Pannon Egyetem Vegyészmérnöki- és Anyagtudományok Doktori Iskola AZ ETIL-LAKTÁT ENZIMKATALITIKUS SZINTÉZISE NEM-KONVENCIONÁLIS KÖZEGEKBEN DOKTORI (PH.D.) ÉRTEKEZÉS TÉZISEI Készítette: Major Brigitta okleveles vegyészmérnök Témavezetı: Dr. Gubicza László egyetemi tanár Pannon Egyetem Biomérnöki, Membrántechnológiai és Energetikai Kutató Intézet 2013
Bevezetés Napjainkban egyre növekvı igény tapasztalható az egészségre ártalmatlan zöld vegyszerek és oldószerek elıállítására és használatára, zöld technológiák kidolgozására a környezet és a gazdaság kímélése céljából. Ez tulajdonképpen azt jelenti, hogy törekedni kell: az emberre és a környezetre ártalmatlan, megújuló forrásból származó alapanyagok használatára; a felhasználás után biológiai hatásra lebomló, ártalmatlan termékek elıállítására; az energiafelhasználás minimalizálására, az energiakihasználtság növelésére; a hulladéktermelés elkerülésére; a segédanyagok, oldószerek használatának csökkentésére, a minél koncentráltabb, kisebb térfogatú elegyekben, katalizátorral történı szintézisekre; a vegyipari balesetek (robbanások, tüzek) lehetıségének minimalizálására [Pereira 2011]. A tejsav jelentısége abból ered, hogy természetes forrásokból, biológiai úton (fermentációval), a kémiai szintézishez képest kisebb költséggel elıállítható optikailag aktív formában is, és számos környezetre ártalmatlan, ipari jelentıségő termék szintézisében felhasználható [Holten 1971]. Többek között akrilsav, politejsav, pentán-2,3-dion, propilénglikol állítható elı belıle, észterezhetı, elıállítható a kalcium- illetve nátriumsója A politejsavból természetben gyorsan lebomló mőanyag állítható elı. [Datta 2006]. Az észterezés a tejsav kinyerése, tisztítása és környezetbarát, nagy értékő termékek elıállítása szempontjából is fontos reakció. Ha az észterezést az ugyancsak természetes forrásból elıállítható etanollal végezzük, egy a természetben is elıforduló aromaanyagot, etillaktátot kapunk, amelyet az élelmiszeriparon kívül a gyógyszeripar és az elektronikai ipar is felhasznál [Pereira 2011]. Ismeretes, hogy a természetes kiindulási anyagokból, enzimatikus átalakítással nyert aromaanyagok természetes minısítést kapnak, ami tovább növeli az elıállított termék értékét. A szerves oldószerek az enzimes észterezési reakciók nem-konvencionális közegei közül a legrégebb óta kutatottak. Ez az oka, hogy a 2-hidroxi savak szerves oldószerekben történı enzimes észterezése témában már születtek publikációk, bár az általam tervezettıl eltérı körülmények között (hosszabb szénláncú alkoholokat és/vagy karbonsavakat, illetve nem Candida antarctica lipáz B enzimet használtak).
A nem-konvencionáis közegek közül a szerves oldószerekhez képest az ionos folyadékok rendelkeznek számos elınyös tulajdonsággal, úgymint pl. az elhanyagolható gıznyomás, vagy a nagy szerkezeti változatosság [Keskin 2007], ezért a bennük lejátszatott enzimes reakciók eredménye gyakran eltér a szerves oldószerben tapasztaltaktól. Az ionos folyadékok viszonylag új és még kevéssé megismert családja a foszfónium kationt tartalmazó vegyületek. Rájuk is igazak az ionos folyadékok kedvezı tulajdonságai, melyek lehetıvé teszik enzimes reakciók lejátszatását bennük, és amik alapján zöld oldószernek tekintjük ıket [Keskin 2007]. Az imidazólium és ammónium típusú ionos folyadékokhoz képest azonban számos további elınyös vonással is rendelkeznek. Ilyen sajátosság pl. a nagyobb kémiai [Martinis 2010] és hıstabilitás [Bradaric 2003], az, hogy feltételezhetıleg kedvezıbb környezetet biztosítanak az enzimek számára [Abe 2008], illetve az a tapasztalat, hogy felhasználhatók a tejsav fermentlébıl való kinyerésére [Marták 2007]. A minimális környezeti terhelést jelentı, a zöld kémiai követelményeknek megfelelı reakciók egyik új megvalósítási módja a mikrohullámú sugárzás használata. Ennek a hıforrásnak a zöld volta abban rejlik, hogy egyenletes és a konvencionális hıközlésnél hatékonyabb hıátadási módszer, ami egyes esetekben megnöveli az enzimek szelektivitását, aktivitását és stabilitását [Carrillo-Munoz 1996], bár a lejátszódó folyamatok mechanizmusa legtöbbször nem ismert. A tejsav felhasználása kapcsán az egyik legnagyobb akadály, amitıl a mai gyártástechnológiák szenvednek, a kis konverzió és a tisztaság, amik a termelést technológiai és ökológiai szempontból versenyképtelenné teszik. Ezért hatékony katalizátorok és elválasztási mőveletek alapvetı fontosságúak a tejsav-észterek versenyképes technológiáinak kifejlesztéséhez. Erre nyújthat lehetıséget a tejsav foszfónium típusú ionos folyadékban történı enzimes észterezése, ha a tejsav kinyerését és az észterképzést sikerül ugyanazzal az ionos folyadékkal megvalósítani. A legkedvezıbb technológia kidolgozásához az észterezési reakció jobb megértése is fontos tényezı, mivel a tejsav hajlamos a felhasználás körülményei között dimereket képezni, illetve ezekbıl visszaalakulni. Ez a mellékreakció a limitáló lépés mind a tejsav tisztításánál, mind az észterek elıállításánál [Engin 2003].
Célkitőzések és kísérleti módszerek Kutatómunkámnak kettıs célja volt: Az egyik, az etil-laktát enzimatikus elıállításának vizsgálata. Ehhez a kísérleteket etanol és tejsav szubsztrátok alkalmazása mellett, immobilizált Candida antarctica lipáz katalizátorral, két szerves oldószer és 12 ionos folyadék közegben hajtottam végre. Toluolban és Cyphos 104-ben vizsgáltam az egyes paramétereknek a reakcióra gyakorolt hatását, az enzim visszaforgathatóságát és meghatároztam az észterezés legalkalmasabb paramétereit. Kísérleteket végeztem konvencionális hıközlés és mikrohullámú hıközlés alkalmazása mellett is vizsgálva a két különbözı hıforrás reakcióra gyakorolt hatását. A másik célom a tejsav egyedi viselkedésének (dimerizációra és a dimerekbıl történı hidrolízisre való hajlamának) vizsgálata volt víztartalom szabályozása nélkül mikrohullámú, illetve konvencionális hıközlés mellett és pervaporációval illetve zeolitos adszorpcióval kombinált mőveletekben. Új tudományos eredmények A PhD kutatómunkám során elért új tudományos eredményeket az alábbi 5 tézispontban foglaltam össze: 1. Tézis: Megállapítottam, hogy az aromaként, gyógyszer- és élelmiszeripari adalékként egyaránt felhasználásra kerülı természetes etil-laktát (L)-tejsavból és természetes etanolból Candida antarctica lipáz B enzim jelenlétében többféle nem-konvencionális reakcióközegben elıállítható. A szerves oldószerek közül a toluol bizonyult a legalkalmasabb reakcióközegnek. Megállapítottam, hogy a vizsgált összesen 12 ionos folyadék közül több foszfónium típusú, a tejsav oldására is alkalmas. Egyes foszfónium típusú ionos folyadékok, mint pl.: Cyphos 163, Cyphos 166, Cyphos 106, Cyphos 102 maguk is katalizálják az észterezést, vagyis szerepük a reakcióban kettıs: oldószer és egyúttal katalizátor. A Cyphos 104 és a Cyphos 202 ionos folyadékok megfelelı közegei a reakciónak, mivel csak oldószerként viselkednek, a reakciót csak az enzim katalizálja. Kísérleteim alapján megállapítottam, hogy konvencionális hıközlés mellett közel azonos hozam érhetı el Cyphos 104 és toluol közegben, ugyanakkor az ionos
folyadék több szempontból (pl. nagyobb alkalmazható savkoncentráció, kisebb mennyiségő enzim, a lipáz jobb újrafelhasználhatósága) kedvezıbb közegnek bizonyult, mint a szerves oldószer. A kétféle oldószerrel végzett kísérletek paramétereit és eredményeit táblázatban foglaltam össze (1). Az etil-laktát elıállítás legmegfelelıbb paraméterei és eredményei toluolban és Cyphos 104-ionos folyadékban. Reakcióközeg Toluol Cyphos 104 Savkoncentráció (a legkedvezıbb reakciótérfogat alapján) 0,2-0,5 mmol/ ml 0,8-1 mmol/ml Alkohol : sav mólarány 5 : 1 7 : 1 Kiindulási víztartalom 4,5 tömeg % 2,0 tömeg % Reakcióidı 8 óra 24 óra Enzimmennyiség 250 mg/ mmol tejsav 12,5 mg/mmol tejsav Elért maximális hozam 94 % 95 % Reakcióhımérséklet 40 C 40 C Visszaforgathatóság Gyenge Megnövekedett 2. Tézis: Kísérleteim bizonyították, hogy a Cyphos ionos folyadék család több tagja többes funkciót képes ellátni a tejsav elıállítás és feldolgozás során. Nemcsak alkalmasak az irodalom szerint ismert módon a tejsav extrakciójára a fermentlébıl, de kinyerés nélkül felhasználhatók a további enzimkatalitikus észterezési reakció közegeként. Ezzel lehetıség nyílik egy olyan kombinált természetes etil-laktát elıállítási eljárás kidolgozására, ahol kiküszöbölhetı egy költséges kinyerési lépés. (1) 3. Tézis: Bebizonyítottam, hogy a mikrohullámú hıközlés pozitív hatással van az etil-laktát szintézisére 4 ionos folyadék közeg esetén, melyek közül Cyphos 202-ben csak enzimkatalizált folyamat megy végbe. A tapasztalt pozitív hatás magasabb hozamban és 2-3- szor rövidebb reakcióidıben nyilvánul meg a konvencionális hıközlés mellett tapasztaltakhoz képest. Cyphos 202 ionos folyadék esetében a konvencionális hıközlésnél szükséges 24 órás reakcióidı 8 órára csökken, miközben növekszik az elért etil-laktát hozam. (2)
Mikrohullámú sugárzás hatása az észterezési reakcióra különbözı ionos folyadékok esetén. IL neve Konvencionális hıközlés Mikrohullámú hıközlés hozam / reakcióidı hozam / reakcióidı Cyphos 202 95 % / 24 óra 106 % / 8 óra Cyphos 163 104 % / 8 óra 104 % / 4 óra Cyphos 166 90 % / 24 óra 93 % / 7 óra Cyphos 102 60 % / 24 óra 65 % / 7 óra Cyphos 104 Nincs hatás Cyphos 110 Nincs hatás Cyphos 106 Nincs hatás 4. Tézis Cyphos 202 ionos folyadék esetén a mikrohullámú hıközlés egy újabb, eddig nem ismert elınyös hatását is igazolták mérési eredményeim. A reakcióelegyben jelen levı víz és észter mennyiségekre fölállított anyagmérleg alapján a reakcióban keletkezı észter mennyisége nagyobb, mint a keletkezı vízé. Eszerint a mikrohullámú sugárzás a reakcióelegyben lévı tejsav dimereinek hidrolízisét meggyorsítja, és ezáltal megnı a szabad (az enzim számára hozzáférhetı) tejsav mennyisége. Mivel a hıközlésen kívül minden egyéb körülmény azonos a két reakcióban, a fönt leírt jelenség a mikrohullámú sugárzás (nem-hı) hatásának tulajdonítható. A hidrolízis sebességének megnövekedése lehetıvé teszi a dimerekben kötött tejsav szubsztrátként történı felhasználását és a szabad tejsavra számolt hozam akár 100 % fölé történı emelkedését. (2) 5. Tézis Vízelvonás, így az általam alkalmazott pervaporáció, illetve zeolitos adszorpció hatására laktilsav keletkezik a reakcióelegyben, ami növeli a reakcióelegy víztartalmát, és közben csökkenti az elérhetı észter hozamot azáltal, hogy a fogyasztja a rendelkezésre álló szabad tejsavat. Így, ellentétben például az etil-acetát, vagy izoamil-acetát szintézisével (ahol nem játszódnak le dimerizációs folyamatok), amikor a vízelvonás jelentıs hozamnövekedéssel járt együtt, ebben az esetben a víztartalom szabályozása (a keletkezı víz elvonása) a hozam csökkenését eredményezi. (3)
Publikációs lista Publikációk: 1. Major B., Nemestóthy N., Bélafi-Bakó K., Gubicza L.: Enzymatic esterification of lactic acid under microwave conditions in ionic liquids, Hungarian J. Ind. Chem., 36 (1-2) 77-81 (2008) 2. Major B., Kelemen-Horváth I., Csanádi Zs., Bélafi-Bakó K., Gubicza L.: Microwave assisted enzymatic esterification of lactic acid and ethanol in phosphonium type ionic liquids as co-solvents, Green Chem. 11 (5) 614-616 (2009) (IF: 5,836, hivatkozás: 7) 3. Major B., Németh G., Bélafi-Bakó K., and Gubicza L.: Unique role of water content in enzymatic synthesis of ethyl lactate using ionic liquid as solvent, Chem. Pap., 64 (2) 261 264 (2010) (IF: 0,754, hivatkozás: 2) A témához kapcsolódó egyéb publikációk 4. Fehér E., Major B., Bélafi-Bakó K. and Gubicza L.: On the background of enhanced stability and reusability of enzymes in ionic liquids, Biochem. Soc. Trans., 35, 1624-1627 (2007) (IF: 3,447, hivatkozás: 37) 5. Fehér E., Major B., Bélafi-Bakó K.and Gubicza L.: Semi-continuous enzymatic production and membrane assisted separation of isoamyl acetate in alcohol - ionic liquid biphasic system, Desalination, 241 8-13 (2009), (IF: 2,034, hivatkozás: 6) Proceedingek, elıadások, poszterek: 1. Major B., Fehér E., Vass A., Gubicza L.: Tejsav enantioszelektív észterezése Candida antarctica lipáz enzimmel ionos folyadék közegben, Mőszaki Kémiai Napok, Veszprém, 2007. április 25-27, elıadás pp. 133-138. 2. Major B., Vrsalović Presečki A., Kelemenné Horváth I., Vass A., Gubicza L.: A mikrohullámú hıközlés hatása tejsav enzimes észterezésére ionos folyadékban, Mőszaki Kémiai Napok, Veszprém, 2008. április 22-24, elıadás pp. 127-132. 3. Major B., Kelemenné Horváth I., Bélafiné Bakó K., Gubicza L.: A víztartalom szerepe a tejsav enzimkatalitikus észterezése során, Mőszaki Kémiai Napok, Veszprém, 2009. április 21-23, elıadás pp. 20-23
4. Dobaj A.; Bányai T.; Major B.; Gubicza L.: Tejsav észterek elıállítása ionos folyadékban végzett enzimkatalitikus észterezéssel, Mőszaki Kémiai Napok, Veszprém, 2009. április 21-23, elıadás pp. 15-19 5. Hunorfi A., Kelemenné Horváth I., Major B., Gubicza L.: Ionos folyadékok alkalmazása észterezési reakciókban oldószerként és katalizátorként, Mőszaki Kémiai Napok, Veszprém, 2009. április 21-23, elıadás pp. 178-182 6. Major B., Fehér E., Vass A., Bélafi-Bakó K., Gubicza L.: Enzymatic production of lactates in ionic liquids, 34th International conference of the Slovak Society of Chemical Engineering (SSCHE), Tatranské Matliare, Szlovákia, 2007. május 21-25., elıadás, pp. 126 és proceedings CD-ROM 7. Major B., Bányai T., Bélafi-Bakó K., Gubicza L.: The effect of water content on the enzymatic esterification of lactic acid in ionic liquid as co-solvent, 36 th International conference of the Slovak Society of Chemical Engineering, Tatranské Matliare, Szlovákia, 2009. május 25-29 elıadás p. 56 és proceedings CD-ROM 8. Major B., Marták J., Gubicza L., Bélafiné Bakó K., Schlosser S.: Tejsav kinyerése és észterezése ionos folyadékok segítségével, Mőszaki Kémiai Napok, Veszprém, 2008. április 22-24, poszter, pp. 326-328. 9. Major B., Nemestóthy N., Kelemen-Horváth I., Gubicza L.: Ethyl Lactate Production in Non-Conventional Media under Normal and Microwave Conditions, EUCHEM 2008 Conference on Molten Salts and Ionic Liquids, Koppenhága, Dánia, 2008. augusztus 24-29, poszter p. 182 10. Major B., Kelemen-Horváth I., Bélafi-Bakó K., Gubicza L.: Enzymatic Production of Ethyl Lactate in Non-Conventional Solvents under Normal and Microwave Heating, 4 th International Congress on Biocatalysis 2008, Hamburg, Németország, 2008. augusztus 31 szeptember 4, poszter p. 256 11. Gubicza L., Bélafi-Bakó K., Bányai T, Major B.: Effect of Ionic Liquids on the Stability and Reusability of Immobilized Candida antarctica lipase B, 8th International Conference on Protein Stabilisation, Graz, Ausztria, 2009. április 14-17., poszter p. 61