrt-pcr) és aktivációja (luciferázteszt) fokozott a PAH-ra jellemző pulmonalis artéria simaizomsejtjeiben a kontroll pulmonalisartéria-simaizomsejtekhez viszonyítva (3. ábra A része). Az sistat3-mal kezelt PAH-ra jellemző pulmonalisartéria-simaizomsejtekben az NFATc2 mrns-ek mennyisége és az NFATc2 aktivációja is szignifikáns mértékben csökkent (3. ábra A része), míg az si- Pim1-gyel kezelt sejtekben csak az NFATc2-aktiváció szintje csökkent (hasonló mértékben, mint az sistat3-kezelés esetében), az NFATc2-mRNS-ek mennyisége nem (3. ábra A része). Ez utóbbi eredményt megerősítette az NFATc2 sejtmagba történő transzlokációjának vizsgálata is. Ahogy az ábrán látható, a Pim1 gátlása szignifikáns mértékben csökkentette a DAPIval (kék szín) kolokalizálódó NFATc2 (zöld szín) mennyiségét, csökkentve a sárga festődést (on-line Melléklet V. ábra). Ezen eredmények összessége alapján arra következtethetünk, hogy a STAT3 aktivációja felelős az NFATc2 expressziójáért, míg a Pim1 csak az NFATc2 aktiválásához szükséges a PAHra jellemző pulmonalis artéria simaizomsejtjeiben. Ezeket az eredményeket megerősítettük a Pim1-gátló kvercetagetin 37 és a Pim1 domináns-negatív adenovírus felhasználásával (3. ábra A része). A kvercetagetin utánozza a Pim1-siRNS hatását (csökkenti az NFAT-aktivációt) a PAH-ra jellemző pulmonalis artéria simaizomsejtjeiben, míg a Pim1-gént hordozó adenovírus által kiváltott túlzott Pim1-expresszió fokozta az NFAT-aktivációt a kontroll pulmonalisartéria-simaizomsejtekben (3. ábra A része). Végül további bizonyítékot szolgáltattunk arra, hogy a STAT3/Pim1-függő NFAT-aktiváció a PAH-ra jellemző pulmonalisartéria-simaizomsejtekben hozzájárul a proproliferatív és antiapoptotikus fenotípus kialakulásához azáltal, hogy növeli az intracelluláris kalciumkoncentrációt (3. ábra B része) amely egy jól ismert proproliferatív faktor és a Bcl-2 antiapoptotikus faktor szintjét az egészséges pulmonalisartéria-simaizomsejtekhez képest (3. ábra C része). Megjegyzendő, hogy a Pim1-gátlásnak nincs hatása az intracelluláris kalciumkoncentrációra a kontroll pulmonalis artéria simaizomsejtjeiben (nem ábrázolt adat). A STAT3/Pim1/NFATc2-tengely aktivitása fokozott a PAH patkánykísérletes modelljeiben A Pim1-expresszió mértékét kvantitatíve meghatároztuk (qrt-pcr-t, immunoblot eljárást és immunfluoreszcenciát alkalmazva) monokrotalinnal (MCT) injektált patkányokból (a PAH elfogadott modellje) izolált tüdőszövetekben és pulmonalis artériákban. 5 A súlyos PAH-ban szenvedő (a monokrotalininjekciót követő 21. nap utáni) patkányok pulmonalis artériáiban fokozott Pim1-expressziót észleltünk. Ezzel ellentétben a részben remodellált pulmonalis artériákban csak kismértékű expresszió volt kimutatható, a nem remodellált pulmonalis artériákban pedig nem volt észlelhető expresszió azokban a patkányokban, amelyek enyhe, korai PAH-ban szenvedtek (a monokrotalininjekciót követő 1 12. nap; 4. ábra A része, illetve on-line Melléklet VI. ábra A és C része). Az emberben megfigyeltekhez hasonlóan, a Pim1-expresszió a pulmonalis artéria simaizomsejtjeire korlátozódik (nagyobb mértékű kolokalizáció a zöld színű Pim1 és a vörös színű simaizomaktin között [on-line Melléklet VI. ábra A része], mint a Pim1 és a VE-kadherin endothelsejtmarker között [on-line Melléklet VI. ábra B része]), és korrelál a PAH súlyosságával (4. ábra A része). Ezenkívül megmértük a Pim1-mRNS menynyiségét kontrollpatkányokból (átlagos pulmonalis artériás nyomás <15 Hgmm), enyhe PAH-ban szenvedő patkányokból (átlagos pulmonalis artériás nyomás <30 Hgmm) és súlyos PAH-ban szenvedő patkányokból (átlagos pulmonalis artériás nyomás >30 Hgmm) izolált buffy coat-mintákból. Ahogy a distalis pulmonalis artériák esetében is megfigyelhető volt, a buffy coat-mintákban mért Pim1-mRNS mennyisége korrelált a PAH súlyosságával (on-line Melléklet VII. ábra A része). Ezen eredmények megerősítik, hogy a Pim1 szerepet

circulation_2011_02_5tord-imp:circulation 11/18/11 2:20 PM Page 178 178 Circulation Magyar Kiadás 2011. június szeptember A Pim1-gátlás visszafordítja a monokrotalinindukált PAH-t Mean PA pressure (mmhg) = Átlagos pulmonalis artériás nyomás (Hgmm) Jobbkamra-hipertrófia (jobb kamra/bal kamrai septum arány) Terheléses kapacitás (m) Distalis pulmonalisartéria-remodelláció, hematoxilin-eozin festés (120X) Monokrotalinin Monokrotalinin Monokrotalinin Kontroll dukált PAH dukált PAH dukált PAH kontroll-sirns sipim1 A Pim1-gátlás csökkenti az NFATc2-aktivációt és a sejtosztódást, és fokozza az apoptózist a distalis pulmonalis artériákban monokrotalinindukált PAH-ban DIC DAPI (kék) Pim1 (vörös) NFATc2 (zöld) Fuzionált (120X) Pim1/NFATc2 kolokalizáció DAPI/NFATc2 kolokalizáció Kontroll Monokrotalin - indukált PAH Monokrotalin - indukált PAH kontrollsirns Monokrotalin - indukált PAH sipim1 A distalis pulmonalis artériákban észlelt NFATc2/DAPI kolokalizációt mutató sejtek százalékos aránya n=5 8 minden csoportban Kontroll Monokrotalinindukált PAH Monokrotalinindukált PAH kontroll-sirns Monokrotalinindukált PAH sipim1 n=5 8 minden csoportban Kontroll Monokrotalinindukált PAH Monokrotalinindukált PAH kontroll-sirns Monokrotalinindukált PAH sipim1 Distalis mediafalvastagság, % (hematoxilin-eozin festés) A distalis A distalis pulmonalis pulmonalis artériákban artériákban észlelt osztódó észlelt sejtek százalékos apoptotikus aránya (PCNA) sejtek százalékos aránya (TUNEL) 5. ábra. A Pim1-gátlás visszafordítja a monokrotalin- (MCT-) indukált pulmonalis artériás hypertoniát (PAH). A: A 18 nappal a monokrotalininjekciót követôen alkalmazott Pim1-gátlás (1 nmol egyszeri porlasztással történô bevitele) csökkentette az átlagos pulmonalis artériás nyomást és a jobbkamrahipertrófiát, növelte a terhelési kapacitást, és csökkentette a distalis pulmonalis artériák falvastagságát. B: Az in vitro vizsgálatokhoz hasonlóan ezeket a hatásokat az aktivált T-sejt nukleáris faktora-c2 (NFATc2) Pim1-függô aktivációjának gátlása közvetítette, amelyet a Pim1/NFATc2 (sárga szín) és az NFATc2/DAPI (lila szín) kolokalizáció csökkenése mutatott, és a pulmonalisartéria-simaizomsejtek proliferációjának (osztódó sejt sejtmagantigén- [PCNA-] pozitivitás százalékos aránya) csökkenéséhez és apoptózisának (a TUNELpróba [terminális dezoxinukleotid-transzferázmediált dutp-láncvég-jelölés] pozitivitás százalékos aránya) fokozódásához vezetett. ját szik a PAH kialakulásában, és arra utalnak, hogy a Pim1 a betegség jó biomarkere lehet. Végül, az a tény, hogy a Pim1-expresszió alacsony egyéb szövetekben, mint például az aortában, a vesében és a májban (on-line Melléklet VII. ábra B része), a Pim1-et ígéretes terápiás célponttá teszi a PAH kezelésében. Hogy még részletesebben tanulmányozhassuk a STAT3/Pim1/NFAT-tengely aktiválódásának szerepét a PAH progressziójában, a patkányokat elaltattuk a szubkután monokrotalininjekciót követő különböző időpontokban. Megmértük a pulmonalis artériás nyomást és a pulmonalis artériák falvastagságát (hematoxilin-eozinfestést alkalmazva). A STAT3-aktiváció (a P-STAT3 sejtmagba történő transzlokációja [4. ábra B része] és az immunoblot eljárással kimutatott P-STAT3/STAT3 arány [on-line Melléklet VI. ábra C része]) a monokrotalininjekciót követő első és második hét között fokozódott, megelőzve a Pim1-expressziót és az NFAT-aktivációt (qrt-pcr és az NFATc2 sejtmagba történő transzlokációja [4. ábra B és C része], illetve immunoblot vizsgálatok [on-line Melléklet VI. ábra C része]), amelyek a monokrotalininjekciót követő második és harmadik hét között nőttek meg, párhuzamosan a pulmonalis artériák falának fokozódó remodellációjával és a pulmonalis artériás nyomás emelkedésével (4. ábra A és B része). Bár ezek az eredmények nem mutatnak ki közvetlen ok-okozati összefüggést a STAT3 és a Pim1/NFAT aktiválódása között, megerősítik, hogy a STAT3/Piml/NFATc2-tengely szerepet játszik a PAH kialakulásában. Ezek az eredmények megerősítik, hogy a Pim1 STAT3-függő aktiválódása szerepet játszik a PAH kialakulásában. A Pim1-gátlás visszafordítja a monokrotalinindukált PAH-t Pim1-siRNS-t (1 nmol) juttattunk szelektíven intratrachealis porlasztás útján monokrotalinindukált PAH-ban szenvedő patkányok tüdejébe 18 nappal a monokrotalininjekciót követően (amikor a Pim1 endogén expressziója a legmagasabb). Hogy kimutassuk a kezelés szöveti megoszlását, egy GFP-t hordozó adenovírust juttattunk be porlasztás útján (on-line Melléklet VIII. ábra A része), és több szövetben megmértük a Pim1-gátlás hatását (on-line Melléklet VIII. ábra B része). Mindkét módszer kimutatta, hogy a Pim1 porlasztott sirnssel történő gátlása a pulmonalis artériákban nyilvánul meg, így káros hatása korlátozott. Miután igazoltuk, hogy a Pim1- sirns-sel kezelt, monokrotalinindukált PAH-ban szenvedő egerek pulmonalis artériáiban és tüdejében is csökkent a Pim1-expresszió (qrt-pcr) (on-line Melléklet VIII. ábra B része), nem invazív módszerekkel (Doppler és echokardiográfia) 5 kimutattuk, hogy a Pim1-gátlás megnöveli a pulmonalis kiáramlás akcelerációs idejét, és csökkenti a jobb kamra falvastagságát a kontroll-sirns-sel kezelt, monokrotalinindukált PAH-ban szenvedő egerekhez képest (on-line Melléklet VIII. ábra C része). Ezeket az eredményeket megerősítettük invazív módszerek alkalmazásával is, a pulmonalis arté riás nyomás, a pulmonalis artériafal remodellációja, a jobbkamra-hipertrófia (jobb kamrai/bal kamrai septum) és az általános szívfunkciók (futószőnyegen mért terheléses kapacitás) vizsgálatával (5. ábra A része). Ez az eredmény a Pim1-függő NFATc2-aktiváció szignifikáns csökkenése mellett volt észlelhető, amely a pulmonalis - artéria-simaizomsejtek proliferációjának (osztódó sejt sejtmag-antigén pozitivitás százalékos aránya) és apoptózissal szembeni rezisztenciájának (TUNEL-próba százalékos értéke; 5. ábra B része) csökkenéséhez vezetett. A Pim1-knockout egerek rezisztensek a PAH kialakulásával szemben PAH-t indukáltunk egerekben intravénás monokrotalininjekcióval (5 mg/kg) és 15 napon át fenntartott krónikus hypoxiával (10% O 2 ) a korábban leírtak szerint. 38 Ahogyan patkányokban is, a PAH kialakulását noninvazív és invazív módszerekkel is megállapítottuk. A Pim1-knockout-egerekkel szemben a monokrotalinnal injektált vagy krónikus hypoxiának kitett vad típusú egerekben kialakult a PAH (csökkent pulmonalis kiáramlási akcelerációs idő és fokozott jobbkamra-hipertrófia, pulmonalisartériafal-vastagság, pulmonalis artériás nyomás, illetve mortalitás) anélkül, hogy a szisztémás

circulation_2011_02_5tord-imp:circulation 11/18/11 2:20 PM Page 179 Paulin és mtsai A transzkripciós jelátvivő és aktivátor-3/pim1 tengely 179 A Pim1-knockout-egerek rezisztensek a monokrotalin-pirrollal és a krónikus hypoxiával indukált pulmonalis hypertoniával szemben Átlagos pulmonalis artériás nyomás (Hgmm) Jobbkamra-hipertrófia (jobb kamra/bal kamrai septum arány) Átlagos szisztémás vérnyomás (Hgmm) Átlagos perctérfogat (ml/min) n=5 8 minden csoportban WT Pim1 = Vad típusú Pim1 Vad típusú Pim1+monokrotalin-pirrol Vad típusú Pim1+krónikus hypoxia Pim1-knockout Pim1-knockout+monokrotalin-pirrol Pim1-knockout+krónikus hypoxia Distalis médiafal-vastagság, % (hematoxilin-eozin festés) Hematoxilin-eozin festés (120X) n=5 8 minden csoportban WT Pim1 = Vad típusú Pim1 Vad típusú Pim1+monokrotalin-pirrol Vad típusú Pim1+krónikus hypoxia Pim1-knockout Pim1-knockout+monokrotalin-pirrol Pim1-knockout+krónikus hypoxia A STAT3/Pim1/NFATc2-tengely aktiválódik pulmonalis hypertoniában szenvedô ATc2/DAPI-kolokalizációt mutató sejtek százalékos aránya Az ép distalis pulmonalis artériákban észlelt PY705- STAT3/DAPI-kolokalizációt mutató sejtek százalékos aránya Pim1 mrna level in distel PAs (2 Ct to 185) NFATc2,RNA level in distal PAs (2 Ct to 185) % of cells with NFATc2/DAPI colonization in distal PAs n=5 8 minden csoportban WT Pim1 = Vad típusú Pim1 Vad típusú Pim1+monokrotalin-pirrol Vad típusú Pim1+krónikus hypoxia Pim1-knockout Pim1-knockout+monokrotalin-pirrol Pim1-knockout+krónikus hypoxia 6. ábra. A Pim1-knockout-egerek rezisztensek a monokrotalin-pirrollal (MCTP) és a krónikus hypoxiával indukált pulmonalis artériás hypertoniával (PAH) szemben. A: A Pim1-knockout-egerekhez képest (n=5) a monokrotalinnal kezelt és a krónikus hypoxiának kitett vad típusú egerekben (n=8) kialakult a PAH (megnövekedett pulmonalis artériás nyomás, jobb kamrai/bal kamrai septumarány és pulmonalis artéria falvastagsága), anélkül, hogy a szisztémás vérnyomás és a perctérfogat kórosan megváltozott volna. B: A PAH kialakulása a monokrotalinnal kezelt és a krónikus hypoxiának kitett vad típusú egerekben az aktivált T-sejt nukleáris faktora-c2 (NFATc2) transzkripciós jelátvivô és aktivátor-3 (STAT3)/Pim1-függô aktivációjának következménye. A STAT3 aktivációja (sejtmagba történô transzlokáció mérése) és az NFATc2-mRNS-ek mennyisége (kvantitatív reverz transzkripció-polimeráz láncreakció [qrt-pcr]) is fokozott a monokrotalinnal kezelt és a krónikus hypoxiának kitett vad típusú és Pim1-knockout-egerekben, de a Pim1 hiányában nem voltak képesek kiváltani a PAH-t. vérnyomás és a perctérfogat megváltozott volna (6. ábra A része, illetve on-line Melléklet IX. ábra A és B része). Ahogyan patkányokban is, a PAH kialakulása a monokrotalinnal injektált és a krónikus hypoxiának kitett vad típusú egerekben az NFATc2 STAT3/Pim1-függő aktivációjával járt. Érdekes módon a STAT3 aktivációja és az NFATc2-mRNS-ek mennyisége megemelkedett a monokrotalinnal injektált és a krónikus hypoxiának kitett Pim1-knockout-egerekben is. A Pim1 hiányában viszont jelenlétük nem volt elegendő a PAH kiváltásához. Ez az eredmény azt sugallja, hogy a STAT3-nak a PAH kialakulásában játszott szerepe nagyrészt Pim1-függő, és hogy a STAT3-aktiváció önmagában nem vezet PAH-hoz. A fentiek alapján a Pim1 lehet a STAT3/Pim1 tengely fő terá - piás célpontja. Megbeszélés Vizsgálatunkban megmutattuk, hogy a STAT3/Piml/NFATtengely összefüggésben áll a PAH kialakulásával, és hisszük, hogy új távlatot nyitottunk a PAH kezelésére irányuló kutatásban. A Pim1 expressziója fokozott mind a betegekben észlelt, mind a kísérletileg létrehozott PAH-ban, és a STAT3 aktivációjától függ (3. ábra). Érdekes módon a Pim1 expressziója párhuzamosan változik az NFAT-aktivációval, a pulmonalis artériák remodellációjával és a pulmonalis artériás nyomással, és összefügg a PAH súlyosságával (1. és 4. ábra). A STAT3-mal és az NFAT-vel szemben, amelyek számos szövetben, köztük az egészséges pulmonalis artériákban is konstitutívan kifejeződnek, a Pim1 expressziója csak a PAHra jellemző pulmonalis artéria simaizomsejtjeiben mutatható ki, így ígéretes terápiás célpont lehet PAH-ban. Figyelemreméltó, hogy az endogén Pim1 gátlása szignifikáns mértékben javítja a pulmonalis artériás nyomást, a pulmonalis artériákban észlelhető mediahipertrófiát és a jobb kamrai hipertrófiát anélkül, hogy befolyásolná a szisztémás vérnyomást és a perctérfogatot (5. és 6. ábra). Közvetlen in vitro és in vivo bizonyítékokat szolgáltattunk arra, hogy azok között a mechanizmusok között, amelyek által a Pim1-gátlás visszafordítja a PAH-t, megtalálható a pulmonalisartéria-simaizomsejtek proliferációjának gátlása a remodellált pulmonalis artériákban (5. ábra), illetve a pulmonalisartéria-simaizomsejtek mitokondriumainak depolarizációja, amely a Bad-aktivitás fokozódásának (2. ábra) és a Bcl-2-aktivitás csökkenésének a következménye. Utóbbi két folyamat fokozza az apoptózist. Úgy gondoljuk, hogy ezeket a hatásokat az NFAT Pim1-függő aktivációja tartja fenn. Az NFAT egy transzkripciós faktor, amely a pulmonalisartéria-simaizomsejtek proliferációját és apoptózissal szembeni rezisztenciáját szabályozza. 5 Mivel célunk az volt, hogy új módot találjunk a kialakult PAH visszafordítására, kutatásunk során a pulmonalis artéria simaizomsejtjeire fókuszáltunk, nem pedig az endothelsejtekre, amelyek működése a PAH kialakulásának kezdetén módosul, és a kifejlődött PAH-ban funkciójuk csökkent. Ugyanakkor, mivel korábbi tanulmányokban közölték, hogy a Pim1 szerepet játszik az embrionális őssejtek endothelsejtekké történő differenciálódásában, 25 a Pim1-nek szerepe lehet olyan endothellel kapcsolatos érrendellenességek kialakulásában is, mint például a plexiform laesiók, amelyeket PAH-ban szenvedő betegekben észleltek. 39 Vizsgálatunk alapján arra lehet következtetni, hogy a keringő vazoaktív faktorok, mint például az angiotenzin, az endothelin-1, a vérlemezke-eredetű növekedési faktor vagy a citokinek, amelyek szintje mind a betegekben észlelt, mind a kí-