Glikogén-foszforiláz inhibítorok előállítása

Átírás

1 Glikogén-foszforiláz inhibítorok előállítása doktori (PhD) értekezés tézisei agy Veronika Témavezetők: Dr. Jean-Pierre Praly Dr. Somsák László University of Debrecen, Faculty of Sciences, Department of rganic Chemistry University Claude Bernard Lyon 1,UM-CS UCBL 5622 Debrecen, 2003.

2 1. Bevezetés Az szervezet energiaellátásában a glükóz központi szerepet játszik. A vércokorszint beállításáért a glükóz és a glikogén metabolizmusa felelős. Ezeket a folyamatokat enzimek és hormonok bonyolult rendszere szabályozza, amelyek együttesen biztosítják az egészséges szervezet normális vércukorszintjét. a ezek az enzimek, hormonok nem termelődnek megfelelő mennyiségben ill. működésük elégtelen, a vércukorszint megváltozik, általában kórosan megemelkedik, így cukorbetegség (diabetes) alakul ki. A 20. század végére a cukorbetegségben szenvedők száma világszerte drámaian megnövekedett. Ez a betegség a fejlett tárasadalmak lakosságának ~6%-át érinti. A cukorbetegséget (diabetes mellitus) két csoportra oszthatjuk attól függően, hogy a páciens szervezete termel-e inzulint vagy sem. Ez alapján megkülönböztetünk inzulinfüggő, vagy más néven I. típusú, valamint nem-inzulinfüggő, vagy II. típusú cukorbetegséget. A betegek mintegy 9-a a II típusú diabetes-ben szenved. Szemben az I. típussal, a II. típusú betegségben szenvedők szervezete képes ugyan inzulin termelésére, de nem megfelelő mennyiségben, ill. az inzulin nem, vagy csak késve fejti ki hatását: a sejtek glükózfelvételének serkentését és a glikogénszintézis előmozdítását. A II. típusú cukorbetegségre jellemző, hogy a tünetek főként 40 éves kor felett jelentkeznek és sokkal lassabban fejlődnek ki. A betegek komplex kezelést igényelnek, mely a vércukorszint csökkentő szerek alkalmazása mellett magában foglalja a rendszeres fizikai tevékenységet és a diétás táplálkozást. A betegség közvetlen kiváltó okait, kialakulásának biológiai, biokémiai hátterét nem ismerjük. Mivel minden tünete és szövődménye a kórosan magas ill. változó vércukorszintre vezethető vissza, a kezelés a normálist megközelítő, állandó vércukorszint biztosítását jelenti. A II. típusú cukorbetegség ellen számos vércukorszintcsökkentő szert (szulfonil-karbamidok, biguanidok, tiazolidindionok, akarbóz) alkalmaznak, azonban ezek csak tüneti kezelést jelentenek és gyakran komoly mellékhatásokat okoznak. Ezért intenzív kutatás folyik egyéb terápiás lehetőségek (többek között új inzulinkiválasztást serkentő, ill. inzulinérzékenyítő anyagok, glükagon-receptor antagonisták, a máj glükóztermelését csökkentő szerek, kombinált terápiák) irányában. A II. típusú diabetes kezelésére egy újonnan vizsgált megközelítés a vércukorszint beállításáért felelős máj glikogén-foszforiláz (GP) enzim gátlása.

3 A PhD tanulmányaim kezdetén a 20 glükopiranozilidén-spiro-hidantoin és 21 tiohidantoin voltak a glikogén-foszforiláz leghatékonyabb glükózanalóg inhibítorai, azonban egyikük sem állt rendelkezésre a biológiai vizsgálatokhoz szükséges nagyobb mennyiségben. X 20 X = MGPb K i = 3.1 µm 21 X = S MGPb K i = 5.1 µm (MGPb: nyúl izom-glikogén-foszforiláz b) A spiro-(tio)hidantoinok, mint vezérmolekulák alapján kutatómunkám célja a glikogén-foszforiláz enzim glükózanalóg inhibítorainak előállítása volt: egy léptéknövélésre alkalmas szintézismódszer kidolgozása a glükopiranozilidénspiro-tiohidantoin 21 előállítására, új, várhatóan GP gátlóhatással rendelkező glükopiranozilidén-spiro-heterociklusok kialakítása intramolekuláris spirociklizációs reakciókkal. II. Alkalmazott módszerek Munkám során a modern preparatív szerves kémia makro- illetve mikromódszereit alkalmaztam. A reakciók követésére és a termékek tisztaságának vizsgálatára vékonyrétegkromatográfiát használtam. Az anyagokat oszlopkromatográfiával vagy kristályosítással tisztítottam. Az előállított vegyületek szerkezetének és tisztaságának vizsgálatát olvadáspont-, elemanalízis-, optikai forgatóképesség-mérésekkel, valamint tömeg- és M spektroszkópiai módszerekkel végeztem. III. A dolgozat új tudományos eredményei III.1. Glükopiranozilidén-spiro-tiohidantoin nagy léptékű előállítása A 21 glükopiranozilidén-spiro-tiohidantoin előállítására egy korábban használt, az enziminhibítort nagyon alacsony összhozammal (~2%) szolgáltatató eljárás (Ősz et al.

4 Bioorg. Med. Chem. Lett. 1999, 9, ) alapján kidolgoztunk egy új módszert, mellyel 21 hozama mintegy 15-szörösére növekedett. Bz Bz Bz Bz Br g(c) 2, C % Bz Bz Bz Bz C Bz Br 2, hν, CCl 3 v. C 2 Cl 2 Bz 95% Bz C Bz C Bz BS, CCl 4, Bz 2 Bz 2 Bz Bz 62% Br TiCl 4, Ac Br, Ac TiCl 4, Ac Br, Ac 2, 53% 94% 2, 54% 89% Bz Bz Bz Bz C 2 Br 2, hν, CCl 3 89% Bz Bz Bz Bz Br C Ag 2, DMS 2 35% KSC or 4 SC C 3 2, 80 o C S 8, 2 Bz Bz Bz Bz C 2 S 110 ame/me reflux, 92% 109 = Bz (79%) (6%) 21 = a.) A védőcsoportokat benzoilra cserélve a szintézis kulcsvegyületének, a 105 glükopiranozil-cianidnak a hozama 11%-ról 58%-ra nőtt, valamint a kromatográfiás elválasztások is elhagyhatóvá váltak. Az anyalúg kromatográfiás tisztításával azonban további 16-19% 105-t nyertünk ki a reakcióelegyből, mely arra utal, hogy a cianobenzilidén melléktermék képződése nem számottevő.

5 Br C C 2 = Ac* 8 11% 1. Ac 2 / 2 2. P, Br 2, 2 g(c) 2 C 3 2 kromatográfia BS, Bz 2 2 CCl 4 = Bz 95% 9 58% 94% BzCl/piridin Br/Ac g(c) 2 C 3 2 Br, Ac 21 Br Br C C 2 teljes hozam S S 83% 68% 87% KSC, C 3 2 kromatográfia 57% 79% 78% 92% hat lépésre: TiCl 4, 2 Ac kromatográfia ame, Me hét lépésre: ~2% ~3 Br 2, CCl 3, hν 4 SC, C 3 2 S 8, 2, 80 C (kromatográfia) ame, Me *Ősz et al. Bioorg. Med. Chem. Lett. 1999, 9,

6 b.) A gyökös brómozási reakciókban korábban használt -bróm-szukcinimidet elemi brómmal váltottuk ki, ezáltal leegyszerűsödött a reakcióelegyek feldolgozásának módja. Megmutattuk, hogy az ilyen reakciókban általánosan alkalmazott széntetraklorid oldószer helyettesíthető könnyebben hozzáférhető kloroformmal ill. diklórmetánnal, amelyek mellett a reakciók alacsonyabb hőmérsékleten is kivitelezhetővé válnak. c.) A cianocsoport részleges hidrolízisét 105 és 106 esetén jégecetes Br-dal végeztük, így tiszta, kristályos nyerstermékként, jó hozammal nyertük a megfelelő benziolezett C-(β-D-glükopiranozil)-formamidokat (107, 108). d.) itrogén atmoszféra alatt nitrometánban, a gyökös mechanizmusú mellékreakciók csökkentése céljából elemi kén jelenlétében 108-at ammónium- vagy kálium-tiocianáttal reagáltattuk és jó hozammal kaptuk 109 spiro-tiohidantoint valamint kevés 110 hidroxi-amid mellékterméket. A 110 hidroxi-amidot független úton is előállítottuk 108-ból dimetilszulfoxidban ezüstsó-katalizált hidrolízissel. 109-et metanolban Zemplén-módszerrel debenzoileztük és 92%-os hozammal kaptuk 21-t. e.) Az új módszerrel grammos tételben állítottuk elő a tiohidantoint, melynek a máj glikogén-foszforiláz enzim aktivitására gyakorolt hatását a Debreceni Egyetem rvosi Vegytani Intézetében vizsgálták meg. Ezek szerint a tiohidantoin 21 mind in vitro, mind in vivo körülmények között igen jelentősen csökkenti az enzimaktivitást, illetve in vivo kísérletekben a vércukorszintet, így egy potenciálisan vércukorszint-csökkentő terápiás szer nagy léptékű szintézisét dolgoztuk ki. III.2. -acil- -β-d-glükopiranozil karbamidok előállítása és fotoreakciói Szénhidrátok anomer centrumán a gyökös reakciók nagymértékben regio- és sztereoszelektíven játszódnak le, ezért, a retroszintetikus ábra szerint, orrish II. típusú fotokémiai reakcióval terveztük a 20 glükopiranozilidén-spiro-hidantoinhoz hasonló szerkezetű vegyületek előállítását. ~.... a.) A 95 per--acetil glükopiranozil-azidból kiindulva két úton állítottunk elő a fotolízis prekurzorainak szánt védett -acil- -glükopiranozil karbamidokat (92, 93, ): glükopiranozil-aminból acil-izocianátokkal (A) vagy glükopiranozil-karbamid acilezésével (B).

7 b.) A fotolíziseket 92 per--acetil -acetil- és 93 -benzoil- -β-d-glükopiranozil karbamidokkal végeztük el különböző körülmények között. Ezen kísérletek során azt tapasztaltuk, hogy a várt átalakulás helyett ún. orrish I. típusú -dezacileződés történt, így azt mondhatjuk, hogy a vizsgált karbamidok nem alkalmasak fotolitikus gyűrűzárásra. c.) A védőcsoportokat klasszikus Zemplén-módszerrel vagy metanolban KS 4 ill. ammónia segítségével távolítottuk el és kaptuk vegyületeket, míg a aminoszármazékot 120 aney-i-lel végzett redukciója során nyertük. Ac Ac Ac Ac 3 2, aney-i 71% Ac Ac Ac Ac , C 2 PPh 3, TF 46% B 60-75% C C 3 C, Ac Ac Ac Ac 2 ZnCl 2 CCl 3 A 60-8 Cl Ac Ac Ac 91 92, 93, Ac 92 = C 3 56% (A) 93 = C (A) 112 = 4-2 -C (A) 65% (B) 113 = 3-Cl-C % (B) 114 = 4-Ac-C % (A) 2 (B) 115 = 1-naftil 73% (A) 116 = 2-naftil 29% (A) 117 = 2-indolil 41% (A) K i (µm), MGPb 118 = C = C = 4-2 -C = 3-Cl-C = 4--C = 1-naftil 7.8

8 124 = 2-naftil = 2-indolil = 4-2 -C 6 4 IC 50 = 14 d.) Az így kapott vegyületek a glikogén foszforiláz inhibítorainak bizonyultak. Ezen inhibítorok közül a naftoil- -β-d-glükopiranozil karbamidot találták a leghatékonyabbnak mely nanomólos K i értékével a jelenleg ismert legjobb glükózanalóg GP inhibítor. A krisztallográfiai vizsgálatok szerint az általunk előállított karbamidszármazékok közül egyesek nemcsak a GP enzim katalitikus helyén kötődnek, hanem az ún. új allosztérikus helyen is, mely eddig nem tapasztalt, egyedülálló tulajdonság a glükózanalóg inhibítorok között. III.3. Kísérletek glükopiranozilidén-spiro-1,2,4-oxadiazolinok előállítására A fenti molekulákkal, valamint egyes, hatékony GP inhibítornak talált glükopiranozilidén-spiro-oxatiazolokkal végzett kinetikai és röntgenkrisztallográfiai vizsgátatok eredményei alapján új glükopiranozilidén-spiro-oxadiazolinok előállítását terveztük per-acetilezett -β-d-glükopiranozil-amidoximok oxidatív körülmények között végzett fotolízisével. Ac Ac Ac Ac ' Ac Ac Ac Ac a.) E prekurzorokat módosított Staudinger-reakcióval per--acetilezett-β-d-glükopiranozil azidból készítettük trimetil-foszfin majd aril-hidroximinoil-kloridok hozzáadásával. Ac Ac Ac Ac Me 3 P, toluol C 2 Cl 2 2. Cl ' ' ' 136 ' = Ac, = C % 137 ' = Ac, = 4-2 -C % 138 ' = Ac, = 4-C-C % ' 139 ' = Ac, = 2-naftil 6% 147 ' =, = 4-2 -C ' =, = 4-C-C 6 4 b.) A 137 acetilezett -β-d-glükopiranozil-4-nitrobenzamidoxim fotolízisét BS jelenlétében végeztük el különböző körülmények között. A képződött termékek szerkezete alapján feltételezzük a kívánt 143 spiro-oxadiazolin kialakulását, melyben azonban a

9 cukorgyűrű felnyílik és egy aromás 1,2,4,-oxadiazol (145) jön létre. A keletkezett szekunder alkohol a reakciókörülmények között 146 oxovegyületté alakulhat át. Az elvégzett kísérletek alapján a célvegyület -β-d-glükopiranozil-amidoxim feltehetően instabil és az általunk vizsgált módszerrel nem állítható elő. A 147 és 148 elszappanosított származékok nem gátolják a glikogén-foszforiláz enzimet. Ac Ac Ac Ac Ac BS hν Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac Az BS mennyisége: Az I lámpa teljesítménye: 4 ekv. 4x1 ekv. 4 ekv. 60W 60W 375W Ac Ac Ac Ac 143 Ac Ac Ac Ac Ac 137 = p-c BS hν Ac Ac Ac Ac Ac 144 Ac Ac % 2 Ac Ac Ac Ac ~3% 45% IV. Az eredmények alkalmazási lehetőségei

10 Kidolgoztuk a 21 glükopiranozilidén-spiro-tiohidantoin D-glükózból kiinduló nagy léptékű előállításának egyszerű és igen hatékony módszerét, mellyel grammos tételben állítottuk elő az inhibítort. Ezáltal lehetővé vált 21-nek a máj glikogénmetabolizmusára gyakorolt hatásának in vitro és in vivo vizsgálata. A hidantoin nyílt láncú analogonjainak tekinthető különféle -acil- -β-dglükopiranozil karbamidokat ( ) is előállítottunk. Ezek a GP nagyon hatékony inhibítorainak bizonyultak, közülük került ki a jelenleg ismert legjobb glükózanalóg gátlószer, a naftoil származék (Ki = 0.4 µm). Az -acil- -β-d-glükopiranozil karbamidok előállításával új vezérmolekulákat fedeztünk fel a GP enzim gátlására. Megvizsgáltuk új glükopiranozilidén-spiro-oxadiazolinok fotokémiai előállításának lehetőségeit per--acetil--β-d-glükopiranozil amidoximból kiindulóan. Tapasztalataink alapján a célvegyület oxadiazolinok feltehetően instabilak és az általunk vizsgált módszerrel nem állíthatók elő. 5. Közlemények jegyzéke 5.1. Közlemények 1. László Somsák, Veronika agy, Tibor Docsa, Béla Tóth, Pál Gergely Gram-scale synthesis of a glucopyranosylidene-spiro-thiohydantoin and its effect on hepatic glycogen metabolism studied in vitro and in vivo Tetrahedron: Asymmetry 2000, 11, László Somsák, Veronika agy A new, scalable preparation of a glucopyranosylidene-spiro-thiohydantoin: one of the best inhibitors of glycogen phosphorylases Tetrahedron: Asymmetry 2000, 11, ikos G. ikonomakos, Magda Kosmopoulou, Spyros E. Zographos, Demetres D. Leonidas, László Somsák, Veronika agy, Jean-Pierre Praly, Tibor Docsa, Béla Tóth, Pál Gergely Binding of -acetyl- -β-d-glucopyranosyl urea and -benzoyl- -β-d-glucopyranosyl urea to glycogen phosphorylase b European Journal of Biochemistry 2002, 269,

11 4. László Somsák, Veronika agy, Zsuzsa adady, Tibor Docsa, Pál Gergely Glucose analog inhibitors of glycogen phosphorylases as potential Antidiabetic agents: recent developments Current Pharmaceutical Design 2003, 9, invited review 5.2. A dolgozat témakörében bemutatott előadások és poszterek 1. Marietta Tóth, Veronika agy, László Somsák Synthesis of D-gluco- and D-xylopyranosylidene-spiro-(thio)hydantoins and their effect on muscle and liver glycogen phosphorylases MTA Szénhidrátkémiai Munkabizottságának emzetközi Előadóülése, May Mátrafüred 2. Veronika agy, Zsuzsa adady, László Somsák, ikos G. ikonomakos, Tibor Docsa, Béla Tóth, Pál Gergely ew glucose analogue inhibitors of glycogen phosphorylases which can also bind at the new allosteric site MTA Szénhidrátkémiai Munkabizottságának emzetközi Előadóülése, May Mátrafüred 3. BélaTóth, Tibor Docsa, Veronika agy, László Somsák, Pál Gergely A glikogén foszforiláz glükózanalóg inhibítorai, mint lehetséges hipoglikémiás szerek A Magyar Fiziológiai Társaság LXVI. Kongresszusa, June Szeged 4. Veronika agy, Zsuzsa adady, László Somsák, ikos G. ikonomakos, Tibor Docsa, Béla Tóth, Pál Gergely Glikogén foszforiláz enzimek új glükózanalóg inhibítorainak előállítása Magyar Kémikusok Egyesülete, Vegyészkonferencia, June ajdúszoboszló 5. László Somsák, Veronika agy, Zsuzsa adady, ikos G. ikonomakos, Tibor Docsa, Béla Tóth, Pál Gergely ew Glucose Analogue Inhibitors of Glycogen Phosphorylase 11 th European Carbohydrate Symposium, September Lisboa, Portugal 6. Veronika agy, Zsuzsa adady, László Somsák, Jean-Pierre Praly, ikos G. ikonomakos, Tibor Docsa, Béla Tóth, Pál Gergely

12 ew glucose analogue inhibitors of glycogen phosphorylase VI ème Journée du Groupe Lyonnais des Glycosciences, ovember Lyon, France 7. Veronika agy, Zsuzsa adady, László Somsák, Jean-Pierre Praly, ikos G. ikonomakos, Tibor Docsa, Béla Tóth, Pál Gergely ouveaux dérivés du D-glucose inhibiteurs de la glycogène phosphorylase XIX ème Journées de Chimie et Biochimie des Glucides, May Albé, France 8. Evangelia D. Chrysina, Magda. Kosmopoulou, C. Tiraidis, G. Loupasakis-Loupasis, Demetres D. Leonidas, ikos G. ikonomakos, Veronika agy, László Somsák, Pál Gergely, Jean-Pierre Praly Structural studies of -β-d-glucopyranosyl urea analogues in complex with glycogen phosphorylase b Congress of the ellenic Society of Biochemistry & Molecular Biology, ctober Ioannina, Greece 9. Veronika agy, Tibor Docsa, Pál Gergely, ikos G. ikonomakos, Jean-Pierre Praly, László Somsák -acyl- -β-d-glucopyranosyl-ureas as glycogen phosphorylase inhibitors 12 th European Carbohydrate Symposium, July Grenoble, France 10. Veronika agy, László Somsák, Jean-Pierre Praly Experiments towards new glucopyranosylidene-spiro-heterocycles 1 st ungarian-austrian Carbohydrate Conference, September Burg Schlaining, Austria 11. László Somsák, Veronika agy, Zsuzsa adady, Attila Krakomperger, Matietta Tóth ew glucose analogue inhibitors of glycogen phosphorylase 1 st ungarian-austrian Carbohydrate Conference, September Burg Schlaining, Austria 5.3. Lecture in other field V. 3. Egyéb témakörben bemutatott előadás Veronika agy, László Somsák Preparation of 1-carboxamido-glycosides as potential glycosidase inhibitors/ inactivators

13 MTA Szénhidrátkémiai Munkabizottságának emzetközi Előadóülése, May Mátrafüred