Rossz vízoldékonyságú antifungális szert tartalmazó intravénás készítmény formulálása Doktori tézisek Dr. Kovács Kristóf Semmelweis Egyetem Gyógyszertudományok Doktori Iskola Témavezetı: Konzulens: Hivatalos bírálók: Dr. Ludányi Krisztina egyetemi docens, Ph.D. Dr. Stampf György egyetemi docens, C.Sc. Dr. Aigner Zoltán egyetemi docens, Ph.D. Kovácsné Dr. Balogh Judit egyetemi adjunktus, Ph.D. Szigorlati bizottság elnöke: Szigorlati bizottság tagjai: Dr. Szökı Éva egyetemi tanár, D.Sc. Dr. Vecsernyés Miklós egyetemi docens, Ph.D. Dr. Kata Mihály ny. egyetemi tanár, D.Sc. Budapest 2010 1
Bevezetés Az oldódás jelentıségére Joseph Carson, a pennsylvaniai egyetem tanára már 1863-ban rámutatott a Materia Medica és Gyógyszerészet címő tárgy elıadásainak összefoglalójában, miszerint minden anyagnak oldott állapotban kell lennie ahhoz, hogy bekerüljön a véráramba. Beszámolt arról is, hogy bizonyítottan aktív, de nem oldódó anyagok esetén lehetıség van azok oldhatóvá tételére. Megállapítása a mai napig helytálló és fontos, hiszen napjainkban a rendelkezésre álló vegyületek mintegy 10-30 %-a, az újonnan kifejlesztett molekulák 60-70 %-a vízben rosszul oldódik. Ezen gyógyszermolekulák nem megfelelı vízoldékonysága továbbra is komoly nehézséget jelent terápiás felhasználásuk szempontjából annak ellenére, hogy a gyógyszerfejlesztık a rossz vízoldékonyság,valamint az ebbıl adódó folyékony gyógyszerformákat érintı problémák megoldásán hosszú ideje dolgoznak. A fentieken túl, a kutatásban napjainkban egyre nagyobb számban jelennek meg a rosszul oldódó vegyületek és ebbıl adódóan az az igény, hogy ezeket terápiásan alkalmazható oldószerrel/oldószerekkel vagy megfelelı oldékonyságnövelı segédanyagokkal/módszerekkel terápiásan alkalmazható gyógyszerkészítménnyé kell alakítani. Egy meglévı molekula oldékonyságának javítása növeli a hatóanyag biohasznosulását és hatékonyságát, amely nem csak tudományos és gyógyászati szempontból releváns, hanem nem elhanyagolható módon jelentıs piaci értéket is teremt. Ezen túlmenıen a már ismert hatóanyagokat tartalmazó 2
készítmények átformulálása (ún. szupergenerikus készítményekké) további terápiás lehetıségeket nyithat meg, és a termék szabadalmi védettségét is növelheti. Egy készítmény átformulálása sokkal kevesebb anyagi ráfordítást igényel, mint egy új hatóanyag kidolgozása és gyógyszerkészítménnyé történı kifejlesztése. A rosszul oldódó vegyületek folyékony gyógyszerformába történı elıállításánál számos kutató és fejlesztı kísérelte meg és jó néhány oldékonyságnövelési módszer ismert a gyógyszertechnológiában, mint pl. ph változtatás, koszolvensek, felületaktív anyagok alkalmazása, illetve liposzómák vagy mikro- és nanoemulziók készítése. Fontos megemlíteni a különbséget azon eljárások között, amelyek az egyes gyógyszermolekulák látszólagos oldékonyságát növelik és ezzel szilárd gyógyszerformában mutatott farmakokinetikai tulajdonságait módosítják; vagy a molekulák valódi, egyensúlyi oldékonyságát változtatják meg. Ez utóbbi módszereket lehet folyékony gyógyszerformáknál elınyösen alkalmazni. Parenterális készítmények esetében, amikor a gyógyszert az emésztıtraktus megkerülésével intravénás injekciók és infúziók esetén közvetlenül a véráramba történı adagolással juttatjuk a szervezetbe, a megfelelı oldékonyságnövelési technika kiválasztása különös odafigyelést igényel. Egyes technikákat csak korlátozottan, másokat pedig egyáltalán nem lehet alkalmazni, hiszen ebben az esetben olyan oldékonyságnövelı módszereket kell választani vagy fejleszteni, amelyek a hatóanyag tulajdonságain túl a szervezet sajátosságait is figyelembe veszi. 3
Célkitőzés Doktori munkám során három rosszul oldódó azol típusú vegyület (itrakonazol, ketokonazol, mikonazol) intravénás készítménybe történı formulálását tőztem ki célul. Vizsgálataim céljának jelentısége abban rejlik, hogy a modell hatóanyagok a klinikumban egyre nagyobb számban megjelenı gombás fertızések kezelésére alkalmasak, így a gyógyszerforma kidolgozása lehetıséget teremt a szisztémás mikózisokban korlátozottan rendelkezésre álló parenterális készítmények bıvítésére. Fontos célkitőzése munkámnak, hogy a készítmények olyan összetételben legyenek formulálva, amely megfelel a parenterális készítményekkel szemben támasztott hatástani, toxicitási és gyógyszertechnológiai követelményeknek. Célom volt olyan kombinált rendszer kidolgozása, amely a formuláláshoz szükséges segédanyagokat a lehetı legkisebb mennyiségben tartalmazza, illetve nem tartalmaz olyan komponenseket mint pl. a mikonazol esetében a korábban forgalmazott termékben lévı Cremophor EL, amely káros mellékhatásokat idézhet elı. Kísérleteim során célul tőztem ki: 1) az azol típusú hatóanyagok oldékonyságának növelését a Ph.Hg. VIII-ban hivatalos ph szabályozó szerek, koszolvensek és felületaktív anyagok alkalmazásával; továbbá a farmakonok terápiásan effektív dózisban történı oldását az oldékonyságnövelésre használt segédanyagok optimális kombinációjával. 2) Ezt követıen a klinikai szempontból releváns elıny/kockázat arány figyelembe vételével célom volt az oldószerrendszer segédanyag- 4
összetételének optimalizálása (csökkentése) úgy, hogy annak oldékonyságnövelı kapacitása ne romoljon. 3) Az optimált rendszer sterilezhetıségének vizsgálata, valamint a csíramentesítés lehetıségeinek vizsgálata a készítmény terápiás alkalmazhatóságának alapfeltétele, ezért célom volt az ehhez szükséges módszerek, paraméterek meghatározása. 4) Ezeken túlmenıen vizsgálni kívántam a tárolás hatását is az összetétel stabilitására, amely elengedhetetlen egy potenciális készítmény forgalomba hozatala szempontjából. 5
Módszerek Az oldékonyságnövelési kísérletek során a modellként használt mikonazol oldékonyságát a következı rendszerekben vizsgáltam: ph módosító szerek (glükonát, foszfát, ammónium-acetát) koszolvensek (propilénglikol, glicerin, makrogol, etanol) felületaktív anyagok (poliszorbát 20, 60, 80) kettıs kombinációk (ammónium-acetát + koszolvensek; ammónium-acetát + felületaktív anyagok) hármas kombinációk (ammónium-acetát + etanol + poliszorbát) A ketokonazol és itrakonazol oldékonyságát az oldékonyságnövelési kísérletek során kidolgozott hármas összetételrendszerben vizsgáltam. A kidolgozott oldószerrendszer segédanyag összetételének optimalizálási kísérleteit mikonazol és ketokonazol tartalmú oldószerrendszerek esetén három részre bontottam/osztottam: poliszorbátkoncentráció csökkentése etanolkoncentráció csökkentése hígítás hatására végbemenı folyamatok ellenırzése. A sterilezhetıségi vizsgálatokat mikonazol tartalmú készítménnyel végeztem. A vizsgálatok során a hısterilezés és membránszőrés hatását ellenıriztem. A membránszőrıkkel statikus szőrıvizsgálatot, membránkompatibilitási és buborék-pont érték meghatározási kísérleteket végeztem. 6
A fejlesztés végén a mikonazol tartalmú oldatokkal fotostabilitás- és gyorsított stabilitás vizsgálatokat (12 hónapig) is végeztem. A kísérletek során a mikonazolt, ketokonazolt és itrakonazolt tartalmazó készítmények hatóanyagtartalmának meghatározása HPLC-UV módszerrel történt Merck-Hitachi HPLC-UV készülékkel. A kromatográfiás elválasztást Agilent Zorbax C8 (4,6 mm x 150 mm, 5µm) oszlopon végeztem izokratikus körülmények között 0,05 mol acetát-puffer (ph = 3,5) és metanol 30:70 arányú elegyével szobahımérsékleten, a mozgó fázis áramlási sebessége 1,0 ml/perc volt. A szennyezı és bomlástermékek azonosítása HPLC-MS/MS módszerrel történt Agilent 6410 Triplequad LC/MS készüléken scan és product ion módban, elektroporlasztásos ionizációval, pozitív üzemmódban. 7
Eredmények Értekezésemben azt a fejlesztési és kutatói munkát mutattam be, amelyet rossz vízoldékonysággal rendelkezı azol típusú vegyületek parenterális gyógyszerformába történı formulálása során végeztem. Az értekezés új tudományos eredményei: Az oldékonyságnövelési kísérletek során megállapítottam, hogy a fejlesztéshez alkalmazott segédanyagok jelentıs oldékonyságjavulást biztosítanak azol típusú hatóanyagok parenterális készítményeinek elıállításához. A vizsgált két modellvegyület a mikonazol és a ketokonazol oldékonysága nagymértékben növelhetı ph beállítók, koszolvensek és felületaktív anyagok segítségével. Kidolgoztam olyan kettıs, illetve hármas oldószerrendszereket, amelyek szinergista oldékonyságnövelı hatásukkal számottevıen javították mind a mikonazol, mind a ketokonazol oldékonyságát. A legjelentısebb oldékonyságnövekedést egy 5 % poliszorbát 80 + 25 % etanol + ammónium-acetát (ph 3,1) oldattal értem el. Ez a rendszer a mikonazol esetében 42,46 ± 1,45 mg/ml, a ketokonazol esetében 158,53 ± 30,40 mg/ml hatóanyag oldására képes. Ez az érték a mikonazol esetén jóval több, mint a korábban forgalomban lévı készítményben oldott hatóanyagkoncentráció. Bizonyítottam, hogy az oldószerrendszer összetételének optimalizálása révén az alacsonyabb koncentrációban jelen lévı segédanyagok hasonló oldékonyságnövelési kapacitással rendelkeznek, mint az optimalizálás elıtt, és alacsonyabb koncentrációjuknak köszönhetıen feltehetıen kisebb terhelést jelentenek a szervezet számára. 8
További optimalizálás során, a rendszer alkalmazhatóságát figyelembe véve a hígítás hatására végbemenı folyamatokat is ellenıriztem. Igazoltam, hogy a kidolgozott oldószerrendszer stabil marad különbözı infúziókkal történı hígítás után. A végsı összetételben a poliszorbát 80 és az etanol a lehetı legoptimálisabb koncentrációban van jelen mind a fiziológiai elviselhetıség, mind a szolubilizáló hatás szempontjából. Bizonyítottam, hogy mind az autoklávozás, mind a membránszőrés némi kitétellel alkalmas az összetétel sterilezésére. A membránszőrés használatánál rámutattam a megfelelı szőrıanyag kiválasztásának fontosságára: a vizsgált szőrık közül a cellulóz-nitrát inkompatibilis a rendszerrel. Kidolgoztam egy új LC-MS/MS módszert, amelynek segítségével a látható fény- és UV- hatásnak kitett mintákban azonosítottam gyógyszerkönyvi szennyezıket és bomlástermékeket, valamint két egyéb termék feltételezhetı szerkezetét is meghatároztam. Vizsgálataim során a terner rendszerben oldott mikonazol bomlástermékeit és szennyezıit azonosítottam 12 hónapos gyorsított stabilitásvizsgálatot követıen, valamint látható fény- és UV- hatásnak kitett mintákban is. Az utóbbi mintákat összehasonlítva a kilenc hónapig tároltakkal megállapítottam, hogy a kilenc hónapig tárolt minták az azonosított vegyületek közül csak hármat tartalmaztak, azokat is jóval kisebb mennyiségben, mint a látható fény- és UVhatásnak kitett minták. Ezek az eredmények igazolják az összetétel stabilitását. 9
Következtetések Az eredmények gyakorlati alkalmazhatósága: A munkám során mikonazol ill. ketokonazol tartalmú parenterális készítményt (koncentrátum infúzióhoz) fejlesztettem, amely szabadalmaztatását követıen alkalmas lehet gyógyszeripari elıállításra. Az oldékonyságnövelési kísérletek során több olyan hármas oldószerrendszert dolgoztam ki, amelynek oldékonyságnövelı hatása terápiásan alkalmazható mennyiségben oldja fel mind a mikonazolt, mind a ketokonazolt és feltevések szerint egyéb rosszul oldódó antifungális imidazolvegyületeket is. Az összetétel kidolgozásának gyakorlati haszna nem feltétlenül korlátozódik parenterális alkalmazásra, hiszen ezzel a gyógyszerformával szemben támasztott követelmények több esetben felülmúlják a belsıleges vagy külsıleges készítményekkel szemben támasztottakat. Az optimalizálási kísérletek rámutattak arra, hogy a kidolgozott hármas oldószerrendszer komponensei mennyiségének változtatásával a haszon/kockázat arány figyelembevételével a készítmény formulálható. 10
Saját publikációk jegyzéke Az értekezés témaköréhez kapcsolódó közlemények 1. Kovács K, Stampf Gy, Klebovich I, Antal I, Ludányi K. (2009) Aqueous solvent system for the solubilization of azole compounds. Eur J Pharm Sci, 36: 352-358. (IF: 2,608) 2. Kovács K, Ludányi K, Stampf Gy, Antal I, Klebovich I. (2009) Aqueous solvent system for the solubilization of azole compounds. US Patent No. 2009/0253712. 3. Kovács K, Antal I, Stampf Gy, Klebovich I, Ludányi K. (2010) Composition optimization and stability testing of a parenteral antifungal solution based on a ternary solvent system. AAPS PharmSciTech, 11: 285-293. (IF: 1,190) 4. Kovács K, Orosz T, Stampf Gy, Antal I, Klebovich I, Ludányi K. (2009) Rossz vízoldékonyságú hatóanyagok parenterális gyógyszerformaként történı formulálásánál felmerülı problémák. Acta Pharm Hung, 79: 35-44. 11
Az értekezés témaköréhez kapcsolódó, teljes terjedelemben megjelent kongresszusi elıadások 1. Kovács K, Stampf Gy, Ludányi K, Klebovich I, Antal I. (2006) Mikonazol tartalmú parenterális készítmény formulálási vizsgálata. Gyógyszerészet, Kongresszusi különszám: 80. 2. Kovács K, Stampf Gy, Antal I, Klebovich I, Ludányi K. (2008) Combined solubilizing effect of ph, co-solvents and surfactants for the formulation of a parenteral solution containing miconazole. Farm Vest, 59: 198-199. 3. Kovács K, Stampf Gy, Antal I, Klebovich I, Ludányi K. (2009) Development of a parenteral solvent system for the solubilization of azole type antifungals. Eur J Pharm Sci, 38(1 suppl): 124-125. Az értekezés témaköréhez kapcsolódó elıadások 1. Kovács K, Stampf Gy, Ludányi K, Antal I, Klebovich I. Parenterális gyógyszerforma tervezés. Gyógyszer az ezredfordulón VI., Sopron, 2006. november 9-11., P6 2. Kovács K, Stampf Gy, Ludányi K, Budai M, Klebovich I, Antal I. Mikonazol tartalmú gyógyszerforma fejlesztése. PhD Tudományos Napok 2007, Budapest, 2007. április 12-13., P-II/13 12
3. Kovács K. Mikonazol oldódásának elısegítése parenterális gyógyszerforma elıállításához. VIII. Clauder Ottó Emlékverseny, Budapest, 2007. április12-13. 4. Kovács K, Ludányi K, Stampf Gy, Klebovich I, Antal I. Quantitative determination of miconazole from different parenteral solutions. 7th Balaton Symposium on high-performance separation methods in memoriam Szabolcs Nyiredy, Siófok, 2007. szeptember 5-7., P-70 5. Kovács K, Stampf Gy, Orosz T, Antal I, Klebovich I, Ludányi K. Antifungális szer preformulációs vizsgálatai parenterális gyógyszerformában. Gyógyszerkutatási szimpózium, Szeged, 2007. november 9-10., P-15 6. Kovács K, Stampf Gy, Antal I, Klebovich I, Ludányi K. Mikonazol: portól az infúzióig. PhD Tudományos Napok 2008, Budapest, 2008. április 10-12., E-VI/5 7. Kovács K, Nagy Zs K, Toldy A, Stampf Gy, Antal I, Klebovich I, Ludányi K. Sterilezési eljárások parenterális oldat stabilitására gyakorolt hatásának vizsgálata. Gyógyszer az ezredfordulón VII. szakmai kihívásaink a XXI. század elején, Sopron, 2008. szeptember 25-27., P-129 13
8. Kovács K, Stampf Gy, Klebovich I, Antal I, Tölgyesi L, Pollreisz F, Ludányi K. Mikonazol tartalmú parenterális készítmény bomlásának vizsgálata HPLC-MS módszerrel. Elválasztástudományi Vándorgyőlés 2008, Sárvár, 2008. november 5-7., P-26 9. Kovács K, Stampf Gy, Antal I, Klebovich I, Tölgyesi L, Ludányi K. Antifungális szert tartalmazó parenterális készítmény stabilitásvizsgálata és bomlástermékeinek szerkezet-azonosítása HPLC és HPLC-MS módszerrel. PhD Tudományos Napok, 2009, Budapest, 2009. március 30-31., E- VI/7 10. Kovács K, Stampf Gy, Antal I, Klebovich I, Ludányi K. Development of a parenteral solution for the solubilization of azole compounds. PharmSciFair Young Scientists meeting, Nizza, 2009. június 8-9., P- DDT-17 11. Kovács K. Rossz vízoldékonyságú antifungális szert tartalmazó parenterális készítmény formulálási vizsgálata. IX. Clauder Ottó Emlékverseny 2009, Budapest, 2009. április 23.-24. 14
12. Kovács K, Stampf Gy, Antal I, Klebovich I, Ludányi K. The importance of solubilizing capacity on the composition optimization and stability testing of a parenteral antifungal solution. 7th World Meeting on Pharmaceutics, Biopharmaceutics and Pharmaceutical Technology, Valletta, Malta, 2010. március 8-11., P- 253 13. Kovács K, Stampf Gy, Antal I, Klebovich I, Ludányi K. The importance of solubilizing capacity on the composition optimization and stability. 6. PhD-Symposium, Bécs, Austria, 2010. június 16-17., P-133 Egyéb jegyzetek, közlemények 1. Stampf Gy, Nikolics M, Kovács K, Antal I, Klebovich I. (2007) Parenterális gyógyszerformák és készítmények., Egyetemi jegyzet IV. éves gyógyszerészhallgatók részére. ISBN 978 963 9656 45 3. 2. Stampf Gy, Kovács K. (2007) Aktualitások és érdekességek a magyar állategészségügyben. Supplementum-Továbbképzı folyóirat gyógyszertári asszisztensek r., 1: 7-11. 3. Stampf Gy, Kovács K. (2007) A parenterális készítmények vízellátása, Gyógyszerészet, 51: 142-146. 15
4. Stampf Gy, Kovács K, Antal I, Klebovich I. (2007) A dioxin mint jelentıs veszélyforrás. Gyógyszerészet 51: 549-553. 5. Stampf Gy, Kovács K. (2008) Az élelmiszer-biztonság jelentısége és szerepe. Studium és practicum 2: 4-8. 6. Stampf Gy, Kovács K. (2009) Természetes eredető anyagok az állatgyógyászatban. Gyógyszerészet, 53: 19-22. 7. Stampf Gy, Kovács K. (2009) Nem mellékes hatások. Studium és practicum, 6: 24-25. 8. Kállai N, Luhn O, Dredán J, Kovács K, Lengyel M, Antal I. (2009) Evaluation of drug release from coated pellets based on isomlat, sugar and microcrystalline cellulose inert cores. AAPS PharmSciTech, 11: 383-391. (IF (2009): 1,190) Egyéb elıadások 1. Stampf Gy, Kovács K, Antal I, Klebovich I. A dioxin közegészségügyi és környezetvédelmi problémái. Congressus Pharmaceuticus Hungaricus XIII., Budapest, 2006. május 25-27., P-119 16
2. Stampf Gy, Kovács K. A dioxinok keletkezése és élettani jelentıségük. Gyógyszerkémiai és Gyógyszertechnológiai Szimpózium, Eger, 2006. szeptember 18-19., E-8 3. Stampf György, Kovács K. A parenterális készítmények gyártásának GMP követelményei. Mezıgazdasági Szakigazgatási Hivatal Központ, Állatgyógyászati Termékek Igazgatósága, Inspektorátus, Info Nap, Budapest, 2007. augusztus 29., E-3 4. Stampf Gy, Kovács K. A nazális gyógyszeradagolás fejlıdése hatás és compliance. Boehringer Ingelheim továbbképzés, Siófok, 2008. március 7. 5. Stampf Gy, Kovács K. Gyógyszertechnológiai problémák a veteriner készítmények formulálásánál. Gyógyszerkémiai és Gyógyszertechnológiai Szimpózium 2008, Zalakaros, 2008. szeptember 29-30., E-12. 6. Stampf Gy, Kovács K, Dredán J, Klebovich I, Antal I. A gyógyszertechnológia oktatás helyzete a Semmelweis Egyetemen. MTA Gyógyszerkémiai és Gyógyszer-technológiai Szimpózium, 2009, Tapolca, 2009. szeptember 28-29. 17
7. Kovács K, Kállai N, Klebovich I, Antal I, Stampf Gy: Izomalt, mint liofilizálási vázképzı anyag értékelése. Congressus Pharmaceuticus Hungaricus XIV., Budapest, 2009. november 11-13., P-56 8. Kállai N, Luhn O, Kovács K, Nagy Z, Dredán J, Klebovich I, Antal I. Isomalt as starter core for sustained drug release delivery system. 6. PhD-Symposium, Bécs, Austria, 2010. június 16-17., P-117 18
Köszönetnyilvánítás Köszönetet szeretnék mondani témavezetımnek, Dr. Ludányi Krisztinának, akivel az elsı perctıl kezdve hatékonyan tudtam együtt dolgozni. Külön köszönet azért, hogy a közös munka során mindig értékes tanácsokkal látott el és mindig készen állt segíteni. Köszönettel tartozom Dr. Stampf Györgynek, akitıl szintén értékes szakmai tanácsokat kaptam és szakmai elhivatottságával példát mutatott. Köszönet illeti Dr. Klebovich Imre professzor urat és Dr. Antal István docens urat, akik lehetıvé tették, hogy a Gyógyszerészeti Intézetben végezzem kutatói munkámat. Köszönöm a Gyógyszerészeti Intézet dolgozóinak minden segítségét és támogatását. Továbbá köszönetet szeretnék mondani Nagy Zsombor Kristófnak (BMGE), aki az elektronmikroszkópos mőszeres mérések elvégzésében nyújtott nélkülözhetetlen segítséget. Végül szeretnék köszönetet mondani Szüleimnek és Feleségemnek a sok szeretetért, bíztatásért és önzetlen segítségért, amit tılük kaptam. 19