Biomolekuláris kölcsönhatások vizsgálata felületi plazmonrezonancia elvén működő Biacore keszülékkel
Biomolekuláris interakciók Fehérje-fehérje Fehérje-ligand Fehérje-DNS/RNS fehérje/ligand-lipid Alegység-kölcsönhatások, enzim-szubsztrát, enzim-inhibitor, domén-kölcsönhatások, antigén-antitest (epitóp térképezés) Farmakológiai vizsgálatok: hormon-receptor, receptor- agonista, receptor-antagonista enzim-kis molekula ( 200 Da) fehérje-kis molekula ( 200 Da) DNS/RNS-kötés kimutatása, DNS kötő régiók azonosítása Fehérjék/molekulák membrán asszociációja Milyen adatok jellemzik a kölcsönhatásokat? a kölcsönhatás kinetikája (k a és k d ) a kölcsönhatás erőssége: affinitás (K a =k a /k d vagy K d =k d /k a ) termodinamika ( G, H, S) a kölcsönhatás specificitása (kölcsönható régiók azonosítása)
Biomolekuláris interakciók kvantitatív vizsgálati lehetőségei Milyen módszerek léteznek? Analitikai ultracentrifuga (AUC) Izoterm kalorimetria (ITC) Előnyök és meghatározható jellemzők Biacore (SPR*-tecnika) (SPR*-tecnika: Surface Plasmon Resonance, felületi plazmon-rezonancia) molekulatömeg meghatározás homogenitás/tisztaság asszociációs állapot affinitás? kinetika? termodinamika? közepes mintaigény elsősorban makromolekulák elemzésére alkalmas affinitás (K a /K d ) termodinamika ( G, H, S) Hátrányok kinetika? nagymennyiségű mintát igényel kinetika (k a /k d ) affinitás (K a /K d ) termodinamika ( G, H, S) specificitása (kölcsönható régiók azonosítása) kismennyiségű mintát igényel a kölcsönható partnerek egyikének immobilizálása szükséges
Biomolekuláris interakciók Biacore vizsgálata Milyen kérdésekre kapunk választ a kölcsönhatást illetően? Mennyire specifikus? Milyen gyors? Mennyire stabil? Milyen a hatásos koncentráció? Jelen van-e egy adott molekula biomolekulák elegyében?
SPR detektálás elve Y + Y Immobilizált ligand Fényforrás Optikai detektáló egység Intenzitás Szög Rezonancia jel Szenzor-chip felület aranyréteggel Idő Minta Áramlási cella Szenzorgram
Rezonancia jel (kru) 18 Disszociáció 12 Asszociáció k a Kinetika k d Koncentráció Regenerálás 100 200 300 400 500 600 Idő (s)
Szenzor-chip felületek
Felépítésük Dextrán mátrix Arany réteg Üveg A dextrán mátrix minden chip felületén jelen van, kivéve a HPA, C1 chipeket. Előnyei: Hidrofil Flexibilis Kis mértékű nem-specifikus kötődés Magas kötő-kapacitás Kitűnő kémiai stabilitás
Sensor Chips CM4 and CM3 Sensor Chip CM4 Karboximetilált dextrán mátrix kisebb mértékű karboxilálással (a CM5-el össszevetve): kevésébé negatív és ezzel a nem-specifikus kötődés kisebb mértékű Sensor Chip CM3 Karboximetilált dextrán mátrix: a CM5-el azonos fokú karboxilálás, de kisebb méretű matrix. Sensor Chip C1 Sima karboximetilált felület Sejtekkel és vírusokkal történő munka esetén
A szenzorchipek felületén lejátszódó kémiai reakciók Sensor Chip CM5 amino- tiol-ligand felületi-tiol -aldehid Kovalens módosítás Karboximetilált dextrán mátrix Különböző funkciós csoportokkal módosítható Kitűnő kémiai stabilitás
Direkt Immobilizálási módszerek Indirekt analyte analyte analyte
1) 2) Elemzési formák jelnövelő molekula Direkt kötődés 3) 4) analyte Direkt kötődés jelerősítést eredményező molekulával kompetitív analyte analyte kompetitív ligand Gátlási vizsgálat az oldatban alkalmazott kompetitív liganddal Kompeticíó a felületen
Sensor Chip SA DNS fragmentum DNS kölcsönható molekulák biotin streptavidin Karboximetilált dextrán mátrixon streptavidint immobilizálnak Ideális biotinilált DNS fragmentumok kötésére és a nukleinsav kölcsönhatások elemzésére Alkalmas biotinilált szénhidrátok, peptidek, fehérjék és polinukleotidok immobilizálására
Sensor Chip NTA His-tag fehérje His-tag fehérjéhez kötődő molekula immobilizált nitrilo-triacetát (NTA) Karboximetilált dextrán mátrixon nitrilo-triacetátot (NTA) immobilizálnak, amelyhez Ni 2+ ionokat kötnek A Ni 2+ -komplex szabad vegyértékei által hexahisztidin peptiddel (Histag) expresszált fehérjék megkötésére képes A fehérjét megfelelő orientációban köti, lehetővé téve a kötőhelyek exponálását Könnyen regenerélható EDTA-val vagy EGTA-val
Lipid felület (egyrétegű) kialakítása Sensor Chip HPA membránhoz kötődő biomolekulák Sima hidrofób felület Lipid felület (egyrétegű) kialakítására alkalmas és lehetővé teszi membránhoz kötődő biomolekulák elemzését Alternativ módszer a membrán-asszociált molekulák szolubilizációs technikával történő vizsgálatának Receptorok kölcsönhatásának vizsgálata membrán-szerű környezetben vizes oldatban előforduló ligandokkal
Sensor Chip L1 Karboximetilált dextrán mátrixhoz lipofil molekulát kötnek Ez alkalmas liposzómák megkötésére úgy, hogy a lipid kettősréteg intakt marad Alkalmas lipid-fehéreje-ligand kölcsönhatások vizsgálatára ligand
Gyógyszerek membrán transzportjának vizsgálata Különböző transzport lehetőségek A legtöbb molekula által használt útvonal
Gyógyszerek membrán transzportjának vizsgálata Különböző összetételű liposzómákból lipid kettősréteget alakítanak ki Különböző gyógyszermolekulák eltérő kölcsönhatása a lipid kettősréteggel
Az anyagok lipid abszorpciójának mértéke Az anyagok lipid abszorpciójának osztályozása
Hogyan nyerhetjük vissza a kötődő komponens(eke)t miután a komplex létrejött? Ez szövetkivonatokból, eddig nem azonosított kötődő partnerek felismerésében és azonosításában fontos és egyben immunprecipitációt és pull-down kisérleteket helyettesíthet
KALMODULIN IZOLÁLÁSA NAGY AFFINITÁSÚ KÖTŐDŐ PEPTIDDEL
KALMODULIN IZOLÁLÁSA NAGY AFFINITÁSÚ KÖTŐDŐ PEPTIDDEL a minta injektálása mosás visszanyerés visszanyert minta
A visszanyert minták tömegspektrometriás elemzése A tisztított mintából visszanyert fehérje spektruma A teljes agy extrakt spektruma A agy extrakt kötődése után visszanyert fehérje spektruma
A agy extrakt kötődése után visszanyert fehérje tripszines emésztése után kapott peptidek spektruma
Biomolekuláris interakciók feltárása Biacore készülékkel Fehérje-fehérje Alegység-kölcsönhatások, enzim-szubsztrát, enzim-inhibitor, domén-kölcsönhatások, antigén-antitest (epitóp térképezés) a kölcsönhatás kinetikája (k a és k d ) Fehérje-ligand Farmakológiai vizsgálatok: hormon-receptor, receptor- agonista, receptor-antagonista enzim-kis molekula ( 200 Da) fehérje-kis molekula ( 200 Da) Fehérje-DNS/RNS Fehérje-ligand-lipid DNS/RNS-kötés kimutatása, DNS kötő régiók azonosítása Fehérjék/molekulák membrán asszociációja a kölcsönhatás erőssége: affinitás (K a =k a /k d vagy K d =k d /k a ) termodinamika ( G, H, S) a kölcsönhatás specificitása (kölcsönható régiók azonosítása) kölcsönható patrner azonosítása lizátumból