ÁLLATTANI KÖZLEMÉNYEK (2010) 95(1): 25 33. A ponty (Cyprinus carpio LINNAEUS) ovariális folyadékának hatása a friss és mélyhűtött pontysperma motilitására HORVÁTH ÁKOS 1, SONIA MARTÍNEZ PÁRAMO 2, KOVÁCS ÁKOS ISTVÁN 1, URBÁNYI BÉLA 1 és PAZ HERRÁEZ 3 1 Szent István Egyetem, Környezet- és Tájgazdálkodási Intézet, Halgazdálkodási Tanszék, H 2103 Gödöllő, Páter Károly u. 1. E mail: Horvath.Akos@mkk.szie.hu 2 Center for Marine Sciences-CCMAR, University of Algarve, Campus Gambelas, 8005-139 Faro, Portugália 3 Departamento de Biología Celular y Anatomía, Universidad de León, Campus de Vegazana, 24071, León, Spanyolország Összefoglalás. Munkánk során az ovariális folyadék és különböző aktivációs oldatok (desztillált víz, aktiváló oldat, 100% ovariális folyadék, valamint 75, 50 és 25% ovariális folyadék) hatását vizsgáltuk a pontyspermiumok motilitására friss és mélyhűtött spermában. Megfigyeléseink szerint az ovariális folyadék önmagában nem aktiválta a hímivarsejteket, azonban a friss pontysperma motilitását a lehető legmagasabb értéken a legtovább a 75% ovariális folyadék tartotta. A mélyhűtést követően, az eredetileg a pénzes pér (Thymallus thymallus LINNAEUS) spermájának mélyhűtéséhez kifejlesztett hígító használatakor kaptuk a magasabb motilitás értékeket, amelyekben szintén megfigyelhető a hígított ovariális folyadék kedvező hatása. A mélyhűtéshez használt hígítóknak azonban nem volt szignifikáns hatásuk a pontyspermiumok életképességére. Kulcsszavak: ponty, sperma, mélyhűtés, aktiváció, életképesség. Bevezetés A külső termékenyítés útján szaporodó csontoshalak spermiumai a herében és az ivari vezetékben mozdulatlanok és a szaporodás közegében, a vízben aktiválódnak. Az édesvízi halfajokban a spermiumok aktivációjának két alapvető módja ismert. A pisztrángfélékben (Salmonidae) a K + -ion koncentrációjának csökkenése a felelős a spermiumok aktivációjáért (MORISAWA et al. 1983). Az édesvizi halfajok nagy részében ezzel szemben a spermiumok aktivációját az ozmolalitás csökkenése váltja ki (MORISAWA 2008). MORISAWA & SUZUKI (1980) kísérletei alapján megállapították, hogy a pontyspermiumok 300 mosmol/kg ozmolalitású mesterséges oldatban (ami megegyezik a szeminális folyadékban mért értékkel) inaktívak maradtak és az őket körülvevő folyadék ozmolalitásának csökkenésére a spermiumok aktiválódtak. A kísérletük szerint pontyfajban 150 mosmol-os oldatban voltak a legaktívabbak a spermiumok. A halak ovariális folyadékának szerepe a termékenyítés során vitatott. Ismert, hogy a pisztrángfélék ovariális folyadéka aktiválja ezen fajok spermiumait (ROSENGRAVE et al. 2009), illetve az is, hogy ebben a közegben a spermiumok tovább mozognak, mint a vízben, 25
HORVÁTH Á. et al. (TURNER & MONTGOMERIE 2002). Irodalmi adatok igazolják, hogy a tüskés pikó (Gasterosteus aculeatus LINNAEUS) spermáját is aktiválja a faj ikrásainak ovariális folyadéka (ELOFSSON et al. 2006). A tengeri fajok közül a hering (Clupea pallasi VALENCIENNES), spermiumai tengervízben csak részben aktiválódnak, az összes sejt aktivációjához viszont szükség van az ikrával együtt ürült folyadékra is, amit a szerzők az ikra felszínéről leváló fehérjéknek tulajdonítottak (MORISAWA 2008). Pisztrángfélék esetében az ovariális folyadék spermiumokat aktiváló hatása érthető, mivel az ovariális folyadék K + -koncentrációja jóval alacsonyabb az aktivációs határértéknél (ROSENGRAVE et al. 2009). A többi említett fajnál, azonban, a magyarázat már nem ilyen egyértelmű. Az ovariális folyadék ozmolalitása tudniillik megegyezik a vérplazma és a szeminális plazma ozmolalitásával, így annak változása nem lehet a spermiumok motilitását aktiváló faktor (ELOFSSON et al. 2006). A sperma mélyhűtése jelentős károsodásokat eredményezhet a sejtek szerkezetében, motilitásukban és termékenyítő képességükben. A mélyhűtött sperma minőségének előrejelzése igen fontos részét képezi a halsperma-mélyhűtéses kísérleteknek szerte a világon (CABRITA et al. 2008). A minőségvizsgálati módszerek közé tartozik a sperma motilitásán kívül a sejtek életképességének meghatározása különböző fluoreszcens festési eljárásokkal. Vizsgálataink egyik célja az volt, hogy feltárjuk a ponty ovariális folyadékának hatását a spermiumok motilitására mélyhűtés előtt és az után. Másik célunk volt megvizsgálni a mélyhűtés hatását a pontysperma sejtmembránjának épségére és az ezzel kifejezett életképességre. Anyag és módszer A kísérleteket Gödöllőn, a Szent István Egyetem Mezőgazdaság- és Környezettudományi Kar Környezet- és Tájgazdálkodási Intézet Halgazdálkodási Tanszékén végeztük. A kísérletben használt tejes egyedeket két helyről, a Dinnyési Ivadéknevelő Tógazdaságtól (4 egyed), illetve az Aranyponty Zrt-től (1 egyed) szereztük be. A halakat a kísérlet kezdetéig a Halgazdálkodási Tanszék haltartó rendszerében, 600 literes műanyag kádakban tartottuk. A halakban a spermiációt hipofízissel indukáltuk, 4mg/testtömeg kg-os dózisban, amelyet 0,65% NaCl oldatban oldottunk fel. A sperma fejését az oltást követően 24 órával végeztük el. A fejés előtt a halakat szegfűszegolaj oldatában bódítottuk el, melynek dózisa 1 csepp volt 1 liter vízben. Az elaltatott egyedeket száraz vászonra fektettük, ivarnyílásukat szárazra töröltük, majd spermájukat a hasoldal masszírozásával 12 ml-es műanyag kémcsövekbe fejtük. A felhasználásig a friss spermát 4 C-os hőmérsékleten, hűtőszekrényben tároltuk. Az aktivációhoz használt ovariális folyadékot a Dinnyési Ivadéknevelő Tógazdaságban gyűjtöttük a gazdaság által végzett rutin pontyszaporítás során. Az ovariális folyadékot több ikrás egyedtől gyűjtöttük be, ömlesztve, tehát nem egyedi mintánként. Az ovariális folyadékot, Gödöllőre szállítását követően, fagyasztóban 30 C-on tároltuk. A mélyhűtés előtt a mintákat kétféle hígítóval hígítottuk: 1. számú hígító: pontyhígító (350 mm glükóz, 30 mm Tris, ph 8,0); 2. számú hígító: pérhígító (200 mm glükóz, 40 mm KCl, 30 mm Tris, ph 8,0). Védőanyagként mindkét esetben 10% metanolt használ- 26
OVARIÁLIS FOLYADÉK HATÁSA A PONTYSPERMA MOTILITÁSÁRA tunk, a hígítási arány 1:9 (1 rész sperma, 1 rész védőanyag, 8 rész hígító) volt. A hígított spermát 5 ml-es műszalmákba töltöttük. A mélyhűtést polisztirol dobozba töltött cseppfolyós nitrogén gőzében végeztük, 3 cm vastag polisztirol kereten. A hűtés ideje 7 perc volt, aminek leteltével a műszalmákat a cseppfolyós nitrogénbe helyeztük majd felolvasztásig abban tároltuk. A mintákat 40 C-os vízfürdőben olvasztottuk fel 40 másodpercig, ezután a felolvasztott spermát 12 ml-es műanyag kémcsövekbe ürítettük. A motilitás vizsgálatát mind a mélyhűtött, mind a friss mintákon elvégeztük. A vizsgálat során 1 µl spermát 20 µl aktiváló folyadékkal kevertünk össze egy tárgylemezen. A sperma aktiválására használt folyadékok a következők voltak: 1. desztillált víz, 2. aktiváló oldat (45mM NaCl, 5mM KCl, 30mM Tris, ph 8,0) (SAAD & BILLARD 1987), 3. ovariális folyadék, 4. 25% ovariális folyadék ovariális folyadék és desztillált víz 25:75 arányú keveréke, 5. 50% ovariális folyadék ovariális folyadék és desztillált víz 50:50 arányú keveréke, 75% ovariális folyadék ovariális folyadék és desztillált víz 75:25 arányú keveréke. A pontysperma aktivációjához használt oldatok ozmolalitása a következő volt: desztillált víz: 5 mosmol/kg; aktiváló oldat: 144 mosmol/kg; ovariális folyadék: 290 mosmol/kg; 25% ovariális folyadék 179 mosmol/kg; 50% ovariális folyadék: 217 mosmol/kg; 75% ovariális folyadék: 255 mosmol/kg. A motilitást Nikon Eclipse E600 fénymikroszkóp segítségével 200 nagyításon, sötét látótérben vizsgáltuk. A motilitásnál a mozgó sejtek arányát%-ban becsléssel állapítottuk meg. Az aktivációt követően 4 percig 30 másodpercenként rögzítettük a becsült motilitás értékeket. Az aktiváló oldatok ozmolalitását Advanced Micro-Osmometer 3MO plus fagyáspont-csökkenéses ozmométer segítségével határoztuk meg. A motilitáson kívül meghatároztuk a spermaminták (friss, illetve a kétféle hígítóval mélyhűtött) életképességét is fluoreszcens élő-halott festéssel. A vizsgálat első lépéseként a spermát 1000-szeresére hígítottuk a mélyhűtéshez is használt hígítóval (friss sperma esetében a pérhígítóval). Ez után az 1 ml hígított spermához 5µl dimetil-szulfoxidban feloldott SYBR green membrán-peremeábilis fluoreszcens festéket adtunk, majd 10 percig sötétben inkubáltuk. Az inkubációt követően 5 µl propidium-jodidot adtunk a hígított spermához, ami csak a sérült sejtmembránon képes áthatolni, tehát az ép membránnal rendelkező sejteket nem festi meg. Ez után is 10 perc inkubáció következett. A mintákat epi-fluoreszcens megvilágítással, mikroszkóp alatt, 200 nagyításon, kék szűrővel vizsgáltuk, melynek gerjesztési hullámhossza 470 nm, emissziós hullámhossza 515 nm volt. A SYBR green festék az ép sejtek DNS-éhez kötődve zöld fluoreszcenciát bocsát ki, míg a propidium-jodid vörös színűre festi a sérült membránnal rendelkező sejteket. A megfestett mintákról digitális felvételt készítettünk és az ImageJ szabad forráskódú kutatói képkezelő szoftver segítségével vizsgáltuk a zöld és vörös fluoreszcenciát kibocsátó sejtek számát. A kétféle sejtek arányával jellemeztük a sperma életképességét. A mélyhűtésnek a sperma életképességére gyakorolt hatását egyszempontos varianciaanalízissel határoztuk meg Tukey-próbát használva utótesztként 5%-os szignifikancia-szint mellett. A statisztikai vizsgálatokat GraphPad Prism for Windows 4.0 szoftver segítségével végeztük. 27
HORVÁTH Á. et al. Eredmények A friss sperma motilitása az aktivációhoz használt oldattól függően 90±7% és 96±5% között alakult az aktiváció pillanatában (1. ábra). A hígítatlan ovariális folyadékban nem aktiválódtak a spermiumok. Az aktiváció pillanatában a folyadékok közel azonos mértékben aktiválták a hímivarsejteket, majd az összetételtől függően változott a motilitás, az idő függvényében. Az aktivációt követő fél percben a 25% ovariális folyadék használatakor figyeltük meg a legmagasabb motilitás értéket (98±5%), de a többi ovariális folyadékot tartalmazó oldat is ennek az értéknek a közelében alakult. A friss sperma a 75% ovariális folyadékban tartotta meg legtovább a legmagasabb motilitás értéket, ami még 4 percnél is 40±14% volt. Motilitás (%) 100 80 60 40 aktiváló oldat desztillált víz Ovariális folyadék Ovariális folyadék 25% Ovariális folyadék 50% Ovariális folyadék 75% 20 0 0 30 60 90 120 150 180 210 240 Aktiváció (másodperc) 1. ábra. A frissen fejt pontysperma motilitásának alakulása különböző aktivációs oldatok jelenlétében. Az adatpontok átlagértékeket jelölnek (n=5). Figure 1. Changes in the motility of fresh common carp sperm during activation with different activating agents. Data are expressed as means (n=5). Pontyhígítóval mélyhűtött spermában (2. ábra) gyengébb motilitási eredményeket kaptunk, mint a friss sperma használatakor. A legmagasabb motilitás értéket itt is az aktiváció után 30 másodperccel, de a tiszta desztillált vízzel értük el. Az 25% ovariális folyadék és az aktiváló oldat nagyon hasonló eredményt mutatott. A friss spermánál a mozgó sejtek legnagyobb arányát legtovább megőrző 75% ovariális folyadék itt a leggyengébb eredményt ad- 28
OVARIÁLIS FOLYADÉK HATÁSA A PONTYSPERMA MOTILITÁSÁRA ta, hiszen csak a spermiumok 6±10%-át aktiválta. Két perc után a másik két ovariális folyadékot tartalmazó elegy, és az aktiváló oldat egymáshoz képest nem mutatott jelentős különbséget. A pérhígítóval mélyhűtött sperma motilitási értékei (3. ábra) magasabbak voltak, mint pontyhígító használatakor. A legmagasabb értéket ebben az esetben az aktiváció pillanatában kaptuk. A desztillált víz 75±6% motilitást eredményezett, amit követett az aktiváló oldat 73±5%-ával. Amellett hogy a pérhígító használatánál is a desztillált víz adta a legmagasabb motilitási értéket, a sejtek ebben mozogtak a legrövidebb ideig. Az idő függvényében vizsgálva a motilitást, a leggyengébb eredményt a 25% ovariális folyadék adta csakúgy, mint a friss spermával végzett kísérletnél. Négy perc elteltével az aktiváló oldat és az 50% ovariális folyadék 23±13, és 20±0%-on tartotta fenn a motilitást. A mélyhűtött sperma életképessége felolvasztás után közel egyforma volt mind a pérhígító (60±10%), mind pontyhígító (60±13%) használata mellett. A kontrollként használt friss sperma életképessége pedig 97 ± 2% volt (4. ábra). A friss és mélyhűtött sperma életképessége között statisztikailag szignifikáns eltérés volt (mindkét hígító esetében P < 0,001). 100 aktiváló oldat desztillált víz 80 Ovariális folyadék Ovariális folyadék 25% Motilitás (%) 60 40 Ovariális folyadék 50% Ovariális folyadék 75% 20 0 0 30 60 90 120 150 180 210 240 Aktiváció (másodperc) 2. ábra. A pontyhígító jelenlétében mélyhűtött pontysperma motilitásának alakulása különböző aktivációs oldatok jelenlétében. Az adatpontok átlagértékeket jelölnek (n=4). Figure 2. Changes in the motility of common carp sperm cryopreserved in a carp extender during activation with different activating agents. Data are expressed as means (n=4). 29
HORVÁTH Á. et al. Motilitás (%) 100 80 60 40 aktiváló oldat desztillált víz Ovariális folyadék Ovariális folyadék 25% Ovariális folyadék 50% Ovariális folyadék 75% 20 0 0 30 60 90 120 150 180 210 240 Aktiváció (másodperc) 3. ábra. A pérhígító jelenlétében mélyhűtött pontysperma motilitásának alakulása különböző aktivációs oldatok jelenlétében. Az adatpontok átlagértékeket jelölnek (n=4). Figure 3. Changes in the motility of common carp sperm cryopreserved in a grayling extender during activation with different activating agents. Data are expressed as means (n=4). 100 75 Életképesség (%) 50 25 0 Friss Pér hígító Ponty hígító 4. ábra. A friss, illetve a ponty- és pérhígítók jelenlétében mélyhűtött pontysperma életképessége. Az adatok átlag ± szórás értékeket jelölnek (friss: n=5, mélyhűtött: n=4). Figure 4. Viability of fresh common carp sperm, as well as of that cryopreserved in the presence of carp or grayling extenders. Data are expressed as mean ± SD (fresh sperm: n=5, cryopreserved sperm: n=4). 30
OVARIÁLIS FOLYADÉK HATÁSA A PONTYSPERMA MOTILITÁSÁRA Értékelés A kísérletben vizsgált, aktiválásra használt folyadékok közül minden esetben a desztillált víz adta a legmagasabb kiindulási motilitás értékeket. A jelenség a spermiumok aktiválódásával magyarázható. A desztillált vízben aktivált spermiumokat éri a legerősebb hipoozmotikus sokk, mivel a ponty hímivarsejtjei a 300 mosmol/kg-os szeminális folyadékból az 5 mosmol/kg-os folyadékba kerülnek. Továbbá minden esetben megállapítható, hogy a desztillált víz csak kb. 90 másodpercig volt képes a motilitás fenntartására. Ezt a pontyspermával kapcsolatos közismert megfigyelést többek között a sejtek flagellumában végbemenő morfológiai elváltozásokkal és a spermiumok ATP-szintjének jelentős csökkenésével (BILLARD et al. 1995), illetve a spermiumok jelentős duzzadásával magyarázzák, ami szintén a hipoozmotikus környezet eredménye (PERCHEC POUPARD et al. 1997). Sokkal érdekesebb megfigyelés, hogy az ovariális folyadék önmagában nem, de hígítva a spermiumokat nem csak aktiválta, hanem a motilitásukat hosszú ideig igen magas értéken tudta tartani. A folyamat szaporodásbiológiai szempontból indokolt: a szervezet biztosítani akarja, hogy a spermiumok eljussanak az ikraszemekig, amit a mozgási idejük meghosszabbításával is megpróbálhat elérni. Az is érthető, hogy íváskor a halak nem egyszerűen a vízbe ürítik az ivarterméküket. A tejes hal az ikra, az ovariális folyadék és a környező víz keverékére üríti a spermáját, tehát az ovariális folyadéknak szerepe lehet a termékenyítésben. Nem világos azonban, hogy miért nem aktiválja az ovariális folyadék önmagában a spermiumokat, ahogyan azt a tüskés pikó esetében teszi (ELOFFSON et al. 2006). Mindenesetre a tény, hogy a 75%-os ovariális folyadék már igen intenzív aktivációt eredményezett a friss spermában, arra utal, hogy az ozmolalitáson kívül más faktorok is szerepet játszanak a spermiumok aktivációjában, mivel a 75% ovariális folyadékban mért ozmolalitás (255 mosmol/kg) magasabb a más szerzők által megfigyelt aktivációs határértéknél (200 mosmol/kg) (PERCHEC POUPARD et al. 1997). A két hígító összehasonlítása során megállapíthatjuk, hogy a pérhígító jobban megfelelt a mélyhűtésre, mint az eredetileg a ponty spermájára kifejlesztett pontyhígító (HORVÁTH et al. 2003). A friss spermával kapott értékektől természetesen elmaradnak a pérhígítóval kapott eredmények, de ez a fagyasztás során jelentkező veszteségeknek tudható be. Továbbá, ennél a hígítónál figyelhető meg a legnagyobb hasonlóság a friss spermamintákhoz képest, a motilitás értékekben és azoknak időbeli változásában egyaránt. Az életképesség vizsgálatának eredményei nem támasztják alá a motilitás eredményeket, ami arra utal, hogy a sejtek mindkét hígítóban ugyanolyan mértékű védelmet kapnak a fagyás károsító hatásai ellen, ám a sejtek mozgását befolyásoló tényezők a pérhígító esetében kedvezőbbek. Köszönetnyilvánítás. A munka a Nemzeti Kutatási és Technológiai Hivatal, valamint az ESP- 16/2006 számú Magyar-Spanyol TéT pályázat támogatásával jött létre. 31
HORVÁTH Á. et al. Irodalomjegyzék BILLARD, R.., COSSON, J., PERCHEC, G. & LINHART, O. (1995): Biology of sperm and artificial reproduction in carp. Aquaculture 129: 95 112. CABRITA, E., ROBLES, V. & HERRÁEZ, P. (2008): Sperm quality assessment. In: CABRITA, E., ROBLES, V. & HERRÁEZ, P. (eds.): Methods in reproductive aquaculture: marine and freshwater species. CRC Press, Taylor & Francis Group, Boca Raton, pp. 93 147. ELOFSSON, H., VAN LOOK, K. J. W., SUNDELL, K., SUNDH, H. & BORG, B. (2006): Stickleback sperm saved by salt in ovarian fluid. Journal of Experimental Biology 209: 4230 4237. HORVÁTH Á., MISKOLCZI E. & URBÁNYI B. (2003): Cryopreservation of common carp sperm. Aquatic Living Resources 16: 457 460. MORISAWA, M. (2008): Adaptation and strategy for fertilization in the sperm of teleost fish. Journal of Applied Ichthyology 24: 362 370. MORISAWA, M. & SUZUKI, K. (1980): Osmolality and potassium ions: their role in initiation of sperm motility in teleosts. Science 210: 1145 1147. MORISAWA, M., SUZUKI, K., SHIMIZU, H., MORISAWA, S. & YASUDA, K. (1983): Effects of osmolality and potassium on motility of spermatozoa from freshwater cyprinid fishes. Journal of Experimental Biology 107: 95 103. PERCHEC POUPARD, G., GATTI, J. L., COSSON, J., JEULIN, C., FIERVILLE, F. & BILLARD, R. (1997): Effects of extracellular environment on the osmotic signal transduction involved in activation of motility of carp spermatozoa. Journal of Reproduction and Fertility 110: 315 327. ROSENGRAVE, P., TAYLOR, H., MONTGOMERIE, R., METCALF, V., MCBRIDE, K. & GEMMELL, N. J. (2009): Chemical composition of seminal and ovarian fluids of chinook salmon (Oncorhynchus tshawytscha) and their effects on sperm motility traits. Comparative Biochemistry and Physiology, Part A 152: 123 129. SAAD, A. & BILLARD, R. (1987): Spermatozoa production and volume of semen collected afert hormonal stimulation in the carp, Cyprinus carpio. Aquaculture 65: 67 77. TURNER, E. & MONTGOMERIE, R. (2002): Ovarian fluid enhances sperm movement in Arctic charr. Journal of Fish Biology 60: 1570 1579. 32
OVARIÁLIS FOLYADÉK HATÁSA A PONTYSPERMA MOTILITÁSÁRA Effect of ovarian fluid on the motility of fresh and cryopreserved sperm of the common carp (Cyprinus carpio LINNAEUS) ÁKOS HORVÁTH 1, SONIA MARTÍNEZ PÁRAMO 2, ÁKOS ISTVÁN KOVÁCS 1, BÉLA URBÁNYI 1 & PAZ HERRÁEZ 3 1 Szent István University, Faculty of Agricultural and Environmental Sciences, Department of Aquaculture, Páter Károly u. 1, H 2103 Gödöllő, Hungary E mail: Horvath.Akos@mkk.szie.hu 2 Center for Marine Sciences-CCMAR, University of Algarve, Campus Gambelas, 8005-139 Faro, Portugal 3 Departamento de Biología Celular y Anatomía, Universidad de León, Campus de Vegazana, 24071, León, Spain ÁLLATTANI KÖZLEMÉNYEK (2010) 95(1): 25 33. Abstract. The objective of this study was to investigate the effect of ovarian fluid and other activating agents (distilled water, activating solution, 100% ovarian fluid as well as 75, 50, and 25% ovarian fluid) on the motility of fresh and cryopreserved common carp sperm. According to the observations, ovarian fluid per se does not activate carp spermatozoa, however, 75% dilution of ovarian fluid maintained high motility rates for the longest time. In cryopreserved sperm, the highest motility values were observed when an extender originally developed for grayling sperm was used The beneficial effect of ovarian fluid on some motility values was also observed in cryopreserved sperm. Extenders used for cryopreservation did not have a significant effect on the viability of common carp sperm. Keywords: carp, sperm, cryopreservation, activation, viability. 33