Polimerlánc egyensúlyi alakja Az a makroállapot, amely a legtöbb mikroállapottal valósítható meg (legvalószínűbb állapot) DNS molekulák fluoreszcencia mikroszkóp alatt Féregszerű polimermodell (Wormlike chain) WLC (wormlike chain): θ(s) ha s elég nagy, cosθ () s s függvényében lecseng: cosθ () s = exp s l p =perzisztencia hossz l p ha s<<l p, akkor cosθ () s ~1, és a θ(s) szög körül fluktuál. Ha s>>l p, akkor cosθ () s ~, azaz θ(s) és 36 közötti értékeket ugyanolyan valószínűséggel vehet fel. A perzisztencia hossz értelme: az a hossz, amelyen belül a lánc megtartja irányát (emlékszik rá). A perzisztencia hosszon túl a lánc elfelejti irányítottságát. s EI = hajlítómerevség (E = Young modulus - anyagfüggő, I = keresztmetszet másodrendű nyomatéka - alakfüggő); k BT = termikus energia Értelme: minél merevebb egy lánc, annál nagyobb távolságon (l p) lesznek csak észlelhetők a termikusan gerjesztett fluktuációk. A globális alak és rugalmasság között összefüggés van l = perzisztencia hossz (hajlítómerevséget jellemzi) L = kontúrhossz Entropikus rugalmasság vizualizálása Csomókötés egyetlen DNS láncra Merev lánc l>>l Mikrotubulus mikrogyöngy mozgatható lézercsipeszben Fáziskontraszt kép Fluoreszcencia kép Szemiflexibilis lánc l~l Aktin filamentum Flexibilis lánc l<<l DNS molekula mikrogyöngy stacionárius lézercsipeszben Kinosita Group
A humán genom fizikai mérete A tanteremnyi modell-sejtre adaptálva: Idealizált sejt: 2 μm oldalfalú kocka Analógia - Tanterem: 2 m oldalfalú kocka A DIFFÚZIÓ SPECIÁLIS ESETE: REPTÁCIÓ Reptáció: polimér hálóban történő kígyószerű diffúzió. (Reptilia: hüllők) DNS vastagsága 2 nm 2 mm DNA teljes hossza 2 m 2 km Perzisztenciahossz (LP) 5 nm 5 cm Átlagos vég-vég hossz 32 μm 32 m Girációs sugár (RG) 13 μm 13 m Tehát: az egyensúlyi alakú DNS nem férne el a sejtben. Teljesen kompakt DNS (elméletileg legkisebb) térfogata (2 mm alapterületű, 2 km hosszú henger térfogata): 8 m 3 (2 m élhosszúságú kocka) A DNS-t a sejtben csomagolni szükséges Egyedi nukleoszóma partikulum: hiszton fehérjekomplex (oktamer) + ~1.6-ször köré tekeredett DNS 2 L N τ r = μ k T τ r = Reptációs idő, egy kontúrhossznyi távolság megtételéhez szükséges idő; L = kontúrhossz; N= elemi szegmensek száma; μ = lánc mozgékonyság; kt = termikus energia D r = ( a N ) τ r 2 D r = Reptációs diffúziós állandó; N= elemi szegmensek száma; a = elemi szegmens hossz (~perzisztenciahossz); τ r = reptációs idő. N.B.: számláló az átlagos négyzetes elmozdulással analóg. Polimerizáció Alegységek összeállásának folyamata Polimerizációs egyensúlyok 1. valódi equilibrium A polimerizáció fázisai: 1. Lag fázis: nukleáció 2. Növekedés fázisa 3. Equilibrium (egyensúly) fázisa 2. dinamikus instabilitás: folyamatos, lassú növekedést követő katasztrofikus depolimerizáció Polimer mennyiség Equilibrium Növekedés Lag Idő 3. Treadmilling: taposómalom
Dinamikus instabilitás Mikrotubulusok In vivo treadmilling Gary Borisy Aktin GFP-aktin Speckle microscope Clare Waterman-Storer Microtubulusok Gary Borisy Motilitás aktin polimerizációval Intracelluláris patogének mozgása Motilitás aktin polimerizációval In vitro körülmények Listeria monocytogenes F-aktin jelölés phalloidinnel Shigella flexneri Listeria Xenopus extraktumban ActA-val aszimmetrikusan bevont mikrogyöngy Xenopus extraktumban ActA-val szimmetrikusan bevont mikrogyöngy Xenopus extraktumban ActA: A protein expressed by the bacterium Listeria monocytogenes that is responsible for the "rocketing" motility of the bacterium throughout the eukaryotic host cell. In addition to other host proteins, ActA binds actin directly.
Erőkifejtés citoszkeletális filamentum polimerizációjával A polimerizációs erő megmérhető Brown-féle kilincskerék mechanizmus m k be δ k ki F Diffúzió K(F) = erő jelenlétében fennálló disszociációs állandó - az a monomer koncentráció, amelynél a nettó filamentum növekedés. K c = kritikus koncentráció ( erőnél); F = erő; δ = diszkrét növekedés egyetlen monomer beépülésekor. k BT = termikus energia. N.B.: F lehet + vagy -. A folyamat lehet reakcióvezérelt (a k be-hez képest túl gyors diffúzió) vagy diffúzióvezérelt (a k be-hez képest lassú diffúzió). MT-depolimerizáció-vezérelt erőkifejtés MCAK: MT-depolimerizáló kinezin MCAK: Kinezin-13 A MT + végéhez kötődik Diffúziós mechanizmussal keresi meg a + véget ATP-t hidrolizál MT depolimerizációt szabályoz ( katasztrófa-faktor ) MT-indukált MT depolimerizáció Vezikulum transzport MT depolimerizációval Kromoszóma (kinetochore) mozgatás MT depolimerizációval Diffúziós keresés a MT mentén (GFP-MCAK)
Tematika Az élő sejt fizikai Biológiája: motorfehérjék, egyensúlytól távoli folyamatok Kellermayer Miklós Motorfehérjék működése. A munkaciklus Egyensúlytól távoli folyamatok. Erővezérelt fehérjegombolyodás. Bemutatások: in vitro motilitási próba. Az atomerőmikroszkóp. Titin kitekerés AFM-mel. MOTORFEHÉRJÉK A motorfehérjék típusai 1. Specifikus citoszkeletális filamentumhoz kapcsolódnak (DE ) 2. Elmozdulást és erőt generálnak 3. Kémiai energiát használnak fel 4. Kémiai energiát közvetlenül alakítják mechanikai munkává (nincs közbülső hővagy elektromos energia) 1. Aktin alapú Miozinok: Konvencionális (miozin II) és nem-konvencionális Miozin szupercsalád (I-XXIV osztályok). Plusz vég irányába mozognak. 2. Mikrotubulus alapú a. Dineinek: Ciliáris (flagelláris) és citoplazmáris dineinek. A mikrotubulus mentén a minusz vég irányába mozognak. b. Kinezinek: Kinezin szupercsalád: konvencionális és nem-konvencionális. A mikrotubulus mentén a plusz vég irányába mozognak. c. Dinaminok: MT-függő GTPáz aktivitás Biológiai szerep: vakuoláris fehérjeválogatás (pinchase enzimek)? 3. DNS alapú mechanoenzimek DNS és RNS polimerázok, vírus kapszid csomagoló motor, kondenzinek A DNS fonal mentén haladnak és fejtenek ki erőt 4. Rotációs motorok F1F-ATP szintetáz Bakteriális flagelláris motor 5. Mechanoenzim komplexek Riboszóma
In vitro aktomiozin motilitás processzív A miozin szupercsalád 5% homológia a tagok között Myosin Actin filament Microscope coverslip HMM 1 mm ATP 3 mm MgCl2 "konvencionális" 2-fejű Immobile fraction Mobile fraction (1.3 μm/s) Minusz vég irányába mozog A miozin II A miozin fej (Subfragment-1) 2 db alfa-hélixből coiled-coil könnyűláncok nyaki v. pánt régió Regulatórikus könnyű lánc (RLC) ATP-kötő zseb csupasz zóna miozin fejek miozin fejek Nyak (erőkar) Aktin-kötő hely miozin farok Esszenciális könnyű lánc (ELC) Konverter domén A motor domén mutációi hipertrofiás kardiomiopátiához vezetnek.
Dineinek Típusok: axonemális és citoplazmáris. Sok alegységes fehérjék (Mr~5 kda) A minusz vég irányába mozognak. Koordinált működésük meghajlítja a ciliumot. minusz vég irányába mozog Processzív motorok. Plusz vég irányába mozognak. Vesicular transport Switch domén: hasonlóság a miozinhoz és G-fehérjékhez. Dinaminok DNS Motorok Vakuoláris fehérjeválogatás GTPázok Processzív motorok T7 DNS Polimeráz pinchase funkció RNS Polimeráz RNS Polimeráz, Wang et al. 1998.
Vírus portális motor Különleges DNS motor DNS mechanoenzimek Kondenzinek SMC fehérjecsalád SMC = "structural maintenance of chromosomes" φ29 bacteriofág portális motor MukBEF nanomechanika és kondenzációs model ROTÁCIÓS MOTOROK I: F1F-ATP SZINTETÁZ 2 nm ATP 2 nm ATP Diszkrét 12 rotációs lépések Kinosita
ROTÁCIÓS MOTOROK II: Bakteriális flagellum motor Mechanoenzim komplex Riboszóma Wen et al. Nature 28 2.7 nm-es lépések (egy triplett).78 s transzlokációs idő Transzlokációval csatolt helikáz aktivitás Fordulatszám: > 2 rpm Fogyasztás: 1-16 W Hatásfok: > 8% Energiaforrás: protonok Titin: rugalmas molekuláris gyöngyfüzér Izomköteg PEVKdomén Izomrost Miofibrillum Egyensúlytól távoli folyamatok: erővezérelt fehérjekitekeredés és gombolyodás Összehúzódás Z Vékony filamentum M Szarkomer Vastag filamentum Z Titin I-szakaszbeli szegmens tandem Ig-régió tandem Ig-régió Ig-domén (7-szálú ß-hordó)
Erő (pn) 1 8 6 4 2 6 55 5 45 4 Titinmolekula nanomechanikája lézercsipesszel ~28 nm 1.75 1.8 1.85 Erőválasz Nemlineáris rugalmasság Domén kitekeredés C A F.5 1 1.5 2 2.5 Megnyúlás (µm) B E D Nemlineáris rugalmasság Erővezérelt szerkezetváltozások: Nemlineáris rugalmasságra szuperponált domén kitekeredés A-B C D E F 3 2 1 2 pn Titin I55-62 rekombináns fragmentum kitekerése Kitekerési erő Erővezérelt fehérje-kitekeredés ΔL G Natív állapot x ß F unf = k BT x β k off Fx ß ln Tranzíciós állapot Kitekert állapot Reakció koordináta rx β k B T k unf A domének egymás után, a mechanikai stabilitásuk növekvő sorrendjében tekerednek ki. 5 nm ΔL = 29,8 ± 3,5 nm Titin I55-62: viszkoelasztikus molekulaszakasz A mechanikai stabilitás biológiai logikája Szerkezetet összetartó H-hidak párhuzamos csatolása Nagy kitereredési erő Az I55-62 fragmentum kitekeredési görbéje 2 15 Gyakoriság 3 1 2 5 1 ΔL 1 2 3 Kitekeredési erő (pn) 4 Mechanikai stabilitás alapja: Szerkezetet összetartó H-hidak soros csatolása Alacsony kitereredési erő 2 pn 5 nm ΔL = 29,8 ± 3,5 nm Az Ig domén első és utolsó ß-láncait összetartó, párhuzamosan csatolt H-hidak
Titin nanomanipulálás erővisszacsatolt lézercsipesszel sulfo-sanpah keresztkötővel bevont latex gyöngy mozgatható mikropipetta T12 anti-titin ellenanyaggal bevont gyöngy titin Mért jel (+/-) (erő) Vezérelt kimenet (+/-) (piezo mogás) Referencia jel (erő) Σ Feedback vezérlés Csapdázott gyöngy Mozgatott gyöngy Megnyúlás (nm) Erő (pn) Konstans-erő kísérlet egyetlen titinmolekulán 12 8 4 3 25 2 15 1 Kvázi erőrámpa High-force clamp Low-force clamp Kiteredési görbe Visszatekeredési görbe..2.4.6.8 1. x1 6 Idő (1 3 s) ~2-perces adatsor Megnyúlás (nm) Erő (pn) Titin kitekeredés konstans erőnél 1 4 38 36 34 32 3 28 26 Monoexponenciális Singleexponential görbeillesztés fit Megnyúlás (nm) 182 1696 159 1484 ~28 nm lépcsők 15 2 25 3 x1 3 5 1 15 2 25 x1 3 A várttól eltérések mutatkoznak a lépcsőméret eloszlásban, a monoexponenciális idő-megnyúlás görbe lefutásában és az erőfüggő sebességi állandó összefüggésben. Freqency Rate constant (s -1 ) 3 25 2 15 1 5 1.1 Lépcsőméret eloszlás 28.2 ± 14.6 SD Megnyúláslépcsők többsége: egyedi doménkitekeredési esemény 1 2 3 4 5 6 Step size (nm) Erőfüggő sebességi állandók 94 97 1 13 Feedback force (pn) Erő (pn) Megnyúlás (µm) Doménkitekeredés hirtelen ugrásokban Kitekeredési ugrások Doméncsoportok korrelált szerkezeti elrendeződést mutatnak fej farok 1.6 Topografikus magasság (nm) 1.2.8.4 Autokorreláció függvény 4-4 2 4 6 8 Axiális távolság (nm) Kellermayer et al. BBA Bioenergetics 23 5-1 doménből álló csoportok kooperatíven tekeredhetnek ki.
Szerkezeti átmenetek alacsony erőnél Megnyúlás (µm) Nagy lépcső (>1 nm) Elsimult átmenet Az elsimult és nagy, lépcsőszerű átmeneteket a PEVK doménben kialakuló rövid- és hosszútávú elektrosztatikus kölcsönhatások okozhatják, amelyek a mechanikai fáradás alapjául szolgálnak. 8 pn 7 pn 6 pn 5 pn 4 pn 3 pn 2 pn 1 pn 5 pn Erő (pn) Erő (pn) Molekuláris fáradás Domén kitekered és Sima Nagy lépcső T12 9D1 (PEVK) Megnyúlás (μm) Z Trombitás et al. J. Struct. Biol. 1998. Titin T12 és 9D1 ellenanyagokkal megragadva Megnyúlás (μm) Megnyúlás (nm) Titin gombolyodás konstans erőnél Erő (pn) 1 2 15 1 5 Kitekert állapot Gyors kontrakció (entrópikus kollapszus) Szerkezeti fluktuációk (A fázis időtartama rövidül az erő csökkenésével) Végső kontrakció (ritkán tapasztalható) Teljesen feltekert állapot 3 4 5 6 7 8 9 x1 3 Az erőt ~3 pn alá kell csökkenteni jelentős domén visszatekeredéshez. A fluktuáció diffuzív keresés a konformációs térben. Részleges viszatekeredés: doméncsoportok kooperatívan tekeredhetnek. Kitekeredés Erő (pn) Megnyúlás (μm) Erő (pn) Megnyúlás (μm) Fluktuációk Domén unfolding ~7 nm 4 pn Fluktuációk Részleges refolding A visszatekeredési útvonal változatos még egyetlen molekula esetén is Megnyúlás (nm) Erő (pn) 1 15 1 5 Erővezérelt ki- és visszatekeredés 6 8 1 12 14 16 18 x1 3 Titinben: -Kooperatív kitekeredés -Mechanikai fáradás -Diffuzív keresés a konformációs térben -Kooperatív visszatekeredés -Mechanikai erő és random fehérjeszakaszok modulálhatják a gombolyodás folyamatát