BUDAPESTI MŰSZAKI ÉS GAZDASÁGTUDMÁNYI EGYETEM rtogonális védőcsoportstratégia heparin és heparánszulfát oligoszacharidok szintézisére Doktori (PhD) értekezés Készítette: Tatai János Témavezető: Dr. Fügedi Péter Magyar Tudományos Akadémia Kémiai Kutatóközpont Biomolekuláris Kémiai Intézet Szénhidrátkémiai sztály 2008.
TARTALMJEGYZÉK RÖVIDITÉSEK JEGYZÉKE 1. BEVEZETÉS 5 2. IRDALMI ÁTTEKINTÉS 7 2.1. A heparin és a heparánszulfát biológiai szerepe 7 2.1.1. A heparin és a heparánszulfát szerkezete 7 2.1.2. A heparin és a heparánszulfát fehérjékkel való kölcsönhatása 10 2.1.2.1. Kölcsönhatás antitrombin III fehérjével 11 2.1.2.2. Kölcsönhatás fibroblaszt növekedési faktorokkal 12 2.2. A heparin és heparánszulfát oligoszacharidok szintézise 14 2.2.1. LIduronsav szintézisek 15 2.2.2. Glikozilezés Liduronsav glikozil donorokkal 21 2.2.3. Szintézisstratégiák heparin és heparánszulfát oligoszacharidok előállítására 24 3. CÉLKITŰZÉS 30 4. SAJÁT VIZSGÁLATK 32 4.1. rtogonális védőcsoportstratégia kidolgozása: heparin diszacharidok szintézise 32 4.1.1. LIduronsav glikozil donor szintézise 32 4.1.2. Glikozilezés: védett diszacharid szintézise 39 4.1.3. Szabad heparin diszacharidok szintézise 40 4.1.3.1. Az αlidopa(2s 3 )(1 4)αDGlcpN származékok szintézise 41 4.1.3.2. Az αlidopa(1 4)αDGlcpN(6S 3 ) származékok szintézise 43 4.1.3.3. Az αlidopa(2s 3 )(1 4)αDGlcpN(6S 3 ) és az αlidopa(1 4)αD GlcpN származékok szintézise 44 4.2. Az ortogonális védőcsoportstratégia kiterjesztése: fibroblaszt növekedési faktorok feltételezett triszacharid ligandumainak szintézise 46 4.2.1. LIduronsav glikozil akceptor szintézise 48 4.2.2. 2Azido2dezoxi glikozil donor szintézise 50 4.2.3. Glikozilezés: védett triszacharid szintézise 52 4.2.4. Szabad heparin triszacharidok szintézise 53 2
4.3. Új glikozilezési módszer: tioglikozidok aktiválása Me 2 S 2 Tf 2 promóterrel 55 4.3.1. Tioglikozidok aktiválása kén atom tartalmú elektrofilekkel 55 4.3.2. Me 2 S 2 Tf 2 promóterrel aktivált glikozilezési reakciók 59 5. ÖSSZEFGLALÁS 66 6. KÍSÉRLETI RÉSZ 68 7. A DLGZAT ALAPJÁUL SZLGÁLÓ KÖZLEMÉNYEK 99 8. IRDALMJEGYZÉK 100 3
RÖVIDITÉSEK JEGYZÉKE absz. abszolut Ac acetil All allil ATIII antitrombin III Bn benzil Boc tercbutoxikarbonil BSP 1fenilszulfinilpiperidin Bz benzoil CAN cérium(iv)ammóniumnitrát ClAc klóracetil CSA kámforszulfonsav d dublett DDQ 2,3diklór5,6dicián1,4benzokinon DMAP 4dimetilaminopiridin DMF N,Ndimetilformamid DMTST dimetilmetiltioszulfóniumtriflát EGF epidermális növekedési faktor Et etil ekv. ekvivalens FGF fibroblaszt növekedési faktor FGFR fibroblaszt növekedési faktor receptor Fmoc (9fluorenilmetiloxi)karbonil GlcpA glükopiranoziluronsav GlcpN 2amino2dezoxiglükopiranóz (glükózamin) H heparin HDTC hidrazinditiokarbonát HS heparánszulfát IdopA idopiranoziluronsav Lev levulinoil m multiplett Me metil MeTf metiltriflát MPBT S[(4metoxi)fenil]feniltioszulfinát MPh (4metoxi)fenil Ms mezil 1 NAP (1naftil)metil 2 NAP (2naftil)metil 1 Naph 1naftil NIS Njódszukcinimid NMR mágneses magrezonancia p olvadáspont PDC piridiniumdikromát Ph fenil Phth ftaloil Piv pivaloil Pyr piridin s szingulett 4
t TBDMS TBDPS tbu TEMP TfN 3 Tf 2 THF TMSTf Tr Ts UDP VRK Z tercier tercbutildimetilszilil tercbutildifenilszilil tercbutil 2,2,6,6tetrametil1piperidiniloxi, szabad gyök trifluormetánszulfonsavazid trifluormetánszulfonsavanhidrid tetrahidrofurán trimetilszililtriflát tritil tozil uridindifoszfát vékonyrétegkromatográfia benziloxikarbonil 5
1. BEVEZETÉS Az elmúlt kéthárom évtizedben a szénhidrátok biokémiai szerepe alapvetően átértékelődött. Míg korábban e vegyületcsoportot szinte kizárólag energiaforrásnak, tartaléktápanyagnak (keményítő) vagy vázanyagnak (cellulóz, kitin) tekintették, napjainkra világossá vált, hogy a szénhidrátok, a nukleinsavakhoz és a fehérjékhez hasonlóan, biológiai információt hordozó molekulák. A nagyobb polimerizációs fokú szénhidrátláncok (oligo és poliszacharidok) komplex vegyületei, a glikokonjugátumok (glikoproteinek, proteoglikánok és glikolipidek) a legkülönbözőbb élettani folyamatokban és azok szabályozásában játszanak lényeges szerepet. A glikokonjugátumok más biomolekulákkal (fehérjékkel, nukleinsavakkal, vagy esetenként éppen szénhidrátmolekulákkal) történő specifikus kölcsönhatása jelenti e folyamatok szabályozásának kulcslépését. A specifikus kölcsönhatásokért általában nem a komplex glikokonjugátum makromolekula egésze, hanem annak valamilyen kisebb oligoszacharid egysége a felelős. A specifikus felismerési folyamatokban szerepet játszó oligoszacharidok azonosítása és kémiai szintézise mind a glikobiológiai alapkutatásoknak, mind azok gyógyszerkutatási alkalmazásának elengedhetetlen lépései. A gyógyászatban véralvadásgátlóként széles körben használt heparin heterogén szerkezetű poliszacharid. Az 1980as években biokémiai vizsgálatokból arra következtettek, hogy a heparin antikoaguláns hatásáért a poliszacharidnak egy kis szerkezeti eleme, egy meghatározott szerkezetű pentaszacharid felelős, amely specifikus kölcsönhatást mutat a véralvadási kaszkádban szereplő antitrombin III (ATIII) fehérjével. Ez a pentaszacharid nem izolálható a természetes polimer kémiai vagy enzimatikus lebontásával, előállítását csak kémiai szintézissel lehetett megvalósítani. E pentaszacharidnak és számos szintetikus analógjának hatásszerkezet vizsgálata egy szintetikus pentaszacharid gyógyszerként történő bevezetését eredményezte. A heparin az antitrombin III mellett több mint száz más fehérjével is kölcsönhatásba lép, és véralvadásgátló hatása mellett számos további fiziológiai aktivitással is rendelkezik (így például gyulladásgátló, simaizom sejtek osztódását gátló, antiasztmatikus, angiogenézis gátló hatással). Általánosan elfogadott, hogy az ATIIImal való kölcsönhatáshoz hasonlóan, az egyes fehérjékkel történő kölcsönhatásokért a heparin más és más oligoszacharid egységei felelősek. Az egyes fehérjék kötődéséért felelős szénhidrát epitópok azonosítása jelenleg többnyire a heparin depolimerizációja után kapott oligoszacharid keverék szétválasztásával 6
történik. Ez a módszer a keverék komplexitása és az egyes komponensek kis mennyisége miatt rendkívül nagy nehézségekbe ütközik. Járhatóbb utat jelent a heparin oligoszacharidok előállítása kémiai szintézis segítségével. Az ismert kémiai szintézismódszerek azonban egy védett oligoszacharidból egyetlen célvegyület előállítására korlátozódtak, így nagyszámú oligoszacharid szintézisére nem alkalmasak. Az MTA Kémiai Kutatóközpont Szénhidrátkémiai sztályán heparin oligoszacharidok előállítására olyan szintézismódszert dolgoztunk ki, mellyel egyetlen központi vegyületből több végtermék állítható elő. 11 Vizsgálataink utat nyithatnak egy heparin oligoszacharid könyvtár előállítására, melynek segítségével lehetőség nyílik eddig még ismeretlen, heparin kötő endogén vagy exogén (pl. virális eredetű) fehérjék felfedezésére is. A heparin biológiai szerepének még teljesebb megértése, valamint a farmakológiai vizsgálatokban aktívnak bizonyult epitópok szerkezete, új szintetikus gyógyszerkészítmények kifejlesztésének lehet az alapja. 7
2. IRDALMI ÁTTEKINTÉS 2.1. A heparin és a heparánszulfát biológiai szerepe A proteoglikánokban különböző vázfehérjékhez glikozidos kötéssel lineáris, ismétlődő diszacharidegységeket tartalmazó, polianionos jellegű poliszacharidláncok, a glikózaminoglikánok kapcsolódnak. E makromolekulák a szervezetben elsősorban a sejtek felszínén és az extracelluláris mátrixban vannak jelen. A proteoglikánok a kötőszöveti szerkezet kialakítása mellett nagyszámú biológiai folyamatban játszanak jelentős szerepet, így például a véralvadásban, az új véredények kifejlődésében (angiogenézis), a sejtadhézióban, a növekedési faktorok szabályozásában. A proteoglikánok hatásukat általában a glikózaminoglikánok (heparin, heparánszulfát, dermatánszulfát, kondroitinszulfát, keratánszulfát, hialuronsav), fehérjékkel való kölcsönhatása révén fejtik ki. 2.1.1. A heparin és a heparánszulfát szerkezete A heparin (H) és rokon vegyülete a heparánszulfát (HS) váltakozó 2amino2dezoxi Dglükopiranóz (DGlcpN) és piranoziluronsav egységekből felépülő glikózaminoglikánok. Az uronsav vagy Dglükuronsav (DGlcpA), vagy annak C5 epimere, az Liduronsav (LIdopA). A Dglükuronsav β(1 4), az Liduronsav pedig α(1 4) kötéssel kapcsolódik a D glükózaminhoz, míg a Dglükózamin és az uronsav között α(1 4) kötés található. A H/HS szerkezetére a szénhidrát lánc szubsztitúciójának következtében nagyfokú heterogenitás jellemző. A hidroxil csoportok közül a Dglükózamin 3, és 6, míg az uronsavak 2 pozíciói szulfatálva lehetnek. A glükózamin általában Nacetilezett vagy N szulfatált formában fordul elő, de a legutóbbi időkben kimutatták, hogy az amino csoport néhány esetben nem tartalmaz helyetesítést. A heparin és a heparánszulfát jellemző diszacharid egységeinek (1 és 2) a szerkezetét az 1. ábra mutatja be. 8
H 2 C R 4 R 2 R 3 R 1 HN 2 C H R 2 R 3 R 1 HN 1 R 4 2 4)βDGlcpA(1 4)αDGlcpN(1 4)αLIdopA(1 4)αDGlcpN(1 R 1 = Ac vagy S 3 vagy H; R 2 = H vagy S 3 ; R 3 = H vagy S 3 ; R 4 = H vagy S 3 ; 1. ábra. A heparin és a heparánszulfát jellemző diszacharid egységei A H/HS a szulfát és a karboxil csoportok nagy száma miatt anionos jellegű elektrolitok. A heparin diszacharid egységenként átlagosan 2,7 szulfát csoportot tartalmaz, ezzel a legnagyobb negatív töltéssűrűséggel rendelkező biológiailag aktív makromolekulának tekinthető. A poliszacharidban az Liduronsav körülbelül kilencszer nagyobb mennyiségben van jelen, mint a Dglükuronsav. A vegyület átlagos molekulatömege 15 kda, míg átlagos töltése 75. A heparinnál általában hosszabb heparánszulfát láncon belül hozzávetőlegesen a glükózaminegységek fele Nszulfatált. Az Nszulfatált diszacharidok jellemzően egymás mellett, 39 diszacharid hosszú tartományokban (Sdomainekben) találhatók. Az Sdomainek szerkezete hasonlít a heparinra, azonban az szulfát csoportok száma kevesebb. Az S domaineket általában GlcpAGlcpNAc szerkezetű nem szulfatált régiók választják el. A heparánszulfát diszacharidonként átlagosan 1 szulfát csoportot tartalmaz, átlagos molekulatömege 30 kda. A heparánszulfátban az uronsavak közül a nem szulfatált régióknak köszönhetően a Dglükuronsav dominál. Az Sdomaineknek a fehérjék, (többek között a növekedési faktorok) felismerésben speciális szerepük van. A lineáris heparin és heparánszulfát poliszacharidlánc konformációjára a negatív töltésű csoportok miatt helikális szerkezet jellemző. A fehérjékkel ellentétben a H/HS polimerek egymással nem lépnek kölcsönhatásba, azaz tercier szerkezetről nem beszélhetünk. A H/HS oligoszacharidok proteoglikánként bioszintetizálódnak. A proteoglikán fehérje része nagyszámú szerin, és glicin aminosav egységet tartalmaz. A vázprotein (szerglicin vázfehérje) szintézise az endoplazmás retikulumban, míg a glikózaminoglikán lánc szintézise, és modifikációja a Golgihálózatban történik. Valamennyi proteoglikánban a glikózaminoglikán egy azonos szerkezetű tetraszacharid egységen a βdglcpa(1 3)βD Galp(1 3)βDGalp(1 4)βDXylp(1 Ser) tetraszacharidon keresztül kapcsolódik. 9
A bioszintézis következő lépésben a fenti tetraszacharidhoz egy aminocukor kötődik. Amennyiben az aminocukor Dglükózamin: glükózaminoglikán (heparin, heparánszulfát), ha Dgalaktózamin: galaktózaminoglikán (kondroitinszulfát, dermatánszulfát) szintetizálódik. Az H/HS bioszintézisének részletei nagy részben tisztázottak. Ismert, hogy az első D glükózaminhoz kapcsolódva, váltakozva Dglükuronsav és Dglükózamin egységek hosszabbítják a láncot. Az építőkövek a megfelelő UDPcukorról kerülnek a növekvő poliszacharidlánc nem redukáló végére. A glikozil képzést egyetlen, kétféle glikozil transzferáz aktivitással (GlcpAtranszferáz és GlcpNAc transzferáz) rendelkező enzimfehérje katalizálja. Megközelítőleg 300 monomeregység beépülése után a szénhidrátlánc elongációja befejeződik. A poliszacharid lánc elongációjával párhuzamosan folyik, a már megszintetizált egységek modifikációja (2. ábra). A folyamat során először az Nacetil csoportok jelentős hányada Nszulfát csoportra cserélődik (3 4), amit egy Ndezacetiláz/Nszulfotranszferáz aktivitással rendelkező enzim katalizál. A további átalakítások nagyrészt az Nszulfatált glükózamin, vagy az ahhoz közvetlenül kapcsolódó uronsav egységeken mennek végbe. A C 5 epimeráz hatására számos Dglükuronsav Liduronsavvá alakul (4 5). Ezt követően az uronsavak 2 (5 6), majd a glükózaminok 6 (6 7) és 3 (7 8) pozíciói a megfelelő szulfotranszferáz jelenlétében szulfatálódhatnak. A szulfotranszferáz reakciókban szulfátdonorként 3 foszfoadenozin5 foszfoszulfát szerepel. 2 C H 2 C 2 C H H H H H Ndezacetiláz/ 2 C H Nszulfotranszferáz H H H H AcHN 3 SHN 3 4 H 3 SHN H 2szulfotranszferáz 2 C H S 3 H 3 SHN 5 6 S 3 S 3 3szulfotranszferáz H H 3 S 3 SHN 2 C 3 SHN H C5 epimeráz 6szulfotranszferáz S 3 S 3 7 8 2. ábra. A heparin és a heparánszulfát bioszintézise 10
A fenti bioszintetikus lépések nem mennek végbe minden diszacharid egységen teljes mértékben. A bioszintézisnek ez a tökéletlensége vezet a heparin nagymértékű heterogenitásához. A heparint 24 különböző diszacharid egység építi fel amelyek az 1. táblázatban láthatók. GlcpA GlcpNAc IdopA GlcpNAc GlcpA GlcpNAc6S 3 IdopA GlcpNAc6S 3 GlcpA GlcpNS 3 IdopA GlcpNS 3 GlcpA GlcpNS 3 6S 3 IdopA GlcpNS 3 6S 3 GlcpA GlcpNS 3 3S 3 IdopA GlcpNS 3 3S 3 GlcpA GlcpNS 3 3,6diS 3 IdopA GlcpNS 3 3,6diS 3 GlcpA2S 3 GlcpNAc IdopA2S 3 GlcpNAc GlcpA2S 3 GlcpNAc6S 3 IdopA2S 3 GlcpNAc6S 3 GlcpA2S 3 GlcpNS 3 IdopA2S 3 GlcpNS 3 GlcpA2S 3 GlcpNS 3 6S 3 IdopA2S 3 GlcpNS 3 6S 3 GlcpA2S 3 GlcpNS 3 3S 3 IdopA2S 3 GlcpNS 3 3S 3 GlcpA2S 3 GlcpNS 3 3,6diS 3 IdopA2S 3 GlcpNS 3 3,6di S 3 1. táblázat. A heparint és heparánszulfátot felépítő diszacharid egységek A 24 diszacharidból tetraszacharid szinten 576, hexaszacharidok esetén 13824 különböző szerkezet jöhet létre, így poliszacharid szinten a heparinban előforduló szerkezeti variációk száma csillagászati számokat ér el. A bioszintézis fenti tökéletlensége azonban korántsem véletlen, a képződő heparin szerkezeti diverzitása a bioszintézis során igen jelentős mértékben kontrollált. 2.1.2. A heparin és a heparánszulfát fehérjékkel való kölcsönhatása A heparin véralvadásgátló tulajdonsága miatt az egyik leggyakrabban használt gyógyszer a thromboemboliás betegségek megelőzésében, illetve kezelésében. A véralvadásgátlás mellett a H/HS számos további fiziológiai aktivitással is rendelkezik (pl. gyulladásgátló, simaizom sejtek osztódását gátló, angiogenézis gátló, antivirális hatás). E folyamatokban a H/HS a sejtek felületén vagy az extracelluláris mátrixban különböző fehérjékhez kötődik, és fontos szerepet játszik a fehérjék biológiai aktivitásának kifejtésében és annak szabályozásában. Napjainkig már több mint száz H/HS kötő fehérjét azonosítottak. Általánosan elfogadott, hogy az egyes fehérjék a H/HS poliszacharidláncok különböző szerkezetű oligoszacharid egységeihez képesek kötődni. Számos esetben a kölcsönhatás 11
rendkívül specifikus. Így a H/HS biológiai hatásának sokféleségét és azok specifikusságát illetően a H/HS olyan kulcscsomónak tekinthető, ami számos zárat nyit. A H/HSfehérje kötődés során elsősorban ionos kölcsönhatások alakulnak ki a H/HS negatív töltésű szulfát és karboxil csoportjai, valamint az aminosavak között, de sok esetben nem ionos kölcsönhatások, pl. hidrogén kötés, vagy e rendkívül poláros vegyületektől nem várt apoláros kötőerők is jelentős mértékűek lehetnek. Az egyes fehérjék felismeréséhez elengedhetetlen a H/HS negatív töltésű funkciós csoportjainak megfelelő orientációja. A H/HS molekula nem merev, a különböző fehérjék kötődéséhez a poliszacharidláncon belül található Liduronsavegységek konformációs flexibilitása nagyban hozzájárul. Az Liduronát gyűrű kitüntetett konformerjei ( 4 C 1, 1 C 4 és 2 S 0 ) a 3. ábrán láthatók. Az Liduronsav konformációját az iduronsavnak, valamint a szomszédos glükózaminnak a szulfát szubsztituensei is befolyásolják. H H C 2 H S 3 2 C H H H S 3 2 C H S 3 H H 9a 4 C 1 9b 1 C 2 4 9c S 0 3. ábra. Az Liduronsav 2szulfát kitüntetett konformerjei A konformerek közül az 1 C 4 és a 2 S 0 energetikailag kedvezményezett. Az 1 C 4 és 2 S 0 konformerek közötti energiagát olyannyira alacsony, hogy például FGF2 fehérjéhez kötődő heparin hexaszacharid kristályszerkezetében két IdopA2S 3 egység közül az egyik 1 C 4 míg egy másik 2 S 0 konformációt mutat. 2.1.2.1. Kölcsönhatás antitrombin III fehérjével A heparin jól ismert véralvadásgátló hatása a poliszacharidnak az antitrombin III (ATIII) fehérjével történő kölcsönhatásának az eredménye. Az ATIII a véralvadási szerin proteáz inhibitorok csoportjába tartozó fehérje. Az ATIII kovalensen kötődik a véralvadási kaszkádban szereplő trombin, illetve az aktivált Xa faktor aktív centrumához, és inaktiválja ezeket a fehérjéket. Az ATIII önmagában nem túlságosan hatékony inhibitor, azonban heparin jelenlétében az ATIII konformációja megváltozik, ezért az enzimgátlás akár 2000 szeresére nőhet. 12
Az antitrombin aktiválásához nem szükséges a heparin molekula egésze. Az ATIIIhoz való kötődésért a poliszacharid egy kisebb pentaszacharid egysége a felelős. E pentaszacharid (10) szerkezetét az 1980as években határozták meg (4. ábra). A heparinantitrombin kölcsönhatás nagymértékben specifikus, kis változtatások a pentaszacharid szerkezetében a biológiai aktivitás jelentős megváltozásához, esetenként teljes elvesztéséhez vezetnek. Az ATIIIkötő pentaszacharid azonosítása gyógyszerkutatási szempontból igen jelentős volt. E kutatások a szintetikus pentaszacharid (11) Arixtra (Fondaparinux sodium) néven gyógyszerként történő bevezetéséhez vezettek 2001ben (4. ábra). A 10 pentaszacharid önmagában csak a Xa faktor ATIII reakciót katalizálja. A trombin inaktiválásához egy, a pentaszacharidot tartalmazó, legalább 16 monomeregységből álló heparin oligoszacharid szükséges, amelyhez egyszerre kötődik az ATIII és a trombin. A kialakult hármas komplexben jön létre a kovalens kötés a trombin és az ATIII között. Mivel a trombinantitrombin komplex affinitása a heparinhoz kicsiny, a heparin szabaddá válik és felhasználódhat egy következő reakcióban. S 3 H H S 3 R 2 HN H 2 C H S 3 2 C NHS 3 3 S H S 3 H 3 SHN R 1 10 R 1 =H; R 2 =Ac 11 R 1 =Me; R 2 =S 3 4. ábra. Az ATIIIkötő pentaszacharid és az Arixtra szerkezete 2.1.2.2. Kölcsönhatás fibroblaszt növekedési faktorokkal A soksejtű, differenciált sejteket tartalmazó szervezetek számára alapvető fontosságú, hogy sejtjeik a megfelelő időben és módon szaporodjanak, és funkcióiknak megfelelően specializálódjanak. Ezen folyamatok szabályozása túlnyomórészt extracelluláris kémiai jelek, többek között növekedési faktorok segítségével történik. A növekedési faktorok a sejtek által termelt és kibocsátott olyan fehérjék, melyek génaktivációt vagy inaktivációt, növekedést vagy fejlődést indíthatnak azokban a sejtekben, amelyek felszínén a faktort megkötő receptorok vannak. 13
A növekedési faktorok azokról a sejtekről kapták nevüket, amelyeken először sikerült a hatásukat megmutatni. Például az epidermális növekedési faktor (epidermal growth factor EGF) hatását elsőként bőrsejteken, a fibroblaszt növekedési faktor (fibroblast growth factor FGF) hatását kötőszöveti sejteken írták le. A fibroblaszt növekedési faktorok a sejt differenciálódásban és proliferációban, a morfogenézisben, illetve az angiogenézisben (új véredények formálása már meglévő erekből) fejtik ki hatásaikat. Napjainkig leginkább a savas (FGF1) és a bázikus (FGF2) fibroblaszt növekedési faktorok és a HS között lejátszódó kölcsönhatásokat tanulmányozták. Ezekben a folyamatokban a HS kisebb oligoszacharid egységei specifikusan kötődnek mind a fibroblaszt növekedési faktorokhoz, mind azok receptoraihoz (FGFR). A HS, FGF, FGFRból létrejött hármas komplex transzdukciós szignált eredményez, ennek következtében jön létre a biológiai válasz. A hármas komplexekről több röntgendiffrakciós felvétel is készült. Az FGF fehérjék kötődéséért felelős HS oligoszacharidok azonosítása és szerkezetének meghatározása ugyancsak intenzív vizsgálatok tárgya. Stack és munkatársai a természetes poliszacharid részleges depolimerizációjával és gélkromatográfiás frakcionalizálásával HS di, tetra, hexa, okta és dekaszacharid frakciókat különítettek el. Megállapították, hogy az FGF2 fehérje kötődéséhez in vitro legalább HS hexaszacharid fragmensek szükségesek. A hexaszacharid frakcióból azonosították a 12 szerkezetű molekulát (5. ábra), amely mind az FGF1, mind az FGF2 fehérjéhez nagy affinitással kötődik. 2 C H H H S 3 S 3 NH 3 S 2 C H S 3 H S 3 NH 3 S 2 C H S 3 S 3 H NH 3 S H 12 5. ábra Az FGF1 és FGF2 fehérjéhez kötődő hexaszacharid szerkezete További vizsgálatokból ismert, hogy az FGF1 és FGF2 fehérjék megkötődéséhez az idopiranoziduronil2szulfát csoportok jelenléte eszenciális. Valószínűsíthető az is, hogy az FGF2 fehérjéhez olyan HS oligoszacharidok kötődnek nagy affinitással, amelyeknek glükózamin egységei 6 pozícióban nem szulfatáltak. 14
Az FGF1 és FGF2 fehérjék minimális HS ligandumainak szerkezetére (13 illetve 14) Lindahl 2001ben tett javaslatot. A feltételezett triszacharid szekvenciákat a 6. ábra mutatja. 2 C H H S 3 NH 3 S 2 C H H S 3 2 C H H H NH 3 S 2 C H H S 3 H S H S 3 3 13 14 6. ábra A feltételezett FGF1 és FGF2 kötő heparin triszacharidok szerkezet rnitz és munkatársai szintetikus HS oligoszacharidok FGF fehérjékkel összefüggő aktivitását vizsgálták. Eredményeik alapján HS di és triszacharidok, és akár nem szulfatált HS származékok is hatásosak lehetnek. 2.2. A heparin és heparánszulfát oligoszacharidok szintézise Az egyes fehérjékhez kötődő H/HS oligoszacharid szekvenciák meghatározásához ismert szerkezetű H/HS oligoszacharidok szükségesek. A természetes poliszacharid nagyfokú heterogenitása miatt tiszta H/HS oligoszacharidok izolálása csak rendkívül nagy nehézségek árán valósítható meg a polimer kémiai vagy enzimatikus lebontásával. Járhatóbb utat jelent a H/HS oligoszacharidok előállítása kémiai szintézis segítségével. A H/HS oligoszacharidok szintézise egy sor problémát vet fel a közönséges oligoszacharid szintézisekhez képest. A szintézisekhez szükséges monomerek, különösen az Liduronsav és a 2azido2dezoxiDglükóz előállítása csak hosszadalmas szintézisekkel lehetséges. A glikozilezési reakciók is problematikusak: az uronsavak glikozilezési reakciókban köztudottan rossz glikozil donorok, a kialakítandó (1 4)kötésekben a glikozil akceptorok C4 hidroxilja általában csekély reakcióképességet mutat. További kihívást jelent a megfelelően szulfatált végtermék (szulfoforma) kialakítása is. A következőkben az Liduronsav szintézisekre kidolgozott legismertebb módszereket, különböző típusú Liduronsav glikozil donorral végrehajtott glikozilezési reakciókat, valamint a H/HS oligoszacharid szintézisekhez rendelkezésre álló stratégiákat mutatom be. 2.2.1. LIduronsav szintézisek 15
A glikózaminoglikánok egyik alapvető alkotóeleme az Liduronsav szabad állapotban nem fordul elő a természetben, és a vegyület a kereskedelemben sem hozzáférhető. A heparin oligoszacharidok szintéziséhez szükséges Liduronsav származékokat kémiai szintézissel kell előállítani. Mivel e szintézisekhez mind glikozil donorként, mind glikozil akceptorként védett származékok szükségesek, az Lido konfiguráció kialakítása a védőcsoportok bevitelével párhuzamosan történik. Az Liduronsav szintézisére kidolgozott jelentősebb szintézismódszereket az alábbiak szerint csoportosíthatjuk: 1. Megfelelően funkcionalizált Dglükofuranóz származékok C5 atomját S N 2 reakcióban invertálva, majd a kapott Lidóz származékot C6on oxidálva állíthatók elő. Az inverzió és oxidáció sorrendje megcserélhető, az oxidált Dglükofuranoziluronsav C5 atomját szubsztituálva ugyancsak Liduronsav szintetizálható. 2. DGlükuronsav származékok C5 helyzetű gyökös szubsztitúciója, majd C5 redukciója szintén Liduronsav származékokat eredményez. 3. Az 5,6 telítetlen exoglükál (Dxylohex5enopiranóz) származékokon a C5 C6 kettős kötésre történő addícióval, és C6 oxidációjával. 4. Öt szénatomot tartalmazó αdxilodialdózok lánchosszabbításával, és az ezt követő oxidációval A különböző módszereket egyegy példa segítségével a következőkben mutatom be: 1. van Boeckel és munkatársai 1,2:5,6diizopropilidénαDglükofuranózból (15) kiindulva 4 lépésben szintetizálták a 6acetil3benzil1,2izopropilidén5mezilαDglükofuranózt (19) (7. ábra). A terméket káliumtercbutiláttal kezelve, az acetil csoport lehasadásával keletkező primer alkoholát nukleofil támadást intéz C5 ellen. Az intramolekuláris nukleofil szubsztitúcióban, a meziloxi csoport távozásával, a 20 Lido epoxid keletkezett. A termék savas hidrolízise során az epoxid gyűrű felnyílása a C5 atom konfigurációjának retenciója mellett ment végbe. Az alkalmazott reakciókörülmények között, az izopropilidénacetál hidrolízise szimultán módon lejátszódott (21). Acetilezést követően a képződött izomerelegyből oszlopkromatográfiás tisztítás után a 22 piranózt izolálták, amelyet 23 Lidozil bromiddá alakítottak. 16
R 3 R 2 R 1 Bn R Bn R Ac Bn Br 15 16 17 18 19 R 1 =H; R 2,R 3 =C(CH 3 ) 2 R 1 =Bn; R 2,R 3 =C(CH 3 ) 2 R 1 =Bn; R 2 =R 3 =H R 1 =Bn; R 2 =R 3 =Ms R 1 =Bn; R 2 =Ms; R 3 =Ac R R Ac 20 21 R=H 23 22 R=Ac Ac 7. ábra LIdóz származék szintézise C5 invertálásával A 8 lépésben (15 23) szintetizált Lidozil bromiddal a 24 1,6anhidro vegyületet KoenigsKnorr körülmények között glikozilezték (8. ábra). A termék diszacharidot (25) további 7 lépésben funkcionalizálták, és csak ekkor alakították az Lidóz részt Liduronsavvá (26) (C6 oxidáció, észteresítés). Ac Br Bn Ac Ac Bn + H N 3 Ac Bn Bn N 3 7 lépés 23 24 Ac Ac 25 Bn Me 2 C Bn N 3 Lev Ac 26 8. ábra. LIduronsav tartalmú diszacharid szintézise Sinaÿ és munkatársai C5 inverzióját nem Dglükózon, hanem az oxidált származékon, Dglükuronsavon végezték (9. ábra). Szintézisük során a 27 tritilétert glükuronsavvá oxidálták (28). Dezacetilezés (29) és észterezés (30) után a szekunder alkoholból trifluormetánszulfonsavésztert (31) állítottak elő, amely C5ön különösen jól kilépő triflát 17
csoportot (Tf) tartalmaz. A triflát csoportot S N 2 reakcióban trifluoracetát csoportra cseréltek (32), majd a trifluoracetil csoport eltávolításával a 33 Liduronsav származékhoz jutottak. R 2 R 1 Bn R C 2 H Bn R C 2 Me Bn C 2 Me R Bn 17 R 1 =R 2 =H 27 R 1 =Ac; R 2 =Tr 28 R=Ac 29 R=H 30 R=H 31 R=Tf 32 33 R=CF 3 C() R=H 9. ábra LIduronsav szintézise Dglükuronsavon keresztül MartínLomas és munkatársai a 33 vegyület szintézisét a kereskedelmi forgalomban kapható Dglükuronolaktonból (34) kiindulva valósították meg (10. ábra). A kiindulási anyagot a 35 izopropilidén származékká alakították, majd a szabad hidroxilt trifluormetánszulfonilezték (36). A triflát csoportot pivaloil csoporttal (Piv) szubsztituálva a 37 idóz származékot kapták, majd a laktongyűrűt, a Piv sérülése nélkül trietilamin metanolos oldatával nyitották fel (38). Azért, hogy a laktongyűrű visszaalakulását elkerüljék, a benzilezést nem a szokásos bázikus körülmények között, hanem HBF 4 jelenlétében fenildiazometánnal, illetve a későbbiek során TfH jelenlétében benziltriklóracetimidáttal hajtották végre (39). A pivaloil csoport hasításával jutottak a 33 Liduronsav származékhoz. H H R Piv 34 H 35 R=H 37 36 R=Tf C 2 Me Piv H C 2 Me Piv Bn C 2 Me H Bn 38 39 33 10. ábra LIduronsav szintézis Dglükuronolaktonból kiindulva 18
A bemutatott szintézisekben problémát jelent az Lidofuranóz vegyületek piranóz származékká alakítása. Az izopropilidén védőcsoport hidrolízise ugyanis az anomer hidroxil felszabadítását eredményezi. Ennek következtében a termékelegyben az anomerkeverék piranóz származékok mellett a furanóz származékok is megtalálhatók. Az anomer hidroxil blokkolásával kapott izomerelegy kromatográfiás tisztítása csak rendkívüli nehézségek árán lehetséges. 2. Sinay és munkatársai 40 Dglükuronsavat gyökösen brómozták (11. ábra). A kapott 41 5 bróm származék redukciója a kiindulási 40 Dglükuronsav és a 42 Liduronsav elegyét eredményezte. A termékelegyből a 42 Lido komponenst 30%, a 40 Dglüko komponenst 63%os hozammal tudták izolálni. Mivel a redukció közel sem diasztereoszelektív, e módszert a későbbiek során nem terjedt el Liduronsavak előállítására. Ac Me Me 2 C Ac Ac C 2 Me Me C 2 Me Br Ac Me Ac 42 + Ac Ac Ac 40 41 Ac Ac Ac C 2 Me Me Ac 40 11. ábra LIduronsav származék szintézise gyökös brómozással 3. Jacquinet és munkatársai a 46 szubsztituált exoglükál vegyületet a 45 6jód származékból HI eliminációjával állították elő (12. ábra). A szabad hidroxil szililezését követően a 47t hidroborálva jutottak 48 Lido származékhoz. A reakciót 9borabiciklo[3.3.1]nonánnal hajtották végre. A termékelegyben Lido (48) : Dglüko (49) 9:1 arányt mértek. A vegyületek szétválasztása nehézkes oszlopkromatografálással lehetséges. Az 48 Lidóz komponenst Jones oxidációval (50) és az azt követő észteresítéssel alakították 51 vegyületté. 19
H I H Bn H Bn R Bn H Me R Me Bz Me 43 H Bn Me 44 R=H 45 R=Bz + TBDMS Bn H 46 R=H 47 R=TBDMS TBDMS 48 Bz 49 Bz Me R 2 C Bn Me TBDMS Bz 50 R=H 51 R=Me 12. ábra Liduronsav származék szintézise hidroborálással 4. Bonnaffé és munkatársai a Dglükózból előállítható 3benzil1,2izopropilidénαDxilodialdózra (52) fémorganikus vegyületekkel karbonsav ekvivalens Cnukleofileket addícionáltattak (13. ábra). Vinilmagnéziumbromid addíciója során az 1:1 arányban képződött Lido (53) és Dglüko (54) származékokat oszlopkromatográfiával választották el. Az 53 Lidokomponensből két lépésben az 56 acetilezett piranóz származékot kapták. A kettős kötés ózonidos bontásával nyert aldehidet (57) oxidálva, majd a kapott karbonsavat (58) észteresítve jutottak az 59 Liduronsav származékhoz. 20
HC Bn H Bn + H Bn 52 53 54 H Bn Bn R HC Bn Ac R R Ac Ac 53 55 56 R=H R=Ac 57 R 2 C Bn Ac Ac 58 59 Ac R=H R=Me 13. ábra LIduronsav származék szintézise lánchosszabbítással Az 52re Grignard reagens helyett trisz(feniltio)metillítiumot addícionálva viszont sztereoszelektíven a 60 Lidotioortoészter képződött (14. ábra). Az tioortoészterből CuCl 2 /Cu katalizátor felhasználásával alakították ki 33 észtert. Az izopropilidén csoport hidrolízisével kapott izomerelegyből a βpiranóz forma (61d) kristályosodik. Az acetilezést optimalizált körülmények között végrehajtva, az 59b βpiranózt jó termeléssel (94%) izolálták. 21
PhS SPh SPh C 2 Me HC Bn H Bn H Bn 52 60 33 C 2 Me C 2 Me H H H H Bn Bn Bn Bn Me 2 C Me 2 C H H H H H H H 61a 61b 61c 61d H Me 2 C Bn Ac Ac Ac 59b 14. ábra LIduronsav származék szintézise lánchosszabbítással A bemutatott irodalmi példák illusztrálják, hogy az Liduronsav származékok szintézise meglehetősen bonyolult kémiai probléma. A heparin oligoszacharidok szintéziséhez szükséges Liduronsav származékok nagy mennyiségben történő előállítására jelenleg nem áll rendelkezésre jó hozamú, egyszerű módszer. 2.2.2. Glikozilezés Liduronsav glikozil donorokkal A H/HS oligoszacharid szintézisekhez szükséges Liduronsav monomerek minél egyszerűbb előállítása mellett, további erőfeszítéseket tettek a glikozilezési reakciók hozamának javítására is. Ilyen vizsgálatok keretében Sinaÿ és munkatársai különböző Liduronsav glikozil donorok előállítását és glikozilezési tulajdonságait tanulmányozták. Azt találták, hogy az iduronsav triklóracetimidátjával (62) valamint 4pentenilglikozidjával (65) sikeresen végrehajtható a glikozilezés, ezzel szemben a megfelelő fluorid (67), tioetil (68) és tiofenil (71) származékok nem eredményezték a várt diszacharidokat (15. ábra). 22
Me 2 C Bn NH CCl 3 + H Bn Ac TMSTf Me 2 C Bn Bn Ac N 3 Me Lev Ac 62 N 3 63 Me Lev Ac 64 Me 2 C Bn + H Bn Ac NIS+TfH Me 2 C Bn Bn Ac N 3 Me Lev 65 Bz N 3 63 Me Lev Bz 66 Ac Me 2 C Bn F + H Bn Ac BF 3 Et 2 Me 2 C Bn Bn N 3 Me Lev Ac 67 N 3 63 Me Lev Ac 64 SEt Bn Me 2 C Lev Bz + Ac H Bn N 3 Me DMTST Me 2 C Bn Ac Bn N 3 Me 68 69 Lev Bz 70 Me 2 C Bn SPh + H Bn Ac DMTST Me 2 C Bn Bn Ac N 3 Me Lev Bz 71 N 3 Me Lev Bz 63 66 15. ábra. Glikozilezés különböző Liduronsav donorokkal 23
A kapott eredmények alapján azt a következtetést vonták le, hogy a tioglikozidok nem alkalmasak Liduronsav donorként H/HS oligoszacharidok szintézisére. Napjainkban a H/HS oligoszacharid szintézisekben szinte kizárólag triklóracetimidát származékokkal glikozileznek. Az általunk bevezetett, a későbbiekben részletesen bemutatott ortogonális védőcsoportok használatán alapuló szintézisstratégiában azonban a labilis glikozil donorok (például: kloridok, bromidok, imidátok) használata problémát jelenthet. Szintézisstratégiánk különböző védőcsoportok kombinációjával funkcionalizált, monomer építőegységek előállítását igényli. A védőcsoportmanipuláció során stabilis glikozil donorok (például: tioglikozidok, szelenoglikozidok, 4pentenilglikozidok) alkalmazása indokolt. A tioglikozidok számos előnyös tulajdonsággal rendelkeznek. Rendkívül stabil vegyületek, sok más glikozil donorral szemben bomlás nélkül tárolhatók. További előnyük, hogy a legtöbb védőcsoport átalakítás elvégezhető rajtuk, így lehetőség van különböző védőcsoportokkal funkcionalizált tioglikozidok előállítására. Igen jelentős, hogy a tioglikozidok nemcsak glikozil donorként, hanem glikozil akceptorként is használhatók és különböző módszerekkel glikozilezhetők. A tioglikozidok e tulajdonságaik miatt, mellyel más típusú glikozil donorok nem rendelkeznek, különösen hasznosak a H/HS oligoszacharidok szintézisére általunk bevezetett stratégiában. Tudomásunk szerint Liduronsav tioglikozid donorral egyedül Codée és munkatársai hajtottak végre sikeres glikozilezési reakciókat. A kapcsolások során a tioglikozidokat a közelmúltban bevezetett rendkívül reaktív 1fenilszulfinilpiperidin/trifluormetánszulfonsavanhidrid promóter alkalmazásával aktiválták. 24
2.2.3. Szintézis stratégiák heparin és heparánszulfát oligoszacharidok előállítására Egy H/HS oligoszacharidokat tartalmazó vegyületkönyvtár igen hasznos eszköznek bizonyulhat a heparinfehérje kölcsönhatások kutatásában. Segítségével meghatározható a poliszacharidláncon belül, a biológiai aktivitásért felelős minimális molekularészletek (epitópok) szerkezete. A vegyületkönyvtár alkalmazásával lehetőség nyílik eddig még ismeretlen, heparin kötő endogén vagy exogén (pl. virális eredetű) fehérjék felfedezésére is. A H/HS biológiai szerepének még teljesebb megértése, valamint a farmakológiai vizsgálatokban aktívnak bizonyult epitópok szerkezete, új szintetikus gyógyszerkészítmények kifejlesztésének lehet az alapja. A H/HS oligoszacharidokat kémiai szintézise során, a monomer szintézisek és a glikozilezési reakciók kivitelezése mellett, a legnagyobb nehézséget a megfelelően szulfatált végtermék (szulfoforma) kialakítása jelenti. A védőcsoportok megválasztása során a következő szempontokat érdemes megfontolni: A glikozil donor uronsavegységek, C2 hidroxil csoportját résztvevő csoporttal szükséges védeni, az 1,2transz interglikozidos kötés kialakítása érdekében. A glikozil donor glükózamin egységek C2 amino csoportját nemrésztvevő csoporttal kell védeni, illetve nemrésztvevő csoportként kell maszkírózni az 1,2cisz kötés kialakítása miatt. Szükséges a végtermékben a szulfatált illetve nem szulfatált hidroxil csoportokat különböző védőcsoportokkal megkülönböztetni. A védőcsoportok legyenek eltávolíthatóak szulfát funkció mellől annak sérülése nélkül. A H/HS oligoszacharidok szintézisére alkalmas első védőcsoportstratégiát Sinaÿ és munkatársai dolgozták ki. Védőcsoportstratégiájuk értelmében a kívánt H/HS oligoszacharid szintézise egy olyan, a szénhidrát vázat már tartalmazó, védett származékon keresztül valósítható meg, amelyben a végtermékben szulfatált hidroxil csoportok acetilezve, míg a végtermékben nem szulfatált hidroxil csoportok benzilezve szerepelnek. Az ATIIIhoz nagy affinitással kötődő 72 pentaszacharidnak e védőcsoportstratégia alapján a 73 védett pentaszacharid feleltethető meg (16. ábra). 25
S 3 H H S 3 3 SHN H 2 C H S 3 2 C NHS 3 3 S 72 H S 3 H 3 SHN H Ac Bn Bn Ac N 3 Ac Me 2 C Bn Ac Bn Bn Bn Me 2 C ZHN Bn N 3 Ac 73 16. ábra Az első védőcsoportstratégia heparin oligoszacharidok szintézisére A 72 heparin pentaszacharidot Sinaÿ és Petitou 6,7,79 blokkszintézis segítségével állították elő (17. ábra). A βglikozidos kötést 75 és 76 monomerek között oldhatatlan ezüstkarbonát promóter alkalmazásával alakították ki (a glikozilezés során, a donor αoldalával orientálódik a promóter felületéhez, így a nukleofil csak βoldalról támadhat). A kapott 79 diszacharidot acetolízist (80) követően glikozil bromiddá (81) alakították. A glikozil akceptorként szereplő diszacharid egységet 77 és 78 kapcsolásával, majd a C4 helyzetben lévő ideiglenes klóracetil (ClAc) csoport eltávolításával (82 83) kapták. A két diszacharid szintézis blokk kapcsolásával szintetizált 84 tetraszacharidot ismét deklóracetilezték, az így kapott 85 akceptort 74gyel glikozilezve jutottak a védett pentaszacharidhoz (73). A 73 védett pentaszacharidból az acetil csoportok a benzil éterek mellől szelektíven eltávolíthatóak. Az így kapott 86 szabad hidroxil csoportjai kéntrioxidpiridin komplexszel szulfatálhatók. A szulfatált származékból (87) a benzil csoportok katalitikus hidrogénezéssel a szulfát csoportok sérülése nélkül eltávolíthatók (88). A katalitikus hidrogénezés egyúttal a szabad aminocsoport kialakítását is eredményezi. A szabaddá vált amino csoportok vizes közegben kemoszelektíven szulfatálhatók a hidroxil csoportok mellett (89). A szintézis befejező lépésében a karboxil csoportok szabaddá tétele történik, óvatos lúgos hidrolízissel a kívánt heparin oligoszacharidot (72) eredményezve. A fentivel teljesen analóg módon történt az Arixtra első szintézise is. 26
Bn Bn Ac ClAc Bn Me 2 C Ac Me 2 C Bn tbu H Bn Ac N Bn AcCl 3 Br Br NHZ H N 3 Bn 74 75 76 77 78 Me 2 C ClAc Bn Me 2 C ClAc Bn Bn Bn R Bn Ac Me 2 C Ac 79 N 3 Bn Ac 80 R 1 =Ac; R 2 =H 81 R 1 =H; R 2 =Br N 3 R 2 R 1 Me 2 C Ac Me 2 C N 3 Ac R Bn Bn Ac 84 R=AcCl 85 R=H Ac 82 83 Bn Bn R=AcCl R=H Ac ZHN Bn Ac NHZ Bn R Bn Bn R N 3 Bn Me 2 C Bn R R Me 2 C N 3 Bn R Bn ZHN S 3 Bn 73 R=Ac 86 R=H 87 R=S 3 H H S 3 R 1 HN H Me 2 C H S 3 Me 2 C NHR 1 3 S H H S 3 R 1 HN H 88 R 1 =H; 89 R 1 =S 3 S 3 H H S 3 3 SHN H 2 C H S 3 2 C NHS 3 3 S 72 H H 3 SHN H S 3 17. ábra Az antitrombin IIIkötő pentaszacharid szintézise 27
A Sinaÿ és munkatársai által kidolgozott szintézisstratégia a későbbiekben általánosan elterjedt, szinte valamennyi heparin oligoszacharid előállítása ennek alapján történt. E szintézisek közös jellemzője, hogy egy védett oligoszacharidból csak egyetlen szulfatált oligoszacharid előállítása lehetséges, így a H/HS biológiai szerepének még teljesebb megértéséhez hasznos, nagyszámú vegyületet tartalmazó vegyülettár szintézise rendkívül munka, költség, és időigényes. Egy ilyen vegyülettár felállításához olyan szintézis módszerek kidolgozása szükséges, amelyekkel egy szintézisben nem egyetlen, hanem nagyszámú célvegyület állítható elő. Napjainkig két ilyen konvergens szintézisstratégia ismert: a moduláris, és az ortogonális szintézisstratégia. A Boons és kutatócsoportja által kidolgozott moduláris szintézisstratégia alapján húsz (90a90t) megfelelően védett diszacharidból (szintézismodulból), számos magasabb tagszámú H/HS oligoszacharid állítható elő (18. ábra). A húsz diszacharid szintézismodul előállítása hat monomerből (9196) kiindulva lehetséges. A Sinaÿ által kidolgozott védőcsoportstratégiához hasonlóan, Boons módszerénél is minden célvegyületnek egyetlen, a szénhidrát vázat már tartalmazó, védett oligoszacharid feleltethető meg. Új eredmény, hogy a védett oligoszacharidok előállítása a húsz diszacharid szintézismodulból kiindulva megvalósítható. A diszacharid szintézismodulok a C4 pozícióban (9fluorenilmetiloxi)karbonil (Fmoc), a C1 pozícióban allil (All) csoportot tartalmaznak, melyek szelektív eltávolítása révén a lánchosszabbításra nyílik lehetőség. A C3, C6, és C2 hidroxilok amennyiben a végtermékben szulfatálva szerepelnek levulinoil (Lev), ellenkező esetben rendre benzil, tercbutildifenilszilil (TBDPS), illetve acetil csoporttal vannak védve. A védett diszacharidok további hidroxil csoportjai benzilezettek. A módszere jellemző, hogy az uronsavak kialakítása (oxidáció) a szintézis utolsó lépésében történik. A szelektív oxidációt katalitikus mennyiségű 2,2,6,6tetrametilpiperidiniloxi (TEMP) és nátriumhipoklorit elegyével hajtották végre. A nagyszámú építőegység szintézise továbbra is rendkívül munkaigényes, így nem meglepő, hogy a húsz diszacharid szintézismodulból napjainkig csak hat előállításáról számoltak be. A moduláris szintézisstratégia alapján idáig mindössze néhány, alacsony tagszámú H/HS oligoszacharidot állítottak elő. 28
Fmoc Bn Bn R 1 R 2 All R 3 N 3 Szulfatált R 1 =Lev R 2 =Lev R 3 =Lev Nem szulfatált R 1 =TBDPS R 2 =Bn R 3 =Ac 90a90t NH H R 2 TBDPS N 3 91 R 2 =Bn 92 R 2 =Lev All Fmoc Bn Bn 93 R 3 =Ac 94 R 3 =Lev R 3 CCl 3 NH Bn Fmoc Bn R 3 95 R 3 =Ac 96 R 3 =Lev 18. ábra Moduláris védőcsoportstratégia heparin oligoszacharidok szintézisére CCl 3 A H/HS szerkezeti heterogenitása egyetlen fajta aminocukorból (Dglükózamin) és kétféle uronsavból (Dglükuronsav és Liduronsav) felépülő alapvázak acetil és szulfát csoportokkal történő szubsztitúciójának az eredménye. Az MTA Kémiai Kutatóközpont Szénhidrátkémiai sztályán olyan szintézismódszert dolgoztunk ki, melynek segítségével egyetlen védett oligoszacharidból nagyszámú heparin oligoszacharid állítható elő (19. ábra). E szintézisstatégiában olyan védett oligoszacharidokat szintetizálunk, melyek azokban a pozíciókban, ahol a H/HS szulfát csoportokat tartalmazhat, egymástól függetlenül, szelektíven eltávolítható úgynevezett ortogonális védőcsoportokat tartalmaznak. Az ortogonális védőcsoportok tetszés szerinti sorrendben történő eltávolítását követő szulfatálás révén, lehetőség van egyetlen védett vegyületből, az alapváz valamennyi lehetséges szulfatált formájának az előállítására. A kidolgozott szintézisterv alapján a védett 97 diszacharid (4metoxi)fenil (MPh), és benzoil (Bz) ortogonális védőcsoportokat tartalmaz az 6 illetve az 2 pozíciókban (19. ábra). A benzoil csoport szelektív eltávolítását követően a szabaddá vált hidroxil csoportot szulfatálva, majd a további védőcsoportokat eltávolítva, végül az amino csoportot kemoszelektíven acetilezve, illetve szulfatálva a 98 és 99 diszacharidokhoz jutottunk. Ugyancsak az ortogonálisan védett 97ből kiindulva, a (4metoxi)fenil szelektív hasítását követő szulfatálás révén a 100 és 101 diszacharidokat szintetizáltuk. Mindkét 29
ortogonális védőcsoportot eltávolítva a diszulfatált (102 és 103), illetve az szulfát csoportot nem tartalmazó (104 és 105) származékokat állítottuk elő. H H C 2 H S 3 H RHN Me H H C 2 H H S 3 RHN Me 98 R=Ac 99 R=S 3 100 R=Ac 101 R=S 3 Bn Bn C 2 tbu Bz Bn 97 MPh ZHN Me H H C 2 H S 3 102 R=Ac 103 R=S 3 S 3 RHN Me H H C 2 H H RHN H Me 104 R=Ac 105 R=S 3 19. ábra rtogonális védőcsoportstratégia heparin oligoszacharidok szintézisére 30
3. CÉLKITŰZÉS Az MTA Kémiai Kutatóközpont Szénhidrátkémiai sztályán heparin oligoszacharidok szintézisére ortogonális védőcsoportok használatán alapuló stratégiát dolgoztunk ki. A módszer segítségével egyetlen védett oligoszacharidból nagyszámú heparin oligoszacharid állítható elő. Bekapcsolódva az sztályon folyó kutatómunkába célul tűztük ki a 106 ortogonálisan védett Liduronsav tartalmú diszacharid és e védett diszacharidból az R 1, R 2 és R 3 csoportok valamennyi lehetséges permutációjának megfelelő heparin oligoszacharid (107114) szintézisét (20. ábra). MPh R 2 tbu 2 C Bn Bn ZHN Me Na 2 C H H R 1 HN Me Bn Bz H R 3 106 107 R 1 =Ac R 2 =H R 3 =S 3 Na 108 R 1 =S 3 Na R 2 =H R 3 =S 3 Na 109 R 1 =Ac R 2 =S 3 Na R 3 =H 110 R 1 =S 3 Na R 2 =S 3 Na R 3 =H 111 R 1 =Ac R 2 =S 3 Na R 3 =S 3 Na 112 R 1 =S 3 Na R 2 =S 3 Na R 3 =S 3 Na 113 R 1 =Ac R 2 =H R 3 =H 114 R 1 =S 3 Na R 2 =H R 3 =H 20. ábra rtogonális védőcsoportstratégia heparin diszacharidok szintézisére Védőcsoportstratégiánkat egy konkrét biológiai probléma megoldásában is alkalmazni kívántuk. Lindahl a közelmúltban tett javaslatot a savas és bázikus fibroblaszt növekedési faktorok minimális heparánszulfát ligandumainak szerkezetére (13 illetve 14). A feltételezett oligoszacharidok metil glikozidjait (116 illetve 117) a diszacharidok szintézisénél használt védőcsoportok alkalmazásával, az ortogonálisan védett 115 triszacharidon keresztül terveztük előállítani (21. ábra). 31
2 C H H S 3 NH 3 S 2 C H H S 3 2 C H H H NH 3 S 2 C H H S 3 H S 3 H S 3 13 14 tbu 2 C Bn MPh Bn tbu 2 C N 3 Me Bn Bz Na 2 C H H R Na 2 C NH S 3 Na Me H S 3 Na Bn Bz 115 H S 3 Na 116 R=S 3 Na 117 R=H 21. ábra A feltételezett FGF1 és FGF2 kötő heparin triszacharidok (116 és 117) szintézise A tioglikozidokkal végrehajtott glikozilezési reakciók hozamának javítása kulcsfontosságú a komplex oligoszacharidok, különösen a heparin származékok szintézise során. A kereskedelmi forgalomban kapható 120 dimetildiszulfid (Me 2 S 2 ) és 121 trifluormetánszulfonsavanhidrid (Tf 2 ) reakciójával ezért egy új, rendkívül aktív tiofil promótert fejlesztettünk ki (22. ábra). Az újonnan bevezetett promóterrel különböző glikozilezési reakciókat kívántunk megvalósítani, melyekben a monoszacharid, az anomer kilépő csoport, az alkalmazott védőcsoportok valamint promóter mennyiségét változtattuk. SR 1 + R 2 H Me 2 S 2 Tf 2 120 121 R 2 118 119 122 22. ábra Tioglikozidok aktiválása Me 2 S 2 Tf 2 promóterrel 32
4. SAJÁT VIZSGÁLATK 4.1. rtogonális védőcsoportstratágia kidolgozása: heparin diszacharidok szintézise A 106 ortogonálisan védett diszacharidot, a 124 parciálisan védett aglikon és a 123 tioglikozid kapcsolásával, terveztük előállítani (23. ábra). MPh SPh MPh Bn Bn Bn tbu 2 C + H ZHN Bn tbu 2 C Me ZHN Bn Bz Me Bn Bz 123 124 106 23. ábra Az ortogonálisan védett diszacharid tervezett szintézise Az irodalmi előzmények alapján az Liduronsav tioglikozidjai DMTST promóter jelenlétében nem alkalmazhatók glikozil donorként glikozilezési reakciókban. Kutatócsoportunkban ugyanakkor Dglükuronsav tioglikozidok segítségével, jó termeléssel szintetizáltak heparin oligoszacharid származékokat. A tioglikozidok előnyös tulajdonságai, elsősorban a védőcsoport átalakításokkal való kompatibilitásuk, indokolttá teszik az L iduronsav tioglikozidok felhasználását az általunk kidolgozott szintézisstratégiában. Így kívánatosnak tűnt, a 123 Liduronsav tioglikoziddal végrehajtott glikozilezési reakció, és a Sinaÿ és munkatársai által közölt eredmények részletes vizsgálata. Ezért elsőként a 123 tioglikozid szintézisét valósítottuk meg (23. ábra). 4.1.1. LIduronsav glikozil donor szintézise A 20 Lido epoxidot az irodalomból ismert módszer szerint szintetizáltuk. A szintézis első lépésében, a kereskedelmi forgalomban kapható, 1,2:5,6diizopropilidénαDglükofuranóz (15) szabad hidroxil csoportját Williamson körülmények között benzileztük (24. ábra). Az 1,2:5,6diizopropilidén acetálok 1,2izopropilidén csoportja vizessavas közegben rendszerint stabilabb a másik izopropilidén csoportnál. Ezt kihasználva 16 származékot 60%os vizes ecetsavval szobahőmérsékleten parciálisan hidrolizáltuk (17). A szabaddá vált C5 és C6 hidroxil csoportokat a szokásos módon piridinben, mezilkloriddal 33
mezileztük (18). A primer mezil csoportot szelektíven, acetil csoporttal helyettesítettük (19). A szubsztitúciót folyadékszilárd kétfázisú rendszerben, 18korona6 fázistranszfer katalizátor jelenlétében, többnapos forralás mellett valósítottuk meg. A folyadék fázis a kiindulási anyag acetonitriles oldata, míg a szilárd fázis káliumacetát volt. Az előzőekben keletkezett intermediereket tisztítás nélkül alakítottuk tovább, 19 vegyületet az átkristályosítást követően a szintézissor kiindulási anyagára vonatkoztatva 60%os hozammal izoláltuk. A 19 acetátot káliumtercbutiláttal kezelve, a C5 szénatom konfigurációjának invertálásával, a 20 Lidoepoxiddá alakítottuk. H H a H Bn b Bn c 15 16 17 Ms Ms Bn d Ac Ms Bn e Bn 18 19 20 24. ábra LIdo konfiguráció kialakítása: a: BnBr, NaH, DMF; b: 60% AcH; c: MsCl, piridin; d: KAc, 18korona6, MeCN (60%); e: KtBu, tbuh, CH 2 Cl 2 (86%) A szintézissor következő szakaszában a 20 epoxidot alakítottuk tioglikoziddá. Az első próbálkozásunk során, az átalakítást irodalmi leírások alapján három lépésben hajtottuk végre. Az első lépésben 20 epoxidot 0,1M kénsavval dioxánban 60 Con hidrolizáltuk (25. ábra). A reakcióban az epoxid gyűrű felnyílása a C5 szénatom konfigurációjának retenciója mellett ment végbe. Az alkalmazott reakciókörülmények között, az izopropilidénacetál hidrolízise szimultán módon lejátszódott. A glikozidos hidroxil felszabadítása miatt a termék oldott állapotban tautomerizálódik. A kialakult egyensúlyban a két furanóz (21b, 21c), a nyíltláncú izomer (21a), valamint a két piranóz származék (21d, 21e) egyidejűleg van jelen. A hidroxil csoportok acetilezésével keletkezett tetraacetátok elegyéből, oszlopkromatográfiás tisztítás után, a 22 anomerkeverék piranóz tautomer formát izoláltuk (α:β=9:1). A 125 tioglikozid kialakítása a 22 anomerkeverékből BF 3 Et 2 Lewis sav jelenlétében tiofenollal 34
történt. Annak ellenére, hogy C2 pozícióban résztvevő csoport (acetil) található, a szubsztitúció során ismét anomerkeverék képződött. A kívánt αanomert reakcióelegy többszöri oszlopkromatografálása után sem sikerült tisztán elkülönítenünk. Meg kívánjuk jegyezni, hogy a tioglikozid előállítása során, az anomerkeverék képződése nincs összhangban a Sinaÿ és munkatársai által közöltekkel, ahol csupán az α anomer képződése van feltüntetve. A 22 125 átalakítást a későbbiek során Kuszmann és munkatársai, valamint Codée és munkatársai szintén közölték. Az utóbbi két publikációban, a mi eredményeinkkel egyezésben, a tioglikozid képzés terméke (125) α/β anomerkeverék formában van feltüntetve. H H H Bn H Bn H Bn 20 a 21b H H H Bn H H CH H H H H CH 2 H 21c H b H Bn H 21a H Bn H H H H H 21d 21e Ac Bn Ac c Ac Bn SPh Ac Ac Ac Ac 22 125 25. ábra Tioglikozid kialakítása irodalmi leírás alapján: a: 0,1 M H 2 S 4, dioxán; b: Ac 2, piridin (61%); c: PhSH, BF 3 Et 2, CH 2 Cl 2 (76%) A tioglikozid (125) kialakítása után az 2 és 4 hidroxil csoportok funkcionalizálását hajtottuk végre (26. ábra). Az acetil csoportok eltávolítása Zemplén 35
dezacetilezéssel (metanolban, katalitikus mennyiségű nátriummetiláttal) történt. A kapott 126 triol 4es és 6os hidroxiljait, benzilidén acetál formájában blokkoltuk. A reakciót az irodalomból ismert módon, vízmentes DMFben, katalitikus mennyiségű kámforszulfonsav jelenlétében, benzaldehiddimetilacetállal hajtottuk végre. Az átacetálozás során felszabadult metanol kidesztillálásával az egyensúlyi reakciót a termékképződés irányába toltuk el. A reakcióelegy oszlopkromatográfiás tisztítása során ezúttal sem sikerült az α és β anomereket szétválasztanunk. A kapott 127 benzilidén szabad hidroxil csoportját a következő lépésben benzoileztük. A termék az eddig szintetizált Lido intermedierektől eltérően kristályosítható volt, ezt kihasználva sikerült a kívánt αanomert (128) tisztán izolálnunk. Ac Ac Bn Ac SPh a H H Bn H SPh Bn Ph 125 126 127 b H SPh c SPh Bn Bz Ph 128 26. ábra Fenil 3benzil4,6benzilidén2benzoil1tioαLidopiranózid szintézise: a: NaMe, MeH (94%), b: PhCH(Me) 2, CSA, DMF (87%); c: BzCl, piridin, CH 2 Cl 2 (86%) Az irodalmi módszer az anomer hidroxil csoport felszabadításakor bekövetkezett tautomerizáció (20 21), valamint a tioglikozidképzés során tapasztalt anomerizáció (22 125) miatt nem volt alkalmas a további szintézisekhez szükséges nagy mennyiségű tioglikozid előállítására (25. ábra). A felmerült nehézségek miatt, a tioglikozid kialakítására új szintézismódszer kidolgozására törekedtünk. Szabad aldohexózok vizes savas oldatában, formálisan vízkilépéssel, anhidro származékok, különösen 1,6anhidro vegyületek képződésére van lehetőség. Az egyensúlyi állapot beálltakor, idoszármazékok esetén, a megfelelő 1,6anhidropiranóz részaránya a 70% ot is meghaladhatja. 36