A FAD transzportjának szerepe az oxidatív fehérje foldingban patkány máj mikroszómákban PhD értekezés tézisek Varsányi Marianne 2005 Témavezető: Dr. Bánhegyi Gábor Semmelweis Egyetem Orvosi Vegytani, Molekuláris Biológiai és Pathobiokémiai Intézet Semmelweis Egyetem Doktori Iskola Molekuláris Orvostudományok Tudományági Doktori Iskola
ÖSSZEFOGLALÁS Az eukarióta sejtekben a szekréciós és membránfehérjék oxidatív foldingja az endoplazmás retikulum luminális kompartimentumában megy végbe. A felszabaduló elektronokat egy elektronszállító lánc juttatja el a végső akceptor oxigénig. Míg a lánc fehérjéi viszonylag jól ismertek, keveset tudunk a kis redox molekulák lehetséges részvételéről. Munkánkban elsősorban a FAD és az aszkorbinsav ilyen szerepét vizsgáltuk. Patkány máj mikroszómális vezikulákon t a FAD transzportját és a transzport hatását a diszulfidhíd képződésre. Az intravezikuláris FAD által hozzáférhető tér meghatározásával megállapítottuk, hogy a FAD átjut a mikroszómális membránon és felhalmozódik a lumenben. Gyorsszűréses technikával kimutattuk a FAD kétirányú transzportját, mely gátolható volt atraktiloziddal és 4,4 -diizotiocianostilbén-2,2 -diszulfonsavval. A lumenbe belépő FAD elősegítette a fehérje tiolok oxidációját és fokozta a glukóz-6-foszfát intraluminális oxidációját. Az intraluminális oxidatív folyamatokhoz a FAD felvétele szükséges: a transzport gátlása csökkentette a FADfüggő tiol oxidációt és a glukóz-6-foszfát intraluminális oxidációját. A transzport jellegzetességei eltérnek a mitokondriális FAD transzport tulajdonságaitól. Az eredmények szerint az élesztőben leírtakhoz hasonlatosan a szabad FAD meghatározó szerepet játszik az oxidatív fehérje folding mechanizmusában emlős sejtek endoplazmás retikulumában is. 2
BEVEZETÉS A szekréciós fehérjék oxidatív foldingja A szekréciós fehérjék diszulfid kötései az eukarióta sejt endoplazmás retikulumának luminális kompartimentumában képződnek. A ciszteinil oldalláncok oxidációja során felszabaduló elektronokat egy elektron transzfer lánc szállítja el a végleges elektronakceptor oxigénig. A láncot fehérjék és kis molekulatömegű redox vegyületek alkotják Az endoplazmás retikulumban képződő diszulfidkötések létrejöttében két fő fehérjének tulajdonítanak szerepet. Az egyik ezek közül a protein diszulfid izomeráz (PDI), mely a környezet redoxpotenciáljától, illetve a szubsztrát fehérje tulajdonságaitól függően képes a diszulfid hidak kialakítására, illetve a nem megfelelően képződött diszulfid hidak izomerizációjára. Tekintettel arra, hogy a PDI gyenge oxidáns, ahhoz, hogy a fő funkcióját, az oxidációt el tudja látni elektronfelvétel után a PDI-t is vissza kell oxidálni. Ezt egy másik enzim, az endoplazmás retikulum membrán belső oldalán elhelyezkedő endopazmatikus oxidoreduktin, az Ero1p végzi. Az Ero1p a flavoproteinek közé tartozó oxidáz, a diszulfidképződés tehát egy flavin-függő reakció. A riboflavinnak, a FAD prekurzorának hiánya gyorsan foldingzavarokhoz vezet. Az Ero1p specifikusan oxidálja a PDI-t; a PDI ezután oxidálja az oxidatív folding szubsztrát fehérjéit. Átmeneti diszulfidképződés is kimutatható a két fehérje között. Az Ero1p és a PDI által katalizált 3
oxidáció tehát egy elektron relé rendszer révén valósul meg, ami relatíve függetlenné teheti a folyamatot a környezet redox viszonyaitól, és lehetővé teheti a hibásan képződött diszulfidok redukcióját és újrarendeződését. Tu és Weissman (2002) kombinált genetikai és biokémiai megközelítés segítségével élesztő Ero1p-t, PDI-t és szubsztrátfehérjéket tartalmazó rendszert hozott létre, mely molekuláris oxigén felhasználásával oxidálta a szekréciós fehérjék tioljait. Megállapították, hogy a szorosan kötődő FAD mellett az Ero1p aktivitása igen érzékeny a szabad FAD koncentrációjának változására. A FAD hatásos koncentrációja azonos nagyságrendben volt az élesztő citoszolban leírt szabad FAD koncentrációval (néhány µm). Szabad FAD jelenlétében az Ero1p hatékonyan redukálta a molekuláris oxigént, körülbelül két diszulfidkötést létrehozva egy O 2 molekula redukciója mellett. A FAD transzportot egy radioaktív, fotóaktiválás hatására kovalens kötést képező FAD analóg, az azido-fad felhasználásával tanulmányozták. Az azido- FAD a FAD-hoz hasonlóan stimulálta az Ero1p-katalizált foldingot. Emlős sejtekben a folyamat kevésbé ismert. Az Ero1p analógjai, az Ero1-L izoformái jelen vannak az emberi endoplazmás retikulumban is, és elektron transzferben játszott szerepük is bizonyítást nyert. Az elektronok további útja az Ero1-L után ismeretlen. Feltételezhető, hogy a FAD itt is hasonló szerepet tölthet be, mint az élesztőben. Azonban sem a FAD transzportját, sem az azzal kapcsolatos oxidatív folyamatokat nem írták le eddig emlős sejtek endoplazmás retikulumában. 4
CÉLKITŰZÉSEK Mint a bevezetésben leírtuk, élesztőben kimutatták a FAD transzportját az endoplazmás retikulum membránján keresztül, illetve a lumenbe bejutó szabad FAD szerepét az oxidatív fehérje folding mechanizmusában. Célul tűztük ki a folyamat egyes elemeinek tanulmányozását emlős sejtekben, ezen belül vizsgálni kívántuk a FAD transzportját endoplazmás retikulumból származó mikroszómális vezikulákon. A transzport jellegzetességeinek megállapításán kívül össze kívántuk hasonlítani a mikroszómális és a már kissé jobban ismert mitokondriális FAD transzport jellemzőit. Meg akartuk állapítani, hogy a szabad FAD képes-e serkenteni az oxidatív fehérje folding mechanizmusát emlős sejteken is. A protein tiol oxidáció mellett más intraluminális oxidatív folyamatok FAD függését is meg kívántuk vizsgálni. Kíváncsiak voltunk arra is, hogy az intraluminális oxidatív hatások és a FAD transzmembrán transzportja között milyen összefüggés van. Kísérleteinket patkány máj endoplazmás retikulumból származó mikroszómális vezikulákon végeztük. 5
ALKALMAZOTT MÓDSZEREK A patkány máj mikroszómák előállítása standard differenciálcentrifugálással történt. A mikroszómák intravezikuláris terét radioaktívan jelzett víz és inulin adásával határoztuk meg. A mikroszómális transzportmechanizmusok és intravezikuláris pool-ok detektálására a gyorsszűréses (rapid filtrációs) technikát alkalmaztuk. A FAD-ot fluorimetriásan detektáltuk. A mikroszómák fehérje tiol tartalmát Ellman módszerrel mértük EREDMÉNYEK Patkány máj mikroszómák FAD által hozzáférhető intravezikuláris terének meghatározása Első kísérleteinkben arra kerestünk választ, hogy a FAD egyáltalán képes-e bejutni a mikroszómális vezikulák lumenébe. Ezért meghatároztuk a FAD számára hozzáférhető intravezikuláris térfogatot. A patkány máj mikroszómák látszólagos intra- és extravezikuláris terét [ 3 H]vízzel, mint teljesen membránpermeábilis molekulával és[ 3 H(C)]inulinnal, mint nem-permeábilis vegyülettel határoztuk meg. 6
A FAD nagyobb intravezikuláris teret foglalt el, mint a víz, ami már jelezte, hogy a molekula számára a membrán átjárható. Az intraluminális FAD felhalmozódás valóban felvétel és nem membránhoz való kötődés eredménye volt, hiszen a pórusképző antibiotikum alameticin jelenlétében végzett kísérletekben nem észleltünk mikroszómális FAD akkumulációt. Az alameticint utólag (a felvétel után) adva a rendszerhez, a FAD túlnyomó része elhagyta a lument, a membránhoz és a fehérjékhez való kötődés a teljes mikroszómális FAD tartalom kevesebb, mint 15%-a volt. A FAD intraluminális felhalmozódása tehát a felvétel és az esetleges mikroszómális metabolizmus következménye. A FAD transzportja patkány máj mikroszómális vezikulákban A fenti eredmények már valószínűsítették a mikroszómális FAD transzport létezését. A FAD felvételét a továbbiakban a gyorsszűréses eljárással vizsgáltuk. A FAD felvétele egy gyors kezdeti fázis után 10 perc körül érte el maximumát. A számított intravezikuláris FAD tér ebben az esetben körülbelül 5 µl/mg protein volt, ami jól egyezik az előző kísérleti rendszerben nyert adattal. A mikroszómával asszociálódott FAD-ot alameticin adásával fel lehetett szabadítani, tehát a FAD valóban intravezikulárisan helyezkedett el. A transzport kétirányú volt: az 7
előzetesen FAD jelenlétében inkubált mikroszómális vezikulákból gyors FAD kiáramlás történt, ha az inkubációs elegyet FADmentes pufferrel hígítottuk. Bizonyítandó a transzport fehérje-mediált természetét, megvizsgáltuk néhány általános anion-transzport gátlószer, valamint a mitokondriális FAD transzport inhibitor atraktilozid hatását a mikroszómális FAD felvételre. A mikroszómák előinkubálása 4,4 -diizotiocianostilbén-2,2 -diszulfonsav (DIDS) vagy atraktilozid jelenlétében gátolta a FAD felvételt, míg az N- etilmaleimid alig volt hatásos és a flufenamát teljesen hatástalannak bizonyult. Mind a DIDS, mind az atraktilozid hatása koncentrációfüggő volt. A DIDS a FAD effluxot is gátolta, ezért a vegyületet a gyorsszűrés során a mosáshoz használt pufferben is felhasználtuk. A DIDS kihagyása a mosó pufferből a FAD felvétel alulbecsléséhez vezet, amit a mosási fázis alatti FAD kiáramlás okoz. Ha a FAD bejut a mikroszóma lumenébe, fokozhatja a lokális oxidatív folyamatokat. Két közismert intraluminális oxidatív reakciót a glukóz-6-foszfát (G6P) és a protein tiolok oxidációját - vizsgáltunk meg, hogy a FAD e hatását bizonyíthassuk. Ismert, hogy a G6P mikroszómális oxidációját, melyet az intraluminális hexóz-6-foszfát dehidrogenáz katalizál, az intraluminális NADPH eloxidálásával fokozni lehet. Erre a célra használható a membrán-permeábilis metirapon, mely egy intravezikuláris reduktáz szubsztrátjaként visszaoxidálja a NADPH-t. A 8
metirapon [ 14 C]G6P adása után fokozza az intraluminális radioaktivitás akkumulációját. A hatásért az intravezikuláris 6-foszfoglukonát koncentrációjának emelkedése a felelős, mely a hexóz-6-foszfát dehidrogenáz terméke. Ennek alapján feltételeztük, hogy más membránpermeábilis NADPH oxidáló vegyületek így a FAD is képesek lehetnek kiváltani a radioaktivitás intraluminális akkumulációját [ 14 C]G6P adása után. A feltételezésnek megfelelően 1 mm FAD jelenlétében inkubált mikroszómákban a radioaktivitás felhalmozódása a steady-state fázisban 1,6-szer magasabb volt a kontrollénál [ 14 C]G6P adása után. Élesztőben a szabad FAD szerepét az oxidatív fehérje foldingban már igazolták. Ezért a következő lépésben mi is megvizsgáltuk a FAD hatását a diszulfid kötések képződésére. A mikroszómális fehérje tiolok koncentrációja FAD nélkül 37 C-on végzett inkubálás során alig változik. FAD adása viszont a tiolok szintjének gyors csökkenéséhez vezet. A maximális hatáshoz 0,2 mm FAD koncentrációra volt szükség. A teljes mikroszómális protein tiolok körülbelül egyharmadát lehetett eloxidálni. A hatás koncentrációfüggő volt, 10 µm FAD már hatékonynak bizonyult, de 0,2 mm-nál magasabb FAD koncentrációk vagy 20 percnél hosszabb inkubálás már nem okozott kifejezettebb hatást. A FAD felvétel gátlása atraktiloziddal kivédte a protein tiolok oxidációját. Az atraktilozid önmagában nem befolyásolta a mikroszómális protein tiolok redox státuszát. 9
MEGBESZÉLÉS A szekréciós fehérjék diszulfid kötéseinek kialakításához szükség van egy elektron transzfer láncra az eukarióta sejt endoplazmás retikulumában, mely az elektronokat a fehérje tioloktól az oxigénig szállítja. A rendszer modelljét legalaposabban élesztőben írták le, ahol az elektron transzfert fehérjék végzik, a protein diszulfid izomeráz és a flavoprotein Ero1p. Az utóbbi fehérje a szorosan kötött FAD mellett képes szabad FAD kötésére is, és ez a kötés alapvető a fehérje működésében. A FAD a citoszolban (és a mitokondriumban) szintetizálódik, de az élesztőben (és mint jelen kísérleteink igazolják, emlős sejtekben is) könnyen bejut az endoplazmás retikulum lumenébe, ahol előmozdítja az Ero1p által katalizált oxidációt. Mivel az emlős sejtek expresszálják az Ero1p analógjait, feltételezhetjük, hogy a mikroszómális FAD transzportnak ezekben a sejtekben is fiziológiás szerepe lehet az oxidatív foldingban. Hipotézisünknek megfelelően sikerült a FAD transzportját kimutatni patkány máj mikroszómális vezikulákban. A gyorsszűréses kísérletek igazolták, hogy a transzport kétirányú. Az intravezikuláris FAD koncentráció az egyensúlyi állapotban magasabb az extravezikulárisnál, amit esetleg a FAD luminális metabolizmusa okozhat. A transzportot mindkét irányban koncentrációfüggő módon gátolni tudtuk az anion transzport blokkoló 4,4 -diizotiocianostilbén-2,2 - diszulfonsavval, és a mitokondriális FAD transzport gátlószerével, az 10
atraktiloziddal. Az eredmények tehát alátámasztják a fehérjemediált FAD transzport jelenlétét a máj endoplazmás retikulumában. A FAD megjelenését a lumenben indirekt módon is bizonyítottuk. A mikroszómális vezikulákhoz adott FAD fokozta a glukóz-6-foszfát és a fehérje tiolok intraluminális oxidációját. A transzport és az intraluminális oxidatív hatás közötti direkt összefüggést is bizonyítani lehetett: a transzport gátlása atraktiloziddal kivédte a fehérje tiolok oxidációját. Az intravezikuláris FAD akkumuláció szintén azt támasztja alá, hogy a FADot intraluminális reakciók hasznosítják. A FAD transzportja az egyes organellumok membránján át alig ismert; egyetlen FAD transzportert sem írtak le eddig molekuláris szinten. FAD transzport aktivitást az élesztő endoplazmás retikulumán kívül csak emlős sejtek mitokondriumának belső membránjában észleltek eddig. A mikroszómális FAD transzport általunk leírt jellegzetességei (gátlás DIDS-szel, relatíve csekély érzékenység atraktiloziddal szemben, enyhe gátlás N-etilmaleimiddel) hasonlóak az endoplazmás retikulum ATP/ADP antiporteréihez. Feltételezhető, hogy a FAD transzport az ATP/ADP antiporterek feladata mind a mitokondriumban, mind az endoplazmás retikulumban. A FAD transzporterek jelenléte az endoplazmás retikulum és a mitokondrium membránjában felvetheti annak a lehetőségét, hogy az oxidatív folding során felszabaduló elektronok ezzel a mechanizmussal eljuthatnak a mitokondriális légzési láncig, ami energetikai szempontból a sejt számára előnyös. Egy ilyen feltételezett mechanizmus szabályozási 11
szerepet is elláthat. A FAD transzport kulcsszerepet játszhat az endoplazmás retikulum membránján keresztül történő elektrontranszferben, hiszen a legtöbb redox-aktív vegyületre nézve az endoplazmás retikulum membrán permeabilitása igen korlátozott. Így a FAD transzportján kívül eddig csak a dehidroaszkorbát transzport volt ismert, mint a lumen redoxpotenciálját befolyásolni képes folyamat, illetve a mikroszómális membrán tokoferoljáról tételeztük fel és bizonyítottuk be, hogy a transzmembrán elektrontranszfer fontos komponense lehet. A FAD transzport in vivo jelentőségének megítéléséhez azonban még nagyon sok információra lenne szükség. Kérdés például, hogy az emlős sejt citoszoljának szabad FAD szintje egyáltalán lehetővé teszi-e a FAD transzporterek hatékony működését. Összefoglalva elmondhatjuk, hogy a citoszol szabad FAD-ja bejuthat az endoplazmás retikulum lumenébe és hozzájárulhat a diszulfid kötések kialakulásához emlős sejtekben is. Az endoplazmás retikulum membránján keresztül történő FAD transzportnak fontos szerepe lehet a diszulfidképződésnek a sejt energetikai, metabolikus és tápláltsági állapotával való összehangolásában. 12
KÖVETKEZTETÉSEK Munkánk célja a FAD transzport kimutatása és annak jellemzése volt patkány máj endoplazmás retikulumból származó mikroszómális vezikulákon. Legfontosabb új eredményeink a következők: A FAD átjut a mikroszómális membránon, és felhalmozódik a lumenben. A FAD transzportja kétirányú, gátolható atraktiloziddal és 4,4 - diizotiocianostilbén-2,2 -diszulfonsavval. A lumenbe belépő FAD reagál a piridin nukleotid és a tiol/diszulfid redox rendszerekkel. A FAD felvétele előmozdítja az intraluminális fehérje tiolok oxidációját, a transzport gátlása kivédi a hatást. Az eredmények szerint tehát az élesztőben leírtakhoz hasonlatosan a szabad FAD meghatározó szerepet játszik az oxidatív fehérje folding mechanizmusában emlős sejtek endoplazmás retikulumában is. 13
Az értekezés alapjául szolgáló közlemények: Bánhegyi, G., Csala, M., Szarka, A., Varsányi, M., Benedetti, A., and Mandl, J. (2003) Role of ascorbate in oxidative protein folding. Biofactors 17, 37-46. Varsányi, M., Szarka, A., Papp, E., Makai, D., Nardai, G.,. Csermely, P., Mandl, J., Benedetti, A., and Bánhegyi, G. (2004) FAD transport and FAD-dependent protein thiol oxidation in rat liver microsomes. J. Biol. Chem. 279, 3370-3374. 14