KISÁLLAT Enteralis vírusfertõzések menhelyi kutyákban Magyarországon 136. 661 670. 2014/11 E. Mihalov-Kovács Sz. Marton E. Fehér Gy.Lengyel F. Jakab T. Tuboly K. Bányai: Enteric viral infections of sheltered dogs in Hungary Mihalov-Kovács Eszter 1*, Marton Szilvia 1, Fehér Enikõ 1, Lengyel György 2, Jakab Ferenc 3, Tuboly Tamás 4, Bányai Krisztián 1 1] MTA ATK ÁOTI H-1143 Budapest, Hungária krt. 21. *e-mail: kovacs.eszter@ agrar.mta.hu 2] Honvéd Egészségügyi Központ, Budapest 3] PTE Szentágothai János Kutatóközpont, Pécs 4] SZIE ÁOTK Járványtani és Mikrobiológiai Tanszék, Budapest Összefoglalás. A szerzõk vizsgálataik során egy északkelet-magyarországi menhely kutyáitól gyûjtött bélsármintákon végeztek szûrõvizsgálatot enteralis vírusok kimutatása céljából. Molekuláris módszerek segítségével (PCR és RT-PCR) kutyában parvovírus, minutevírus, coronavírus, calicivírus, kobuvírus, astrovírus, valamint rotavírus jelenlétét vizsgálták. A pozitív PCR-eredményeket Sanger-féle DNS-szekvenálással erõsítették meg, és a kapott szekvenciaadatokat filogenetikai elemzésnek vetették alá. A különféle vírusok elõfordulási gyakorisága eltérõ volt (pl. calicivírus, 4%, ill. coronavírus, 33%). A minták 25,4%-ban többszörös vírusfertõzést találtak, de életkortól függetlenül gyakori volt a tünetmentes vírusürítés is. Az egyes vírusok genetikai sokféleségének vizsgálata új astrovírus faj, valamint már ismert vírusfajba tartozó szekvenciaváltozatok (pl. heterogén coronavírusok, norovírusok és vesivírusok) jelenlétét igazolta a vizsgált állományban. Tudomásunk szerint hazánkban elõször sikerült molekuláris módszerekkel kimutatni kutyák astro-, kobu-, rota- és calicivírus-fertõzöttségét. Summary. Fecal samples were collected from sheltered dogs in the north-eastern region of Hungary during 2012. Individual PCR and RT-PCR assays were performed to detect the presence of major viral enteric pathogens, as well as less known viruses. The methods were used to detect canine parvovirus, coronavirus, calicivirus, kobuvirus, astrovirus and rotavirus. To confirm the PCR results the amplified genomic regions were sequenced and the obtained data were used for phylogenetic analysis. The prevalence of different viruses showed some variations (e.g., calicivirus, 4%; coronavirus, 33%). Co-infection with multiple viruses was detected in 25% of the samples. Viral shedding was very common in asymptomatic animals. The analysis of the genetic diversity of enteric viruses confirmed the presence of a novel astrovirus and potential new variants of known canine enteric pathogens, such as corona-, noro-, and vesiviruses. To the best of the authors knowledge, they are the first to report the occurrence of astro-, kobu-, rota-, and calicivirus in dogs in Hungary. A kutyák vírusos eredetû enteralis fertõzéseinek fõ tünetei: láz, hasi fájdalom, hasmenés, hányás Világszerte, beleértve hazánkat is, a kutyák az elsõ számú házi kedvencek. A kutyákat érintõ vírusos eredetû enteralis fertõzések fõ tünetei a láz, hasi fájdalom, hasmenés és hányás, amely utóbbiak a fecalis-oralis fertõzési mód miatt elõsegítik a vírusok terjedését (17). Számos vírus szerepe tisztázódott már a kutyák gastrointestinalis megbetegedéseiben, míg mások csak újabban kerültek a figyelem középpontjába (17). A szopornyicavírus (canine distemper virus CDV; Paramyxoviridae család) és a kutyaparvovírus (canine parvovirus-2 CPV-2; Parvoviridae) súlyos, lázzal, hasmenéssel, hányással, ill. CDV esetében idegrendszeri és légúti tünetekkel járó betegséget okoz (1, 10, 15, 19, 20, 21). Mindkét vírus jelenléte régóta ismert hazánkban, rutinszerûen alkalmaznak ellenük védõoltást (29). A CPV-2 okozta betegség elsõsorban a fiatal egyedeket érinti, a CDV a felnõtt állatokat Enteralis vírusfertõzések kutyában 122 661
Az ismertebb parvoés coronavírus mellett astro-, calici-, rota-, és kobuvírusok kimutatását végezték el menhelyi kutyák bélsármintáiból is megbetegíti. Széles körben elterjedt parvovírus a bocavírusok közé sorolt kutya-minute vírus (CPV-1; Parvoviridae). Ez a vírus vemhes állatokban az embrió elhalását, halvaszülést, fejlõdési rendellenességeket és gyenge kölykök születését okozhatja, míg fiatal állatoknál idegrendszeri, légúti és bélrendszeri tüneteket idézhet elõ (18). Az enteralis coronavírus- (CCoV; Coronaviridae) fertõzés általában enyhe tünetekkel (bélgyulladás, hasmenés) jár, súlyosabb lefolyású betegséget fõleg fiatal állatokban és/vagy egyéb vírusokkal való társfertõzéses esetekben (CPV-2, CDV, kutya-adenovírus 1) tapasztalhatunk (7). A kutyák fertõzõ hepatitisét okozó kutya-adenovírus 1 (Canine adenovirus 1, CAdV-1; Adenoviridae) szintén okozhat gastrointestinalis tüneteket (2, 27). Kutyák bélsarából a molekuláris biológiai módszerek fejlõdésével párhuzamosan az elõbb említetteken kívül még számos, különbözõ családba tartozó vírust mutattak ki az elmúlt 15 évben. Ezek többségének oktani szerepe még nem tisztázott, elõfordulásukról gyakran valamelyik ismert kórokozó mellett társfertõzésként számolnak be. Néhány esetben azonban, mint például a kutyarotavírus (CRVA, Reoviridae) (6, 26), kutya-astrovírus (CAstV; Astroviridae) (23, 24) vagy a kutya-calicivírusok (CaCV; Caliciviridae) esetében (17, 22, 25, 28), elektronmikroszkópos felvételek alapján már régóta tudni lehet jelenlétükrõl, és feltételezik kórokozó szerepüket is. Az utóbbi idõkben vírusgenomok konzervatív szakaszaira illeszkedõ, általános primerekre épülõ polimeráz-láncreakció- (PCR-) rendszerek, ill. a random DNS-amplifikációt követõ mélyszekvenálás használatának térhódítása robbanásszerûen bõvítette ismereteinket a kutyák enteralis vírusainak sokféleségérõl. Ilyen módszerekkel azonosították kutyákból többek között a Picornaviridae családba tartozó kobu- (CKoV), picorna- és picodicistrovírust (3, 14, 17, 30), valamint a Caliciviridae családba tartozó noro- (NoV) és sapovírust (17, 22, 25) is. 2012 2013-ban egymással közelebbi rokonságot mutató, de az egyéb parvovírusoktól eltérõ bocavírusokat azonosítottak többek között hasmenéses tüneteket mutató és tünetmentes ebekbõl (13, 16). Tanulmányunk célja az volt, hogy megállapítsuk: vajon az újonnan leírt enteralis vírusok Magyarországon is elõfordulnak-e. Annak kivizsgálására, hogy az azonosított vírusok kapcsolatba hozhatóak-e hasmenéses megbetegedéssel, kontrollvizsgálatot végeztünk el. Saját vizsgálatok Anyagok és módszer 122 662 Magyar Állatorvosok Lapja 2014. november Vizsgálati minták Összesen 63 bélsármintát gyûjtöttünk 2012-ben a januártól szeptemberig terjedõ idõszakban, egy északkelet-magyarországi menhelyen. Amikor csak lehetett, egyedi mintavétel történt, 23 minta esetében bizonytalan volt a bélsárminták eredete, mivel több (2 5) állatot tartottak egyidejûleg egy-egy kennelben. Tizenhárom egyedileg beazonosítható minta esetében 14 nap különbséggel újabb mintavételre került sor. A mintákat hasmenéses és tünetmentes egyedektõl, bélsárürítés után vagy közvetlenül a végbélbõl gyûjtöttük. A mintákat két csoportba osztottuk aszerint, hogy hasmenéses (n = 25) vagy tünetmentes (n = 38) egyedekbõl származtak. Két korcsoportot állítottunk fel, egy év alatti (kölyök) és egy év feletti (felnõtt) vizsgálati csoportra osztva az ebeket. Molekuláris biológiai vizsgálatok Beérkezést követõen a bélsármintákat foszfátos pufferoldattal (PBS) hígítottuk 10 20%-os bélsárszuszpenziót készítve, amelyeket felhasználásig 70 C-on tartottuk. A nukleinsav-kivonást megelõzõen ülepítõ centrifugálást (5000 g, 10 perc, 4 C), majd a felülúszóból teljes vírusnukleinsav-kivonást végeztünk innuprep Virus DNA/RNA Kittel (Analytik Jena). A vírusok kimutatása vírusspecifikus PCR-, ill. RNS-vírusok esetén reverz transzkripciós PCR (RT-PCR) segítségével történt. Az egy- és kétlépéses RT-PCR-ek és a kétkörös (nested) PCR-ek a CPV-2, CPV-1, CCoV, CAstV, CKoV, CaCV és CRVA kimutatását szolgálták. A munkánk során használt
1. táblázat. A munkánk során használt primerek neve, szekvenciája Table 1. Name and sequence of primers used in this study Kimutatott vírus kutya-astrovirus (CAstV) kutya-parvovirus 2 (CPV-2) kutya-minutevirus (CPV-1) kutya-calicivirus (CaCV) kutya-coronavirus (CCoV) kutya-rotavirus A (RVA) kutya-kobuvirus RdRp kutya-kobuvirus VP1 Oligonukleotid elnevezése panastro F1a panastro F1b panastro R panastro F2a panastro F2b F2977 R3238 CaMV-NP1-F CaMV-NP1-R1 CaMV-NP1-R2 P290 P289 11FW 13RV VP6F VP6R RdRp-kobu-f RdRp-kobu-r VP1-kobu-f VP1-kobu-r 5-3 szekvencia Amplifikált szakasz (bp) GARTTYGATTGGRCKCGKTAYGA GARTTYGATTGGRCKAGGTAYGA GGYTTKACCCACATNCCRAA CGKTAYGATGGKACKATHCC AGGTAYGATGGKACKATHCC CTCAAGCAGACTTGTACATTTAAATATGC TGAGTAGCAGATTCTGAAACAGTC TGATCGATTGGTCCTCACAACCATC AGCTGAAAGCATTTCTGCGTCAGA CTGCTTTTATGTTCATTGAATACATGCATCGG GATTACTCCAAGTGGGACTCCAC TGACAATGTAATCATCACCATA TGATGATGSNGTTGTNTGYTAYAA GCATWGTRTGYTGNGARCARAATTC GACGGVGCRACTACATGGT GTCCAATTCATNCCTGGTGG CAGGTGTATGATCTGGACTACAAG TTCTGTTGCGTAGATGACATCG AACGTCCAGGACTGGTTT TTCCCACCACTTGGAGAA Célrégió Referencia 422 RdRp CHU és mtsai (4) 261 VP2 jelen tanulmány 549 NP1 jelen tanulmány 297 RdRp JIANG és mtsai (12) 179 ORF1b ESCUTENAIRE és mtsai (8) 379 VP6 ITURRIZA- GÓMARA és mtsai (11) 323 RdRp jelen tanulmány 449 VP1 jelen tanulmány A CPV-1, CPV-2, ill. a kobuvírus esetében saját primereket használtak oligonukleotidokat (1. táblázat) elõzetes irodalmi adatok alapján választottuk ki, ill. a CPV-1, CPV-2 és CKoV esetében magunk terveztük génbanki szekvenciákból készített illesztések felhasználásával (4, 8, 11, 12). Agarózgél-elektroforézist követõen a specifikus PCR-termékeket a gélszeletekbõl kitisztítottuk, majd mindkét irányból közvetlen szekvenciameghatározást végeztünk BigDye Teminator v3.1 Kittel (Life Technologies). A termékek elektroforézise ABI PRISM 310, ill. ABI PRISM 3100 Avant Genetic Analyser készülékek segítségével történt. A filogenetikai vizsgálatokhoz, ill. a távolsági mátrixok elkészítéséhez a MEGA 6 szoftvert (http://www.megasoftware. net/) vettük igénybe, referenciaként a génbank adatbázisából letölthetõ szekvenciákat (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/) használtuk. A filogenetikai fák elkészítésénél maximum likelihood módszert és bootstrap elemzést alkalmaztunk vírusonként más-más, a program által legjobbnak ítélt nukleotida (nt) szubsztitúciós modellel. A statisztikai számításokat Fisher-féle egzakt próba segítségével végeztük. Eredmények CPV-2-t 12 hasmenéses (48%) és 5 tünetmentes (13%) állat bélsarában találtak Enteralis vírusok elõfordulása Harmincöt felnõtt (10 hasmenéses és 25 egészséges) és 28 kölyök (15 hasmenéses és 13 egészséges) kutyából származó bélsármintát dolgoztunk fel. A vizsgált bélsárminták 64%-ában (43/63) legalább egy vírust azonosítottunk, és 25%-ában (16/63) 2-4 vírus egyidejû jelenlétét igazoltuk (2. táblázat). A laboratóriumi diagnosztika során, egy-egy Magyarországon is gyakran kimutatott DNS, ill. RNS-vírust, a CPV-2-t és a CCoV-t használtuk referenciapontként a kutyák enteralis vírusfertõzéseivel kapcsolatban, feltételezve, hogy ezek a vírusok elõfordulhatnak a vizsgált populáció hasmenéses egyedeiben. CPV-2-t 12 hasmenéses (12/25; 48%) és öt tünetmentes (5/38; 13%) állat bélsarában találtunk, amely a vírus gyakoriságára nézve szignifikáns különbséget jelent a beteg és egészséges csoport között (p = 0,0023). A CPV-2 pozitív minták közül 10 származott kölyökkutyától, amelyek közül nyolc mutatott hasmenéses tüneteket. CCoV jelenlétét a vizsgált minták harmadában (21/63) igazoltuk. A 10 felnõtt Enteralis vírusfertõzések kutyában 663 122
2. táblázat. Menhelyrõl származó kutyák bélsármintáiban elõforduló vírusok eloszlása F: 1 éves és idõsebb; K: 1 év alatti állat; GI tünet: hasmenés Table 2. Viruses found in faecal samples of sheltered dogs. Abbreviations: F: dog 1 year of age; K: dog <1 year of age; GI tünet: diarrhoea Mintanév Kor GI tünet CAstV CKoV CaCV CRVA CCoV CPV-1 CPV-2 KE-2012/1 F + + + + KE-2012/2 K + + + + + KE-2012/3 F + + KE-2012/4 K + + + + + KE-2012/5 K + + + + + KE-2012/6 F + + + KE-2012/7 K + + KE-2012/8 K + + + + + KE-2012/9 K + + + KE-2012/10 K + + KE-2012/11 K + + KE-2012/12 F + + KE-2012/14 F + KE-2012/16 F + KE-2012/18 K + KE-2012/19 F + + + KE-2012/20 F + KE-2012/21 F + KE-2012/22 F + + KE-2012/59 F + KE-2012/60 F + KE-2012/64 K + + + KE-2012/65 F + + KE-2012/67 F + KE-2012/68 F + KE-2012/114 F + KE-2012/116 F + + KE-2012/117 K + + KE-2012/123 K + + KE-2012/124 K + + KE-2012/125 K + + KE-2012/126 K + + KE-2012/129 F + KE-2012/132 F + KE-2012/133 K + KE-2012/135 K + KE-2012/136 K + KE-2012/174 K + KE-2012/175 K + + KE-2012/497 F + KE-2012/526 K + + + KE-2012/527 F + + + KE-2012/528 F + + + 122 664 Magyar Állatorvosok Lapja 2014. november
Kutya-coronavírust a vizsgált minták harmadában találtak, leggyakrabban társfertõzésben A hasmenéses kutyák mintáinak 16%-ában találtak kutyaastrovírust és 11 kölyökkutya közül négy, ill. hét állat mutatott hasmenéses tüneteket. A hasmenéses CCoV pozitív esetek közül mindössze háromban nem mutattunk ki egyéb vírusfertõzést, a többi esetben egyéb vírusok is jelen voltak a mintákban, sokszor többszörös fertõzés formájában (2. és 3. táblázat). A leggyakoribb társfertõzõ a CPV-2 volt, amelyet a CCoV pozitív minták közel felébõl (10/21) ki tudtunk mutatni. A hasmenéses tüneteket mutató kölyökkutyák többsége (5/7) a CCoV mellett CPV-2 fertõzött is volt. Az újonnan felismert, ill. Magyarországon korábban nem azonosított vírusok közül vizsgáltuk a CAstV, CKoV, CaCV, CPV-1, CRVA jelenlétét. CAstV-t a hasmenésben szenvedõ állatok mintáinak 16%-ában (4/25) és az egészséges egyedek 8%-ban (3/38) mutattunk ki; a pozitív eredmények öt esetben egy év alatti, míg két esetben felnõtt egyedekbõl származtak. A 63 vizsgált bélsárból három hasmenéses (3/25; 12%) és négy egészséges (4/38; 10%) kutyából származó minta volt CKoV pozitív. Hat esetben mutattunk ki CKoV-t kölyökkutyák bélsármintájából; ezen belül három tünetmentes, három pedig hasmenéses állatból származott. A CaCV-ok közül egy vesivírus (CVeV) és két CNoV részleges genomszekvenciáját azonosítottuk. Mindhárom pozitív mintát hasmenéses állattól gyûjtöttük. Az egyik CNoV-pozitív bélsármintában társfertõzõ vírust nem találtunk. Négy hasmenéses (4/25; 16%) és 10 (10/38; 26%) tüneteket nem mutató állat bélsármintájában azonosítottuk a CPV-1 jelenlétét. A négy hasmenéses állat között három kölyökkutya és egy felnõtt eb volt. A CPV-1-pozitív minták felében nem találtunk vírusos társfertõzésre utaló bizonyítékot. Két fiatal egyed mintájában azonosítottunk CRVA-t. Az egyik minta esetében az állat gastrointestinalis tüneteket mutatott, míg a másik állat bélsara nem mutatott elváltozást. Tizenhárom kutya esetében lehetõségünk volt 14 nap különbséggel kontrollminták vételezésére és vizsgálatára (3. táblázat). Két egyednél mindkét idõpontban gyûjtött minta vizsgálata negatív volt, öt esetben pedig csak az egyik mintavétel során vett bélsárból sikerült vírus(oka)t kimutatnunk. A KE-2012/1 és KE-2012/6 mintapárnál az elsõ és a második mintában is kimutattunk CPV-2-t; az elsõ mintavételkor a hasmenéses mintában CaCV és CCoV, míg második mintavételkor CPV-1 is ürült a bélsárral. Az elsõ és második mintában kimutatott CPV-2 vírusok szekvenciája 100%-ban megegyezett egymással. A KE-2012/2 és KE-2012/7 mintapár esetében a kölyökkutya az elsõ és a kontrollmintavétel idején is mutatott tüneteket, azonban a két mintavételi idõpontban eltérõ vírusokat ürített. A szintén egy állatból származó KE-2012/21 és a KE-2012/59-es 3. táblázat. Kontrollminta-vizsgálatok eredményei A mindkét esetben negatív eredménnyel záruló vírusdiagnosztikai vizsgálatokat nem ábrázoltuk. Zárójelben tüntettük fel az elsõ és a második mintában kimutatott szekvenciák közötti hasonlóságot. F: 1 éves és idõsebb; K: 1 év alatti állat; GI tünet: hasmenés Table 3. Virus detection in case-control sampling The negative results are not shown. Similarity values (shown in parenthesis) between sequences identified in sample 1 and 2. Abbreviations: F: dog 1 year of age; K: dog <1 year of age; GI tünet: diarrhoea 1. mintavétel 2. mintavétel Eb Kor GI tünet Mintaazonosító Kimutatott vírusok GI tünet Mintaazonosító Kimutatott vírusok 1 F + KE-2012/1 CaCV, CPV-2, CCoV + KE-2012/6 CPV-1, CPV-2 (100%) 2 K + KE-2012/2 CAstV, CKoV, CPV-2, CCoV + KE-2012/7 CaCV 3 K + KE-2012/8 CAstV, CKoV, CPV-2, CCoV + KE-2012/57 4 F KE-2012/21 CPV-1 KE-2012/59 CPV-1 (99%) 5 F KE-2012/17 - KE-2012/65 CPV-1, CCoV 6 F KE-2012/20 CCoV KE-2012/66 7 F KE-2012/18 CPV-1 KE-2012/67 CPV-2 8 F KE-2012/19 CPV-1, CPV-2, CCoV KE-2012/60 CCoV (92%) 9 K + KE.-2012/115 - KE-2012/123 CKoV, CPV-1 10 F KE-2012/68 CPV-1 + KE-2012/128 11 K + KE-2012/126 - + KE-2012/132 CCoV Enteralis vírusfertõzések kutyában 665 122
1 122 666 Magyar Állatorvosok Lapja 2014. november
1. ábra. Filogenetikai fák (A) Kutya-astrovírus (CAstV), részleges RdRp-gén. (B) Kutya-coronavírus (CCoV), részleges RdRp-gén. A jelölések a fa jobb oldalán általunk felállított csoportokat mutatnak. (C) Kutya-kobuvírus (CKoV), részleges VP1-gén. (D) CKoV, részleges RdRpgén. (E) Kutya-calicivírus (CaCV, beleértve a CNoV és CVeV), részleges RdRp-gén. (F) Kutya-minutevírus (CPV-1), részleges NP1-gén. (G) Kutya-parvovírus (CPV-2), részleges VP2-gén. (H) Kutya-rotavírus A, (CRVA), részleges VP6-gén. A jelölések a fa jobb oldalán a VP6 genotípusokat mutatják. A fákat MEGA 6 (verziószám 6.05) szoftver segítségével készítettük maximum likelihood statisztikai módszer segítségével, a program által ideálisnak ítélt szubsztitúciós modell alkalmazásával Figure 1. Phylogenetic trees (A) Canine astrovirus (CastV), partial RdRp sequence. (B) Canine coronavirus (CCoV), partial RdRp sequence. Different groups are labelled on the right side of the tree. (C) Canine kobuvirus (CKoV), partial VP1 sequence. (D) CKoV, partial RdRp sequence. (E) Canine calicivirus (CaCV; including CNoV and CVeV), partial RdRp sequence. (F) Canine minutevirus (CPV-1), partial NP1 sequence. (G) Canine parvovirus (CPV-2), partial VP2 sequence. (H) Canine rotavirus A (CRVA), partial VP6 sequence. Different VP6 genotypes are labelled on the right side of the tree. The trees were constructed with the MEGA 6 software (version 6.05), using the maximum likelihood statistical method and the best matched substitution model, according to the calculations of the program Enteralis vírusfertõzések kutyában 667 122
mintákban CPV-1-et azonosítottunk, és a két szekvencia > 99%-os hasonlóságot mutatott nukleotid (nt) szinten. A KE-2012/19 és KE-2012/60 mintapárból az elsõ idõpontban CPV-1 és -2, valamint CCoV is kimutatható volt, míg a második mintában csak CCoV-t deketáltunk. Érdekes, hogy ennél a mintapárnál a kimutatott CCoV eredetû szekvenciák csupán 92%-os hasonlóságot mutattak egymással. Az RNS-vírusok esetében jelentõs genetikai változékonyságot figyeltek meg Enteralis vírusok genetikai sokfélesége A diagnosztikai szûrésre alkalmazott primerek által felerõsített genomszakaszok nem minden esetben voltak alkalmasak az adott vírus filogenetikai kapcsolatainak feltárására. Részben emiatt is a CPV-1- és CPV-2-szekvenciák, valamint a két CRVA minimális eltérést mutattak a velük rokon referenciatörzsekhez, ill. egymáshoz képest (CPV1, 98%, CPV2, 97%, CRVA, 98% nt-hasonlóság) (1./F, G, H ábrák). A CCoV részleges ORF1b régiójának elemzése viszont két klaszter* elõfordulását jelezte. Az egyik csoporton belül a CCoV-szekvenciák közötti nt-hasonlóság legalább 94% volt, és ezek a 341/05 génbanki referencia CCoV-törzshöz (EU856361) hasonlítottak leginkább ( 97%). A másik csoportba tartozó CCoV-k részleges szekvenciái 97%-ban egyeztek egymással, és ezekhez a génbanki referenciatörzsek közül a PRC ISU-1 sertés légzõszervi coronavírus (DQ811787) állt, de azokkal is csupán ~92 94% hasonlóságot mutatott (1./B ábra). A többi RNS-vírus (CAstV, CKoV, CCaV) szintén jelentõs genetikai változatosságot mutatott, még a konzervatívnak mondható RdRp régió elemzése során is. A CAstV esetén a filogenetikai elemzés legalább három klaszter hazai elõfordulását mutatta; a vírusok többsége közös ágon helyezkedett el a génbankban megtalálható egyéb kutya-astrovírusokkal (JX878479, HM045005), míg a KE-2012/8 jelzésû mintában azonosított vírus külön ágat alkotott egy hollandiai, rókából származó AstV sal (KC692365) (1./A ábra). A különbözõ klaszterekbe tartozó hazai CAstV-k egymással nt-szinten 95%, a legközelebbi génbanki CAstV referenciákkal pedig egyes esetekben közel 98% hasonlóságot mutattak. Kivétel volt a KE-2012/8 jelzésû vírus, amely a másik hat magyarországi CAstV-sal ~55 58%-ban, míg a róka- AstV-törzzsel ~68%-ban egyezett. A CKoV esetében a részleges VP1-szekvenciák alapján készített filogenetikai fán a hazai vírusok a referenciatörzsekkel egy ágon helyezkedtek el, és egymással 92 96%-os hasonlóságot mutattak, míg a referenciaszekvenciákkal 90 94%-ban egyeztek a felerõsített szakaszon (1./C ábra). Az RdRp szekvenciák filogenetikai vizsgálata alapján három sikeresen szekvenált genomszakasz esetében > 95% hasonlóságot figyeltünk meg, míg ugyanezek a génbanki CKoV referenciaszekvenciákkal ~93 97%-os hasonlóságot mutattak (1./D ábra). A calicivírusokat illetõen a CNoV-szekvenciák között jelentõs különbséget tapasztaltunk mind a saját, mind a génbankból letöltött referenciaszekvenciák esetén. A KE-2012/7 és KE-2012/64-es mintából felerõsített szakaszok között nt-szinten alig 80%-os azonosság volt, és mindkét vírus egy-egy Olaszországból származó CNoV-törzzsel (JF939046, JF930689) mutatott közelebbi rokonságot. A KE-2012/528-as mintából kimutatott CVeV-szekvencia ~91 93% hasonlóságot mutatott egyéb kutya CVeV-szekvenciákkal (1./E ábra). Következtetések A menhelyekre bekerülõ kutyák a vakcinázás ellenére számos baktériummal és vírussal fertõzõdhetnek A kutyatartási kultúra fejlõdésével a felelõs állattartók egyre nagyobb gondot fordítanak kedvenceik egészségvédelmére, azaz a higiénikus tartási viszonyokra és a fertõzõ betegségek megelõzésére, vakcinás védelemre. Ezzel párhuzamosan még mindig számtalan gazdátlan, kóbor ebet fogadnak be állatmenhelyek vagy állategészségügyi telepek. A vizsgált menhelyen a kutyák bekerülésük után külsõ és belsõ parazitamentesítésen esnek át, ill. vakcinázási programjuk elindul, azonban számos baktérium és vírus átvitele elkerülhetetlen. Tanulmányunkban egy északkelet-magyarországi állatmenhelyen tartott kutyák között végeztünk felmérést a bélsárral ürülõ, hasmenéssel összefüggésbe hozható vírusok elõfordulását * genetikailag hasonló, egy csoportba tartozó törzsek, szekvenciák 122 668 Magyar Állatorvosok Lapja 2014. november
A hasmenéses kutyákban gyakori volt a CPV-2- és a CCoVtársfertõzés A kutya-astrovírus esetében a génbankitól jelentõsen eltérõ szekvencia alapján felmerül egy új CAstV-faj jelenléte hazánkban A szerzõk hazánkban elsõként mutattak ki astro-, kobu- és norovírust kutyában illetõen. A menhelyen körülbelül 200 250 kutya elhelyezésérõl gondoskodnak egy idõben, éves szinten pedig 600 700 kutyát vesznek gondozásba. A vizsgált állomány egyedeitõl gyûjtött bélsármintákban a szakirodalmi adatokkal megegyezõen a CPV-2 és CCoV volt a leggyakrabban azonosított vírus (5, 17). A többszörösen fertõzött, emésztõrendszeri tüneteket is mutató ebek esetében nagyarányú CPV-2- és CCoV-társfertõzést igazoltunk. Bár a tünetek súlyosságára vonatkozó adatokat nem gyûjtöttünk, a szakirodalmi adatok szerint a két vírus együttes jelenléte súlyosabb lefolyással párosul (9). Eredményeink alapján sem a teljes mintaszámra vetített víruspozitivitás, sem az egyszeres és többszörös fertõzés, valamint a hasmenéses állapot fennállása között nem találtunk kapcsolatot (p = 0,28, ill. p = 0,22). Az egyes vírusok jelenléte és az emésztõszervi tünetek között egyedül a CPV-2 esetében találtunk statisztikailag szignifikáns összefüggést. A CAstV, CaCV, CKoV és CRVA elõfordulását illetõen ismereteink világviszonylatban is hiányosak, így adataink hozzájárulhatnak e vírusok elõfordulásának és esetleges kórokozó szerepének jobb megértéshez. A vizsgált vírusok magyarországi jelenléte felhívja állatorvos kollégáink figyelmét arra, hogy a gyomor-bélrendszeri betegségek megjelenése esetén érdemes gondolni a kevéssé ismert, csekélyebb jelentõségûnek vélt vírusok megbetegítõ szerepére is. Magyarországon az emésztõszervi megbetegedéseket okozó vírusok közül a CDV, CPV-2, CCoV és a CAdV-1 ellen állnak rendelkezésre vakcinák. Ezek nem szerepelnek a kötelezõen beadandó vakcinák között, alkalmazásuk mégis egyre elterjedtebb. Magyarországi és más országok adatai alapján a CPV-2-fertõzések aránya az oltások ellenére is magas, ráadásul több vírustípus együttesen cirkulál (5). Tanulmányunk korlátai között említjük meg a rövid mintagyûjtési idõszakon túl a viszonylag kis mintaszámot, továbbá az alkalmazott diagnosztikai rendszerek korlátozott érzékenységét, különösen a nagyon változékony RNS-vírusok esetében. Részben emiatt nem egyszerû megfelelõen értelmezni bizonyos eredményeket. Így például a 13 egyedre kiterjesztett követéses vizsgálatban tapasztalt vírusürítési mintázat egyaránt jelentheti a különféle vírusok ürítésének eltérõ jellegét, változó vírustitert, ill. kópiaszámot, vagy akár a gazdán belüli változások nyomán fellépõ vírusváltozatok létrejöttét, ami a választott diagnosztikai módszer érzékenységével kapcsolatos problémákhoz vezethetett. Ugyanakkor nyilvánvaló az is, hogy egyes vírusok a menhelyen tartás során fertõzték az egyedeket, amit alátámaszt az a megfigyelés, miszerint az egyik ebnél az elsõ alkalommal vett mintában azonosított CCoV eltért a második mintában talált CCoV-tól. A vírusdiagnosztikai PCR során felszaporított és meghatározott genomszakaszok néhány száz bázis hosszúságúak voltak. Mégis, e szakaszon belül néhány esetben, így a CAstV-nál is, a génbanki referenciáktól igen eltérõ szekvenciákat azonosítottunk, ami új CAstV-faj magyarországi jelenlétét jelezte. Ezen kívül jelentõs genetikai változékonyságra figyeltünk fel a CCoV és a CaCV esetében is. Mivel a vizsgált genomszakaszok tipikusan az adott vírus konzervatív régiójának egyegy részét reprezentálták, és így ezek nem feltétlenül tükrözik a teljes genomra jellemzõ különbségeket, a megfigyelt diverzitás jobb megértéséhez szükség lesz majd a teljes vírusgenomok meghatározására. Összegezve: Magyarországon elõször történt a kutyákat érintõ, újonnan felfedezett és potenciálisan gastroenteritist okozó vírusok kimutatását célzó járványügyi felmérés, amely magában foglalta néhány, eddig hazai állományokban nem tanulmányozott vírus elõfordulásának a feltérképezését is. Ennek során hazánkban elsõként mutattunk ki többek között astro-, kobu, és norovírust kutyák bélsármintáiból. Eredményeink alapján a kutyák menhelyre kerülésével felmerül a különféle, újonnan bekövetkezett vírusfertõzések kockázata. E fertõzések egy részének állategészségügyi jelentõségét ma még nem ismerjük, azonban fontos megjegyezni, hogy elsõsorban kölyökkutyáknál a többszörös vírusfertõzések súlyosbíthatják a tüneteket. Tanulmányunkkal szerettünk volna rámutatni a kérdés további vizsgálatának szükségességére, remélve, hogy a jövõben gyûjtött adatok segítenek majd számos, korábban nem ismert vírus klinikai és járványtani szerepének tisztázásában. Enteralis vírusfertõzések kutyában 669 122
Köszönetnyilvánítás A szerzõk munkájukhoz támogatást kaptak a Magyar Tudományos Akadémiától (Lendület program). Köszönettel tartozunk a Miskolci Állatsegítõ Alapítványnak a mintákért és a mintagyûjtésben nyújtott segítségükért. IRODALOM 1. ALLISON, A. B. HARBISON, C. E. et al.: Role of multiple hosts in the cross-species transmission and emergence of a pandemic parvovirus. J. Virol., 2012. 86. 865 872. 2. BULUT, O. YAPICI, O. et al.: The serological and virological investigation of canine adenovirus infection on the dogs. Sci. World J., 2013. 587024. 3. CARMONA-VICENTE, N. BUESA, J. et al.: Phylogeny and prevalence of kobuviruses in dogs and cats in the UK. Vet. Microbiol., 2013. 164. 246 252. 4. CHU, D. K. W. POON, L. L. M. et al.: Novel astroviruses in insectivorous bats. J. Virol., 2008. 82. 9107 9114. 5. CSÁGOLA, A. VARGA, S. LÕRINCZ, M. TUBOLY, T.: Analysis of the full-length VP2 protein of canine parvoviruses circulating in Hungary. Arch. Virol., 2014. 159. 2441-2444. 6. DE GRAZIA, S. MARTELLA, V. et al.: Canine-origin G3P[3] rotavirus strain in child with acute gastroenteritis. Emerg. Infect. Dis., 2007. 13. 1091 1093. 7. DECARO, N. BUONAVOGLIA, C.: An update on canine coronaviruses: viral evolution and pathobiology. Vet. Microbiol., 2008. 132. 221 234. 8. ESCUTENAIRE, S. MOHAMED, N. et al.: SYBR green realtime reverse transcription-polymerase chain reaction assay for the generic detection of coronaviruses. Arch. Virol., 2007. 152. 41 58. 9. GODSALL, S. CLEGG, S. R. et al.: Epidemiology of canine parvovirus and coronavirus in dogs presented with severe diarrhoea to PDSA PetAid hospitals. Vet. Rec., 2010. 167. 196 201. 10. HOELZER, K. SHACKELTON, L. A. et al.: Phylogenetic analysis reveals the emergence, evolution and dispersal of carnivore parvoviruses. J. Gen. Virol., 2008. 89. 2280 2289. 11. ITURRIZA-GÓMARA, M. WONG, C. et al.: Rotavirus subgroup characterisation by restriction endonuclease digestion of a cdna fragment of the VP6 gene. J. Virol. Methods, 2002. 105. 99 103. 12. JIANG, X. HUANG, P. W. et al.: Design and evaluation of a primer pair that detects both norwalk- and sapporo-like caliciviruses by RT-PCR. J. Virol. Methods, 1999. 83. 145 154. 13. KAPOOR, A. MEHTA, N. et al.: Characterization of novel canine bocaviruses and their association with respiratory disease. J. Gen. Virol., 2012. 93. 341 346. 14. KAPOOR, A. SIMMONDS, P. et al.: Characterization of a canine homolog of human Aichivirus. J. Virol., 2011. 85. 11608 11613. 15. KELLY W. R.: An enteric disease of dogs reselmbing feline panleucopaenia. Aust. Vet. J., 1978. 54. 593. 16. LI, L. PESAVENTO, P. A. et al.: A novel bocavirus in canine liver. Virol. J., 2013. 10. 54. 17. LI, L. PESAVENTO, P. A. et al.: Viruses in diarrhoeic dogs include novel kobuviruses and sapoviruses. J. Gen. Virol., 2011. 92. 2534 2541. 18. MANTEUFEL, J. TRUYEN, U.: Animal bocaviruses: a brief review. Intervirology, 2008. 51. 328 334. 19. MARTELLA, V. BIANCHI, A. et al.: Canine distemper epizootic among red foxes, Italy, 2009. Emerg. Infect. Dis., 2010. 16. 2007 2009. 20. MARTELLA, V. ELIA, G. et al.: Canine distemper virus. Vet. Clin. North Am. Small Anim. Pract., 2008. 38. 787 797. 21. MARTELLA, V. ELIA, G. et al.: Genotyping canine distemper virus (CDV) by a hemi-nested multiplex PCR provides a rapid approach for investigation of CDV outbreaks. Vet. Microbiol., 2007. 122. 32 42. 22. MARTELLA, V. LORUSSO, E. et al.: Detection and molecular characterization of a canine norovirus. Emerg. Infect. Dis., 2008. 14. 1306 1308. 23. MARTELLA, V. MOSCHIDOU, P. et al.: Enteric disease in dogs naturally infected by a novel canine astrovirus. J. Clin. Microbiol., 2012. 50. 1066 1069. 24. MARTELLA, V. MOSCHIDOU, P. et al.: Detection and characterization of canine astroviruses. J. Gen. Virol., 2011. 92. 1880 1887. 25. MATSUURA, Y. TOHYA, Y. et al.: Complete nucleotide sequence, genome organization and phylogenic analysis of the canine calicivirus. Virus Genes, 2002. 25. 67 73. 26. MATTHIJNSSENS, J. DE GRAZIA et al.: Multiple reassortment and interspecies transmission events contribute to the diversity of feline, canine and feline/canine-like human group a rotavirus strains. Infect. Genet. Evol., 2011. 11. 1396 1406. 27. MENDEZ, E ARIAS C. F.: Fields Virology. Vol. 1. 5 th ed. Lippincott Williams and Wilkins. Philadelphia, USA, 2007. 28. MESQUITA, J. R. NASCIMENTO, M. S. J.: Serosurvey of Veterinary conference participants for evidence of zoonotic exposure to canine norovirus. Study Protocol. Virol. J., 2012. 9. 250. 29. SOÓS, T. TUBOLY, S.: Vakcinológia. A fertõzõ állatbetegségek immunprophylaxisa. A/3 Nyomdaipari és Kiadói Szolgáltató Kft. Budapest, 2009. 30. WOO, P. C. Y. LAU, S. K. P. et al.: Complete genome sequence of a novel picornavirus, canine picornavirus, discovered in dogs. J. Virol., 2012. 86. 3402 3403. Közlésre érk.: 2014. szept. 15. 122 670 Magyar Állatorvosok Lapja 2014. november