IZOMSZÖVET MINTÁK VÍZTEREINEK NMR SPEKTROSZKÓPIÁS VIZSGÁLATA HÁZINYÚLBAN

21 IZOMSZÖVET MINTÁK VÍZTEREINEK NMR SPEKTROSZKÓPIÁS VIZSGÁLATA HÁZINYÚLBAN GYARMATI T. 1, ANDRÁSSYNÉ BAKA G. 2, ROMVÁRI R. 2, TAKÁCS I. 2 1 PATE Állattenyésztési Kar, Kisállattenyésztési Tanszék, 7400 Kaposvár,Guba S. u. 40. 2 PATE Állattenyésztési Kar, Diagnosztikai Központ, 7400 Kaposvár Guba S. u. 40. E-mail: gyarmati@atk.kaposvar.pate.hu ABSTRACT NMR spectroscopy examination of water spaces in rabbit muscle tissue samples In the course of this experiment muscle samples were taken at two examination times, at birth and during the growing period, from the posterior part of the m. longissimus dorsi (m. LD.) and from the lateral part of the m. quadriceps femoris (m. QF.). In addition to the above sites, samples were also taken from the m. soleus (m. S.) of adult rabbits. NMR proton spectroscopy examinations were performed to enable the tissue water spaces to be depicted. The measurements included the recording of T1 and T2 relaxation times and the multiexponential analysis of T2 curves performed for the purposes of the quantitative examination of the water fractions. The results obtained, which should be considered to be of a preliminary nature, indicated that T1 relaxation times for the tissue samples decreased in parallel with advancing age in the rabbits, in line with changes in the water content of the samples. On analysis of the T2 relaxation times it was established that in the newborn rabbits the proportions of the strongly and weakly bound components in samples taken from the m. LD. and the m. QF. were almost the same (49 % and 51 % respectively). Subsequently, in the growing rabbits the two tissue samples were observed to differ significantly from each other in these proportions (79 % and 21 % respectively); in adult rabbits the proportion of strongly bound components could again be regarded as identical (77 % and 76 % respectively). Water spaces in the red muscle tissue examined (m. S.) were found to differ from those in the white muscle tissue (m. LD. and m. QF.) in areas where the proportion of the weakly bound components was significantly higher (44 % and 56 % respectively). BEVEZETÉS Karunkon a 80-as évek óta folynak műszeres vizsgálatok a vágóérték in vivo becslésére és a test összetételének meghatározására. A CT-vel végzett kutatások a vágóérték meghatározása mellett már a különböző testalkotó szövetek, illetve kémiai testösszetevők változásának vizsgálatára is lehetőséget adnak. Az általunk végzett NMR spektroszkópiás mérések jól kiegészíthetik a non-invazív eljárásokkal (TOBEC, CT, MRI) elérhető eredményeket a különböző szöveti összetevők (víz, zsír) vonatkozásában. A húsminőséget első közelítésben a ph-val, a víztartóképességgel és a színnel jellemezhetjük (BLASCO és mtsai., 1990). Élő szervezetekben alkotórészként jelenlévő víz jelentősen különbözik az egyszerű oldatokban lévő víz állapotától. Az extra- és intracelluláris vizterek között- a vízmolekulák rendezettsége, struktúrálódása és mobilitása, a víz- és makromolekula közötti kapcsolat alapján - pontosan szabályozott kapcsolat áll fenn. A víztartó képesség a húsnak az a képessége, hogy különböző környezeti viszonyok között (aprítás, hőmérséklet, préselési nyomás) a saját kolloidálisan kötött vizét megtartani képes. A hús víztartó és vízkötő képessége fontos minőségi tulajdonság a feldolgozás és tárolás során, hiszen a különböző módon kötött szöveti víz eltérő technológiai eljárásokat igényel az eltérő húsfeldolgozási eljárások esetén. Biológiai rendszerekben a vízkompartment dinamikus változásai az NMR relaxációs paraméterekkel jellemezhetők. Az NMR mérések során T1, T2 relaxációs idők felvétele történik. A T2 görbék multiexponenciális analízisekor az izomban található gyorsan és lassan relaxálódó

22 komponensek különithetők el, melyeket az izomban található különböző víztereknek foghatunk fel. CAPOZZI és mtsai. (1996) eredményei szerint a nyulak hosszúhátizom szöveteinek gyengén- és erősen kötött víztartalma is magasabb, mint azt a sertéseknél tapasztalták. Megállapításuk szerint az erősen kötött víztartalom és a csepegési veszteség negatív korrelációban áll. Miután utóbbi képezi a veszteségek legnagyobb hányadát, ezért a technológiákban azt a legkisebb mértékre kell csökkenteni. Harántcsíkolt izmok esetében három izomtípus különíthető el: αr, αw, βr. A β-típus lassú kontrakciójú, az α-típus gyors (ASHMORE és DOERR S 1971). Az R-típusú izom (R=red) oxidatív típusú, a W (W=white) pedig glikolitikus anyagcsere típusú. Amíg a fehérizom legnagyobb arányban αw típusú rostokat, addig a vörösizom pedig αr vagy βr típusú rostokat tartalmaz. Jelen vizsgálatunkban célul tűztük ki újszülött-, növendék-, és kifejlett nyulak eltérő anyagcsere típusú, valamint kontrakciós és relaxációs idejű (αw és βr) izom szöveti víztereinek NMR spektroszkópiás vizsgálatát, a minták víztartalmának meghatározását. Az első lépcsőben metodikai jellegű kísérletben a szabad, illetve a kötött víz mennyiségének növekedésbiológiai szempontból fontos változásait vizsgáltuk. Ilyen jellegű mérési adatok házinyúlnál nem ismeretesek. ANYAG ÉS MÓDSZER Vizsgálatainkat a PATE Diagnosztikai Központjában végeztük. A kísérletekhez a PATE ÁTK Kísérleti telepéről származó Pannon fehér vegyes ivarú nyulakat használtunk. Az újszülött nyulakból (n=24) közvetlen születés után, még szoptatás előtt, a túlaltatást követően (SBHketamin; 50 mg/testsúly kg intracardialis alkalmazásával) szövetmintákat vettünk a m. longissimus dorsi (m.ld.) posterior részéből (αw-típus), a quadriceps femoris (m.qf.) laterális részéből (αw-típus). A növendék korcsoportban (n=10) a mintavétel a fentiekkel megegyező volt. A kifejlett nyulak esetében (n=9) az előző két izomcsoporton kívül még az m. soleus-ból (m.s.) (βr-típus) is történt mintavétel. Az izomminták víztartalmát 105 o C-on súlyállandóságig történő szárítással határoztuk meg. A minták analízise a mintavételt követően a szöveti víztartalom és az 1 H NMR relaxációs idő szempontjából történt. Mivel a relaxációs idő az idő függvényeben igen erősen változik a méréseket a mintavételt követően azonnal elvégeztük. A T1 és T2 relaxációs idők mérésére Bruker gyátmányú Minispec PC 140 NMR spektroszkópot (40 MHz) használtunk. A T1 relaxációs időt inversion recovery, a T2 relaxációs időt CPMG szekvenciával határoztuk meg. Az NMR spektroszkópiás vizsgálatokat követően a különböző mobilitású vízfrakciók mennyiségi vizsgálatát a T2 relaxációs görbék multiexponenciális analízisre alapoztuk. A víztartalmat nedvsúly %-ban fejeztük ki. A relexációs idők statisztikai feldolgozását az SPSS programcsomaggal végeztük. EREDMÉNYEK ÉS MEGBESZÉLÉSÜK Ismert tény, hogy emlős fajokban az újszülött egyed szöveteinek víztartalma a felnőtt egyedektől eltérő, azoknál jóval magasabb. A korai posztnatális fejlődés során is igen gyors

23 változások következnek be, az első hetekben az újszülött egyed szöveteinek víztartalma fokozatosan csökken és adott szövettípustól függően a felnőttre jellemző értékek néhány hét, illetve hónap elteltével alakulnak ki (nyilvánvalóan fajtól függően). Az 1. ábrán látható módon a különböző szövetminták víztartalma az életkor előrehaladtával csökken. 85 80 Víztartalom, % 75 70 65 Újszülött Növendék Kifejlett 3-D Column 2 m.qf. m.ld. 1.ábra/ Fig. 1. Különböző szövetminták vízszázalék értékeinek változása az életkor függvényében (Changes in water percentage values for various tissue samples as dependent of age) Az m.ld. esetén nagyobb arányú csökkenés figyelhető meg, mint a combizomban (m.qf.). EL-GAMMAL és mtsai. (1984) 1 és 9 hónapos életkor között vizsgálták a mellső és hátulsó lábakból, valamint a hátizomból vett izommintákat. Eredményeik szerint az életkor előrehaladtával mindhárom testrészben csökkent a nedvességtartalom. BERÉNYI és mtsai. (1996) újszülött nyulak különböző szöveteinek víztereit vizsgálták. Megállapították, hogy folyadékvisszatartás esetén (születés után nem szoptatott kisnyulakban) az izomszövet víztartalma állandó volt, a máj víztartalma és T2 relaxációs ideje emelkedett. PARIGI-BINI és mtsai. (1992) comb és hosszú hátizom összetételét vizsgálva 9 és 13 hetes kor között a minták víztartalmának csökkenését tapasztalták. SZENDRŐ és mtsai. (1996) 2,2-3,5 kg-os intervallumban Pannon fehér nyulak hosszú hátizom és combizom kémiai összetételét vizsgálták. Mindkét minta esetében a víztartalom az állatok fejlődésével csökkent (hosszú hátizom esetén 75,3%-ról 74,2%- ra, combizom esetén 74,6%-ról 74,2%-ra változott). A 2. ábra a T1 relaxációs idő változását szemlélteti. Eredményeink szerint a nyulak életkorának növekedésével a T1 relaxációs idő a szöveti víztartalommal összefüggésbencsökken. A m.qf. és m.ld-ra jellemző T1 érték napos korban a legmagasabb, mely növendék korra mindkét izom esetében 30 %-kal csökken. A fejlődés további fázisaiban a csökkenés kismértékű. m.qf-nél 3,5%-os csökkenés, a m.ld-nál 7%-os csökkenést tapasztaltunk. A m.s-ra jellemző T1 relaxációs időt csak kifejlett korban vizsgáltuk, miután az izom mérete a pontos mintavételt csak ebben az életkorban tette lehetővé.

24 1.20 T1 relaxációs idő sec 1.00 0.80 0.60 0.40 újszülött növendék kifejlett m.qf. m.s. m.ld. 2. ábra/fig. 2. T1 relaxációs idő változása különböző szövetekben az életkor függvényében (Changes in T1 relaxation time in various tissues as dependent on age) POLAK és mtsai. (1988) nyulak vörös és fehér izomszöveteinek víztaratalmát és a T1, T2 relaxációs idejét vizsgálták. A soleusból vett minta (vörös izom) esetén a T1 és T2 relaxációs idő is hosszabb volt, mint fehér izom esetén. A soleus vizsgálatakor a T1 idő és a víztartalom között r = 0,67 es korrelációt állapítottak meg, a T2 idő és a víztartalom között nem volt szignifikáns összefüggés. Első megközelítésben a gyorsan és lassan relaxálódó komponenseket az izomban található különböző víztereknek foghatjuk fel. A gyorsan relaxálódó komponensek a szövetek erősen kötött víztartalmára, a lassan relaxálódók a szövetek gyengén kötött víztartalmára utalnak. A komponensek arányainak eltolódása a vízterek egymáshoz való viszonyát jelenti, az időállandók változása az egyes vízterekben lévő víz mozgászsabadságáról informál. BERÉNYI és mtsai. (1996) eredményei szerint bőrben, vázizomzatban és májban található szöveti víztartalom egyaránt 34 40%. A minták triexponenciális analízise során megállapították, hogy azokban a gyengén kötött víz aránya dominál (bőr: 48-64%, izom 54-65%, máj 45-63%), arányaiban ezt követi a szabad víztartalom (bőr 26-45%, izom 23-32%, máj 20-25%) és a kötött vízmennyiség (bőr 6-14%, izom 10-16%, máj 14-33%). A szabad, a gyengén és erősen kötött víz tehát egymással összefüggésben áll, mennyiségük és arányuk függ az életkortól, a folyadékfelvételtől és a szövettípustól. Eredményeink alapján megállapítható, hogy mind a m.ld., mind a m.qf. esetében az első korcsoportban a lassan és gyorsan relaxálódó komponensek aránya csaknem megegyezik: 51 illetve 49% (3. és 4. ábra). A növendék és kifejlett korcsoportban mindkét minta esetén a gyorsan relaxálódó komponensek aránya magasabb. A m.ld. esetén már a második korcsoportban látható a különbség, növendék korra a gyors komponensek aránya szignifikánsan magasabb (48 és 77%) és a nyulak fejlődésével már nem változik jelentősen. (77 illetve 76%). Ebben az izomcsoportban tehát a gyorsan relaxálódó komponensek növendék korra elérik maximum értéküket, míg m.qf. esetén ez csak a kifejlett

25 korra történik meg. Ez arra enged következtetni, hogy a két izomcsoport fejlődése ebből a szempontból eltérő. A lassú komponensek vagyis a gyengén kötött víz aránya mindkét minta esetében a kor előrehaladtával csökken. A m.qf. esetén a második és a harmadik korcsoport között jelentős mértékű a csökkenés, m.ld. esetén már növendék korra szignifikánsan kevesebb a gyengén kötött víz aránya. gyors lassú gyors lassú 100% 80% 60% 40% 20% 100% 80% 60% 40% 20% 0% 0% Újszülött Növendék Kifejlett Újszülött Növendék Kifejlett 3. ábra/fig. 3. 4. ábra/fig. 4. A quadriceps femoris T2 relaxációs A longissimus dorsi T2 biexponenciális idejének idejének biexponenciális analízise analízise (Biexponencial analysis of T2 relaxation times for thigh muscle) (Biexponencial analysis of T2 relaxation times for longissimus) d i l ) A kísérlet során vizsgált harmadik izomszövet (soleus) az egyetlen általunk vizsgált élettanilag vörösizom kategóriába sorolt szövet. A vörösizmok kisebb átmérőjű rostokat tartalmaznak ezenkívül foszfolipid tartalmuk is magasabb, mint a fehérizmoké. Több mitokondrium és mioglobin található bennük. Ennek eredményeként színük sötétebb, ízük erősebb és nedvességtartalmuk is magasabb. A vörösizmokban (melyek felnőtt állatokban oxidatív jellegüek) a születést követően az oxidatív enzimaktivitás nő, 30 napos életkor után csökken, míg a glikolitikus enzimaktivitás felnőtt korig nagyon alacsony szinten marad (BACOU és VIGNERON, 1976; cit. DALLE ZOTTE, 1993). A m.s-ból vett minta eltérő tulajdonságokat mutatott a T2 idő biexponenciális analizise során a másik két izomszövethez (fehérizom) képest. Az 5. ábra szerint, a kifejlett korcsoportban a soleusban a gyengén kötöt víz 27%-kal magasabb az erősen kötött komponensekhez képest. Új kísérleti irányt jelent az NMR spektroszkópia alkalmazása a gazdasági haszonállatok izomszöveti víztereinek vizsgálatában. Jelen metodikai jellegű vizsgálatainkat követően további kísérleteket tervezünk a növekedés során bekövetkező vízkompartment változások részletes jellemzésére. A kapott spektroszkópiai eredmények, élelmiszertechnológiai szempontból is igen értékesek, miután a különböző húsfeldolgozási eljárások során az eltérő módon kötött szöveti víz eltérő technológiai eljárásokat igényel. Az eltérő anyagcsere típusú (oxidatív, glikolítikus) izomrostok vizsgálatakor kapott eredmények igen érdekesek, figyelemmel arra az elméletre, amely szerint a gyors növekedésre történő szelekció a glikolitikus út előtérbe kerülését segíti. Utóbbi, részben az intracelluláris zsírok hiánya miatt csökkenő víztartóképességgel jár együtt.

26 80 70 60 50 % 40 30 20 10 0 m.qf. m.ld. m.s. gyors lassú 5. ábra/fig. 5. T2 idők biexponenciális analízise különböző izomcsoportokban (Biexponential analysis of T2 relaxation times for various muscle groups) IRODALOMJEGYZÉK ASHMORE C. R., DOERR L., 1971. Exp. Neurol., Vol. 30, 441-446. BERÉNYI E., SZENDRŐ ZS., RÓZSEHEGYI P., BOGNER P., SULYOK E., 1996. Postanal Changes in Water Content and Proton Magnetic Resonance Relaxation Times in Newborn Rabbit Tissues. Pediatr. Res., Vol. 39, 1-7. BLASCO A., Ouhayoun J., Masoero G., 1993. Harmonization of criteria and terminology in rabbit meat research. World Rabbit Science, 1:1, 3-10. CAPOZZI F., CAVANI C., LUZI F., MAERTENS L., 1996. Suitability of low resolution nuclear magnetic resonance to assess water holding capacity of rabbit meat. 2 nd International Conference of Rabbit Production in Hot Climates. Adana DALLE ZOTTE A., OUHAYOUN J. 1993. Postweaning evolution of muscular energy metabolism and related physico-chemical traits in rabbit. 5. Nyúltenyésztési Tudományos Nap, Kaposvár. 15-22. EL GAMMAL F. M., MAKLED M. N., ABDEL-NABY M. A., 1984. Chemical composition of rabbit meat as effected by age, sex and carcass cuts. Indian Journal of Animal Sciences. 54:3, 227-229. PARIGI BINI R., XICCATO G., CINETTO M., DALLE ZOTTE A., 1992. Effect of slaughter age and weight on carcass and meat quality of the commercial rabbit. J. Appl. Rabbit Res., Vol. 15, 819-826. POLAK J. F., JOLESZ A., ADAMS D., 1988. NMR of Skeletal Muscle. Differences in Relaxation Parameters Related to Extracellular / Intracellular Fluid Spaces. Invest. Radiol., Vol. 23, 107-112. SZENDRŐ ZS., RADNAI I., BIRÓ NÉMETH EDIT, ROMVÁRI R., MILISITS G., 1996. Changes in water, protein, fat and ash content in the meat of rabbits between 2,2 and 3,5 kg live weight. 6 th World Rabbit Congress, Toulouse, Vol. 3, 269-272.