Kadmium, ólom, szelén és ón meghatározása emberi agymintákból grafitkemencés atomabszorpciós módszerrel Ph.D. értekezés tézisei Szoboszlai Norbert Semmelweis Egyetem, Budapest ELTE Szervetlen és Analitikai Kémiai Tanszék 2002
Bevezetés Az utóbbi évtizedekben jelentősen megváltozott a nyomelemek élettani szerepével kapcsolatos tudásanyag. Az analitikai módszerek fejlődése következtében a korábbiaknál nagyságrendekkel kisebb koncentrációkat tudunk meghatározni, egyre több elemről derül ki a biológiai rendszerekben betöltött szerepe, kölcsönhatásuk az élő szervezetekkel és ezek mechanizmusa. A kutatások alapján számos elem toxikusnak, míg más elemek esszenciálisnak bizonyultak. Az általunk vizsgált négy elem biológiai jelentőségét széleskörűen tanulmányozzák napjainkban is. Az ólom és a kadmium toxikus nyomelemek, melyeket a fokozódó ipari termelés mind nagyobb mennyiségben halmoz fel környezetünkben. Az emberi szervezetbe jutva kis koncentrációban is káros hatásokat okoznak, melyek mechanizmusa még nem teljesen ismert. A szelén több enzimrendszerünkben is jelenlevő esszenciális elem, biokémiai antioxidáns funkciója miatt szerepe a rákkutatásban is felmerült. Az ón biológiai szerepéről nagyon kevés adat áll még rendelkezésre. A kémiai elemzés során döntő kérdés, hogy a meghatározandó komponens mellett jelenlevő egyéb, a mérést zavaró anyagok hogyan befolyásolják a mérés érzékenységét, megbízhatóságát. Minél nagyobb a kísérő anyagok (mátrix) mennyisége a mérendő elemhez képest, annál nehezebb a mérés megbízhatóságát, valamint reprodukálhatóságát biztosítani, azaz az optimális mérést kivitelezni. Az elemzést akkor tudjuk elvégezni, ha az alkalmazott módszer érzékenysége és kimutatási határa megfelelő. A nyomelemek meghatározásához szükséges, hogy a módszer kimutatási határa a ng/g (ppb parts per billion) koncentráció tartományban illetve ez alatt legyen. Igen kis anyagmennyiségek mérésére jól használható a grafitkemencés atomabszorpciós spektrometria (GF-AAS graphite furnace atomic absorption spectrometry). A mérés elve, hogy a gázhalmazállapotú atomok fényelnyelése arányos a koncentrációval. Az AAS technika bevezetésekor alkalmazott láng atomforrással szemben a grafitkemence előnye, hogy a mintagőz tartózkodási ideje a fényútban 2-3 nagyságrenddel nagyobb, ami nagy érzékenységet és alacsony kimutatási határt eredményez. Az ELTE Szervetlen és Analitikai Kémiai Tanszékén dr. Andrási Erzsébet vezetésével évek óta folyik emberi agyminták vizsgálata. A korábbi kísérletek során
behatóan tanulmányozták a mintavételi, -tárolási, -elõkészítési eljárásokat, valamint vizsgálták a különbözõ mérési metodikák alkalmazhatóságát emberi agyrészek nyomelemtartalmának meghatározására. A kutatások egyrészt az ún. elsõdleges idegrendszeri elváltozásban nem szenvedõk agyrészeinek vizsgálatára irányult, másrészt az egyes idegrendszeri betegségek (pl. Glioblastoma multiforme, Parkinson-kór, Alzheimer-kór, Sclerosis multiplex) és a nyomelem-koncentrációk változásai közötti lehetséges összefüggést vizsgálták. Jelen dolgozat témája GF-AAS módszer kidolgozása kadmium, ólom, szelén és ón meghatározására emberi agymintákból, és ezen elemek normál koncentrációinak megállapítása. A kísérletek során tanulmányoztuk a különböző feltárási technikák alkalmazhatóságát agyminták esetén. Vizsgáltuk a kísérő anyagoknak a mérendő elemek atomabszorpciós jelére kifejtett hatását. Optimáltuk a vizsgálat körülményeit az abszorbancia-idő, az előhevítési és az atomizációs görbék felvételével. Az elemzések pontosságának ellenőrzésére nemzetközi standard referencia anyagokat használtunk. Tanulmányoztuk az elemek eloszlásának jellegzetességeit az emberi agyban, és meghatároztuk az un. normál átlagértékeket. 1. Kísérleti rész A vizsgálatokat Perkin Elmer SIMAA 6000 típusú grafitkemencés atomabszorpciós spektrométerrel végeztük. A grafitküvetták Perkin Elmer THGA elnevezésű, végein peremezett (end capped) és perem nélküli (non end capped) keresztfűtésű grafitcsövek voltak, melyek integrált platformot tartalmaztak. A készüléket optikai rendszere (Tetrahedral Echelle Polychromator, fókusztávolság 0,5m) és detektora (Solid-state Detector, diódasoros 60 dióda) multielemes mérésre teszi alkalmassá, egyszerre hat elem mérhető. Fényforrásként vonalas spektrumot sugárzó, elemspecifikus EDL (Electrodless Discharge Lamp) lámpákat használtunk. Az analízishez, illetve a következtetések levonásához feltétlenül szükséges, hogy pontosan meghatározott anatómiai területekrõl kerüljenek ki a minták, harminc különböző agyterületről történt mintavételezés. A minták feltárását nedves roncsolással végeztük Parr-bombában, illetve mikrohullámú készülékkel. A súlyállandóságig kiszárított és analitikai pontossággal
bemért 0,1g mintát 2,5cm 3 65%-os HNO 3 és - a mikrohullámú módszernél - 0,5 cm 3 30%-os H 2 O 2 hozzáadásával tártuk fel. 2. Új tudományos eredmények 1. A felhasznált feltárási technikák összehasonlítása Összehasonlítottuk a Parr-bombával feltárt minták elemkoncentrációit a mikrohullámú energiával feltárt mintákéval és nem tapasztaltunk különbséget. A mikrohullámú feltárás időigénye jelentősen kevesebb, így ez bizonyult hatékonyabbnak. 2. A Cd és Pb meghatározása szimultán GF-AAS módszerrel A mátrix okozta zavaró hatásokat az előhevítési és atomizációs hőmérsékletek optimálásával küszöböltük ki. A Cd és az Pb esetében sikerült szimultán módszert kidolgozni. Vizsgáltuk az előhevítési és az atomizációs hőmérsékletnek az atomabszorpciós jelre gyakorolt hatását 5 µg NH 4 H 2 PO 4, és 3 µg magnéziumot tartalmazó Mg(NO 3 ) 2 módosítók jelenlétében. A kísérletek alapján 600 o C előhevítési és 1600 o C atomizációs hőmérséklet bizonyult optimálisnak. 3. A szelén meghatározása Szelén esetében megvizsgáltuk a kémia módosító növekvő koncentrációinak az atomabszorpciós jelre gyakorolt hatását 5, 10, 15, 20 µg Pd esetében. Az integrált abszorbancia értékek nem változtak lényegesen, míg az abszorbancia tranziensek lefutása a Pd koncentrációjának növekedésével jelentősen javult. Vizsgáltuk a Pd különböző módosulatainak (redukált, nem redukált, előredukált) hatását az előkezelési görbékre. Szelén meghatározására kémiai módosítóként 20 µg palládiumot tartalmazó palládium-nitrátot alkalmaztunk. A módosítót 1000 o C-on palládiummá redukálva, ún. thermally pre-reduced módosító használatával a háttér csökkenését, valamint az atomabszorpciós csúcsalak javulását tapasztaltuk. Az előkezelési hőmérséklet 1200 o C- nak, az atomizációs hőmérséklet 2100 o C-nak adódott. 4. Az ón meghatározása Az ón mérésénél belső gázként Ar helyett 95% Ar és 5% H 2 összetételű gázt alkalmaztunk. Mg nélküli Pd módosító használatával a mátrix okozta zavaró hatás jelentős mértékben megnövekedett. Nagyobb mennyiségű Mg módosító adagolása a
háttér-abszorbancia növekedését eredményezi. 10 µg Pd és 3 µg Mg alkalmazásával 1500 o C előkezelési és 2300 o C atomizációs hőmérsékletet értünk el. 5. Analitikai teljesítmény paraméterek A mérések relatív standard deviációja (RSD%) Cd <1%, Pb, Se <5%, Sn esetében <10%. Az előhevítési hőmérsékletek és a mátrixmódosító reagensek optimálását, az integrált abszorbancia zavarásmentes mérését a hozzáadott standardot tartalmazó mintákra mért visszanyerési értékekkel igazoltuk. Cd, Pb elemek esetében a visszanyerés 90-105%-nak, Se-re 80-90%-nak, Sn-ra 105-120%-nak bizonyult. A mérések pontosságát nemzetközi biológiai referenciaanyagok (NIST SRM 1577/a, DORM-2, IAEA-155) analízise, és szelén esetében független módszer (neutronaktivációs analízis) alkalmazása igazolta. 6. A vizsgált elemek koncentráció-tartományának és eloszlásának vizsgálata az emberi agyban. Az agyminták szárazanyagra vonatkoztatott átlagos nyomelem koncentrációi a következők: Cd: 80-300 ng/g, Pb: 100-500 ng/g, Se: 500-600 ng/g, Sn: 30-120 ng/g. Az eredmények az elemek nem-homogén eloszlását mutatják. Az esszenciális szelén koncentrációja hasonló a két félteke megfelelő területein. A toxikus elemek (Cd, Pb, Sn) jelentős koncentráció-eltéréseket mutatnak a különböző emberek ugyanazon agyrészeiben és a két agyi félteke között is, így ezekre az elemekre normál átlagértékek nem állapíthatóak meg. A különböző személyekből származó nagy koncentráció különbségek feltehetően a környezetből történő különböző akkumulációnak tulajdonítható. Determination of cadmium, lead, selenium and tin in human brain by graphite furnace atomic absorption spectrometry 3. Summary Trace elements play a key role in a variety of processes necessary for life. Various studies have shown that a define correlation exists between trace element content and many common diseases. Because of its high metabolic rate and low capacity for
regeneration the central nervous system should be especially sensitive to disturbances in trace element concentrations. In the present work our aim was to carry out a graphite furnace atomic absorption spectrometry (GF-AAS) method to determine the Cd, Pb, Se and Sn concentrations at trace level in human brain samples, to study different digestion techniques, to determine the normal concentrations of these elements. Sample digestion applying microwave heating proved to be a rapid method for digestion of brain samples. In the case of the Cd and the Pb simultaneous method was carried out. During the optimization of pre-treatment and atomization temperatures for Cd and Pb 600 and 1600 o C approved to be the most appropriate using 50µg NH 4 H 2 PO 4 + 3µg Mg (as nitrat) matrix modifier. Disturbance effects caused by the matrix were eliminated by the optimization of the pre-treatment and atomization temperature. In the case of the selenium pd-nitrate was used (20 µg Pd) as a chemical modifier. The decrease of the background and the improvement of the shape of the atomic absorption peak were experienced using the thermally pre-reduced modifier (reduction of the Pd-nitrate to Pd on 1000 o C). The pre-treatment temperature was 1200 o C, the atomization temperature was 2100 o C. For Sn measuring instead of Ar, 95% Ar and 5% H 2 gas was used as an internal gas, applying 10 µg Pd + 3 µg Mg were recognized as the most appropriate techniques. The higher amounts of Pd have caused higher noise and higher detection limits. Optimizing the temperature program for Sn 1500 o C pyrolysis and 2300 o C atomization temperature proved to be the best. The elemental analysis of standard reference materials (NIST Bovine Liver 1577/a, DORM-2 Dogfish Muscle, IAEA-155 Whey Powder) revealed, that our analytical procedures were accurate, and within the 95% confidence limit for the elements. The present results show a non-homogeneous distribution of the essential element (Se) in normal human brain. Corresponding regions in both hemispheres showed an almost identical concentration of this element. In the case of toxic elements (Pb, Cd, Sn) an average value in different brain regions can not be established because of the high variability of individual data.
4. Közlemények 1. Szakdolgozat: Cu, Zn, Mn, Fe, Mg agyi koncentrációinak változása az életkor függvényében A Sclerosis multiplex betegség. 2. E. Andrási, É. Farkas, N. Szoboszlai, L. Almási. Earth alkali element inbalances in brain of Alzheimers disease patients. Clinical Neuroscience 49 (1996) 25 26. 3. E. Andrási, N. Szoboszlai, S. Igaz, K. Tóth. Quality control in element analysis of plant materials. Microchemical Journal 58 (1998) 262-271. 4. E. Andrási, S. Igaz, N. Szoboszlai, É. Farkas, Zs. Ajtony. Several methods to determine heavy metals in the human brain. Spectrochimica Acta Part B 54 (1999) 819-825. 5. N. Szoboszlai, E. Andrási, Zs. Ajtony, I. Császma. Determination of selenium and tin in human brain by graphite furnace atomic absorption spectrometry. Mikrochimica Acta 137 (2001) 81-86. Konferencia anyagok: 1. Andrási E., Farkas É., Szoboszlai N., Almási L., Earth alkali element inbalances in brain of Alzheimers disease patients, 3 rd Hungarian Congress on Alzheimers Disease, Budapest 1996, Abstracts p.14. 2. E. Andrási, N. Szoboszlai, É. Farkas, L. Almási, Intercomparison run IAEA 331 for the determination of trace elements in spinach and cabbage (poszter), 8 th. Hungarian Italian Symposium on Spectrochemistry, Debrecen 1997 3. N. Szoboszlai, E. Andrási, S. Igaz, Zs. Ajtony. Determination of trace elements in human brain by GF-AAS (poszter), 3 rd. European Furnace Symposium, Prága 1998 Abstracts p/ii 12.
4. N. Szoboszlai, Zs. Ajtony, E. Andrási, Cs. Bélavári, Simultaneous determination of Cd, Pb, and Cr in human brain samples using graphite furnace atomic absorption spectrometry (poszter), CSI XXXI, Pre-Symposium on Electrothermal Atomization and Vaporization Technique in AAS, OES and ICP-MS, Nevsehir 1999, Abstracts p.62. 5. N. Szoboszlai, E. Andrási, Zs. Ajtony, I. Császma, Determination of trace amounts of selenium and tin in human brain samples by transversely heated graphite atomizer for atomic absorbtion spectrometry (poszter), CSI XXXI, Ankara 1999, Abstacts p.452. Magyar Spektrokémiai Vándorgyűlés 1. Szoboszlai N., Andrási E., Farkas É., Tóth K., Emberi agyminták elemtartalmának meghatározása GF-AAS és ICP-MS módszerrel (előadás) MSV 41 Budapest 1998. 2. Szoboszlai N., Andrási E., Ajtony Zs., Emberi agyminták kadmium, króm, ólom, szelén és ón tartalmának meghatározása GF-AAS módszerrel (poszter) MSV 42 Veszprém 1999.