Flagellin alapú filamentáris nanoszerkezetek létrehozása Vonderviszt Ferenc PE MÜKKI Bio-Nanorendszerek Laboratórium MTA Enzimológiai Intézete MTA MFA
Bakteriális flagellumok Flagelláris filamentum: ~10 4 flagellin alegység hosszúság: 10-20 µm átmérő: 23 nm
A flagelláris filamentumokat felépítő flagellin alegységek szerkezete (a) D2 D3 (b)
A flagellin fehérje jellemzése A flagellin polimerizációra képes A molekula terminális régiói játszanak meghatározó szerepet a filamentáris szerkezet kialakításában Az aminosavszekvencia 190-284 hipervariábilis szegmense által felépített D3 domén nem vesz részt a filamentumépítésben
Célkitűzés A D3 domén átalakításával vagy más fehérjékkel történő helyettesítésével kívánunk létrehozni olyan előnyös tulajdonságokkal rendelkező flagellin variánsokat, amelyekből filamentáris nanoszerkezetek építhetők. flagellin-gfp jelző-alegységek flagellin-enzim fúziós konstrukciók (flagzimek) flagellin alapú kötőfehérjék
Flagellin alapú fúziós konstrukciók előállítása D3-deléciós flagellin variáns ( D3-FliC) előállítása és jellemzése A beültetendő fehérje szerkezetének analízise Megfelelő linkerek tervezése A fúziós génkonstrukció létrehozása Bakteriális termeltetés, tisztítás Helyes feltekeredettség ellenőrzése Polimerizációs képesség vizsgálata
D3-deléciós flagellin előállítása és jellemzése D3_FliC polimerizációra képes a natívval megegyező szerkezetű és stabilitású filamentumokat alkot D3-FliC alegység A D3 domén nem játszik lényeges szerepet a filamentáris szerkezet stabilizálásában. Kalorimetriás stabilitásvizsgálat Natív filamentumok D3_FliC filamentumok
A FliC-sfGFP létrehozása A szuperstabil GFP variáns (sfgfp) beillesztése a D3 helyére sfgfp A beépített GFP helyesen feltekeredik (fluoreszcencia) A flagellin-sfgfp fúziós fehérje polimerizációra képes FliC-sfGFP D3_FliC Ni-NTA tisztítás Filamentumépítés AS polimerizációval
A FliC-CHMO flagzim előállítása CHMO CHMO: ciklohexanon monooxigenáz (543 aa) FliC-CHMO génkonstrukció elkészült Termeletetés E.coli sejtekben Tisztítási eljárás kidolgozás alatt Emésztési kísérletek alapján a beillesztett CHMO feltekeredett
Flagellin alapú kötőfehérjék
Flagellin alapú receptorok A flagellin külső D3 doménjének átformálásával hozunk létre adott célmolekulák felismerésére képes mesterséges receptorokat. Előállítás: Fehérjetervezés Irányított evolúció D3 Előnyök: Baktériumokkal termeltethetők Könnyen izolálhatók és tisztíthatók Nanostruktúrák építhetők belőlük
Cys-mutáns flagellin: T239C Helyspecifikus jelölhetőség Felületi rögzíthetőség D3
Ni-kötő flagellin variáns L209H V235H K241H D3
D3 kötődomén létrehozása irányított evolúcióval D3 D3 Célkitűzés: a D3 domén L1-L3 hurokrégióiban randomizált variánsainak előállítása a célmolekula kötésére képes változatok kiválasztása
Miért jó filamentáris receptorokat építeni? Előnyök: - stabilitás - nagy felületi kötőhelysűrűség - azonos lokális környezet (nincs szükség hordozó mátrixra) - lehetőség különféle módosított flagellinek együttes polimerizációjára
Rekonstruált flagelláris filamentumok
Filamentáris receptorok felületi rögzítése D3
Ni-kötő filamentáris receptorok felületi rögzítése és alkalmazása Kötőhelysűrűség: SPR mérés ~ 10 4 BS/µm 2 C1 chip
Összefoglalás A D3 domén helyére történő beépítés révén polimerizációra képes kötőfehérjék, enzimek, jelölőmolekulák előállítására nyílik lehetőség A flagellin alapú fúziós konstrukciók építőelemként szolgálhatnak filamentáris nanoszerkezetek kialakításában.
PE MÜKKI: Jankovics Hajnalka Klein Ágnes Muskotál Adél Szabó Veronika Tóth Balázs Köszönetnyilvánítás: MTA Enzimológiai Intézete: Závodszky Péter Kamondi Szilárd Sajó Ráchel