Genetikai tényezők szerepe a hangulati dimenziók és a dohányzási szokások variabilitásában

Genetikai tényezők szerepe a hangulati dimenziók és a dohányzási szokások variabilitásában Kótyuk Eszter Doktori értekezés tézisei ELTE-PPK Pszichológia Doktori Iskola Magatartáspszichológiai Program Témavezető: Dr. Veres-SzékelyAnna, habil. egyetemi docens Az ELTE-PPK Pszichológia Doktori Iskola vezetője: Prof. Dr. Oláh Attila A Magatartáspszichológiai Program vezetője: Dr. Bányai Éva Hivatalos bíráló bizottság: Elnök: Oláh Attila, PhD, CSc Belső bíráló: Mérő László, PhD, CSc Külső bíráló: Szilágyi Ágnes, PhD Titkár: Józsa Emese, PhD Tagok: Gonda Xénia, PhD Döme Péter, PhD Dúll Andrea, PhD Budapest, 2013 1

1. Bevezetés Disszertációm egy pszichogenetikai vizsgálatsorozatot mutat be, mely egy interdiszciplináris területen helyezkedik el a pszichológia és a molekuláris genetika határán. A pszichogenetikai kutatások alapvető célja, hogy a pszichológiai jellemzők egyedi variabilitása mögött meghúzódó biológiai háttér-mechanizmusokat feltérképezzék. Módszertani szempontból ez a tudományterület fenotípusok és génvariánsok között keres statisztikai összefüggéseket. Disszertációm a dohányzási szokások és a hangulati dimenziók egyes genetikai tényezőit tárgyalja. Mindkét jellemző kialakulásában fontos a dopamin rendszer, így a vizsgált kandidáns gének a dopamin rendszer működéséhez kapcsolódnak. A dohányzás pszichogenetikai kutatásának témakörében a dopamin neurotranszmisszió fontosabb kandidáns génjeinek asszociáció elemzését végeztem el major depresszióval diagnosztizált mintán. A vizsgált kandidáns gének magukba foglalták a D4-es dopamin receptort, valamint a jel terminálásért felelős transzportert, illetve dopamin bontó enzimet kódoló gének legfontosabb polimorfizmusait. A dohányzás fenotípusát egyrészt dohányzási szokásokra vonatkozó kategóriákkal, másrészt a nikotinfüggőség mértéke alapján vizsgáltam. A hangulati dimenziók pszichogenetikai asszociáció elemzése során a dopaminerg neuronok trofikus faktorát kódoló GDNF (glial derived growth factor) gén polimorfizmusainak lehetséges hatását teszteltem. A vizsgált polimorfizmusok funkcionális jelentősége még nem tisztázott, de a gén által kódolt GDNF fehérje kritikus szerepet játszik a dopamin neuronok fejlődésében és differenciációjában. A bevont egészséges, illetve major és bipoláris depresszióval diagnosztizált személyek szorongás és depresszió pontszámát önbeszámolós módszer alapján mértem. 2

A pszichológiai jellemzők, köztük az itt bemutatott szorongás és a dohányzás is komplex öröklődésű jellegek, így hátterükben csupán genetikai haljam azonosítható. Ezek a jellegek nem egy, hanem több gén által kódoltak, így azt is figyelembe kell venni, hogy a vizsgált genetikai hatások gyakran más génekkel együtt, valamint a környezettel interakcióban fejtik ki hatásukat. 2. Célkitűzések Doktori munkám során olyan genetikai rizikófaktorokat kívántam azonosítani, melyek összefüggenek a dohányzás, illetve a hangulati dimenziók endofenotípusaival. Ezt a kérdést három, eltérő fókuszú vizsgálattal kívántam megközelíteni: 1. A dohányzás és a dopamin rendszer kandidáns génjeinek lehetséges összefüggései major depressziós mintán: Az öngyógyítási elmélet szerint a depresszió és a dohányzás magas komorbiditása a részben azonos neurobiológiai rendszerek zavarával magyarázható. Mivel a dopamin rendszer fontos szerepet játszik mind a depresszióban, mind pedig a dohányzásban, feltételeztem, hogy a major depressziósok dohányzásának genetikai hátterében fontosak lehetnek a dopaminerg rendszer génjei. Ezért célul tűztem ki néhány fontos dopaminerg génváltozat (DRD4 VNTR, DRD4-521CT SNP, DRD4-616 CG SNP, DAT1 VNTR, COMT Val/Met SNP) és a dohányzási szokások asszociációvizsgálatát major depressziós betegek körében. A dohányzási szokások genetikai rizikófaktorainak azonosításához vizsgálni kívántam, hogy az dohányzási szokások alapján képzett alcsoportok genotípus gyakoriságai különböznek-e, tehát beszélhetünk-e például a rendszeres dohányzásra hajlamosító génváltozat(ok)ról. Ezen túlmenően arra is kíváncsi voltam, hogy kimutatható-e különbség az egyes genotípusok mentén létrehozott alcsoportok nikotinfüggésének a mértékében, azaz a dopamin rendszer vizsgált polimorfizmusai a nikotinfüggőség rizikófaktorainak tekinthetők-e. 3

2. Egészséges személyek hangulati jellemzői és a dopaminerg neuronok fejlődését szabályozó GDNF polimorfizmusok asszociációvizsgálata: A szakirodalomban csak kevés asszociáció kutatás foglalkozott a GDNF gén polimorfizmusaival, így feltáró jellegű vizsgálatomban azt kívántam elemezni, hogy a GDNF gén nyolc SNP-je (rs1981844, rs3812047, rs3096140, rs2973041, rs2910702, rs1549250, rs2973050, rs11111) összefüggésben áll-e egészséges személyek szorongás és depresszió értékeivel. Dimenzionális elemzések alapján azt kívántam vizsgálni, hogy vannak-e eltérések a polimorfizmusok alléljai mentén képzett alcsoportok szorongás és depresszió skálaátlag értékeiben. 3. A GDNF genetikai polimorfizmusai, mint a hangulati jellemzők lehetséges rizikófaktorai major-, vagy bipoláris depressziós személyeknél Az egészséges személyek vizsgálata alapján nyert eredményekből kiindulva további célom volt replikálni, pontosítani ezeket klinikai minta bevonásával. Elsőként eset-kontroll elrendezésben kívántam megvizsgálni, hogy a klinikai és a kontroll minta allélgyakorisága különbözik-e a GDNF rs3812047 és a GDNF rs3096140 polimorfizmusok esetében. Ezen túlmenően az egészséges személyek mintáján dimenzionális módszerrel kapott asszociációkat major- és a bipoláris depresszióval diagnosztizált személyek almintáiban is tesztelni kívántam. 3. Módszerek A disszertációm alapját képező genetikai és fenotípusos adatok gyűjtését több projekt keretében végeztük (FIRCA R03 TW007656-01A1, OTKA K K100845, OTKA K 81466, OTKA CK 80289). Ezen projektek során kutatócsoportunk 2008 és 2013 között több ezer fővel vett fel adatokat, ebből jómagam körülbelül 400-500 személlyel végeztem az adatfelvételt. 4

A dohányzási szokások pszichogenetikai asszociáció elemzését 133 major depresszióval diagnosztizált személy genetikai és fenotípusos adatán végeztem el. A dohányzási szokásokat négy kategóriával jellemeztem: soha nem dohányzó személyek, a dohányzásról leszokott személyek, az alkalmanként dohányzó és a rendszeresen dohányzó személyek kategóriáival. A nikotinfüggőség mértékét a Nikotindependencia Tünet Kérdőív és a Fagerstrom Nikotinfüggés Teszttel mértem. A hangulati jellemzők vizsgálata során 708 egészséges személy, illetve 183 major depresszióval, és 116 bipoláris depresszióval diagnosztizált személy adatát elemeztem. Az egészséges személyek toborzása az ELTE Pedagógia és Pszichológia Karán, a Budapesti Rendőrtiszti Főiskolában és a Budapesti Rendészeti Szakközépiskolában, valamint érdeklődő személyek körében történt (pl. Kutatók Éjszakája, idősotthonok). Az egészséges személyek kiválasztásakor bármilyen pszichiátriai kórtörténet kizáró ok volt. A depresszióval diagnosztizált minta a Semmelweis Egyetem Kútvölgyi Klinikai Tömb Klinikai és Kutatási Mentálhigiénés Osztály által kezelt major depressziós (MDD) és bipoláris depressziós (BPD) személyeiből tevődött össze, a betegek primer diagnózisát a DSM-IV-TR kritériumai alapján határozták meg két pszichiáter véleménye alapján. A szorongás és a depresszió mértékét a Hospital Anxiety and Depression Scale-el mértem (HADS). A vizsgálatokat az Egészségügyi Tudományos Tanács Tudományos és Kutatásetikai Bizottsága (ETT-TUKEB) hagyta jóvá. A genetikai adatbázist a Molekuláris Genetikai Laboratórium munkatársai hozták létre, mely tartalmazta a DNS számokat és valamennyi vizsgált polimorfizmus egyedi genotípus értékeit. A jelen munkában a DRD4, COMT, DAT1 és GDNF gének polimorfizmusai kerültek felhasználásra. 5

4. Eredmények 1. A dopaminerg neurotranszmissziós rendszer polimorfizmusainak szerepe a dohányzás genetikai meghatározottságában A dopamin rendszer mind a depresszióval, mind a dohányzással összefügg. Így feltételezhető volt, hogy major depresszióval diagnosztizált személyek dohányzási szokásainak kialakulásában szerepet játszhatnak a dopamin rendszer egyes génváltozatai is. 133 MDD-vel diagnosztizált személy dohányzási szokásait és dopaminerg polimorfizmusait felmérve a követező eredményeket kaptuk: (1) A vizsgált dopaminerg polimorfizmusok genotípus gyakoriságai nem különböztek a négyféle dohányzási kategóriába sorolt ( soha nem dohányzott, rendszeres dohányzó, leszokott és alkalmi dohányos ) betegeknél. (2) A Nikotindependencia Tünet Kérdőívet használva a DRD4-521 CT polimorfizmus asszociációt mutatott a nikotinfüggőség mértékével (p=0,0027). A DRD4-521 CT polimorfizmus TT homozigóta változatát hordozó, major depresszióval diagnosztizált személyek Nikotindependencia Tünet Kérdőíven mutatott átlagos pontszáma magasabb volt, mint a CC vagy CT változatot hordozó betegeké, tehát a DRD4-521 C allél jelenléte major depressziós személyeknél egy lehetséges védőfaktor a nikotinfüggőséggel szemben. 2. A dopaminerg neuronok fejlődését szabályozó GDNF polimorfizmusai és a hangulati jellemzők összefüggései egészséges mintán Mivel a GDNF kulcsfontosságú a dopaminerg neuronok fejlődésében, differenciációjában, és ezáltal a szinaptikus plaszticitásban, feltételezhető, hogy a GDNF genetikai variációi szerepet játszhatnak a dopamin rendszert érintő pszichiátriai 6

rendellenességek és pszichológiai jellemzők kialakulásában. Ezért megvizsgáltuk, hogy a GDNF egyes polimorfizmusai milyen összefüggésben vannak egészséges személyek, és major vagy bipoláris depresszióval diagnosztizált betegek hangulati jellemzőivel. 708 pszichiátriai kórtörténettel nem rendelkező, genetikailag független fiatal személy HADS kérdőívvel felmért szorongás és depresszió pontszáma és nyolc GDNF polimorfizmus asszociáció elemzése alapján: (1) Szignifikáns asszociáció mutatkozott a GDNF két polimorfizmusa és a szorongás dimenziója között (rs3812047: p=0,00070; és rs3096140: p=0,00138). Ez az összefüggés szignifikáns maradt a többszörös tesztelésre történő (Bonferroni) korrekció után is. Mindkét ritka allél mellett magasabb HADS szorongás átlagpontszám volt jellemző, a gyakoribb allélt hordozókhoz viszonyítva. (2) Az rs3812047 SNP genetikai hatása a nemekkel szignifikáns interakcióban alakította a hangulati pontszámokat. A nők általában magasabb szorongás pontszámmal jellemezték önmagunkat (nemi főhatás: p=0,0004), és az A allél mellett mind a nők, mind a férfiak csoportja magasabb szorongás átlagpontszámot mutatott (polimorfizmus főhatás: p=0,0002). A ritka allél (A) hatása azonban kifejezettebbnek mutatkozott férfiak esetében, mint a nőknél (a polimorfizmus és a nem interakciós hatása: p=0,033). (3) Az rs3096140 SNP esetében a szignifikáns nemi és genetikai főhatás mellett nem sikerült szignifikáns interakciós hatást kimutatni. (4) A két rizikóallél (rs3812047 A és rs3096140 C) haplotípusainak elemzése alapján szignifikáns összefüggést tártunk fel a szorongással (p=0,00029). Azok mutatták a legalacsonyabb szorongás átlagpontszámot, akiknél egyik 7

rizikóallél sem volt jelen a haplotípusban. Az egy rizikóallélt magába foglaló haplotípusok mellett magasabb volt a szorongás átlagpontszám, illetve a legmagasabb szorongás azokat jellemezte, akiknél mindkét rizikóallél szerepelt a haplotípusban. 3. A GDNF polimorfizmusok és a hangulati jellemzők összefüggései major-, és bipoláris depresszióval diagnosztizált mintán Az egészséges személyek adatai alapján a GDNF rs3812047 A és rs3096140 C alléljai a hangulati rendellenességek esetleges rizikófaktorai. Ezt az asszociációt depresszióval diagnosztizált betegek mintáján is teszteltük. 183 MDD-vel és 116 BPD-vel diagnosztizált személy vizsgálata alapján: (1) Az eset-kontroll elrendezés alapján nem sikerült a klinikai depresszióra hajlamosító genetikai hatásokat kimutatni: A GDNF rs3812047 A és rs3096140 C rizikó allélok gyakorisága nem tért el szignifikánsan az MDD-vel vagy BPD-vel diagnosztizált csoportokban a kontroll csoporthoz képest. (2) A dimenzionális elemzés érzékenyebb megközelítési módnak bizonyult: A BPD-vel diagnosztizál csoportban az rs3812047 A allélja mellett szignifikánsan magasabb szorongás (p=0,043) és tendenciózusan (p=0,099) magasabb depresszió átlagpontszám volt jellemző a G allélt hordozók csoportjához viszonyítva. (3) Az rs3812047 G allélja az MDD-vel diagnosztizált csoportban is szignifikáns összefüggést mutatott a depresszió átlagpontszámával (p=0,012), de a hatás iránya ellentétes volt. (4) Mivel az egyes betegségalcsoportokban (MDD és BPD) eltérő irányú összefüggés volt megfigyelhető, interakció elemzéssel vizsgáltam, hogy a betegségalcsoport és az rs3812047 alléljai hogyan hatnak a szorongás és depresszió pontszámokra. Szignifikáns polimorfizmus - betegségalcsoport interakció volt kimutatható mind a szorongás (p=0,029), mind pedig a depresszió alskála esetében (p=0,0036). 8

5. Következtetések A hangulati változásoknak és a dohányzási szokásoknak is jelentős népegészségügyi vonatkozásai vannak. Így egyre több vizsgálat fókuszál e jellemzők molekuláris biológiai és genetikai hátterének megismerésére. A dopamin rendszer a jutalmazási mechanizmusban betöltött szerepe révén mind a hangulati dimenziók, mind pedig a dohányzás tekintetében fontos. Dolgozatomban a dopamin rendszer működésében szerepet játszó genetikai variánsok hatását vizsgáltam a szorongás és a depresszió, illetve a dohányzási szokások egyéni különbségeire. A dohányzás pszichogenetikai asszociáció elemzése során azt találtuk, hogy a vizsgált genotípusok gyakorisága nem különbözött szignifikánsan az egyes dohányzási kategóriákban. Ugyanakkor a dimenzionális elemzések alapján a DRD4-521 CT SNP C allélja mellett szignifikánsan alacsonyabb Nikotindependencia Tünet Skálaátlag volt jellemző, mint a C allél hiányakor. Ennek alapján úgy tűnik, hogy a DRD4-521 C allél egy lehetséges védőfaktor a nikotinfüggőséggel szemben. Igaz, hogy kis elemszámú mintán mutattuk ki ezt az asszociációt, de a kovariancia elemzés során kapott Eta-négyzet érték bíztató: a DRD4-521 CT SNP a jelen minta függőségének összvarianciájából 14,7%-ot magyaráz. A hangulati dimenziók asszociáció elemzése során a dopamin neuronok egy trofikus faktorát kódoló gén polimorfizmusait vizsgáltuk egészséges mintán. A HADS szorongás alskálán négy nominális szignifikancia szintet elérő hatást mutattunk ki, a HADS depresszió alskálán egy nominálisan szignifikáns eredményt azonosítottunk. A többszörös tesztelésre való korrekció után a szorongás alskála és az rs3812047, illetve az rs3096140 közötti asszociáció maradt szignifikáns. Mindkét polimorfizmus esetében magasabb szorongás volt jellemző a ritka allélok mellett. A két polimorfizmus hatását a haplotípus 9

elemzés is megerősítette. Érdekes, hogy az rs3812047 esetében a minor (A) allél hatása kifejezettebb volt a férfiaknál, mint a nőknél. A vizsgálatsorozat következő lépéseként, a hangulati dimenziókkal egészséges mintán asszociációt mutató két GDNF SNP elemzését major-, illetve bipoláris depresszióval diagnosztizált személyekből álló mintán is megismételtük. Az eset-kontroll elemzések nem mutattak szignifikáns különbséget az egészséges és depresszióval diagnosztizált személyek genotípus gyakoriságaiban. Ugyanakkor a klinikai minta dimenzionális elemzése részben alátámasztotta az egészséges mintán kapott eredményeket. Az egészségesekhez hasonlóan a bipoláris depresszióval diagnosztizált alminta esetében magasabb HADS szorongás átlagpontszám volt jellemző az rs3812047 ritka (A) allélja mellett, mint a G allél mellett. Érdekes, hogy a major depresszióval diagnosztizáltakból álló almintán viszont a ritka allél mellett szignifikánsan alacsonyabb szorongás átlagpontszámokat találtunk. A bipoláris-, illetve a major depressziós alminták és az rs3812047 genetikai variánsainak interakciós hatását mindkét hangulati dimenzió esetében kimutattuk; az A allél mellet a bipoláris alcsoport magasabb szorongás és depresszió átlagpontszámmal volt jellemezhető, mint a többi csoport. Összefoglalva, a bipoláris betegcsoportban sikeresen reprodukáltuk a rs3812047 génvariáns és a hangulati jellemzők korábban nem-klinikai mintán leírt kapcsolatát, valamint ezzel ellentétes hatást mutattunk ki a major depressziós betegeknél. Ugyan a depresszió egyes fajtái esetében a kis elemszám miatt a GDNF és a hangulati dimenziók közötti asszociáció pontosításához további vizsgálatokra van szükség, a hangulati dimenziók és a GDNF közötti független mintákon kimutatott asszociáció-eredményeink bíztatóak. 10

6. Saját publikációk jegyzéke A dolgozat témakörében megjelent közlemények Kotyuk, E., Kovacs-Nagy, R., Faludi, G., Urban, R., Ronai, Z., Sasvari-Szekely, M., & Szekely, A. (2009). A nikotin dependencia és a dopamine D4-es receptor -521 CT promoter polimorfizmusának asszociációja major depressziós betegcsoportban. Neuropsychopharmacol Hung, 11(2), 59-67 Kotyuk, E., Keszler, G., Nemeth, N., Ronai, Z., Sasvari-Szekely, M., Szekely, A. (megjelenés tervezett dátuma: 2013.12.06.) Glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) as a novel candidate gene of anxiety. IF=3.730 Kotyuk E., Németh N., Halmai Z., Faludi G., Sasvári-Székely M. és Székely A. A hangulati dimenziók és a glia-eredetű növekedési faktort kódoló gén polimorfizmusainak összefüggése depresszióval diagnosztizált mintán Neuropsychopharmacologia Hungarica 2013. XV. évf. 2. szám, 63-72 Anderson-Schmidt H, Beltcheva O, Brandon MD, Byrne EM, Diehl EJ, Duncan L, Gonzalez SD, Hannon E, Kantojärvi K, Karagiannidis I, Kos MZ, Kotyuk E, Laufer BI, Mantha K, McGregor NW, Meier S, Nieratschker V, Spiers H, Squassina A, Thakur GA, Tiwari Y, Viswanath B, Way MJ, Wong CC, O'Shea A, Delisi LE (2013). Selected rapporteur summaries from the XX World Congress of Psychiatric Genetics, Hamburg, Germany, October 14-18, 2012. Am J Med Genet B Neuropsychiatr Genet, 162B(2), 96-121. IF=3.231 Kongresszusi kivonat hazai (citálható) folyóiratban: Kótyuk E., Németh N., Halmai Z., Faludi G., Sasvári-Székely M., Székely A.: A hangulati dimenziók és a GDNF gén polimorfizmusának összefüggése; XV. Magyar Neuropszichofarmakológiai Kongresszus - Elvárások a neuropszichofarmakológiától: miben van és miben nincs konszenzus?; Tihany, 2012. október 4 6.; Neuropsychopharmacologia Hungarica 2012. XIV. S1,. 14. Első szerzős poszterek nemzetközi tudományos konferenciákon: Kotyuk, E., Szekely, A., Sasvari-Szekely, M. Genetic Components of Smoking Behavior; 13th Annual Meeting of the SRNT Europe Antalya, Turkey, 2011. szeptember 08-11. (travel award) Kótyuk E., Elek Z., Ronai Z., Sasvari-Szekely M., Szekely A.: Glial Cell Line-derived Neurotrophic Factor (GDNF) and Mood Characteristics: An Association Study Among Healthy Adults; XXth World Congress of Psychiatric Genetics Confronting the complexity of Brain and Behavior; 2012 október 14-18, Hamburg, Germany (a poszterszekció nyertese, travel award) Első szerzős előadások hazai tudományos konferenciákon: Kotyuk E. Öngyógyítás dohányzással? Dopaminerg rizikógének a nikotinfüggésben; XXIX. Országos Tudományos Diákköri Konferencia, Pécs, 2009. 04. 6-8. 11

Kotyuk E., Sasvari-Szekely M., Székely A., A glia eredetű növekedési faktor (GDNF) és a dohányzás pszichogenetikai elemzése; A Magyar Pszichológiai Társaság XXII. Országos Tudományos Nagygyűlése. Budapest, 2013. 06. 05-07. Első szerzős poszterek hazai tudományos konferenciákon: Kotyuk E. Gyógyír a depresszióra? Adalékok a nikotin-addikció öngyógyítási elméletéhez Illyés Sándor emléknapok, a Pszichológiai Intézet szervezésében, Budapest, 2008. március 26-28. A dolgozat témájához szorosan nem kapcsolódó közlemények Társszerzős eredeti publikáció hazai tudományos szaklapban: Szeman, B., Nagy, G., Varga, T., Veres-Szekely, A., Sasvari, M., Fitala, D., Szöllősi, A., Katonai, R., Kotyuk, E., Somogyi, A., (2012). [Changes in cognitive function in patients with diabetes mellitus]. Orv Hetil, 153(9), 323-329. Kongresszusi kivonat hazai (citálható) folyóiratban: Kótyuk E., Nánási T., Németh N., Rónai Z., Sasvári-Székely M. és Székely A.: Új kandidáns gének a dohányzás vonatkozásában; XIV. Magyar Neuropszichofarmakológiai Kongresszus - A neuropszichofarmakonok és a beteg; Tihany, 2011. október 6 8. ; Neuropsychopharmacologia Hungarica 2011. XIII. S2., 44. Első szerzős előadások hazai tudományos konferenciákon: Kótyuk, E., Sasvári-Székely, M., Veres-Szekely, A. "Csak kipróbálom..." - a dohányzásra való rászokás genetikai rizikófaktorai. A Magyar Pszichológiai Társaság XIX. Országos Tudományos Nagygyűlése. Pécs, máj. 27-29, 2010. Kótyuk E. Szabályozás a szabályozásban: a dohányzásra való rászokás egy új genetikai rizikófaktora; Tehetséggondozás a pszichológiában II. konferencia, Szombathely, 2010. 12.1-3. Kotyuk E. Szabályozás a szabályozásban: a dohányzásra való rászokás egy új genetikai rizikófaktora; XXX. Jubileumi Országos Tudományos Diákköri Konferencia; Kecskemét, 2011. ápr. 7-9. Kotyuk E., Szekely A., Sasvári-Székely M. A dohányzás rizikófaktorainak pszichogenetikai elemzése; A Magyar Pszichológiai Társaság A tudomány emberi arca című XXI. Országos Tudományos Nagygyűlése. Szombathely, 2012. május 30-június 1. Első szerzős poszterek hazai tudományos konferenciákon: Kotyuk E., Szekely A. Temperamentumjellemzők és genetikai faktorok a dohányzás hátterében. A Magyar Pszichológiai Társaság XVIII. Országos Tudományos Nagygyűlése, Nyíregyháza, 2008. május 22-24. 12

Kotyuk E. Kapcsolatok-különbségek? A társasági dohányzás genetikai háttere; Illyés Sándor emléknapok, a Pszichológiai Intézet szervezésében, Budapest, 2009. március 18-20. (poszter szekció nyertes). Kotyuk E. Ha olyan hangulatom van A kísérletező dohányzás genetikai összetevői Illyés Sándor emléknapok, a Pszichológiai Intézet szervezésében, Budapest, 2010. 03. 17-19. (poszter szekció nyertes). Társ-szerzős előadások hazai tudományos konferencián: Szekely A, Halmai Z, Kotyuk E, Szilagyi A, Sasvári M. A retrospektív figyelemzavar és hiperaktivitás genetikai háttértényezői. A Magyar Pszichológiai Társaság XVIII. Országos Tudományos Nagygyűlése, Nyíregyháza, 2008. május 22-24. Vereczkei, A., Szekely, A., Kótyuk, E., Nemoda, Z., Sasvári-Székely, M. A szerotonin transzporter promoter polimorfizmusa és a dohányzás. A Magyar Humángenetikai Társaság VIII. Kongresszusa. Debrecen, szept. 2-4, 2010. Veres-Székely A., Kótyuk E., Sasvári-Székely M., Öröklődő és nem öröklődő genetikai hatások; Illyés Sándor Emléknapok, a Pszichológiai Intézet szervezésében, Budapest, 2013. 03. 18-20. Székely A., Katonai E. R., Kotyuk E., Sasvari-Székely M. Új kandidáns gének a kognitív funkciók genetikai hátterének kutatásában; A Magyar Pszichológiai Társaság XXII. Országos Tudományos Nagygyűlése. Budapest, 2013. 06. 05-07. 13

7. Köszönetnyilvánítás Elsőként szeretnék köszönetet mondani a Pszichológiai Doktori Iskola vezetőjének, Prof. Oláh Attilának. Továbbá köszönöm a Magatartáspszichológiai Program vezetőjének, Prof. Bányai Évának, és az Affektív Pszichológiai Tanszék vezetőjének, Dr. Varga Katalinnak a támogatását, az elgondolkodtató kérdéseket, a sok együttgondolkodásra szánt órákat. Köszönöm, hogy időt nem sajnálva, gyakran részletekbe menően segítették a munkámat. Szeretném megköszönni témavezetőmnek, egyben a Pszichogenetikai Laboratórium vezetőjének, Veres-Székely Annának az évek során nyújtott fáradhatatlan segítségét. Köszönöm a belém vetett bizalmát, a tanításomra fordított idejét, és nem utolsó sorban azt a szemléletformálást, amit tőle kaptam. Köszönöm, hogy szakmailag, és emberileg is támogatott. Köszönöm a Pszichogenetikai Laboratórium munkatársainak, Halmai Zsuzsának, Varga Gábornak, Katonai Rózsának, a TDK hallgatóknak, és segítőinknek, hogy a megvalósítás, a kivitelezés során mellettem álltak. Köszönöm, hogy a napi szinten felmerülő kérdések, nehézségek megoldásában segítettek. Köszönettel tartozom az Affektív Pszichológia Tanszék munkatársainak, és összes tanáromnak az inspiráló, elgondolkodtató beszélgetéseket, a tapasztalatszerzési lehetőséget. Köszönöm Urbán Róbertnek a dohányzás témakörben nyújtott útmutatásait, és ötleteit. Továbbá köszönöm Faludi Gábor professzornak, a Semmelweis Egyetem Klinikai és Kutatási Mentálhigiénés Osztály vezetőjének, és munkatársainak, hogy lehetővé tették a vizsgálatot. Köszönettel tartozom továbbá Sasvári Mária professzorasszonynak, aki nem csupán a felbecsülhetetlen értékű genetikai adatokat bocsájtotta a rendelkezésemre, hanem szakmailag is segítette munkámat ezen az interdiszciplináris területen. Szintén köszönöm a Semmelweis Egyetem Molekuláris Genetikai Laboratórium munkatársainak segítségét, különösen Rónai Zsolt, Németh Nóra, és Keszler Gergely áldozatos munkáját. Köszönettel tartozom a kutatásban résztvevő összes személynek, akiknek etikai okokból csak név nélkül, ezúton tudok köszönetet mondani. Köszönöm páromnak és családomnak a támogatását, és a türelmét, amivel nemcsak a dolgozatírást, de az ehhez vezető utat is megkönnyítették. 14

Genetic factors of individual variability of mood characteristics and smoking behavior Eszter Kótyuk PhD thesis ELTE-PPK Faculty of Education and Psychology PhD School of Psychology, Behavioral Psychology Program Supervisor: Dr. Anna Szekely, habil. associate professor Head of the Doctoral School: Prof. Dr. Attila Oláh, PhD, CSc Head of the Doctoral Program: Prof. Dr. Éva Bányai Budapest, 2013 15

1. Introduction My dissertation presents a series of psychogenetic studies. Psychogenetics is an interdisciplinary scientific field of psychology and molecular genetics. The aim of psychogenetic studies is to analyze the biological background of inherited psychological traits. From a methodological aspect we seek associations between phenotypes and genetic variants. In my dissertation I studied the genetic factors underlying smoking behavior and mood characteristics. The dopamine system has an important role in both of these phenotypes, thus candidate gene variants of my dissertation are related to the functioning of the dopaminergic system. In the psychogenetic association study of smoking behavior I analyzed the most important gene variants of dopamine neurotransmission on a sample of patients with major depressive disorder (MDD). Specifically, I studied the most important polymorphisms of the D4 dopamine receptor gene and the dopamine transporter gene as well as the most important gene variants of dopamine degradation. I used smoking categories and nicotine dependence as phenotypes of smoking behavior. In the psychogenetic association study of mood characteristics I analyzed 8 polymorphisms of the GDNF (glial derived growth factor) gene which codes a neurotrophic factor of dopamine neurons. The functional significance of these polymorphisms has not yet been proved but the GDNF protein coded by this gene plays a central role in the development and differentiation of dopamine neurons. The association study was carried out using data from healthy subjects and patients with major or bipolar depression. The anxiety and depression score was measured by self-report data. Inheritance of psychological characteristics, such as smoking behavior is complex. These traits are not coded by a single gene, 16

but bare the effect of several genes, which are in interaction with each other as well as the environment. 2. Objectives Results of research described in my dissertation aimed to identify genetic risk factors of smoking behavior and mood characteristics. Three main line of studies were carried out: 1. The possible role of dopaminergic gene variants in shaping smoking behavior of patients with major depressive disorder: According to the self-medication hypothesis, high comorbidity of depression and smoking behavior can partly be explained by dysfunctions in overlapping neurobiological systems. The dopamine system, for example, plays an important role in both smoking behavior and depression, thus, I hypothesized that certain dopaminergic genes may have an effect on the MDD patients smoking behavior. Thus the aim of my study was to analyze the possible associations of smoking and some dopaminergic polymorphisms (DRD4 VNTR, DRD4-521CT SNP, DRD4-616 CG SNP, DAT1 VNTR, COMT Val/Met SNP) in a sample of MDD patients. To investigate this question I compared genotype frequencies in subgroups characterized by different smoking behavior. Is there, for example, a risk gene variant predisposing regular smoking behavior?! Furthermore I aimed to analyze measures of nicotine dependence in those with the different genotype groups, to test if the analyzed dopaminergic polymorphisms are risk factors of nicotine dependence. 2. Association analysis of mood characteristics and GDNF polymorphisms using data from a healthy sample: There are only a few association studies analyzing effects of GDNF polymorphisms thus this exploratory study was aimed to test if 8 polymorphisms of GDNF (rs1981844, rs3812047, rs3096140, rs2973041, rs2910702, rs1549250, rs2973050, rs11111) are in association with the level of anxiety and depression in healthy 17

young adults. Using a dimensional approach I aimed to examine possible differences in the level of anxiety and depression in carriers of the different alleles of these polymorphisms. 3. Association analysis of mood characteristics and GDNF polymorphisms on a sample of major and bipolar depressive patients: Based on the results obtained from the previous study of healthy subjects my aim was to replicate and further clarify results using data from a clinical sample. First I wished to test if the allele frequencies of GDNF rs3812047 and rs3096140 were different in the control and clinical sample. Furthermore, I wished to test previous results of the dimensional approach based on data from healthy subjects on clinical subsamples of major and bipolar depression. 3. Methods The genetic and phenotypic data used in my dissertation was collected in several research projects (FIRCA R03 TW007656-01A1, OTKA K K100845, OTKA K 81466, OTKA CK 80289). During these projects our research group tested more than a thousand participants between 2008 and 2013, from which I have done the data collection with about 400-500 subjects. Psychogenetic association analyses were carried out on a sample of 133 major depressive patients. I divided the sample into four categories based on their smoking behavior: those who never smoked, quitters, occasional smokers and regular smokers. The level of nicotine dependence was assessed by the Hooked on Nicotine Checklist and the Fagerstrom Test for Nicotine Dependence. Association analyses of mood characteristics were carried out using a sample of 708 healthy, young volunteers as well as a sample of 183 major depressive patients (MDD) and 116 bipolar 18

depressive patients (BPD). Healthy young adults were recruited at the Institute of Psychology, Eötvös Loránd University, college and university students from two law enforcement institutions in the Budapest area and volunteers recruited on different occasions (e.g. Researchers' Night, and elderly homes). Those reporting any kind of psychiatric history were excluded from the healthy sample. The clinical sample was collected at Department of Clinical and Theoretical Mental Health, Kutvolgyi Clinical Center, Semmelweis University, Budapest. The primer diagnosis of MDD and BPD patients was based on the DSM-IV-TR, assessement has been carried out by two psychiatrist. I measured the severity of anxiety and depression symptoms by the Hospital Anxiety and Depression Scale (HADS). The study protocol was approved by the Scientific and Research Ethics Committee of the Medical Research Council (ETT TUKEB). The genetic database was created by the Molecular Genetic Laboratory and contained the DNA numbers and genotypes of the analyzed polymorphisms. In the present work I used data for the DRD4, COMT, DAT1 and GDNF polymorphisms. 19

4. Results 1. The role of polymorphisms of the dopamine neurotransmission system in smoking behavior The dopamine system plays an important role in mood disorders and in smoking as well. Thus, I hypothesized that the polymorphisms of the dopamine system may effect smoking behavior of major depressive patients. Results from analyses of the 133 MDD patients smoking habits and dopaminergic polymorphisms: (1) Genotype frequencies were not different in the four smoking categories (in those who never smoked, quitters, occasional smokers and regular smokers). (2) The level of nicotine dependence measured by the Hooked on Nicotine Checklist associated with the DRD4-521Ct polymorphism (p=0.0027). Those patients with major depressive disorder who carried the TT homozygote of the DRD4-521CT SNP showed a higher mean score on the Hooked on Nicotine Checklist as compared to those with CC or CT genotypes. Thus the C allele of the DRD4-521 CT SNP is a possible protective factor against nicotine dependence. 2. Association analysis of polymorphisms of dopamine neurons growth factor GDNF and mood characteristics using data from a healthy sample Since GDNF is crucial in the development and differentiation of dopamine neurons it is plausible that genetic variants of GDNF are important factors in the background of psychiatric disorders and psychological characteristics related with dopamine dysfunctions. Thus we analyzed the association of GDNF polymorphisms and mood characteristics using both healthy and clinical samples. 20

The results of analyzing 708 healthy, genetically independent young adults anxiety and depression score measured by the Hospital Anxiety and Depression Scale and 8 GDNF polymorphisms: (1) Significant associations have been found between two GDNF polymorphisms and anxiety (rs3812047: p=0.00070; and rs3096140: p=0.00138). These associations remained significant after correcting for multiple testing (Bonferroni). In case of both SNPs higher HADS anxiety mean score characterized those with the minor allele as compared to carriers of the more frequent allele. (2) A polymorphism gender interaction on anxiety has been observed in case of the rs3812047 SNP. Females showed significantly higher anxiety mean scores (gender main effect: p=0.0004) and carriers of the rs3812047 A allele showed higher anxiety mean scores than carriers of the G allele in both females and males (polymorphism mean effect: p=0.0002). The effect of the rs3812047 A allele as a risk factor of anxiety, however, was more pronounced in males (polymorphism gender interaction: p=0.033) (3) In case of the rs3096140 SNP the analysis revealed significant gender and polymorphism main effects, but no significant interaction was found. (4) Haplotype analysis of the two risk alleles of the SNPs described above (the rs3812047 A and the rs3096140 C allele) revealed a significant association with anxiety scores (p=0.00029). Mean anxiety scores raised according to the number of risk alleles present in the haplotypes. 21

3. Association analysis of GDNF polymorphisms and mood characteristics in MDD and BPD patients. According to the results of the association analysis carried out on the healthy sample the GDNF rs3812047 A and rs3096140 C alleles are possible risk factors for mood disorders. This was tested using data from a clinical sample. The results of analyzing 183 MDD and 116 BPD patients are: (1) Case-control analysis has not revealed any significant differences in allele frequencies: frequency of GDNF rs3812047 A and rs3096140 C alleles was similar in the MDD or BPD groups as allelic distribution in the control group. (2) The dimensional approach seemed to be more sensitive: In the BPD sample significantly higher mean anxiety score (p=0.043) and tendentiously higher depression mean score (p=0.099) was observed in carriers of the rs3812047 A allele as compared to mood characteristics of those with the G allele. (3) The G allele of the rs3812047 showed association with depression in the MDD sample as well, however in the opposite direction. (4) Since we observed association results running in opposite direction in the two patient categories we carried out an interaction analysis to examine joint effect of depression subtypes and the rs3812047 SNP on anxiety and depression. A significant polymorphism mood disorder category interaction was observed both on anxiety (p=0.029) and depression (p=0.0036). 22

5. Conclusions Both mood characteristics and smoking have a major impact on public health. Thus, molecular and genetic backgrounds of these characteristics are in the focus of many studies of the field. The dopamine system plays an important role in the reward mechanisms, and thus is important in developing individual variations of both mood characteristics and smoking behavior. In my thesis I investigated association of certain dopamine related gene variants and mood characteristics or smoking behavior. In the association analysis of smoking behavior we found that the genotype frequencies of the polymorphisms were not significantly different in the subgroups characterizing smoking behavior. On the other hand, dimensional analyses showed significant association of addiction and a promoter polymorphism: DRD4-521 CT SNP. Those who carried the C allele showed lower mean scores on the Hooked on Nicotine Checklist as compared to those who did not carry the C allele. This result suggests that the C allele of the DRD4-521 CT SNP is a possible protective factor against nicotine addiction. These results should be interpreted cautiously because of the small sample size, however, based on the Eta square value, the DRD4-521 CT SNP is responsible for 14.7% of individual differences of addiction as measured by the Hooked on Nicotine Checklist. In the association analysis of mood characteristics we examined some polymorphisms of the GDNF gene which codes a growth factor for dopamine neurons. On the sample of healthy young adults five SNPs showed nominally significant associations with the HADS questionnaire: four with the anxiety subscale and one with the depression subscale. After correcting for multiple testing, effect of two SNPs (rs3812047, rs3096140) on anxiety remained significant. In both cases increased anxiety mean 23

scores were observed in the presence of minor alleles. We also carried out haplotype analyses which confirmed the effect of these two SNPs. Furthermore, in case of the rs3812047 the effect of the minor allele was more pronounced in males then in females. As a further step of the study, we repeated the association analyses of mood characteristics on a sample of patients with major depressive disorder and bipolar depressive disorder investigating those two GDNF SNPs which showed association on the healthy sample. The case-control analyses revealed no significant differences in genotype frequencies of the healthy and clinical samples. On the other hand, dimensional analyses partly confirmed our previous GDNF-mood association findings based on the healthy sample. The subgroup of patients with bipolar depressive disorder showed the same pattern as the sample of healthy young adults. Higher HADS anxiety scores were reported in the presence of the rs3812047 minor (A) allele, as compared to those with the G allele. On the other hand, the subgroup of patients with major depressive disorder showed an opposite pattern; MDD patients with the minor allele reported lower anxiety scores. An interaction effect of patient subgroups and genetic variants of the rs3812047 was observed for both HADS subscales. In summary, we replicated our previous findings demonstrated on a non-clinical sample using patients with bipolar depressive disorder, and found an opposite effect of the rs3812047 in patients with major depressive disorder. Although further association studies on clinical samples are needed to clarify the relationship between GDNF polymorphisms and mood characteristics, these consistent association results based on independent samples are very promising. 24

6. Publications of the PhD candidate Publications in the topic of the dissertation Kotyuk, E., Kovács-Nagy, R., Faludi, G., Urbán, R., Rónai, Z., Sasvári-Székely, M., Székely, A. (2009). The nicotine dependence and the dopamin D4 receptor -521 CT polymorphism association in major depressive disorder. Neuropsychopharmacologia Hungarica 11(2), 59-67. Kotyuk, E., Németh, N., Rónai, Z., Nemoda, Z., Sasvari-Szekely, M., Urban, R. and Szekely, A., Association of glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) polymorphisms and anxiety in young adults in PLosOne (manuscript accepted for publication) IF=3.730 Kótyuk, E., Németh, N., Halmai, Z., Faludi, G., Sasvári-Székely, M. és Székely, A. Association of glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) and mood characteristics in depressive patients in Neuropsychopharmacologia Hungarica (manuscript accepted) Anderson-Schmidt H, Beltcheva O, Brandon MD, Byrne EM, Diehl EJ, Duncan L, Gonzalez SD, Hannon E, Kantojärvi K, Karagiannidis I, Kos MZ, Kotyuk E, Laufer BI, Mantha K, McGregor NW, Meier S, Nieratschker V, Spiers H, Squassina A, Thakur GA, Tiwari Y, Viswanath B, Way MJ, Wong CC, O'Shea A, Delisi LE. (2013): Selected rapporteur summaries from the XX world congress of psychiatric genetics, Hamburg, Germany, october 14-18, 2012 in Am J Med Genet B Neuropsychiatr Genet. 2013 Mar;162(2):96-121. IF=3.705 Poster presentations on citable Hungarian academic conferences Kotyuk, E., Nánási T., Németh N., Rónai Z., Sasvári-Székely M. és Székely A.: New candidate genes in smoking behavior; 14th Hungarian Congress of Neuropsychopharmacology, Tihany, October 6 8. 2011; Neuropsychopharmacologia Hungarica 2011. XIII. S2., 44. Poster presentations on international academic conferences Kotyuk, E., Szekely, A., Sasvari-Szekely, M. Genetic Components of Smoking Behavior; 13th Annual Meeting of the Society for Research on Nicotine and Tobacco (SRNT) Europe Antalya, Turkey on September 08-11, 2011. (travel award) Kótyuk, E., Elek, Z., Ronai, Z., Sasvari-Szekely, M., Szekely, A.: Glial Cell Line-derived Neurotrophic Factor (GDNF) and Mood Characteristics: An Association Study Among Healthy Adults; XXth World Congress of Psychiatric Genetics Confronting the complexity of Brain and Behavior; October 14-18, 2012; Hamburg, Germany (poster session winner, travel award) Oral presentations on Hungarian academic conferences Kotyuk, E. Self medication with smoking? Dopaminerg risk genes in nicotine dependence. XXIX. National Students Science Competence, Pécs, April 6-8. 2009 25

Kotyuk E., Sasvari-Szekely M., Székely A., Association analysis of glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) and smoking behavior; The Hungarian Psychological Association s XXII. National Acadamic Conference, Budapest, Jun 05-07. 2013 Poster presentations on Hungarian academic conferences Kotyuk, E. Cure for depression? Data for the nicotin addiction s self medication hypothesis. Illyés Sándor Memorial Day, organized by the Institute of Psychology Budapest, March 26-28. 2008. Other Publications Szémán, B., Nagy, G.,Varga, T., Veres-Székely, A., Sasvári, M., Fitala, D., Szöllősi, A., Katonai, R., Kotyuk, E., Somogyi, A. (2012) Changes in cognitive function in patients with diabetes mellitus in Orvosi Hetilap 153(9) 323 329. Poster presentations on citable Hungarian academic conferences Kotyuk, E., Nánási T., Németh N., Rónai Z., Sasvári-Székely M. és Székely A.: New candidate genes in smoking behavior; 14th Hungarian Congress of Neuropsychopharmacology, Tihany, October 6 8. 2011; Neuropsychopharmacologia Hungarica 2011. XIII. S2., 44. Oral presentations on Hungarian academic conferences Kotyuk, E., Sasvári-Székely, M., Veres-Szekely, A. I ll just try it out The genetic risk factors of the habituation of smoking. The Hungarian Psychological Association s XIX. National Academic Conference, Pécs, May. 27-29. 2010 Kotyuk, E. Regulation in the regulation process: a new genetic risk factor of smoking behavior; II. conference on talent improvement in psychology, Szombathely, Hungary. December 1-3. 2010 Kotyuk, E. Regulation in the regulation process: a new genetic risk factor of smoking behavior; XXX. National Students Science Competence; Kecskemét, Hungary, April 7-9. 2011 Kotyuk, E., Szekely, A, Sasvari-Szekely, M. Psychogenetic association study of the risk factors of consuming tobacco products; The Hungarian Psychological Association s XXI. National Academic Conference, Szombathely, May 30- Jun 01. 2012 Poster presentations on Hungarian academic conferences Kotyuk, E., Szekely, A. Temperament types and genetic factors on the background of smoking. The Hungarian Psychological Association s XVIII. National Acadamic Conference, Nyíregyháza, May 22-24. 2008 Kotyuk, E. Connections differencies? The genetic background of social smoking. Illyés Sándor Memorial Day, organized by the Institute of Psychology, Budapest, March 18-20. 2009 26

Kotyuk, E. When I feel like it The experimental smoking genetic components. Illyés Sándor Memorial Day, organized by the Institute of Psychology, Budapest, March. 17-19. 2010 Co-author oral presentations on Hungarian academic conferences Szekely A, Halmai Z, Kotyuk, E., Szilagyi A, Sasvári M. The genetic background of the retrospective attention deficit disorder and hyperactivity. The Hungarian Psychological Association s XVIII. National Acadamic Conference, Nyíregyháza, May 22-24. 2008 Vereczkei, A., Szekely, A., Kotyuk, E., Nemoda, Z., Sasvári-Székely, M. The serotonin transporter s promoter polymorphism and smoking. The Hungarian Society of Human Genetics VIII. Congress. Debrecen, September. 2-4. 2010 Veres-Székely A., Kótyuk E., Sasvári-Székely M., Heritable and not heritable genetic effects; Illyés Sándor Memorial Day, organized by the Institute of Psychology Budapest, March 18-20. 2013 Székely A., Katonai E. R., Kotyuk E., Sasvari-Székely M., New candidate polymorphisms in the background of cognitive functions; The Hungarian Psychological Association s XXII. National Acadamic Conference, Budapest, Jun 05-07. 2013 27

7. Acknowledgement First of all I would like to thank Prof. Attila Oláh, head of the Doctoral School of Psychology and Prof. Éva Bányai, head of the Doctoral Program as well as Dr. Katalin Varga, head of the Department of Affective Psychology for their support and their useful comments. I would like to express my deepest gratitude for my supervisor, Anna Veres-Székely, and thank her excellent guidance, caring, patience, and providing an excellent atmosphere for doing research. Her guidance helped me a lot in my studies as well as in writing my thesis. I would also like to say thanks to members of the Psychogenetic Laboratory: Zsuzsa Halmai, Gábor Varga, Katalin Rózsa, the TDK students and to everyone, who helped me carry out these studies. I would like to thank colleagues of the Department of Affective Psychology and all my teachers for the lessons, encouragement and experience in the field of research. I would like to say special thanks to Róbert Urbán for his help, advices and ideas in the field of smoking behavior research. I would also like to thank Prof. Gábor Faludi, head of the Department of Clinical and Theoretical Mental Health, Kutvolgyi Clinical Center, Semmelweis University and his colleagues for enabling investigation of patient characteristics. My sincere thanks also goes to Prof. Mária Sasvári, who not only gave me permission to use the genetic data, but facilitated my work professionally in this interdisciplinary field. I also thank the help of every colleague at the Molecular Genetic Laboratory, Semmelweis University. Especially Zsolt Rónai, Nóra Németh and Gergely Keszler. I would like to thank the help of every participant in this study. Last, but not least I would like to thank my family and my partner for their support. I would never have been able to finish my dissertation without their help. 28