A glifozát-toleráns transzgénikus (GM) fajták előállítása és termesztése

BIOTECHNOLÓGIA O I ROVATVEZETŐ: Dr. Heszky László akadémikus Az előző részben ismertettük a transzgénikus gyomirtószer-tolerancia stratégiáit és röviden bemutattuk a glifozát, glufozinát, szulfonilurea, imidazolinon és a bromoxinil szerekre toleráns GM-növények előállításának helyzetét. Ezek közül köztermesztésben és kereskedelmi forgalomban a világon jelenleg csak a glifozát és glufozinát alapú totális gyomirtó szerekre toleráns transzgénikus fajták és hibridek vannak, ezért ebben és a következő részben ezeket mutatjuk be. BIOTECHNOLÓGIA O I Tanuljunk géntechnológiául (34.) Transzgénikus növényvédelem (VI./3.) A glifozát-toleráns transzgénikus (GM) fajták előállítása és termesztése Dr. Heszky László SzIE Mezőgazdaság- és Környezettudományi Kar, Genetika és Biotechnológiai Intézet, Gödöllő Bevezetés A glyphosate továbbiakban glifozát John E. Franz kémikus (Monsanto) által 1970-ben felfedezett és Roundup kereskedelmi néven szabadalmaztatott herbicid. Kereskedelmi forgalmazása 1974-ben kezdődött. Alkalmazását tekintve a ROUNDUP az egyik legnagyobb mennyiségben és legszélesebb körben használható gyomirtó szer a világon (http://www.monsanto.hu). Totális (nem szelektív) gyomirtó szerként alkalmazható a mezőgazdaságilag nem művelt területek gyomirtására, szántóföldön a kultúrnövények kelése vagy palántázása előtti (preemergens, újabban pre-posztemergens) gyomirtására, kultúrnövények lombtalanítására stb. Kontakt és felszívódó (szisztemikus) szer. Célszerű intenzív növekedésben lévő növények leveleire permetezni. A felszívódást követően a glifozát a növény intenzíven növekvő (merisztematikus) szöveteibe transzlokálódik. A pusztulás 3-7 napon belül következik be. Jelenleg a világban 90 féle ROUNDUP termék van forgalomban, 150 körüli kereskedelmi név alatt. A glifozát gyenge szerves sav (2-foszfonometil-amino ecetsav), 1. ábra A glifozát (C 3 H 8 NO 5 P) hatóanyagának az N-foszfonometil-glicinnek szerkezeti képlete (A) és molekuláris modellje (B) (Wikipedia, the free encyclopedia.htm) 90 2013. május

2. ábra Az aromás aminosav bioszintézis főbb lépései, a glifozát (A) és a toleranciagén (B) hatása A: glifozát hatóanyaga a gyomokban a zöld színnel jelzett reakciót katalizáló EPSPS-enzimhez kapcsolódva, gátolja (kompetitív gátlás) annak működését. Ennek következtében az aromás aminosav bioszintézis ennél a lépésnél megakad. A sejtekben az aromás aminosav hiány miatt leáll a fehérjeszintézis, a sejtek és a növények elhalnak. B: A transzgnikus növényben a mutáns EPSPS-génről a sejtekben egy módosított EPSP-szintáz enzim termelődik, amihez a glifozát hatóanyaga nem tud kapcsolódni. A mutáns enzim tehát glifozát jelenlétében is képes katalizálni az aromás aminosavak bioszintézisének ezt a lépését. Nincs aminosav hiány, a fehérjeszintézis normális, a sejteket és a növényt a glifozát nem tudja károsítani. ezért a kereskedelmi forgalomba kerülő kiszerelései a glifozát különböző sóit tartalmazzák pl. a glifozát-ipa só (izopropilamin), vagy glifozát- TMS só (trimetilszulfónium). A glifozát alkalmazásával kapcsolatos környezet-egészségügyi problémákat Darvas Béla munkatársaival 2011-ben részletesen összefoglalta, ezért a szer felhasználásának következményeivel és tapasztalataival a növénytermesztés-biztonsági kérdések kivételével csak érintőlegesen foglalkozunk. Glifozát molekuláris hatásmechanizmusa 3. ábra A glifozát gyomirtó hatásának molekuláris háttere 1 és 2: Az aromás aminosavak bioszintézisének egyik lépését az EPSPS-enzim katalizálja. A glifozát hatóanyaga az N-foszfonometil-glicin szerkezete nagyfokú hasonlóságot mutat a reakcióban résztvevő egyik komponenssel a enol-piroszőlősav-3-foszfáttal. 2: A szerkezeti hasonlóság mellett a glifozát nagyobb affinitást mutat az EPSPSenzimhez, kiszorítva az enol-piroszőlősav-3-foszfátot a reakcióhelyről. 3: Ezzel megakadályozza (kompetitív gátlás) az 5-enolpiruvilsikiminsav-3-foszfát szintézisét. A glifozát, aminofoszfonsav típusú glicinanalóg (glicin-foszfonát). Hatóanyaga az N-foszfonometilglicin (1. ábra), ami a permetezést követően az aromás aminosavak (fenilalanin, hisztidin, triptofán) bioszintézisét állítja le a kloroplasztiszban. A hatóanyag ugyanis gátolja ezeknek az aminosavaknak a bioszintézisét, a bioszintézis egy lépését katalizáló enzimnek, az EPSP-szintáznak (5-enolpiruvilsikiminsav-3- foszfát szintáz) a gátlásával. Az EPSP-szintáz katalizálja az enol-piroszőlősav-foszfátból és a sikiminsav-3-foszfátból az 5-enolpiruvilsikininsav-3-foszfát kialakulását (2/A. ábra). Az enzim gátlásának következménye az aromás aminosavak termelődésének hiánya, mely a sejtekben a fehérjeszintézis leállásához vezet. A fehérjeszintézis hiánya a sejtek, majd a szövetek és szervek, végül az egész növény pusztulását eredményezi. A folyamatot gyorsítja, a bioszintézis előző lépésében keletkező de tovább alakulni már nem képes köztes termék a sikiminsav akkumulációja a sejtekben. Az EPSP-enzim működése gátlásának molekuláris oka az, hogy a glifozát hatóanyagának molekuláris szerkezete, nagyon hasonló az enolpiroszőlősav-foszfáthoz, de annál erősebb affinitással képes kapcsolódni (kompetitív gátlás) az EPSPszintázhoz (3. ábra). Ez a felismerés adta az elvi alapot a mutáns génre alapozott toleráns GM-fajták előállításához. 2013. május 91

1. táblázat Fontosabb glifozát-toleranciát biztosító gének származása és funkciója, valamint sikeres alkalmazásuk különböző kultúrnövények termesztésbe került GM-fajtáiban és -hibridjeiben Megjegyzés: *Glifozát ammonium hatóanyag ellen hatásos Glifozát tolerancia kialakítása mutáns génnel Molekuláris megoldás stratégiája A stratégia a herbicidhatóanyag által gátolt enzim mutáns változatának előállítására és felhasználására alapul. Ennek érdekében az EPSP-szintáz enzim génjében olyan mutációkat alakítottak ki, tehát a gén nukleotid sorrendjében (szekvenciájában) olyan módosításokat végeztek, amiknek következtében a módosított génről szintetizálódó mutáns enzimfehérjében egy bizonyos pozícióban egy aminosav megváltozik. Ennek következtében a mutáns génről szintetizálódó enzimfehérje szerkezete is megváltozik. A megváltozott (mutáns/módosított) EPSP-enzimhez a glifozát hatóanyaga már nem képes kapcsolódni. A tolerancia lényege, hogy mutáns génnel történő transzformációt követően a toleráns transzgénikus növények sejtjeiben az adott enzimfehérjének kétféle a korábbi érzékeny és egy új (mutáns) rezisztens változata termelődik. Mivel a mutáns változathoz a hatóanyag nem tud kapcsolódni, a mutáns enzim működése biztosítja az aromás aminosavak folyamatos termelődését. A következmény pedig a sejtek, illetve a növények glifozát toleranciája (2/B. ábra). Géntechnológiai kivitelezés Az aromás aminosavak bioszintézisére csak a növények és baktériumok képesek. A mutáns EPSPSgént ezért, mind a növényekből, mind a mikroorganizmusokból lehet izolálni (1. táblázat). Az állatok nem képesek ezeket az aminosavakat (fenilalanin, triptofán, hisztidin stb.) előállítani, számukra ezek az ún. esszenciális aminosavak (2. ábra), melyeket készen csak a takarmányból tudják felvenni. A köztermesztésben lévő glifozáttoleráns fajták előállítása során a mutáns EPSPS-szintáz (mepsps) génnel való transzformációt alkalmazták. A mutáns gént (aroa-gén) először a Salmonella typhimuriumból izolálták, később azonban az Escherichia coli mutáns aroa génjének, illetve az Agrobacterium CP4 törzse mutáns EPSPS-génjének (CP4EPSPS) használata vált általánossá (4/A. ábra). Mutáns gént izoláltak még kukoricából (2 mepsps), Agrobacterium tumefaciens-ből és Agrobacter globiformis-ból (epspsag) (1. táblázat). A mutáns EPSPS-génben egy vagy két pozícióban lévő tripletet módosítottak (vad: CCT mutáns: TCT), ami a hatóanyag kapcsolódásánál okoz aminosav cseréket (vad: prolin mutáns: szerin) az EPSP-szintáz enzimben (5. ábra). A mutáns EPSP-szintáz gént a GM-növények sejtmagjai tartalmazzák. Erről a génről a citoplazmában szintetizálódik a mutáns EPSP-szintáz enzim. Az enzimnek azonban a kloroplasztiszban kell működnie, ezért az enzimet kódoló DNS fragmentum elé, még egy 72 aminosavból álló petúniából vagy lúdfűből (Arabidopsis) származó tranzit peptid információját is beépítették. A tranzit peptid biztosítja a mutáns EPSP-szintáz enzim célba juttatását a kloroplasztiszba, ahol proteolitikus hasítást követően alakul ki a 48kD tömegű aktív enzim (4/A. ábra). A transzgén konstrukció tartalmaz még egy intront is. Ennek oka, hogy a gazdaságilag jelentős gén (mepsps) baktériumból származik, ami prokarióta, tehát nem tartalmaz intront. A transzgénikus növény minden sejtje tartalmazza a mutáns gént, és mivel a génkonstrukcióban eléje egy folyamatosan működő (konstitutív) promótert kapcsoltak, a mutáns fehérjét a GM-növény minden sejtje termeli a növény egész élete folyamán. Ennek előnye, hogy a glifozát-permetezést a GM-fajta fejlődésének bármelyik fázisában el lehet végezni, továbbá a hatóanyag a növény bármelyik részére kerülhet, a GM-fajta egyetlen egyede sem fog károsodni. Glifozát-tolerancia kialakítása detoxifikáló génnel Molekuláris megoldás stratégiája A megközelítés lényege, hogy a növényt egy olyan enzim génjével transzformáljuk, ami képes hatástalanítani a herbicid hatóanyagát. Ezeket a géneket általában különböző a herbicidre rezisztens mikroorganizmusokból izolálják. A transzgénikus növény minden sejtje termeli ezt az enzimet. A tolerancia mechanizmusa, hogy permetezést 92 2013. május

4. ábra Glifozát-toleranciát biztosító transzgének (gén/vektor konstrukciók) 4/A: A glifozát-toleranciát biztosító 2 mutáns epsps-gént tartalmazó vektor konstrukció (mepsps-gének származása: E. coli és Agrobacterium baktériumokból). 4/B: A glifozát-toleranciát biztosító kettős, mutáns epsps-gént és GOX detoxifikáló gént tartalmazó vektor konstrukció (GOX-gén származása: Agrobacterium és Ochronobactrum baktériumból) A vektor/transzgén konstrukció egyes elemei P: promóter, T: terminátor, L: célba juttató peptid, I: intron különböző élőkből származnak! követően a növény sejtjeibe jutó hatóanyagot ez az új enzim olyan formává alakítja, mely már nem tud a célfehérjéhez kapcsolódni. Tehát a sejt anyagcseréje nem károsodik. Géntechnológiai kivitelezés 2013. május A glifozát hatóanyagát hatástalanítani képes enzim a glifozát oxidoreduktáz (GOX), aminek génjét az Ochrobactrum anthropi-ból izolálták. A GOX-enzim, egy detoxifikáló enzim, ami a glifozát hatóanyagát (N-foszfonometil-glicin) glioxaláttá és aminometil-foszfonsavvá (AMPA) alakítva hatástalanítja. A transzgénben az enzimet kódoló GOX szekvencia elé a mutáns génhez hasonlóan konstitutív promótert építettek (4/B. ábra). A GM-növények emiatt egész életükben és minden sejtjükben folyamatosan termelik a glifozátot hatástalanítani képes GOX-enzimet. Detoxifikálásra alkalmas még a Bacillus licheniformis glifozát N-acetiltranszferáz enzimje is. Az enzim acetilálja a glifozát hatóanyagát, és a kémiailag módosult hatóanyag már nem képes az EPSPSenzim kompetitív gátlására. Az enzimet kódoló gének a gat4601 és a gat4621 jelzést kapták. Ezek közül a gat4621 gént tartalmazó GM-fajták már köztermesztésben vannak (1. táblázat). A 4. ábrán látható, hogy a transzgén egyes elemi (promóter, intron, célba juttató szekvencia, terminátor, gazdaságilag jelentős gén) különböző rendszertanilag távoli élőkből (különböző vírusok, baktériumok és növények) származnak. Erre az ad lehetőséget, hogy a földi élet információja minden élőben azonos molekulában a DNS-ben, azonos módon a tripletekben van kódolva és a kód is azonos. A növényi sejtek mint automaták képesek realizálni az információt, bármilyen élőből is származik, egyetlen kritérium van, hogy az idegen eredetű DNS-t, a növényben működő promóterhez kell kapcsolni. A 4. ábrán látható transzgének probléma nélkül működnek a köztermesztésben lévő transzgénikus (GM) fajták minden sejtjében. Glifozát-toleráns GM-fajták termesztése, előnyök és kockázatok A Monsanto glifozát-toleráns GMfajtáinak kereskedelmi elnevezése: Roundup Ready, röviden RR. Az első glifozát-toleráns transzgénikus fajtát (GM-szója) az Agracetus Campus (Middleton, Wisconsin, USA) 1995-ben állította elő. Bevezetésére 1996-ban került sor az RR-repcével együtt. A következő években kereskedelmi forgalomba került az RR-gyapot (1997), az RRkukorica (1998), az RR-cukorrépa (1999), és az RR-lucerna (2005). A transzgénikus herbicidtoleráns növényfajták vetésterülete 2012-ben elérte 100 millió ha-t a világon. A legújabb repce, szója, kukorica és cukorrépa GM-fajtákba és -hibridekbe már mind a mutáns EPSP-gént (CP4EPSPS), mind hatóanyagot elbontó enzim génjét (GOX) beépítették (4/B. ábra, 1. táblázat). A glifozát-toleráns GM-fajták sikeres karriert futottak be az elmúlt 16 évben a világon, különösen az USAban, Brazíliában és Argentínában (ld. Agrofórum 2012. 23/1., januári számában). Az Amerikai Egyesült Államokban a GM-szója vetésterülete eléri a szója vetésterületének 94 %-át, de 90 % felett van Argentínában is. A többi növény esetében is magas a GM-fajták területi részaránya az USA-ban: GM-kukorica 72 % (1. kép), GM-gyapot 73 %, GM-cukorrépa 95 % (ld. Agrofórum 2012. 23/2., februári számában). A Monsanto napjainkra további növényfajokból állított elő RR-fajtákat pl. búza, burgonya, Brassica, rapa, Agostiis stolonifera stb., ezek kereskedelmi bevezetése részben még a kezdetén tart, részben termesztésükkel kapcsolatban problémák merültek fel (1. táblázat). A glifozát-toleranciát biztosító transzgéneket megtalálhatjuk a többgénes fajtákban is, általában a rovarrezisztenciát biztosító Btgénekkel kombinálva. A glifozáttoleranciával és rovarrezisztenciával rendelkező többgénes GM-fajták termőterülete a világon már meghaladja a 20 millió hektárt (ld. Agrofórum 2013. 24/4., áprilisi számban). A kereskedelmi forgalomban lévő többgénes fajtákat és hibrideket, a gének 93

5. ábra A hagyományos és a glifozát-toleráns fajta molekuláris összehasonlítása A: A hagyományos fajta az eredeti EPSPS-génnel és enzimmel rendelkezik. B: A transzgénikus fajta is rendelkezik az eredeti EPSPS-génnel és enzimmel, de tartalmazza még a géntechnológiával bejuttatott mutáns EPSPS-gént és termékét az EPSPS-enzimet is. C: A különbség az eredeti és mutáns EPSPS-gén között, hogy a mutáns gén egy vagy két pozíciójában a triplet egy bázisát megváltoztatták. D: A különbség az eredeti és mutáns EPSPS-enzim között, hogy a mutáns enzim egy vagy két pozíciójában, az aminosav megváltozott. Emiatt a glifozát hatóanyaga nem tud a mutáns EPSPS-enzimhez kapcsolódni. kombinációival együtt a sorozat korábbi részeiben már bemutattuk (ld. Agrofórum 2011. 22/9., szeptemberi és a 2012. 23/4., áprilisi számaiban). A termőterület gyors növekedése a világ egyes országaiban bizonyítja a transzgénikus glifozát-tolerancia technológiai és gazdasági jelentőségét. Természetesen a terület gyors és nagyarányú növekedése miatt, a termesztésbiztonsági problémák rövid időn belül jelentkeztek. Ezeket a kockázatokat már bemutattuk az Agrofórum 2012. évi számaiban (tudáshiány kockázatai: 2012. 23/8., termesztésbiztonsági kockázatok: 2012. 23/9. és 10., élelmiszer-biztonsági kockázatok: 2012. 23/11., gazdasági és szociális kockázatok: 2012. 23/12.). Ezekben közöltek egy része, a glifozát-toleráns GM-fajtákra is vonatkozik. Az EU-ban korábban is tilos volt, és jelenleg is tilos a glifozát-toleráns GM-fajták termesztése. A glifozáttoleráns GM-fajták termesztésének legfontosabb kockázatait ezért, az USA Nemzeti Tudományos Tanácsa (NRC National Research Council) által felállított Szakértő Bizottság jelentése alapján foglalom össze (részletesen ld. az Agrofórum 2012. 23/3., márciusi számában): 1./ A glifozát-toleráns GM-fajták alkalmazása során a felhasznált gyomirtó szer mennyisége nem csökkent, mivel a farmerek a korábban használt hagyományos herbicideket glifozátra cserélték. 2/A glifozát gyomirtó szer domináns herbiciddé válása a földeken, idővel csökkentette a gyomirtás hatékonyságát. Ennek legfontosabb oka a glifozát-toleráns gyomok, illetve glifozátra kevésbé érzékeny gyomtársulások megjelenése volt. Ez azzal magyarázható, hogy molekulárisan nagyon kicsi a különbség az EPSPS-enzim érzékeny és mutáns (rezisztens) változata között. Az EPSPS-génben egy bizonyos pozícióban bekövetkező 1 báziscsere, egy aminosav cserét okoz az EPSPS-enzimben és ez elegendő a rezisztenciához (5. ábra). Ez a változás (mutáció) figyelemmel nagy egyedszámra könnyen és rövid idő alatt bekövetkezhet a gyomokban. A glifozát folyamatos és tartós nagy területre kiterjedő használata mind az észak- mind dél-amerikai államokban kedvezett a rezisztens gyomok kialakulásának és gyors terjedésének. Az USA-ban: az Amaranthus palmeri, Amaranthus tuberculatus, Ambrosia artemissifolia, Ambrosia trifida, Lolium ssp., Sorghum halepense fajok; Brazíliában: a Conyza spp., Lolium ssp.; Argentínában: a Sorghum halepense glifozáttoleráns változatai különös veszélyt jelentenek (Duke S.O., Powles, S. B, 2009). 3/ A 2. és 3. pontokban foglaltak alapozták meg az USA Szövetségi Bírósága 2010-ben hozott a Monsanto RR-cukorrépa és RRlucerna GM-fajtáinak termesztését tiltó ítéletét. Indoklás szerint az USDA (USA Mezőgazdasági Minisztériuma) nem kellően megalapozott vizsgálatok alapján adta ki a termesztési engedélyt. A Bíróság az ezt követő években a GM-cukorrépaszaporítóanyag megsemmisítését is elrendelte (ld. Agrofórum 2012. 23/4. áprilisi számában). 4/ A glifozát-toleráns GM-fajták termőterületének növekedésével azonban egyre nagyobb problémát jelentett a génáramlás az azonos faj hagyományos fajtáira, abban az esetben, ha a farmer a hagyományos fajtákból, GMO-mentes termést vagy bioterméket akart előállítani. A legnagyobb konfliktust a GM-fajtákat használó és nem használó gazdák között a génáramlás és génmegszökés okozhatja a jövőben. Az USAban a GMO-t, így a GM-fajtákat és termékeiket jelenleg nem kell jelölni! 5/ A glifozát-toleráns GM-vetőmag 20-25 %-kal drágább a hagyományosnál. Ezzel szemben a hagyományos termés a nemzetközi kereskedelemben, a GMO-mentesség miatt 20-40 %-kal magasabb (prémium) áron adható el. Az 1-5. pontokban foglalt problémák miatt a herbicid (glifozát) toleráns GM-fajták termesztésének gazdaságossága az USA-ban folyamatosan csökkent. A kialakult helyzet arra kényszerítheti a gazdákat, hogy visszatérjenek a korábban alkalmazott gyomirtási technológiákhoz summázza a transzgénikus herbicidtoleranciával kapcsolatos 94 2013. május

érékelését az USA Nemzeti Tudományos Tanácsának 2010. évben publikált jelentése. A problémák megoldása érdekében széleskörű együttműködést sürgetett, a szabadalomtulajdonos cégek, az egyetemek, kutató és fejlesztő intézmények és a farmerek különböző szervezeteinek bevonásával. Az EU-ban ezek a problémák nem jelentkeztek, mert napjainkig egyetlen glifozát-toleranciával rendelkező GM-fajtának a termesztését sem engedélyezték. A következő részben a glüfozinát hatóanyagú herbicidet (Finale), és arra toleráns GM-fajták előállítását, valamint termesztésének tapasztalatait mutatjuk be. A kutatás a TAMOP- 4.2.2/B-10/1-2010-0011 A tehetséggondozás és kutatóképzés komplex rendszerének fejlesztése a Szent István Egyetemen c. pályázat támogatásával valósult meg. Hivatkozások National Research Council: 2010, The Impact of Genetically Engineered Crops on Farm Sustainability in the United States. Washington, DC: The National Academies Press. Duke S.O., Powles, S. B.: 2009, Glyphosate-Resistant Crops and Weeds: Now and in the Future. J. Agrobiotechnology Management & Economics 12/3-4, article 10. (http:// www.agbioforum.org/v12n34/ v12n34a10-duke.htm) Darvas B, Fejes Á, Mörtl M, Bokán K, Bánáti H, Fekete G, Székács A.: 2011, A glyphosate alkalmazásának környezet egészségügyi problémái. Növényvédelem 47 (9), 387-401. 2013. május 95