ligoszacharidok előállítása kemoenzimatikus szintézissel Doktori (Ph.D.) értekezés tézisei Gálné Remenyik Judit Témavezető: Dr. Kandra Lili Synthesis of oligosaccharides by chemoenzymatic methods Ph.D. Theses Judit Remenyik-Gál Supervisor: Dr. Lili Kandra Debreceni Egyetem, TEK, TTK MTA Szénhidrátkémiai Kutatócsoport Biokémiai Tanszék Debrecen, 2007.
1. Az értekezés előzményei és célkitűzései Az értekezés célkitűzése általános módszerek kidolgozása oligoszacharidok előállítására enzim katalizált reakcióban. Az enzimek alkalmazása egy értékes alternatív módszer maltooligomerek előállítására, mivel az enzimek a kívánt típusú és konfigurációjú glikozidos kötést védőcsoportok bevezetése nélkül generálják. Az elmúlt években az érdeklődés középpontjába került az exoglikozidázok alkalmazása oligoszacharidok szintézisére. Az endoglikozidázokat ezidáig kevéssé vizsgálták, így nem ismertek azok a szerkezeti követelmények, amelyek feltétlenül szükségesek a szintézis megvalósításához. Az α-amiláz enzimek aktív helyének feltérképezéséhez, a hidrolízis mechanizmusának megértéséhez, és a transzferáz aktivitás tanulmányozásához elsőként állítottunk elő tanszékünkön 2-klór-4-nitrofenil-maltooligomer szubsztrát sorozatot. Mutációval sikerült bevezetni transzferáz aktivitást a vad típusú humán nyál amilázba, ami lehetővé tette enzimatikus trnszglikozilezésekhez történő felhasználását. A kutatásaink másik célkitűzése új típusú α-amiláz inhibitorok előállítása kemoenzimatikus szintézissel, a mára már népbetegségnek számító diabetes, kóros elhízás és fogszuvasodás megelőzésére és gyógyítására. 1
2. Az alkalmazott vizsgálati módszerek Az α-amiláz szubsztrátok és inhibitorok előállítása során klasszikus kémiai, kemoenzimatikus és enzimatikus módszereket alkalmaztunk. A reakciók követése során vékonyréteg kromatográfiát, HPLC és MALDI-TF analízist alkalmaztunk. A transzfertermékek detektálását és elválasztását folyadékkromatográfiás módszerrel, különböző semipreparatív oszlopok alkalmazásával végeztük. Az α-amilázok alhely térképét a SUMA komputer program segítségével készítettük el (gyemant@tigris.klte.hu). Az előállított vegyületek azonosítására, és szerkezetük igazolására MALDI-TF, ESI- TF MS és NMR spektroszkópiai módszereket alkalmaztunk. Az NMR vizsgálatok során a teljes 1 H- és 13 C-NMR hozzárendelését kétdimenziós technikák alkalmazásával ( 1 H- 1 H CSY, TCSY és 13 C- 1 H HSQC) végeztük el. 3. Az értekezés új tudományos eredményei 3.1. CNP ß-maltooligoszacharidok előállítása Kemoenzimatikus módszerrel állítottunk elő CNP-maltooligoszacharidokat a többlépéses kémiai szintézis helyett nyúl vázizomból preparált glikogén foszforiláz b enzim katalizálta reakcióban. A kiindulási anyagunkat a 2-klór-4-nitrofenil ß maltoheptaóz (CNP-G 7 ) donort kémiai szintézissel ciklodextrinből állították elő. A magasabb tagszámú maltooligomerek DP 8-11 a transzglikozilezés során képződtek α-d-glükopiranozil-foszfát (G-1-P) donor jelenlétében. Több mint 90%-os konverziót eredményezett a 10:1 donor:akceptor arány alkalmazása. A transzglikozilezési reakciót 37 Con, 30 percig 10 U enzim alkalmazásával hajtottuk végre. A képződött oligomerek aránya 22,8 % CNP-G 8, 26,6 % CNP-G 9,23,2 % CNP-G 10, 16,5 % G 11, és 6,8 G 12. A reakciótermékek izolálását HPLC-s technikával, semipreparatív oszlopon végeztük. Az oligomerek kötétípusának igazolására a HPLC retenciós idők analízisét alkalmaztuk, a molekulatömegüket MALDI-TF MS technikával határoztuk meg (1. ábra). 2
1. ábra: A félpreparatív HPLC elválasztás elúciós profilja 3.2. Az α-amiláz alhely térképe Az alhely térkép megmutatja az alhelyek számát és a pozícióját az aktív centrumban és megadja a látszólagos kötési energiát az alhely és a szubsztrát monomer egysége között. Laboratóriumunkban az alhely térkép számításához egy számítógépes programot fejlesztettek ki. A program WINDWS környezetben működik és a kísérletileg meghatározott kötéshasítási gyakoriságot használja az energia értékek számításához. A program neve SUMA és az interneten hozzáférhető (gyemant@tigris.klte.hu). 3
3.2.1. A Bacillus licheniformis α-amiláz alhely térképenek vizsgálata különböző hőmérsékleteken (50, 80 és 100 C) A Bacillus licheniformis mezofil organizmus, de az általa termelt α-amiláz (BLA) magas termostabilitással bír. A BLA egyike az iparban legelterjedtebben használt keményítőbontó enzimeknek. Széles körben felhasználja az alkohol-, a keményítő- és a cukoripar. Az enzim szerkezetére és hőstabilitására vonatkozó mélyreható tanulmányok ellenére kevéssé ismertek az enzim biokémiai tulajdonságai. Újabb eredmények szerint a BLA katalizálta keményítő hidrolízis termékeloszlása függ a hőmérséklettől. Mivel az alhelyek számáról és természetéről nem voltak adatok, ezeket az eredményeket nem tudták értelmezni, ezért tanulmányoztuk a BLA bontási képét CNP-glikozidokon. 2. ábra: Termékeloszlások 50, 80, 100 C-on BLA katalizálta hidrolízisben 4
A bontási kép szerint a BLA egy különös kettős termék specifitás -t mutat. Rövidebb szubsztrátok (DP 6-8) esetében a nem-redukáló vég felöli maltopentaóz (G 5 ) felszabadítása a kedvezményezett 68, 84 és 88%, míg a hosszabb szubsztrátok (DP 8-10) hidrolízise a trimer glikozid (G 3 -CNP) domináns felszabadításához vezetett 88, 83 és 83%. Eredményeinkből arra következtettünk, hogy a BLA szubsztrátkötő helye legalább nyolc, öt glikon (-5, -4, -3, -2, -1) és három aglikon (+1, +2, +3) alhellyel rendelkezik. Ellentétben a korábbi vizsgálatokkal, a BLA a pentamer, sőt a tetramer szubsztrátot is hidrolizálja, bár a reakció sebessége lényegesen kisebb. A G 5 -CNP fő hidrolízis terméke G 3 - CNP, de G 2 -CNP és G 1 -CNP is jelentős mennyiségben keletkezik. A számított energiák igazolják feltételezésünket, miszerint a BLA 8 alhelyből álló kötőhellyel rendelkezik. A legszembetűnőbb a (+4) alhely esetén mért pozitív kötési energia, ami a glükóz egység és az alhely kedvezőtlen kölcsönhatását mutatja. Ezt az alhelyet gát alhelynek (barrier subsite) nevezik. Vizsgáltuk a termékeloszlásokat 80 és 100 C-on. Megállapítható, hogy a 80 C-on történő hidrolízis nem változtatja meg a termékeloszlást szignifikánsan. A BLA 100 C-on is aktív enzim. Azonban a termékek eloszlásában egy szabályos eltolódás mutatkozik, ami az aktív hely szerkezetének lényeges megváltozására utal. 100 Con történő hidrolízis során CNP-G 1 sohasem képződik, a (+2) kötőhely nem alkalmas CNP molekula befogadására, kedvezményezett a dimer és a trimer glikozid hasítása. A rövidebb oligomerek olyan produktív kötőmódot létesítenek az enzim aktív centrumával, melyben a CNP-G 2 a távozó csoport (CNP-G 4 -ből 79 %, CNP-G 5 -ből 50 %, CNP-G 6 -ból 59 % és CNP- G 7 -ből 62 %); míg a hosszabb oligomerekből a CNP-G 3 képződik elsődlegesen (62 % a CNP- G 8 -ból, 68 % a CNP-G 9 -ből és 64 % a CNP-G 10 -ből). Az egyes alhelyek energiaértékének csökkenése arra utal, hogy gyengül a glükóz molekulák és az alhelyek affinitása 100 C-on. Kivétel a (+2) kötőhely, melynek nagy energia értéke (-17,5 kj/mol) a CNP-G 2 jelentős képződésének tulajdonítható. 5
10 Látszólagos kötési energia (kj/mol) 5 0-5 -10-15 T ( C) 50 80 100-20 -5-4 -3-2 -1 1 2 3 4 Alhelyek 3. ábra: A BLA alhely térképe különböző hőmérsékleteken 3.2.2. A humán nyál amiláz (HSA) és Y151M mutánsának alhely térképe A humán nyál és hasnyálmirigy α-amiláza alaposan tanulmányozott enzim a klinikai kémiában, mivel fontos indikátorai ezen mirigyek elváltozásainak. Érdeklődésünk középpontjában a humán nyál amiláz áll, amely egy multifunkciós enzim. Szerepet játszik a fogszuvasodás illetve a fog plakk képződésében is. Az α-amilázok jól használhatóak gyógyszertervezésre. Ez napjainkban igen jelentős, mivel az elhízásban a cukorbetegségben a hyperlipidémiaban szenvedők száma több száz millió a világban. Az emlős amilázok (HPA, HSA) aktív centrumát három aromás aminosav, a Trp59, Tyr62 és a Tyr151 veszi körül, melyek kölcsönhatást létesítenek egymással és a kötött glükóz molekulával. Feltételezték, hogy a Tyr151, amely a (+2) alhelyen helyezkedik el, befolyásolja a távozó csoport méretét. Ezért egy baculovirus expressziós rendszer segítségével létrehozták az Y151M mutánst, melyben a tirozint a 151-es pozícióban metioninra cserélték 6
Leu58 Trp58 Trp59 Asp300-4 -3-2 -1 +1 +2 +3 Tyr62 Asp197 Tyr151 Met 151 4. ábra: A humán nyál amiláz alhely modellje A mutáció lényegesen csökkentette az amiláz specifikus aktivitását különböző szubsztrátokon. Meghatároztuk a hidrolízis termékeit mind a vad típusú, mind a mutált enzim katalizálta reakciók esetében CNP-maltooligomer szubsztrátokon. A vad típusú és az Y151M mutáns amiláz termékanalízisének összehasonlítása azt mutatta, hogy a mutáns enzimben a maltóz, mint minimális távozó csoport glükózra cserélődött. A HSA és az Y151M katalizálta hidrolízis termékek HPLC profilját mutatja a ábra a CNP-G 8 szubsztrát esetében. 7
5. ábra: A HSA és az Y151M katalizálta hidrolízis termékek HPLC profilja CNP-G 8 szubsztrát esetében. 8
2 0 0,6 1,3 0 0 0 0 0,6 Apparent binding energy (kj/mol) -2-4 -6-8 -10-1,4-1,9-6,1-6,5-8,8-5,6-2,6-1,5 HSA Y151M -12-12 -14-5 -4-3 -2-1 1 2 3 Subsite number 6.ábra: A humán nyál amiláz és Y151M mutált enzim alhely térképe A termékanalízisből és az egyes glikozidos kötések hasításának gyakoriságából létrehoztuk az alhely térképeket. Meghatároztuk az első alhely térképet, amely mutatja az alhelyek számát, a hasító hely pozícióját és a kötési energiákat az alhely és a szubsztrát monomer egységei között. Mind a HSA, mind a Y151M mutáns aktív centrumában négy glikon és három aglikon kötőhely található. Jól látható, hogy a számított kötési energiákban a (+2) alhelyen jelentkezett a legjelentősebb csökkenés (-2,6 kj/mól a -12,0 kj/mól helyett), ahol a mutáció történt. Ez a szignifikáns redukció a Met oldallánc jelenlétével magyarázható, amely feltehetően egy olyan konformációt vesz fel, ami részben elfoglalja a glükóz kötődési helyét. Ez magyarázza, hogy a mutáns enzim esetében a minimális távozó csoport a maltóz helyett glükózra cserélődött. Jelentősen lecsökkent a hidroláz aktivitása, viszont transzferáz aktivitása jelentősen megemelkedett. Az aglikon kötőhelyen létrehozott szerkezeti változás megnöveli a nyálamiláz szintetikus aktivitását és a PNP-glikozidok jobb akceptorai az Y151M enzimnek, mint a vad típusú HSA-nak. 9
3.3 Enzimatikus glikozilezések 3.3.1. A transzferáz aktivitás bevezetése a humán nyál α-amiláz mutánsába Vizsgálataink arra irányultak, hogy tanulmányozzuk az új mutált enzim alkalmazhatóságát PNP-glikozidok DP 2-4 szintézisére. cleavage site -4-3 -2-1 +1 +2 Tyr151Met H H H N 2 S H H 7. ábra: A humán nyál amiláz Y151M mutánsának aktív centruma ligoszacharidok preparatív méretű szintézisére a PNP 1-S-ß-Glc-t választottuk akceptorként. Az enzimatikus glikozilezés három fő lépéssel jellemezhető. Először hidrolízist szenved a donor. A reakció során 20% maltóz vagy maltotrióz és 80% glükóz képződik. Második lépésben 8 C-on, maltotrió hidrolízis termék és PNP-glikozid akceptor jelenlétében tetramer glikozid, vagy 15 C-on, maltóz jelenlétében trimer glikozid képződik. Hosszabb inkubációs idő alatt, vagy magasabb hőmérsékleten (37 C) a transzfer termékek másodlagos hidrolízist szenvednek és a dimer forma szaporodik fel a reakció elegyben. 10
N 2 H H + H H H S H 2, 37 o C 59 % 5 N 2 S H H S 2 N 2 8 o C 17% H H H H + 4 H H H 1 H 15 o C 15% N 2 S N 2 H H S 2 H H 3 H + H H 8. ábra: A transzglikozílezés mechanizmusa az Y151M katalizálta reakcióban Az NMR mérési adatok megerősítették, hogy az Y151M mutált enzim megtartotta α- szelektivitását és nem változtatta meg az akceptor tio-glikozid anomer konfigurációját. 3.3.2. α-akarviosinil-izomaltozil-spiro-tiohidantoin (PTS-GTH) szintézise a Bacillus stearothermophilus α-amiláz katalizálta reakcióban A BSMA egy termostabil a-amiláz (EC 3.2.1.1.), amely magas hirolitikus és transzferáz aktivitással rendelkezik. Képes hidrolizálni az akarbózt, amely a humán α- amilázok igen jó inhibitora. Ezt követően képes transzferálni az akarviozinil-glükózt (PTS) glükopiranozilidén-spiro-tiohidantoin akceptor molekulára A 1 H és 13 C korrelált spektrumok alapján az enzim megtartotta α-sztereoselektivitását. A glikozilezés során képződött fő termék 1-6 interglikozidos kötéssel képződött α-acarviozinil-izomaltozil-spiro-tiohidantoin. A reakció követésére VRK, HPLC és MALDI-TF analízist alkalmaztunk. A két UV aktív terméket 10 óra inkubációs idő elteltével detektáltuk. 48 óra elteltével mennyiségük szignifikánsan megnőtt és HPLC-s technikával fordított fázisú oszlopon izoláltunk a reakció elegyből. A szerkezetét ESI-TF és NMR spektroszkópiai mérésekkel igazoltuk. 11
H H HN H H H H 50 o C 48 h BSMA H N S NH 2 H 2 H H HN H 3 H H H A HN H B 4 20 % H C H H D H N N E S H H H + HN H H 5 H H N N H S 9. ábra: A transzglikozílezés mechanizmusa BSMA katalizálta reakcióban 3.3.3. A PTS-GTH, mint új amiláz inhibítor A PTS-GTH-t jobb amiláz inhibítornak találtuk, mint a GTH-t. A kinetikai méréseket szintetikus és természetes HSA szubsztrátokon végeztük. A PTS-GTH kevert nem-kompetitív inhibíciót eredményez. Az inhibítor bekötődése feltehetően ugyanazon a másodlagos kötőhelyen történik és csak egy molekula kötődik az enzimhez. Az inhibíciós konstansok a másodlagos ábrázolásokból határoztuk meg és µm-os tartományba estek. 12
4. Összefoglalás Új kemoenzimatikus szintézis stratégiát dolgoztunk ki a kémiai úton igen nehezen, vagy egyáltalán nem előállítható2-klór-4-nitrofenil-(cnp) ß-maltooligoszacharid szubsztrát sorozatot (DP 3-12) preparatív méretű előállítására a glikogén foszforiláz b (EC 2.4.1.1.) katalizálta reakcióban. Az átalakulási konverzió a reakcióban 70-75%. A termékeket semipreparatív HPLC-s technikával izoláltuk. A CNP-glikozidokat az α-amilázok alhely térképezése során használtuk. Elsőként írtuk le a Bacillus licheniformis és a humán nyál α-amiláz (HSA) alhely térképét komputer program segítségével. Az alhely térkép megmutatja az alhelyek számát, pozícióját az aktív centrumban és megadja a látszólagos kötési energiát az egyes alhely és a szubsztrát monomer egységei között. Bevezettük a humán nyál amiláz Y151M mutánsába a transzferáz aktivitást. Maltotetraóz donor és különböző PNP-glikozid akceptorok az Y151M katalizálta reakcióban dimer, trimer és tetramer glikozidokat eredményeznek. Az enzim megtartja regio-, és sztereospecifitását és 1-4 típusú a glikozidos kötést hoz létre a hidrolízis termék és az akceptor molekula között. Új típusú akarbóz analógot szintetizáltunk. A képződött α-akarviozinil-(1-4)-α-dglukopiranozil-(1-6)-d-glükopiranozilidén-spiro-tiohidantoin a humán amilázok igen jó inhibitora. Információink közelebb visznek jó inhibitor aktivitással rendelkező molekulák tervezéséhez és kifejlesztéséhez, mely célmolekulák hozzájárulhatnak a ma már népbetegségnek számító diabetes, obesitas és caries gyógyításához és megelőzéséhez. 13
5. Publikációk Az értekezés alapjául szolgáló közlemények 1. L. Kandra, J. Remenyik, Gy. Gyémánt, A. Lipták Effect of temperature on subsite map of Bacillus licheniformis alpha amylase Acta Biologica Hungarica (2006) 57:367-375. Impakt: 0.636 2. L. Kandra, Gy. Gyémánt, J. Remenyik, C. Ragunath, N. Ramasubbu Transzglycosylations catalysed by Y151M mutant of human salivary alpha-amylase (HSA) Biologia, Bratislava (2005) 60:57-64. Impakt: 0.208 3. L. Kandra, J. Remenyik, Gy. Batta, L. Somsák, Gy. Gyémánt, Kwan Hwa Park Enzymatic synthesis of a new inhibitor of alpha-amylases: acarviosinyl-isomaltosylspirothiohidantoin Carbohydrate. Research (2005) 340:1311-1317. Impakt: 1.533 4. J. Remenyik, C. Ragunath, N. Ramasubbu, Gy. Gyémant, A. Lipták, L. Kandra Introducing transglycosylation activity to human salivary α-amylase (HSA) rganic Letters. (2003) 5:4895-4898. Impact: 3.715 5. L. Kandra, Gy. Gyémánt, J. Remenyik, C. Ragunath, N. Ramasubbu Subsite mapping of human salivary α-amylase and the mutant Y151M FEBS Letters (2003) 544:194-198. Impakt: 3.64 6. Kandra, L., Gyémánt, G., Remenyik, J., Hovánszki, G., Lipták, A. Action pattern and subsite mapping of Bacillus licheniformis alpha-amylase (BLA) with modified maltooligosaccharide substrates FEBS Letters (2002) 518(1-3):79-82. Impakt: 3.64 14
Egyéb közlemény 1. L. Kandra, Á. Zajácz, J. Remenyik, Gy. Gyémánt Kinetic investigation of a new inhibitor for human salivary α-amylase Biochemical and Biophysical Research Communications (2005) 334:824-828. Impakt: 2.830 2. Tóth, A., Remenyik, J., Bajza, I., Lipták, A. Synthesis of the methyl ethers of methyl 6-deoxy-3-C-methyl-α-L-talopyranoside and -α- L-mannopyranoside. Examination of the conformation and chromatographic properties of the compounds. Arkivoc 2003 (V) 28-45.. Impakt: 0,392 3. Kandra, L., Gyémánt, G., Pál M., Petró, M., Remenyik, J., Lipták, A. Chemoenzymatic synthesis of 2-chloro-4-nitrophenyl beta-maltoheptaoside acceptorproducts using glycogen phosphorylase b Carbohydrate Research (2001) 333(2):129-136. Impakt: 1,606 5.1. Az értekezés témájához kapcsolódó előadások (E) és poszterek (P) 1. L. Kandra, G. Gyémánt, J. Remenyik Subsite mapping of α-amylases MTA Szénhidrátkémiai Munkabizottság Előadóülése 2002. Mátrafüred (E) 2. Kandra L., Gyémánt Gy., Remenyik J. α-amilázok kötőhelyeinek térképezése Debreceni Tudományos Napok 2002, Debrecen (E) 3. Remenyik J., Gyémánt Gy., Kandra L., Lipták A. A Bacillus licheniformis α-amiláz kötőhelyének vizsgálata Magyar Biokémiai Társaság előadóülése, Tihany, 2003 12-15. (P) 15
4. J. Remenyik, G. Gyémánt, L. Kandra, A. Lipták Introduction of transglycosdase activity into the human salivary α-amylase 1 st Austrian Hungarian Carbohydrate Conference, Burg Schlaining, Austria, 2003.09.04-06. (E) 5. Remenyik J., Kandra L., Gyémánt Gy., Lipták A. Akarbózanalógok szintézise Bacillus stearothermophilus maltogén amilázzal MTA Szénhidrát kémiai Munkabizottság Előadóülése 2004.10.05. (E) 6. Remenyik J., Kandra L. ligoszacharidok szintézise a humán nyál amiláz (HSA) Y151M mutáns enzimével Kémiai Előadói Napok, Szeged, 2004.10.25-27. (E) 7. J. Remenyik, L. Kandra, Gy. Gyémánt, L. Somsák, A. Lipták Towards the enzymatic synthesis of alpha-amylase inhibitors 2 nd Austrian Hungarian Carbohydrate Conference, Somogyaszaló, 2005.05.24-26. (E) 8. Remenyik J., Kandra L., Gyémánt Gy., Somsák L., Batta Gy., Kwan Park, Lipták A. Bacillus stearothermophylus maltogén amiláz (BSMA) katalizálta glikozílezések Vegyészkonferencia, Hajdúszoboszló, 2005.06.25-27. (E) 9. L. Kandra, G. Gyémánt, J. Remenyik, Enzyme catalysed glycosylation reaction 1 st European Chemistry Congress, Budapest, 2006.08.27-31. (P) 16