A MEDICAGO MINIMA GYÖKÉRENDOFITON GOMBÁINAK VIZSGÁLATA A FÜLÖPHÁZI FÉLSZÁRAZ HOMOKTERÜLETEN

Mikológiai Közlemények, Clusiana 49(1 2): 67 77. (2010) TUDOMÁNYOS DOLGOZATOK RESEARCH ARTICLES A MEDICAGO MINIMA GYÖKÉRENDOFITON GOMBÁINAK VIZSGÁLATA A FÜLÖPHÁZI FÉLSZÁRAZ HOMOKTERÜLETEN KNAPP G. Dániel és KOVÁCS M. Gábor Eötvös Loránd Tudományegyetem, Biológiai Intézet, Növényszervezettani Tanszék, 1117 Budapest, Pázmány Péter sétány 1/c; knappdani@gmail.com A Medicago minima gyökérendofiton gombáinak vizsgálata a fülöpházi félszáraz homokterületen. A szárazföldi edényes növények többsége gyökerén keresztül különböző nem-patogén gombapartnerekkel él együtt. Az endofiton gombák a növények szöveteiben találhatók, és nincs negatív hatásuk a gazdaszervezetre. A gyökérendofiton gombák egy formacsoportját a tömlősgombákhoz tartozó sötét szeptált endofiton -ok (dark septate endophytes: DSE) alkotják. A sötéten pigmentált, szeptált hifáik a gyökérben futnak, és annak kéregrészében jellegzetes intracelluláris mikroszkleróciumokat hoznak létre. Célunk annak vizsgálata volt, hogy milyen gyökérendofiton gombák kolonizálják az apró lucernát a fülöpházi homokterületen. Összesen 26 gombatörzset sikerült izolálnunk 23 növényegyed gyökeréről. A molekuláris taxonómiai vizsgálatok során a törzsek ITS-régióját amplifikáltuk, szekvenáltuk, és nemzetközi adatbázisok szekvenciáival vetettük össze. A törzsek mind a Pleosporales rendbe illeszkedtek. In vitro inokulációs kísérleteket állítottunk össze póréhagymával, és megállapítottuk, hogy a törzsek többsége DSE-gombának tekinthető. A DSE-gombák szekvenciái egyértelmű hasonlóságot mutattak különböző éghajlatú és földrajzi fekvésű területek különböző gazdaszervezeteiből származó gombák szekvenciáival. Study of root colonising endophytic fungi of Medicago minima in a semiarid sandy grassland area near Fülöpháza (Great Hungarian Plain). The majority of the terrestrial vascular plants form mutualistic symbioses with different fungi. Fungal endophytes live internally and asymptomatically within the tissues of the host plants. The dark septate endophytes (DSE) represent a form-group of root endophytic ascomycetous fungi. The aim of our study was to gain data about the root-colonising endophytic fungi of Medicago minima in a semiarid sandy grassland area near Fülöpháza in the Great Hungarian Plain. Altogether 26 fungal strains were isolated from 23 plant specimens. The ITS region of nrdna was amplified, sequenced and compared with those deposited in public databases. All the strains belonged to the order Pleosporales. Based on the results of the in vitro tests with Allium porrum plants, the majority of the isolates could be assumed as DSE fungi. The ITS sequences of the DSE strains showed unambiguous similarities with fungal sequences from different hosts originating from different geographical and climatical regions. Kulcsszavak: apró lucerna, endofiton gomba, Fusarium, mikroszklerócium, sötét szeptált endofiton Key words: dark septate endophytes, DSE, endophytic fungi, Fusarium, Medicago, microsclerotium BEVEZETÉS A szárazföldi edényes növények többsége gyökerén keresztül különböző nempatogén gombapartnerekkel él együtt, melyek stratégiájukat tekintve a mikorrhizaképző és az endofiton gombák közé sorolhatók. Mikológiai Közlemények, Clusiana 49(1 2), 2010 Magyar Mikológiai Társaság, Budapest

68 KNAPP G. D. és KOVÁCS M. G. Az endofitonokat sokféleképpen definiálják; általában azokat a gombákat nevezzük endofitonoknak, melyek életciklusuk teljes vagy meghatározó szakaszában megtalálhatók a gazdanövényben, de nem okoznak látható szöveti károsodást (HIRSCH és BRAUN 1992, SAIKKONEN és mtsai 1998). Az endofitonok inter- és intracellulárisan kolonizálják a növények különböző szöveteit. Segíthetnek a gazdanövénynek a kórokozók elleni védelemben, például másodlagos anyagcseretermékek, toxinok termelésével, míg a gazdanövény tápanyagokat és védelmet biztosíthat az endofiton gombáknak. Gazdasági okok miatt főként a pázsitfűfélék föld feletti szöveteiben előforduló gombákról vannak ismereteink, és jóval kevesebbet tudunk a gyökereket kolonizáló endofitonokról (SAIKKONEN és mtsai 1998). A gyökereket kolonizáló endofiton gombák egy formacsoportját alkotják a sötét szeptált endofiton -ok (dark septate endophytes: DSE) (JUMPPONEN és TRAPPE 1998). Ezeket a steril vagy konídiumképző gombákat a tömlős- és az imperfekt gombák közé sorolták, és molekuláris taxonómiai vizsgálatok alapján is a tömlősgombák törzsének különböző rendjeibe illeszkednek. A DSE-gombák jellemző struktúrái a sötéten pigmentált, szeptált, inter- és intracellulárisan egyaránt futó hifák, és annak kéregrészében létrehozott jellegzetes intracelluláris struktúrák, az úgynevezett mikroszkleróciumok (1. ábra) (CURRAH és TSUNEDA 1993, JUMPPONEN és TRAPPE 1998, READ és HASELWANDTER 1981). A DSE-gombák különböző hatással lehetnek a gazdanövényre. Több vizsgálat irányult a kapcsolat megismerésére, és a különböző gyökérendofitonok gazdanövényre gyakorolt pozitív, semleges és negatív hatását is kimutatták (JUMPPONEN 2001, JUMPPONEN és TRAPPE 1998). Egyes tanulmányok leírták, hogy növelik a növény foszfátfelvételét (HASELWANDTER és READ 1982), a növényevők ellen toxinokat termelnek a pázsitfűfélékben (SAIKKONEN és mtsai 1998), és megváltoztatják a gazdanövény vízfelvételét és környezeti hatásokra adott válaszát (MANDYAM és JUMPPONEN 2005). DSE-gombákat több száz növényfajból mutattak ki, melyek között mikorrhizát képző és nem képző fajok is voltak (JUMPPONEN és TRAPPE 1998). Előfordulásuk a szubantarktikus, alpesi, mérsékelt övi száraz és hideg területeken jelentős mértékű (MANDYAM és JUMPPONEN 2005), szerepük egyes helyeken akár a mikorrhizákéhoz is mérhető, ellenben más éghajlati övek és területek DSE-gombáiról kevés adattal rendelkezünk (MANDYAM és JUMP- PONEN 2005). Habár a legtöbb magyarországi mikorrhizáltsági státuszvizsgálat során a szeptált hifák jelenlétét külön jelezték (KOVÁCS 2008), az élőhelyek DSE-gombáira kevés kutatás irányult. Alföldi homokterületek vizsgálata során nagy gyakoriságú DSEkolonizációt írtak le (KOVÁCS és BAGI 2001, KOVÁCS és SZIGETVÁRI 2002). A fülöpházi homokpusztagyepben például a 89 vizsgált növényfajból 63 növény esetében figyeltek meg gyökéren belüli szeptált hifákat, és 36 esetben találtak mikroszkleróciumot (KOVÁCS és SZIGETVÁRI 2002). Ezen kutatás során a pillangósvirágúak családjából öt növényt vizsgáltak. Ezek gyökerében minden esetben megfigyeltek arbuszkuláris mikorrhizára jellemző képleteket és szeptált endogén hifákat is (KOVÁCS és SZIGETVÁRI 2002). Az egyik vizsgált faj egy kis termetű, egyéves növény, az apró lucerna (Medicago minima (L.) Grufbg.), volt, melynek előfordulása alföldi száraz gyepekben és legelőkön gyakori (SIMON 2001). A növényre jellemző az arbuszkuláris mikorrhizaképzés, de emellett

A Medicago minima gyökérendofiton gombáinak vizsgálata a fülöpházi homokterületen 69 jelentős DSE-kolonizációját is leírták a területen (KOVÁCS és SZIGETVÁRI 2002). A Medicago nemzetségbe tartozó fajok hasonlóan sok más pillangósvirágú növényhez nitrogénkötő baktériumokkal élnek szimbiózisban. A nitrogénkötő baktériumokkal és az arbuszkuláris mikorrhizákkal kialakított mutualista szimbiózisoknak közös szabályozási lépései is vannak (ENDRE és mtsai 2002). Ennek igazolása során Medicago fajokat is vizsgáltak. 1. ábra. Mikroszkleróciumok (A) és szeptált hifák (B) az apró lucerna gyökerében. Mérce: 20 µm. Fig. 1. Microsclerotia (A) and septate hyphae (B) in the root of Medicago minima. Scale: 20 µm. A Medicago nemzetség több faja is molekuláris növénybiológiai modellnövény, ezért a félszáraz területek nem-patogén gyökérkolonizáló gombáira irányuló, hosszú távú kutatásainkban célul tűztük ki annak vizsgálatát, hogy egy ilyen élőhelyen természetesen előforduló Medicago fajban mint a fülöpházi területen élő apró lucerna milyen DSE-gombák fordulnak elő. ANYAG ÉS MÓDSZER Mintavétel és törzsek izolálása Mintavételi területünk Fülöpházától 3,5 km-re DNy-ra, félszáraz homokpusztagyepben volt. A terület mérsékelt kontinentális klímájú. A napsütéses órák száma évente 2000 2100 körüli, az évi középhőmérséklet 10 12 C, az éves csapadékmennyiség 500 és 600 mm közötti. A terület tengerszint feletti magassága 100 120 m között van. A talaj enyhén bázikus és tápanyagokban szegény (KOVÁCS-LÁNG és mtsai 2000, VÁRALLYAI 1993). Mintáinkat két időpontban (2008. július és 2009.

70 KNAPP G. D. és KOVÁCS M. G. július) gyűjtöttük. Mintavételkor a Medicago minima növények egész gyökérzetét kivettük a talajból, majd nedves homokkal nejlonzacskókban 8 C-on tároltuk a feldolgozásukig (legfeljebb 3 napig). Az endofiton gombák izolálásakor a gyökereket desztillált vízzel alaposan lemostuk, és ecsettel megtisztítottuk, majd körülbelül 1 cm hosszú, különböző elhelyezkedésű és fejlettségű szakaszokat választottunk ki, melyeket levágtunk a gyökérzetről. A gyökérdarabok felszínét sterilizáltuk (90 másodperc 2%-os Na-hipoklorit, 1 perc 70%-os etil-alkohol és 3 4 perc steril desztillált víz), majd négy részre vágtuk és Petri-csészében MMN-táptalajra (modified Melin-Norkrans, MARX 1969) (250 mg/l (NH 4 ) 2 HPO 4, 500 mg/l KH 2 PO 4, 150 mg/l MgSO 4 7 H 2 O, 50 mg/l CaCl 2 2 H 2 O, 25 mg/l NaCl, 20 mg/l Fe-EDTA, 10 g/l glükóz, 3 mg/l malátakivonat, 0,1 µg/l tiamin HCl, 15 g/l agar, 10 µg/ml sztreptomicin, ph = 5,8) helyeztük. A gyökerekből kinövő gombákat növekedési jellemzőik alapján szétoltottuk, hogy tiszta tenyészeteket kapjunk. Az izolátumokat 18 C-on sötétben tároltuk, és 2 3 havonta átoltottuk. A törzsek elnevezése (pl. med1/2 ) a növényegyedet ( med1 ) és az egyedről izolált törzs számát ( 2 ) jelöli. Molekuláris taxonómiai módszerek A molekuláris taxonómiai vizsgálatokhoz a DNS-kivonást a különböző tenyészetekből kivágott néhány mm-es micéliumdarabból GARDES és mtsai (1991) szerint végeztük kisebb módosításokkal. A mintákat 400 µl CTAB-pufferben (2% CTAB, 20 mm EDTA (ph = 8), 100 mm Tris-HCl (ph = 9), 1,4 mm NaCl) sterilizált kvarchomok és üvegtörő segítségével Eppendorf-csövekben szétdörzsöltük, majd 50 percen keresztül 60 C-on szárazblokkban inkubáltuk (MRC szárazblokk). A mintákat 400 µl kloroform hozzáadásával tisztítottuk, majd 20 percig 13 230 g-n centrifugáltuk (Hettich Mikro200). A mintákat, majd a felülúszót új Eppendorf-csövekben újból 1 térfogatnyi kloroformmal tisztítottuk. Újabb 20 perces centrifugálás után a felülúszóhoz 30 µl Na-acetátot (3 M, ph = 4,6, Sigma) és 600 µl 96%-os etanolt adtunk, és 16 18 órán keresztül 20 C-on tartottuk. Ezután a mintákat 50 percig centrifugáltuk 13 230 g-n, majd a pellet 70%-os etanolos mosása után újabb 20 percig. Az Uniequip vákuumcentrifugával kiszárított pelleteket 30 µl steril milli-q vízben oldottuk. A molekuláris taxonómiai vizsgálatokhoz a törzsek sejtmagi riboszomális DNS-ének ITS-régióját amplifikáltuk és szekvenáltuk. A polimeráz láncreakciót (PCR) Biometra T-Gradient 96 típusú készüléken végeztük. Az amplifikációhoz ITS1F (GARDES és BRUNS 1993) és ITS4 (WHITE és mtsai 1990) primereket használtunk. A 20 µl össztérfogatú reakcióelegy összetétele: 1 µl DNS-templát, 2 µl (NH 4 ) 2 SO 4 puffer (10 ) (Fermentas), 2 µl MgCl 2 (Fermentas) (25 mm), 2 µl dntp (Fermentas) (2 mm), 1 1 µl primer (10 µm), 1 µl Taq polimeráz (Fermentas) (1 U/µl) és 10 µl Milli-Q víz volt. A PCR programja a következő volt: 3 perc denaturáció (94 C), ezután 35 cikluson keresztül 0,5 perc denaturáció (94 C), 0,5 perc annealing (primer kötés) (52,2 C) és 1,5 perc extenzió (lánchosszabbítás) (72 C), majd 10 perc végső extenzió (72 C). A reakciók sikerességét agaróz gélelektroforézis segítségével ellenőriztük. Az amplifikált termékeket etídium-bromid vagy Sybr Safe (Invitrogen) fluoreszcens DNS-fes-

A Medicago minima gyökérendofiton gombáinak vizsgálata a fülöpházi homokterületen 71 téket tartalmazó 1,5%-os agaróz gélen ellenőriztük, és UV-fény átvilágítással detektáltuk a Bio-Rad Geldoc készülékkel. A sikeresen amplifikált ITS-szakaszok szekvenálását az Agowa Genomics cég (Berlin, Németország) végezte az amplifikációhoz használt primerekkel. A kapott elektroforegramokat a Staden-programcsomaggal (STADEN és mtsai 2000) ellenőriztük és javítottuk. Szekvenciáinkat a GenBank BLASTN keresőjével vetettük össze a nyilvános adatbázisban szereplő hasonló szekvenciákkal (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast) (ALTSCHUL és mtsai 1990). A filogenetikai számításokhoz a szekvenciák illesztését a Multalin programmal végeztük (http://bioinfo.genotoul.fr/multalin/multalin.html) (CORPET 1988). Az alignment (illesztés) ellenőrzéséhez a ProSeq 2.9 (FILATOV 2002) programot, majd a filogenetikai számításainkhoz a MEGA 4.0 (TAMURA és mtsai 2007) programot használtuk. A filogenetikai távolságok számításakor a Kimura 2-paraméteres modellel dolgoztunk a gap-ek (inzerciós helyek) páronkénti ignorálásával, a törzsek rokonsági viszonyait bemutató fát neighbor-joining módszerrel (SAITOU és NEI 1987) készítettük. Az elágazások erősségének meghatározására bootstrapmódszert (FELSENSTEIN 1985) alkalmaztunk, 500 ismétléssel. In vitro növényfertőzési tesztek Az in vitro kísérletek során póréhagymákat (Allium porrum) inokuláltunk a különböző törzsekkel. A póréhagyma magjait felszínsterilizáltuk (3 percig 30%-os H 2 O 2 - ban, majd két lépésben 10 és 15 percig steril csapvízben tartottuk). Ezután steril csapvízzel benedvesített szűrőpapíron, Petri-csészékben csíráztattuk ki őket. A gyökérendofitonok ITS-szekvenciái alapján kapott törzsfa kládjaiból egy-egy gombatörzset vizsgáltunk az inokulációs teszttel, hogy el tudjuk dönteni, az adott csoport DSEgombának tekinthető-e. A tenyészetekből pár mm-es, micéliumot tartalmazó agar kockákat vágtunk ki, melyeket cukormentes MS-táptalajra (MURASHIGE és SKOOG 1962; Sigma Basal Salt Mixture M5524; 15 mg/l agar, 10 µg/ml sztreptomicin, ph = 5,8) helyezett 7 12 napos hagymanövénykék mellé tettünk. Gombatörzsenként öt hagymát inokuláltunk. Minden inokulációs sorozatban kontrollként öt növényt is beállítottunk. A vizsgált növényeket Sanyo MRL-350 fényszekrényben neveltük (megvilágítás: 24 C, 14 óra, kevert fény; sötét: 22 C, 10 óra) 8 9 héten keresztül. Az inokulálás időtartama alatt a növénykéket rendszeresen ellenőriztük, majd azokról a kísérlet végén fotót készítettünk. Azokat a törzseket tekintettük DSE-gombáknak, melyek belenőttek a gyökerekbe, nem pusztították el a növényt, és mikroszkleróciumot képeztek. Mikroszkópia A mintázott növények és az inokulált póréhagymák gyökereiből preparátumokat készítettünk. A gyökereket 10 percig 65 C-on 10%-os KOH-oldatban színtelenítettük, kétszer 10 percig mostuk desztillált vízben, ezután további 10 percen keresztül tejsavas vízben savanyítottuk. A mintákat anilinkékkel festettük meg, majd tejsavas desztillált vízben mostuk ki a felesleges festéket. A festett gyökereket poli-vinil-alkohol-tejsav-glicerolban (PVLG) fedtük le. A preparátumokat fénymikroszkóppal vizsgáltuk (Nikon Eclipse 80i) hagyományos és Nomarski-féle optikát (DIC) használva.

72 KNAPP G. D. és KOVÁCS M. G. EREDMÉNYEK ÉS ÉRTÉKELÉSÜK A jelen dolgozatban bemutatott vizsgálat során 23 Medicago minima egyed gyökeréről gyűjtöttünk mintát a fülöpházi homokpusztagyepről. A növényeknél minden esetben jelentős mértékű kolonizációt találtunk. Az arbuszkuláris mikorrhizák jellemző képletei mellett sötét, szeptált hifákat és mikroszkleróciumokat is megfigyeltünk a gyökerekben, hasonlóan a területen korábban végzett vizsgálat eredményeihez (KOVÁCS és SZIGETVÁRI 2002). A legtöbb esetben egy növényegyedről 4 10, telepmorfológiájuk szempontjából egy- vagy kétféle gombatörzs tenyészett ki. Az egy növényegyedről származó, azonos telepmorfológiával és növekedési jellemzőkkel rendelkező törzseket azonosnak tekintettük, és csak egy telepből végeztük el a molekuláris taxonómiai vizsgálatokat. Így összesen 26 gombatörzset különítettünk el, és ezek mindegyikének sikerült az ITS-szakaszát felerősíteni és szekvenálni (a szekvenciák további vizsgálatok után a GenBank-ba kerülnek elhelyezésre). A nemzetközi adatbázisok szekvenciáival való összevetés alapján megállapítottuk, hogy az összes izolált törzs a tömlősgombákon belül a Pleosporales rendbe tartozik. Törzseink szekvenciájához hasonló szekvenciák általában környezeti minta - ként, endofiton gombaként, vagy azonosított nemzetségként és/vagy fajként (pl. Embellisia tellustris, Fusarium sp., Rhizopycnis vagum) szerepeltek az adatbázisban. A gyökerekből izolált gombatörzsek ITS-szekvenciáik alapján hét csoportba rendeződtek (2. ábra). Az inokulációs kísérletek során a hifák minden esetben kolonizálták a póréhagymagyökereket. Voltak törzsek, melyek nem voltak negatív hatással a növényre, azonban nem képeztek mikroszkleróciumot ( med5a/1, med6a/1 ). Ennek a két törzsnek az ITS-szekvenciája teljes mértékű egyezést mutatott egyes mohákból izolált, az Atradidymella nemzetségbe tartozó fajokkal, a med5a/1 törzs szekvenciája például teljesen megegyezett a mohák kórokozójaként ismert Atradidymella muscivora faj szekvenciáival (DAVEY és CURRAH 2009). 2. ábra. A fülöpházi homokterületen gyűjtött apró lucerna gyökerekből izolált gombák és nyilvános adatbázisokban elhelyezett törzsek ITS-szekvenciáinak viszonyait bemutató törzsfa. A filogenetikai számítás neighbor-joining (NJ) módszerrel, Kimura-2 paraméteres modellel, az inzerciós helyek páronkénti ignorálásával, MEGA 4.0 programmal készült. Az 500 ismétlésen alapuló bootstrapértékek %-ként vannak feltüntetve 70% fölött. A mérce 5 változást jelöl 100 karakteren. A kapcsos vonalak a DSE-gombacsoportokat jelölik (1 5). Az adatbázisokból származó szekvenciáknál: nt (= nem-tenyésztett), gazdaszervezet, származási hely, GenBank-azonosító van feltüntetve. Több helyen az adatok hiányosak. Fig. 2. The neighbor-joining (NJ) tree of the strains isolated from the roots of Medicago minima in the sandy area of Fülöpháza and sequences from public databases. The tree was inferred using the Kimura-2 parameters model and pairwise deletion at gaps using the program MEGA 4.0. Bootstrap values obtained from 500 replicates are shown as percentages, but not shown below 70%. Scale: 5 differences per 100 characters. The numbered braces (1 5) show the DSE groups. Hosts, areas of sample collections and accession numbers are shown after the sequences deposited in public databases (nt = uncultured). Data is missing, if there is no available source.

A Medicago minima gyökérendofiton gombáinak vizsgálata a fülöpházi homokterületen 73 99 med5/1 med6/2 med2/1 med3/1 med6/1 99 med5/3 med5/4 aszkuszos gomba (Lycopersicum sp.) / Kolumbia / AM944361 med2/4 med8/1 med6/3 Rhizopycnis vagum (Citrullus lanatus) / USA / AF022786 med7/2 med3/2 endofiton gomba (Rosmarinus officinalis) / AF373055 98 med4/2 med4/4 med8/2 med7/1 nt. endofiton gomba (gyökérvégek) / Olaszország / AJ879648 endofiton gomba (Pinus halepensis) / Olaszország / AF373052 99 Pleosporales sp. (Mangrove) / FJ624263 avarbeli gomba (Inga laurina levél) / Puerto Rico / AF502832 endofiton gomba (Magnolia liliifera) / Thaiföld / DQ485963 med2/2 med5a/1 99 med6a/1 med1/3 med1/1 nt. talajbeli gomba (Bouteloua gracilis) / USA / EU479868 99 endofiton gomba / Kína / FJ025362 Alternaria alternata (Alnus incana) / Lettország / GU062279 endofiton gomba (Jania rubens) / Földközi-tenger / GQ120986 Lewia infectoria (ember bőrfelszín) / GQ376103 nt. gomba (talajminta) / Franciaország / FN397305 99 99 med2/3 Lewia sp. (Picea abies) / Lettország / FJ903347 nt. endofiton gomba (Zea mays) / USA / EF505528 Embellisia sp. (Hennediella heimii) / Antarktisz / AY864335 88 Embellisia sp. (Bryum argenteum) / Antarktisz / AF212309 med5/2 98 nt. talajbeli gomba (talajminta) / Új-Mexikó, USA / EU480177 Embellisia tellustris / FJ357316 71 med4/1 nt. gyökérbeli gomba (Bouteloua gracilis) / USA / EU144461 nt. gyökérbeli gomba (Sporobolus cryptandrus) / USA / FJ362230 Embellisia sp. (Hennediella heimii) / Antarktisz / AY956759 nt. aszkuszos gomba (Fagopyrum esculentum) / EF154351 med1/2 Setophoma sacchari (Allium fistulosum) / Japán / AB499793 95 Alternaria longissima (Linaria hegelmaieri) / DQ865104 Setophoma sacchari (Holcus lanatus) / Spanyolország / FN394730 med4/3 94 nt. endofiton gomba (Zea mays) / USA / EF505610 nt. talajbeli gomba (száraz gyepi talajminta) / USA / EU490117 1 2 3 4 5 0,05

74 KNAPP G. D. és KOVÁCS M. G. Más törzsek elpusztították a növényeket vagy egyértelmű negatív hatással voltak a póréhagymákra ( med3/1, med5/3 ). A gazdanövények növekedése lelassult, leveleik elsárgultak, gyökereik rövidek és vékonyak maradtak. A med3/1 törzs ITSrégiója 100%-os egyezést mutatott egy Új-Mexikóban, Yucca gyökeréből izolált gombával (KHIDIR és mtsai 2009), és a közismert, nagyrészt növénypatogén, de endofiton törzseket is magában foglaló (PAPARU és mtsai 2006, ZHAN és mtsai 2007) Fusarium nemzetség több fajával is (pl. GenBank: GU324272, Wang nem publikált adata). Ez a törzs az in vitro kísérletekben elpusztította a növényeket. A med5/3 törzs szekvenciája több, adatbázisokban elhelyezett gomba ITS-szekvenciájával is 100%-os egyezést mutatott, például egy Microdochium nivale-ként azonosított gomba (GenBank: FJ792588, Jiang és mtsai nem publikált adata), és egy Peruban gyűjtött gyökerekről izolált gombatörzs ITS-szekvenciájával, melyet endofiton gombaként neveztek meg (SMITH és mtsai 2008). A kísérleteink során ez a törzs az összes inokulált hagymát elpusztította. Izolált törzseink közül 16 bizonyult DSE-gombának, melyek 5 csoportba rendeződtek a filogenetikai elemzések során (2. ábra). A DSE-gombatörzsek ITS-szekvenciáinak elemzésekor a legtöbb esetben találtunk az adatbázisokban nagy hasonlóságú ITS-szekvenciákat (2. ábra). Ezek a szekvenciák általában talajmintákból vagy különböző növények gyökereiből kerültek elő. A törzseink szekvenciáival a legnagyobb hasonlóságot mutató BLAST-eredmények több földrész (Észak-Amerika, Dél-Amerika, Ázsia, Európa, Antarktisz) alpesi, antarktikus (BRADNER és mtsai 2000) és mérsékelt övi hideg és száraz (PORRAS- ALFARO és mtsai 2008, KHIDIR és mtsai 2009) területeiről származtak. Az 1. csoportba rendeződő DSE-gombát 7 növényről is izolálni tudtuk. A törzsekhez hasonló ITS-szekvenciájú gombák a legtöbb esetben endofitonként szerepeltek, és különböző növények gyökeréről származtak. Ez az ITS-szekvencia egy Texasból, Hondurasból, Guatemalából és Tajvanból egyaránt előkerült, Rhizopycnis vagumként leírt törzs ITS-szekvenciájával mutatott 100%-os egyezést. Ezt a törzset görögdinnyéből (Citrullus lanatus) izolálták, majd sárgadinnyét (Cucumis melo) inokuláltak vele. Mindkét növényben sötét, szeptált hifákat és mikroszkleróciumokat is megfigyeltek, azonban ezeket a gombákat patogénnek írták le (FARR és mtsai 1998). A 2. csoportba egy törzs került: a med1/1, melynek az ITS-szekvenciájához hasonló adatok is főként gyökerekből származtak, egy endofiton gombaként jellemzett adat egy Földközi-tengerben előforduló inváziós vörös algából (Jania rubens) származott (Larriba és mtsai, nem publikált adat). A med1/1 törzs ITS-régiója megegyezett egy ismert patogén és allergén gombáéval (Alternaria alternata). A 3. csoportba, mely feltehetően a Lewia nemzetségbe illeszkedik, egy törzs ( med2/3 ) került. Az adatbázisok hasonló szekvenciái főleg gyökerekből származtak, de például egy szekvencia keratitiszes emberi mintából származik (2. ábra). A 4. csoportba két törzs rendeződött ( med5/2, med4/1 ), Új-Mexikóból (POR- RAS-ALFARO és mtsai 2008), és antarktiszi mohákról (BRADNER és mtsai 2000) származó gombaszekvenciákkal együtt. A csoport minden bizonnyal az Embellisia nemzetségbe tartozik. Az 5. csoportot két törzs ( med1/2, med4/3 ) és különböző családokba tartozó növények gyökereiből származó gombaszekvenciák képezték. Az egyik teljes ITS-

A Medicago minima gyökérendofiton gombáinak vizsgálata a fülöpházi homokterületen 75 egyezést mutató törzs a Setophoma sacchari volt, mely (az általában szárazabb helyekről közölt adatokkal szemben) a nedves élőhelyekre jellemző pelyhes selyemperje (Holcus lanatus) gyökeréből származott (SÁNCHEZ MÁRQUEZ és mtsai 2010). SÁNCHEZ MÁRQUEZ és mtsai (2010) közleményében a S. sacchari GenBank-i azonosítószáma mellett Podospora tetraspora megnevezés szerepel. Az általunk izolált DSE-gombának bizonyuló törzsekhez hasonló gombák minden esetben több területről, több különböző növény gyökeréről származtak. Ez is megerősíti azt, hogy a DSE-gombák feltehetően generalista, széles gazdaspektrumú gyökérkolonizálók (JUMPPONEN és TRAPPE 1998, KNAPP és KOVÁCS 2009). Szekvenciáinknak az adatbázisokkal való összevetésekor számos példát találtunk arra a jelenségre, mikor molekuláris diverzitási vizsgálatoknál csupán a szekvenciák hovatartozása (pl. tömlősgomba) és a növényi szerv (pl. gyökér) alapján jelölik meg a gombák stratégiáját (pl. endofiton, mikorrhizás vagy éppen patogén) anélkül, hogy azt funkcionális vizsgálatokkal ellenőriznék. Ez általános probléma nem csak az endofiton gombák, de a mikorrhizaképző gombák esetében is (BRUNDRETT 2009). Természetesen szem előtt kell tartanunk azt, hogy az általunk alkalmazott, teljesen mesterséges tesztrendszer eredményeit csak nagy körültekintéssel szabad extrapolálni. Igaz, párhuzamos vizsgálataink alapján (KNAPP és KOVÁCS 2009) úgy tűnik, a terület DSE-gombáinál nem találunk gazdaspecificitást, így nem kell megkérdőjeleznünk azt az eljárást, hogy a tesztekben sokszor a gazdanövényektől jelentősen különböző tesztnövényt alkalmazunk. Vizsgálataink alapján a Medicago minima gyökeréről izolált 26 gombatörzs jelentős része (16 törzs) DSE-gombának tekinthető. Ezek közül az elemzéseink során az 1. csoportba tartozó, feltételezhetően Rhizopycnis fajt a legtöbb mintánkból izolálni tudtuk, és a területen több növényből rendszeresen kimutattuk (KNAPP és KOVÁCS 2009). A korábbi eredmények (JUMPPONEN és TRAPPE 1998) és a területen a specificitást célzó vizsgálataink (KNAPP és KOVÁCS 2009) is azt mutatják, hogy a DSEgombákra nem jellemző a specificitás. Így ezek a törzsek ígéretes jelöltek lehetnek további, Medicago modellnövényekkel végzett, a DSE-gombák (fél)száraz élőhelyeken betöltött szerepének funkcionális vizsgálataihoz. * * * Köszönetnyilvánítás Ezúton szeretnénk megköszönni Dózsainé Kerekes Piroska labormunkákban nyújtott nélkülözhetetlen segítségét és dr. Vági Pál segítségét a mikroszkópos munkákban. A kutatást az OTKA (K72776) támogatta. IRODALOMJEGYZÉK ALTSCHUL, S. F., GISH, W., MILLER, W., MYERS, E. W. és LIPMAN, D. J. (1990): Basic local alignment search tool. J. Mol. Biol. 215: 403 410. BRADNER, J. R., SIDHU, R. K., YEE, B., SKOTNICKI, M. L., SELKIRK, P. M. és NEVALAINEN, K. M. H. (2000): A new microfungal isolate, Embellisia sp., associated with the Antarctic moss Bryum argenteum. Polar Biol. 23: 730 732. BRUNDRETT, M. C. (2009): Mycorrhizal associations and other means of nutrition of vascular plants: understanding the global diversity of host plants by resolving conflicting information and developing reliable means of diagnosis. Plant Soil 320: 37 77.

76 KNAPP G. D. és KOVÁCS M. G. CORPET, F. (1988): Multiple sequence alignment with hierarchical-clustering. Nucl. Acids Res. 16(22): 10881 10890. CURRAH, R. S. és TSUNEDA, A. (1993): Vegetative and reproductive morphology of Phialocephala fortinii (Hyphomycetes, Mycelium radicis atrovirens) in culture. Transact. Mycol. Soc. Japan 34: 345 356. DAVEY, M. L. és CURRAH, R. S. (2009): Atradidymella muscivora gen. et sp. nov. (Pleosporales) and its anamorph Phoma muscivora sp. nov.: a new pleomorphic pathogen of boreal bryophytes. Amer. J. Bot. 96: 1281 1288. ENDRE G., KALÓ P., KEVEI Z., KISS P., MIHACEA, S., SZAKÁL B., KERESZT A. és KISS G. B. (2002): Genetic mapping of the non-nodulation phenotype of the mutant MN-1008 in tetraploid alfalfa (Medicago sativa). Mol. Genet. Genom. 266(6): 1012 1019. FARR, D. F., MILLER, M. E. és BRUTON, B. D. (1998): Rhizopycnis vagum gen. et sp. nov., a new coelomycetous fungus from roots of melons and sugarcane. Mycologia 90(2): 290 296. FELSENSTEIN, J. (1985): Confidence limits on phylogenies: an approach using the bootstrap. Evolution 39: 783 791. FILATOV, D. A. (2002): ProSeq: a software for preparation and evolutionary analysis of DNA sequence data sets. Mol. Ecol. Notes 2: 621 624. GARDES, M. és BRUNS, T. D. (1993): ITS primers with enhanced specificity for basidiomycetes application to the identification of mycorrhizae and rusts. Mol. Ecol. 2: 113 118. GARDES, M., FORTIN, J., WHITE, T. J., BRUNS, T. D. és TAYLOR, J. W. (1991): Identification of indigenous and introduced symbiotic fungi in mycorrhizae by amplification of the internal transcribed spacer. Can. J. Bot. 69: 180 190. HASELWANDTER, K. és READ, D. J. (1982): The significance of root-fungus association in two Carex species of high-alpine plant communities. Oecologia 53: 352 354. HIRSCH, G. és BRAUN, U. (1992): Communities of parasitic microfungi. In: WINTERHOFF, W. (szerk.): Handbook of vegetation science. Volume 19: Fungi in vegetation science. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, The Netherlands, pp. 225 250. JUMPPONEN, A. (2001): Dark septate endophytes are they mycorrhizal? Mycorrhiza 11: 207 211. JUMPPONEN, A. és TRAPPE, J. M. (1998): Dark septate endophytes: a review of facultative biotrophic root-colonizing fungi. New Phytol. 140: 295 310. KHIDIR, H. H., EUDYA, D. M., PORRAS-ALFARO, A., HERRERA, J., NATVIG, D. O. és SINSABAUGH, R. L. (2009): A general suite of fungal endophytes dominate the roots of two dominant grasses in a semiarid grassland. J. Arid Environ. 74(1): 35 42. KNAPP D. és KOVÁCS M. G. (2009): Study of root colonizing dark septate endophytic fungi of invasive and indigenous plants of semiarid sandy areas. Acta Microbiol. Immunol. Hung. 56: 183. KOVÁCS M. G. (2008): Magyarországi növények mikorrhizáltsági vizsgálatainak összefoglalása. Mit mondhatnak ezek az adatok? Kitaibelia 8(1): 62 73. KOVÁCS M. G. és BAGI I. (2001): Mycorrhizal status of a mixed deciduous forest from the Great Hungarian Plain with special emphasis on the potential mycorrhizal partners of Terfezia terfezioides (Matt.) Trappe. Phyton 41: 161 168. KOVÁCS M. G. és SZIGETVÁRI CS. (2002): Mycorrhizae and other root-associated fungal structures of the plants of a sandy grassland on the Great Hungarian Plain. Phyton 42: 211 223. KOVÁCS-LÁNG E., KRÖEL-DULAY GY., KERTÉSZ M., FEKETE G., MIKA J., DOBI-WANTUCH I., RÉDEI T., RAJKAI K., HAHN I. és BARTHA S. (2000): Changes in the composition of sand grasslands along a climatic gradient in Hungary and implications for climate change. Phytocoenol. 30: 385 407. MANDYAM, K. és JUMPPONEN, A. (2005): Seeking the elusive function of root-colonising dark septate endophytic fungi. Stud. Mycol. 53: 173 189. MARX, D. H. (1969): The influence of ectotrophic mycorrhizal fungi on the resistance of pine roots to pathogenic infection 1. Antagonism of mycorrhizal fungi to root pathogenic infection fungi and soil bacteria. Phytopathol. 59: 153 163. MURASHIGE, T. és SKOOG, F. (1962): A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 155: 473 497. PAPARU, P., DUBOIS, T., GOLD, C. S., ADIPALA, E., NIERE, B. és COYNE, D. (2006): Improved colonization of Musa tissue culture plants by endophytic Fusarium oxysporum. J. Crop. Improv. 16: 81 95.

A Medicago minima gyökérendofiton gombáinak vizsgálata a fülöpházi homokterületen 77 PORRAS-ALFARO, A., HERRERA, J., SINSABAUGH, R. L., ODENBACH, K. J., LOWREY, T. és NATVIG, D. O. (2008): Novel root fungal consortium associated with a dominant desert grass. Appl. Environ. Microbiol. 74(9): 1308 1315. READ, D. J. és HASELWANDTER, K. (1981): Observations on the mycorrhizal status of some alpine plant communities. New Phytol. 88: 341 352. SAIKKONEN, K., FAETH, S. H., HELANDER, M. és SULLIVAN, T. J. (1998): Fungal endophytes: a continuum of interactions with host plants. Ann. Review Ecol. System. 29: 319 343. SAITOU, N. és NEI, M. (1987): The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees. Mol. Biol. Evol. 4: 406 425. SÁNCHEZ MÁRQUEZ, S., BILLS, G. F., DOMÍNGUEZ ACUÑA, L. és ZABALGOGEAZCOA, I. (2010): Endophytic mycobiota of leaves and roots of the grass Holcus lanatus. Fungal Diversity 41: 115 123. SIMON T. (2001): A magyarországi edényes flóra határozója. Nemzeti tankönyvkiadó, Budapest. SMITH, S. A., TANK, D. C., BOULANGER, L. A., BASCOM-SLACK, C. A., EISENMAN, K., KINGERY, D., BABBS, B., FENN, K., GREENE, J. S., HANN, B. D., KEEHNER, J., KELLEY-SWIFT, E. G., KEMBAIYAN, V., LEE, S. J., LI, P., LIGHT, D. Y., LIN, E. H., MA, C., MOORE, E., SCHORN, M. A., VEKHTER, D., NUNEZ, P. V., STROBEL, G. A., DONOGHUE, M. J. és STROBEL, S. A. (2008): Bioactive endophytes warrant intensified exploration and conservation. PLoS ONE 3: e3052. STADEN, R., BEAL, K. F. és BONFIELD, J. K. (2000): The Staden package, 1998. Meth. Mol. Biol. 132: 115 130. TAMURA, K., DUDLEY, J., NEI, M. és KUMAR, S. (2007): MEGA4: Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) software version 4.0. Mol. Biol. Evol. 24: 1596 1599. VÁRALLYAI GY. (1993): Soils in the region between the rivers Danube and Tisza (Hungary). In: SZUJKÓ-LACZA J. és KOVÁTS D. (szerk.): The flora of the Kiskunság National Park. Magyar Természettudományi Múzeum, Budapest, pp. 21 42. WHITE, T. J., BRUNS, T. D., LEE, S. és TAYLOR, J. W. (1990): Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. In: INNI, M. A., GELFAND, D. H., SNINSKY, J. J. és WHITE, T. J. (szerk.): PCR protocols. A guide to methods and applications. Academic Press, San Diego, pp. 315 322. ZHAN, J. X., BURNS, A. M., LIU, M. P. X., FAETH, S. H. és GUNATILAKA, A. A. L. (2007): Search for cell motility and angiogenesis inhibitors with potential anticancer activity: beauvericin and other constituents of two endophytic strains of Fusarium oxysporum. J. Natur. Prod. 70: 227 232.