PhD értekezés A titin PEVK domén aktinkötő és mechanikai tulajdonságai Nagy Attila Pécsi Tudományegyetem Általános Orvostudományi Kar Biofizikai Intézet Pécs 2006
A program megnevezése: Programvezető: Az alprogram megnevezése: Alprogramvezető: Biokémia és molekuláris biológia Dr. Sümegi Balázs Funkcionális fehérjedinamika vizsgálata biofizikai módszerekkel Dr. Somogyi Béla Témavezető: Dr. Kellermayer Miklós S. Z.
If the doors of perception were cleansed everything would appear to man as it is: Infinite. Ha az észlelés kapui tiszták lennének, az ember mindent olyannak látna, amilyen valójában: Határtalannak. William Blake 3
Köszönetnyilvánítás Köszönetet szeretnék mondani mindazoknak, akik segítettek e munka elvégzésében. Mindenekelőtt és mindenek fölött köszönettel tartozom ifj. Dr. Kellermayer Miklósnak támogatásáért, tudásáért, barátságáért, türelméért és emberi példamutatásáért. Köszönöm Dr. Somogyi Béla Professzor Úrnak, hogy PTE ÁOK Biofizikai Intézetében dolgozhatok, köszönöm őszinte és kiváló kritikáit. Köszönöm Intézetünk minden dolgozójának önzetlen segítségét és értékes észrevételeit. Köszönöm Kutatócsoportunk minden tagjának a remek, családi légkört és a barátságot. Köszönöm Hoffmanné Simon Évának a mindennapi kiváló segítséget. Köszönöm Édesanyámnak és Édesapámnak. Köszönöm Clara Anderson Schollnak. Köszönöm barátaimnak, Dr. Kovács Mihálynak és Mártonfalvi Zsoltnak. 4
Tartalomjegyzék 1. Bevezetés és irodalmi áttekintés... 7 1.1. A titinkutatás története... 7 1.2. A titin a szarkomerben... 9 1.3. A titin szerkezete... 10 1.4. A titin génjének szerkezete... 16 1.5. A titin szerepe... 18 1.6. A titin kölcsönhatása szarkomerikus fehérjékkel... 21 1.7. A titin rugalmassága... 23 2. Célkitűzések... 27 3. Alkalmazott anyagok, módszerek, elméleti számítások... 28 3.1. A humán vázizom PEVK-darabok klónozása, expressziója és tisztítása... 28 3.2. Fehérjepreparálás... 29 3.3. In vitro motilitási próba... 29 3.4. Szilárd felszínhez való kötődési próba (solid-state surface binding assay) és aktinkeresztkötési próba... 30 3.5. Aktin-PEVK koszedimentáció vizsgálat... 30 3.6. A miofibrillumok előállítása, jelölése és vizualizálása... 30 3.7. Steady-state aktin-aktivált ATP-áz mérés... 31 3.8. Kémiailag módosított üvegfelszín kialakítása egyedi molekula manipulációhoz... 31 3.9. Atomerő-mikroszkópia... 31 3.10. Az erő - megnyúlás görbék kiértékelése... 32 3.1.1 Immun-elektronmikroszkópia... 33 3.12. A PEVK domén, mint polielektrolit lánc... 33 4. Eredmények... 35 4.1. A PEVK szakasz klónozása és expressziója... 35 4.2. A PEVK kölcsönhatása aktinnal... 36 4.2.1. A PEVK szegmensek kölcsönhatása aktinnal... 36 4.2.2. A PEVK fragmentumok kölcsönhatása aktinnal... 40 4.3. A PEVK szegmensek egyedi molekula mechanikája... 44 5
5. Megbeszélés... 52 5.1. A titin PEVK domén aktinkötése... 52 5.2. A titin PEVK domén elasztikus tulajdonságai... 57 6. Kísérleteink alapján levonható legfontosabb következtetések... 62 7. Összefoglalás... 63 8. Rövidítések jegyzéke... 66 9. Hivatkozott irodalom... 67 10. Az értekezés témakörébe tartózó közlemények... 76 10. Az értekezés témakörébe tartózó közlemények... 76 10.1. Az értekezés témakörébe tartózó saját, eredeti közlemények... 76 10.1.1. Eredeti közlemények... 76 10.1.2. Referált folyóiratban megjelent absztraktok... 76 10.1.3. Egyéb absztraktok... 77 10.2. Értekezéshez nem kapcsolódó egyéb közlemények... 79 10.2.1. Eredeti közlemények... 79 10.2.2. Referált folyóiratban megjelent absztraktok... 80 10.2.3. Egyéb absztraktok... 80 6
1. Bevezetés és irodalmi áttekintés Az izomkutatás nem ok nélkül nagy népszerűségnek és tudományos érdeklődésnek örvendő terület. Izomkutatás alatt azonban legtöbben az aktin és miozin kölcsönhatásának részletes vizsgálatát értik. Ha azonban csak egy fél lépéssel messzebbről vesszük szemügyre a harántcsíkolt izmot, és igyekszünk megérteni annak működését, rá kell csodálkoznunk e szövettípus hihetetlen rugalmasságára. Az izmot, annak tönkretétele nélkül több mint kétszeresére nyújthatjuk. Ez a dolgozat a harántcsíkolt izom rugalmas tulajdonságát biztosító legfontosabb fehérje, a titin működését mutatja be. 1.1. A titinkutatás története. A harántcsíkolt izom működési egységének, a szarkomer szerkezetének vizsgálata immár több mint fél évszázados múltra tekint vissza. Az első, két filamentum rendszerből építkező szarkomer modellt Huxley és Hanson, valamint Huxley és Niedergerke alkotta meg [1-3]. E modell jól magyarázta az izom számos, aktív összehúzódás, kontrakció során mutatott viselkedését, ám az is hamar kiderült, hogy nem magyarázza az izom passzív rugalmas tulajdonságait. Az izomrostok eredeti hosszuk mintegy kétszeresére nyújthatók anélkül, hogy a szarkomerben fennálló szerkezeti rend megbomlana. A megnyúlás közel egyenletes az izomrost mentén, és az egyes szarkomerek relatív hosszváltozása közel azonos. A megnyúlás során az izomban ellenállás, ún. passzív izomerő fejlődik, amely a nyújtó hatás megszűnte után helyreállítja az izom nyugalmi hosszát. Az is egyértelmű volt, hogy húzás közben fejlődő passzív izomerő nem a vastag és vékony filamentumok kölcsönhatása révén jön létre, mivel a nagymértékben túlnyújtott rostokba ezek már nem fednek át. Az 1950-1960-as években végzett elektronmikroszkópos munkák [4-6] alapján levonható következtetés az volt, hogy a szarkomerben léteznie kell egy harmadik 7
filamentumrendszernek is [7-9]. Túlnyújtott izomrostokról készült felvételen az volt látható, hogy a vastag filamentumok végéből vékony, alig látható szálak indulnak ki a vékony filamentumok irányába (1. ábra). Ezeket a fehérjéket gap vagy rés filamentumoknak nevezték el. I-szakasz 1. ábra. Vázizom szarkomer az aktin filamentumok szelektív eltávolítása után. A vastag filamentumok végét a szarkomert lezáró Z-vonallal összekötő rugalmas filamentumok az aktin-mentes I-szakaszban figyelhetők meg [10]. A harántcsíkolt izom elasztikus tulajdonságainak vizsgálata során Maruyama és munkatársai különböző extraháló oldatokkal sorban vonták ki a rostból a fehérjéket. Végül egy olyan frakciót nyertek, amely nagyon ellenálló volt az extraháló oldatokkal szemben, és oldhatatlan, fehérje alapú gélt alkotott [11]. A gélből kivonható legnagyobb fehérje a connectin nevet kapta [12]. Ugyenezen az úton haladva a Szent-Györgyi laborban dolgozó Guba Ferenc írta le elsőként a fibrillin nevű fehérjét, amely ugyanaz a fehérje volt, mint Maruyama és munkacsoportja által izolált conectin [13, 14]. Wang és munkatársai ugyanebben az időben filamin-szerű fehérjék után kutattak gerinces harántcsíkolt izomrostban. Filamint nem sikerült találniuk, de a legnagyobb, megadaltonos mérettartományba eső fehérjét titinnek nevezték el [15]. Ma már tudjuk, hogy Maruyama és Wang egymástól függetlenül, közel egy időben ugyanarra a fehérjére találtak. A titinkutatás első tíz esztendejének egyik legfontosabb eredménye az volt, hogy sikerült igazolni az óriásmolekula létét, valamint pontosan meghatározni elhelyezkedését a szarkomeren belül. A titin élettani szerepének vizsgálata terén is fontos tényekre derült fény: bizonyított és elfogadott lett, hogy az izom passzív rugalmasságáért elsősorban a titin felelős. 8
A titin az izom szerkezeti és működési egységében, a szarkomerben található. 1.2. A titin a szarkomerben A titin a vékony és vastag filamentumok között, azokkal párhuzamosan helyezkedik el. A molekula N-terminálisa a Z-vonalhoz, míg C-terminálisa az M-csíkhoz rögzül, így a titin a szarkomer felét, mintegy 1 µm-nyi távolságot hidal át [16] (2. ábra). A titin N-terminális vége a Z-csikhoz erősen rögzül. A titin molekula 60-80 kda tömegű szakasza a Z-vonalban pányvázódik ki. Két, szomszédos szarkomerben található titin ezen a szakaszon átfed. Ilyen módon a titin molekulák egy, a szarkomerek során, az egész filamentum hosszában végigfutó molekulaláncolatot alkotnak. Z-vonal M-vonal Z-vonal titin miozin aktin I-szakasz A-szakasz 2. ábra. A titin elhelyezkedése a szarkomerben. A Z-vonalban a titin kapcsolatot létesít a telethonin (másik nevén titin-sapka, vagy T-cap), valamint az alfa-aktinin fehérjékkel. Irodalmi adatok szerint ezek a fehérjék végzik a titinmolekula N-terminálisának Z-vonalhoz való kipányvázását és a titin molekulák hosszirányú keresztkötését [17]. A C-terminálisok kapcsolata nagy hasonlóságot mutat az N-terminálisokéval. A titin ezen végei az M-vonalak területén fednek át [17]. Az A-szakaszban a titin mintegy 2 MDa nagyságú része található. Ebben a szakaszban a titin és a vastag filamentum kölcsönhatása igen erős. Minden egyes vastag filamentumhoz, 9
helyesebben a vastag filamentum M-vonaltól Z-vonal felé mutató feléhez hat titinmolekula kapcsolódik [18, 19]. Az I-szakaszban (szövettípustól, illetve titin izoformától függően) a titinnek egy kb. 0,8-1,5 MDa közötti tömegű része található. Ebben a szakaszban a titin kölcsönhatása a vékony filamentummal jóval rugalmasabb és érdekesebb, mint az A-szakaszban a vastag filamentummal. Ez a szakasz létesít rugalmas kapcsolatot vastag filamentumok végei és a Z- vonalak között. A titin I szakeszbeli szegmense a molekula talán legizgalmasabb, így legintenzívebben kutatott részlete. A titin szerkezetét tekintve ezen a szakaszon igen változatos [20]. A molekula I-szakaszbeli része három szegmensre osztható. A vastag filamentumok végétől számított 0,1 µm hosszú szakaszon a titin molekulák hosszuk mentén több molekulából felépülő kötegekké ( end filament ) kapcsolódnak össze [21]. A Z-vonal közepétől számított 0,1 µm-es szakaszon a titin molekulák a vékony filamentumokhoz kapcsolódnak [22, 23]. A két szakasz között a kötegek különálló molekulákká válnak szét [24]. A titin mechanikai sajátságait, szarkomerben betöltött szerepét úgy érthetjük meg, ha részletesen megvizsgáljuk a molekula szerkezetét. 1.3. A titin szerkezete A titin szélsőségesen moduláris felépítésű fehérje. A 3.0-3.5 MDa tömegű fehérjének mintegy kilencven százaléka klasszikusnak nevezhető építőelemekből, immunglobulin- és fibronektin típusú egységekből épül föl. Az egységek elrendeződése nagy szabályszerűséget mutat. Induljunk el a titin N-terminálisa felől, és vizsgáljuk meg e hatalmas molekulát! A Z- vonalban a titin 45 aminosav hosszúságú egységekből (Z-repeat) áll, amelyek hét másolatban 10
találhatóak meg a molekula ezen szakaszán. A Z-repeat egységei nagy (45 %) szekvencia homológiát mutatnak [25]. A titin Z-vonalban található részének a szerepe a molekula N- terminálisának biztos, erős rögzítése a szarkomert határoló vonalhoz. A C-terminális felé haladva a titin következő szakasza a szarkomer I-szakaszára esik (3. ábra). Talán ez a molekula legizgalmasabb szakasza, de annyit mindenképp elmondhatunk, hogy a titin megnyújthatóságának szerkezeti alapelemei ebben a szakaszban találhatóak. A titin I-szakaszbeli része izomtípustól függően igen különböző méretű lehet. E funkcionálisan elasztikus szakaszt három részre oszthatjuk (3. ábra). A Z-vonaltól távolabb eső (disztális) tandem Ig szegmensre, a Z-vonalhoz közelebbi (proximális) Ig-régióra, és az e kettő által közrefogott, egyedi szekvenciákból felépülő szakaszra (3. ábra). Ez utóbbi tovább osztható az Ig-domének és egyedi szekvenciák váltakozó sorozatából felépülő N2 régióra, valamint PEVK szegmensre. Proximális tandem Ig-régió N2A PEVK Disztális tandem Ig-régió Z I-szakasz A-szakasz M 3. ábra. A titin I-szakaszbeli részének felépítése és elhelyezkedése a szarkomerben. Tekintsük át az Ig-régiót, az N2 és a PEVK-szakaszok felépítését részletesen! A proximáis és a disztális Ig-régiót a fehérjék világában egyik leggyakrabban előforduló strukturális modul, az Ig-domén ismétlődései alkotják. Labeit és munkatársai a titin cdns szekvenciájának elemzése alapján megállapították, hogy az I-szakaszt zömmel 90-100 aminosav hosszúságú egységek építik fel [26]. A szekvencia-homológia alapján előbb a C2- [27], később az I-típusú [28] immunglobulin (Ig) doménként azonosították az egységeket. Az 11
immunglobulin egységek térszerkezetének vizsgálata azt mutatta, hogy ezek mindegyike stabil globuláris domént alkot, amelyet hét antiparallel béta-lemez épít fel (4. ábra) [29, 30]. 4. ábra. A titin egyik immunglobulin (I27) doménjének szerkezete A titin I-szakaszában található N2 régió Ig-doménekből és stabil másodlagos szerkezettel nem rendelkező szekvencia részletekből áll. A legismertebb és funkcionális szempontból is legfontosabbnak tartott egyedi szekvencia a titin I-szakaszbeli részében található PEVK szegmens, amely nevét a több mint 70%-át kitevő prolin (P), glutaminsav (E), valin (V) és lizin (K) aminosavakról kapta. Labeit és Kolmerer modellje szerint [31], a PEVK szegmensben található nagyszámú, fiziológiás ph-n töltött aminosav oldallánc megakadályozza stabil másodlagos szerkezet kialakulását. A viszonylag rövid szakaszon elhelyezkedő, nagy számú töltött aminosav-oldallánc egymásra gyakorolt vonzó és taszító hatása következtében a PEVK-szegmens a feltetelezések szerint nem rendelkezik stabil másodlagos szerkezettel [31]. NMR és CD-spektroszkópiás mérésekkel a PEVK doménben a random szerkezet mellett sikerült kimutatni rövid életidejű, egymásba könnyen átalakuló másodlagos szerkezeti elemeket, poliprolin hélixet, β-redőt [32], azonban a PEVK szakasz másodlagos szerkezetét illetően még sok a nyitott kérdés. A titin I-szakaszbeli része izomtípustól függően igen különböző lehet. Érdekes tény, hogy a titint egyetlen gén kódolja. A génben található exonok száma hatalmas: 363 [33].. A génről alternatív splicing révén, szövettípustól függően különböző méretű tömegű és szerkezetű titin izoformák fejeződnek ki. 12
A disztális tandem Ig régió konstitutívan fejeződik ki, azaz az egyes izoformákon belül mindig ugyanolyan. A differenciálisan kifejeződő proximális Ig-régió és a PEVK szakasz hossza izoformánként változó (5. ábra) [34, 35]. Az 5. ábra a titin alternatív splicing révén kifejeződő I-szakaszbeli régiójának moduláris szerkezetét mutatja. Az egyes izoformák közötti különbségek az egyes izoformák között igen nagyok. A vázizomban 53 Ig doménnel több alkotja a proximális Ig-régiót, mint szívizomban. Az eltérés az egyes izoformák között talán a PEVK szakasz tekintetében a legszembeötlőbb. A m. soleus izoformában található PEVK szakasz 2174 aminosav hosszúságú, míg a szívizomban mindössze 163 aminosav alkotja e rendkívül érdekes molekula - részletet (5. ábra). Az egész titinre jellemző modularitás még a stabil másodlagos szerkezettel nem rendelkező PEVK szakasz esetén is megmutatkozik. Két fő szekvencia motívumot különböztetünk meg a PEVK szakaszban: a PPAK és a polye motívumokat. Az átlagosan 28 aminosav hosszúságú PPAK motívumokban a bázikus oldalláncú aminosavak dominálnak, míg a polye szekvenciában savas oldalláncú glutamátok [36]. Az N2A és N2B egyedi szekvenciák közül vázizomban általában az N2A forma található meg, míg a szívizom titin izoformák tartalmazhatják az N2B, vagy együttesen az N2A és N2B változatokat. Az titin szövetről szövetre eltérő méretben, és eltérő domén összetétellel expresszálódik. Az egyes izoformák más és más fizikai paraméterekkel (nyújthatóság, hajlítómerevség) rendelkeznek, így a titin nagy mértékben képes befolyásolni az egyes harántcsíkolt izomtípusok merevségét, nyújtással szemben mutatott ellenálló képességét. 13
Vázizom N- m. soleus izoforma -C m. psoas izoforma Proximális Ig régió N2A PEVK Disztális Ig régió N- -C Szívizom N2BA izoforma N- -C N- N2B izoforma N2B -C PEVK szegmens Egyedi szekvencia Ig - domén Z - sorozat 5. ábra. A titin I-szakaszbeli régiója különböző harántcsíkolt (vázizom és szívizom) izmokban [37]. Továbbhaladva a titin mentén a C-terminális irányába a következő szakasz a szarkomer A-szakaszába eső molekula darab. A titin A-szakaszbeli része konstitutívan expresszálódik, azaz minden szövettípusban ugyan olyan. A titinnek ezen szakasza szabályos, moduláris felépítésű. A titin A-szakasza a már korábban bemutatott immunglobulin doménekből, 14
valamint fibronektin (FnIII) típusú doménekből áll. Az FnIII domének szerkezete nagy hasonlóságot mutat az immunglobulinok felépítésével (6. ábra). Erre a doménra is jellemző a béta-lemezekből álló struktúra és a nagyfokú szekvencia homológia. Csakúgy, mint az immunglobulin domének, a fibronektin típusú szerkezeti elemek is igen gyakoriak a fehérjékben. Az átlagosan 100 aminosavból felépülő béta-hordó szerkezetű domének együttes száma egy titin molekulában eléri a körülbelül háromszázat [27]. 6. ábra. A titin egyik fibronektin (A1) doménjének szerkezete Az A-szakasz N-terminális végéhez közel található D (disztális) - szakasz egy 7 domén hosszúságú mintázat (Ig-Fn-Fn-Ig-Fn-Fn-Fn) hatszori ismétlődéséből áll (7. ábra). Az ezt követő C-zónát egy tizenegyszer ismétlődő, 11 domén hosszúságú sorozat (Ig-Fn-Fn-Ig-Fn- Fn-Fn-Ig-Fn-Fn-Fn szuper-sorozat (super-repeat)) alkotja. A P (proximális) zóna kapcsolja a titint az M-csíkhoz, valamint ezen a részen található a titin kináz domén (7. ábra). 15
D-szakasz C-szakasz P-szakasz N- -C M - vonal Ig - domén Egyedi szekvencia Fn - domén Kináz domén 7. ábra. A titin A-szakaszbeli régiója [17]. A titin A-szakaszának rendezett szerkezete vetette fel azt a lehetőséget, hogy ez a szakasz molekuláris sablonként segíti a vastag filamentum felépülését. 1.4. A titin génjének szerkezete A titint egyetlen gén kódolja. A titin génje nagyon konzervatív: az összes gerinces genetikai állományában megtalálható, és igen kicsi varianciát mutat. Ember esetében a titin génje a 2. kromoszóma hosszú karján, a 2q31 régiójában található [26, 38, 39]. Már a humán genom szekvenciájának meghatározását célzó kutatások kezdeti szakaszában ismert volt, hogy a titin génjét legalább 174 exont tartalmaz, köztük az addig ismert legnagyobb, 17 kb-os emberi exon. A későbbiek során felnőtt humán szív- és vázizomban [27], valamint fötális [32] harántcsíkolt izmok cdns-ének vizsgálata során újabb 100 exonra bukkantak, amelyek mindegyke PEVK szakaszt kódolt. A PEVK sajátos kodonhasználata és rendkívül kicsi mérete (70-100 bp) miatt a Humán Genom Project kezdeti szakaszában rejtve maradtak a kutatók elől. Mai tudásunk szerint a titin génje (AJ277892.2) egy hatalmas, 280 kb hosszú szakaszon helyezkedik el, mely 363 exont tartalmaz. 16
Pár szóban tekintsük át az egyes titin izoformákra jellemző exon shuffling útvonalakat és exon összetételt. A Z-vonalban található titin részletet (8.-14. exonok), amely kölcsönhatásban áll az alfa-aktininnel és vélhetőleg az aktinnal [40, 41] hét darab (Z-repeat), egyenként 45 aminosavat kódoló exon kódolja. Mind a hét Z-egység kizárólag ez emlősök szívében expresszálódó titin izoforma esetén található meg, míg más szövettípusokban lévő titinek esetén ezekből 1-3 egység hiányzik [42]. Régóta ismert tény, hogy a Z-vonal szélessége izomtípustól függően változik, és nagyon kecsegtető az a hipotézis, hogy a Z-vonal szélességét épp a Z-ismétlődések (Z-repeatek) száma határozná meg [25]. Az I-szakasz (49. - 224. exonok) lehetséges splicing útvonalait korábban már említettük. A 49. exon a szívizom N2B elemét kódolja, az 50. 101. exonok a tandem Ig- régió exonjai. A 102. 108. exonok az N2A szakasz exonjait, melyeket a PEVK szakasz exonjai (109. 224.) követnek [33]. A PEVK exonok többsége PPAK motívumokat kódol és csak 10 exon tartalmazza a polye szakaszok aminosav sorrendjét. Az egyes titin izoformák szövetspecifikus kialakulása során ez a régió (49. 224. exonok) játsszák a legfontosabb szerepet, tulajdonképpen ezen exonok shufflingja során alakulnak ki a különböző titin molekulák. A szarkomer A-szakaszában, valamint az M-vonalban lévő titin régió nagyon konzervatív, minden titin izoforma estén ugyan olyan. Egy exon, a 362. mégis említésre méltó, mivel ez az exon kódolja azt a molekulaszakaszt, amely calpaint (calpain 3, vagy p94) köt. Ez az exon minden szív-specifikus titin izoformában megtalálható, míg a vázizmok esetében hiányozhat [43]. A calpainnak fontos szerepet tulajdonítanak a szignál- transzdukcióban, amely a befolyásolhatja a szövetekben expresszálódó titin izoformák összetételét, így az izom mechanikai, passzív rugalmas tulajdonságainak finomhangolásában játszhat fontos szerepet. A titin szerkezetének bemutatása után vizsgáljuk meg, mi is a titin szerepe a szarkomerben. 17
1.5. A titin szerepe Az elhelyezkedés alapján a titint két részre, egy funkcionálisan rugalmatlan, valószínűleg vastag filamentumot szervező szerepet betöltő A-szakaszbeli és egy rugalmas I-szakaszbeli részre osztottuk fel. A titin biztosítja az izom passzív, nem a vastag és vékony filamentum, vagy azok kölcsönhatása révén kialakuló rugalmasságát. E tény már a régóta ismert. Bizonyítása igen elegáns: a titin ionizáló sugárzással történő degradációja nyomán az izomrostokban fellépő passzív feszültség jelentősen csökkent [44]. A titin másik igen fontos funkciója lehet az A-szakasz illetve az M-vonal centrálása az izomösszehúzódás során. Ez azért nagyon fontos, hogy az összehúzódás illetve a a megnyúlás során az egyes szarkomereket egyforma terhelés érje [45]. Ismét haladjunk a molekula mentén az N-terminális felől a C-terminális irányába! A titin Z-vonalbeli szakaszának szerepe lehet a Z-vonal szerkezetének kialakításában [40, 46]. A titin ezen részében 45 aminosav hosszúságú motívumok (Z-sorozat, Z-repeat) ismétlődnek, amelyek kötődnek az alfa-aktininhoz. A Z-repeatek száma változik, valamint változó számuk korrelációt mutat a Z-vonal szélességével. A Z-vonal szélessége változó: jellemző módon gyors izmokban keskeny, lassú izmokban pedig széles, feltehetően a nagyobb szilárdság biztosítása érdekében. A titin rugalmasságának titka a molekula I-szakaszbeli részében rejtezik. A Z-vonal közelében a titinmolekulák a vékony filamentumokhoz kapcsolódnak [22, 23], így csak a fennmaradó rész megnyújtható. Az különböző szövettípusokban, az exon shuffling mechanizmusok következtében ezen szakasz hossza igen változatos. Labeit és Kolmerer szerint épp e szakasz variálhatósága biztosítja a különböző izom típusok eltérő rugalmas sajátosságait [27, 34]. Ismert tény, hogy az izom passzív rugalmassága összefüggésben van a titin I-szakaszának hosszával, domén összetételével és nyújthatóságával [47]. Például bizonyos fajok szívizmában két titin izoforma expresszálódik: az N2B szekvenciát tartalmazó N2B titin és az N2A és N2B szekvenciákat egyaránt tartalmazó N2BA titin[27]. A két izoforma az egyes szarkomerekben együtt, keverve van jelen, arányuk azonban eltérő. A 18
túlnyomórészt N2B izoformát (rövidebb egyedi, másodlagos szerkezettel nem rendelkező, így igen elasztikus szakasz) expresszáló izomsejtek passzív rugalmassága kisebb, mint a túlnyomórészt N2BA (hosszabb elasztikus szakasz) titint expresszáló sejteké [47]. A szívizomban expresszálódó titin izoformák aránya betegség hatására megváltozhat, ám eddig nem sikerült egyértelmű összefüggést találni egyes kórképek és a titin expressziójának megváltozása között [48] [49, 50]. A titin A-szakaszban található része fiziológiás körülmények között nyújthatatlan. E nyújthatatlanság oka valószínűleg az, hogy a titin szoros kölcsönhatásban áll a vastag filamentumokkal [51]. A már említett mintázatosság (repeatek) szerepe abban állhat, hogy ez a szakasz periodikusan, szabályos ismétlődésekben elhelyezkedő kötőhelyeket biztosít a miozin és más A-szakaszbeli fehérjék számára [52]. Érdekes tény, bár nem döntő bizonyíték, hogy az A-szakaszbeli titin 11 domén hosszúságú mintázata 43 nm-enként ismétlődik, és a vastag filamentumon belül a miozin fejek egy olyan helikális struktúrát alkotnak, amelynek menetemelkedése szintén 43 nm. talán nem túlzó az a feltételezés, hogy az A-szakaszban a titin egyfajta állványként szolgál a vastag filamentum szabályos szerkezetének és pontos hosszának kialakulásakor. Miben állhat a titin szarkomer szerkezetét meghatározó szerepe? Elsősorban tekintsük át, mit tudunk a titinről e tekintetben. Tudjuk, hogy a szarkomer kialakulásakor a titin az első fehérje, amely beépül a miofibrillumba. Tudjuk, hogy kölcsönhat nagyon nagy számú szarkomerikus fehérjével. Tudjuk, hogy szövettípustól függően a titin szerkezete, mérete és rugalmas tulajdonságai mások és mások [53]. Figyelembe véve a fenti tényeket nagy biztonsággal kijelenthetjük, hogy a titinnek igen fontos szerep jut a szarkomer szinte kristályos szabályosságának kialakításában, valamint az izom rugalmasságának finomhangolásában. A titin kolokalizálódik a kromoszómákkal [54], ám e kölcsönhatás szerepe egyelőre nem tisztázott. Figyelembe véve a titin izomban betöltött szerepét, talán a kromoszómák mechanikai stabilitását biztosítja [55-57]. Granzier és Labeit kutatási eredményei azt mutatják, hogy a titin szívizomban befolyásolja az aktomiozin kölcsönhatást, valamint 19
egyelőre nem ismert mechanizmusok által szabályozza a szarkolemmában található ioncsatornák permeabilitását, valamint köze lehet a génexpresszió szabályozásához [37]. A titinnek fontos szerep jut a szarkomer integritásának fenntartásában. Horowits és munkatársai eredményei azt mutatják, hogy a titnnek fontos szerep jut a szarkomer szimmetriájának fenntartásában az izomösszehúzódás során, illetve e munkacsoport bizonyította először, hogy az izom passzív rugalmasságát a titin biztosítja [44, 45, 58]. A titin A-szakaszában található egy kináz domént. Ismert tény, hogy ezen kináz szubsztrátja a Z-vonalban található telethonin [59]. Enzim és szubsztrátja között ily módon hatalmas, relaxált izom esetén is mintegy 1 µm-nyi távolság van. Nem ismerjük a választ arra a kérdésre, hogy mi lehet a szerepe a kináznak, illetve a telethonin foszforilációjának. Kináz és szubsztrátja kizárólag fejlődő miocitákban találkozhat, ahol a miofibrillumok kialakulásának korai szakaszában a titin C-terminális része és a T-cap kolokalizációját figyelték meg. Feltételezések szerint a telethonin foszforilációja elengedhetetlen a szarkomer szerkezetének kialakulásához [17]. Titin nem csak a harántcsíkolt izmokban található. Az óriásmulekula megtalálható a simaizmokban is [60, 61]. A simaizmokban a vastag filamentumok szerkezete gyökeresen eltér a harántcsíkolt izomban található vastag filamentumokétól, így a titin és a vastag filamentum kölcsönhatása is más, jóval dinamikusabb jellegű, mint a harántcsíkolt izomszövetekben [62]. A titin tehát nagyon sokféle fehérjével létesít kapcsolatot. Tekintsük át, hogy melyek ezek a fehérjék, és hogy mi lehet a kölcsönhatás szerepe. 20
1.6. A titin kölcsönhatása szarkomerikus fehérjékkel Bár a titin szerkezete már jól ismert, igen keveset tudunk a titin más fehérjékkel való kölcsönhatásairól. Elsősorban tekintsük át, milyen ismeretekkel bírunk a titin vastag és vékony filamentumokkal való kölcsönhatásával kapcsolatban. Immun-elektronmikroszkópos módszerekkel és monoklonális antitestek használatával sikerült igazolni, hogy a szarkomer A-szakaszában a titin a vastag filamentum szerves részét alkotja. Még nem tudjuk pontosan, hogy a titin a vastag filamentum felszínén fut vagy teljesen megbújik a miozin molekulák között, ám az antitestekkel végzett kísérletek eredményei arra engednek következtetni, hogy az első lehetőség a valószínűbb. Az arányokat illetően scanning transzmissziós elektronmikroszkópos [18] és gélelektroforézis [19] analízissel végzett kutatások azt mutatják, hogy a hat titin molekula fut egyetlen fél-vastag filamentumban, tehát hat molekula titin húzódik egy vastag filamentumon belül az M és a Z- vonal között. A titin a szarkomer I-szakaszában kötődik az aktinhoz [63-65]. A Z-vonal közelében mintegy 100 nm hosszan a titin N-terminális része igen erős kölcsönhatást alakít ki a vékony filamentummal [66]. A titin a szarkomer A-szakaszban lévő részében található bizonyos fibronektin- és immunglobulin doménekről is kimutatták, hogy kötődnek az aktinhoz, azonban a jelenség fiziológiás szerepe nem tisztázott [67]. A titin szarkomerben betöltött szerepének alapos megismeréséhez elengedhetetlen a titinnel kölcsönható fehérjék pontos ismerete. Dotblot assay-k segítségével sikerült bizonyítani, hogy a titin kölcsönhatásba lép a miozinnal és a MyBP-C-vel [68, 69]. Élesztő két-hibrid rendszer alkalmazásával több, a titinnel kölcsönhatást mutató fehérje is horogra akadt. Ilyenek a fehérjék szarkomerben való kicserélődésében szerepet játszó P94/calpain-3, a kálium csatornák működését befolyásoló T-cap/telethonin és a MinK, a szarkoplazmatikus retikulum helyzetét meghatározó sank-1 és obscurin, a metabolikus enzimek kompartmentalizációjáért felelős DRAL/FLH-2, a génexpresszió szabályozásában résztvevő 21
izom LIM fehérje (MLP), vagy a szívspecifikus ankyrin repeat protein (CARP) és az ankyrinrepeat domain-2 (Ankrd2). Ezen fehérjék a titinnel való kölcsönhatásnak a helye nem random a molekula hosszában, hanem találhatunk bizonyos forró pontokat, ahová több molekula is kapcsolódhat. Ilyen forró pont a Z-vonalban található titin részlet, vagy az I-szakaszbeli titin. Ezekben a forró pontokban bizonyos funkciókat együttesen, mintegy komplexben betöltő fehérjék kötőhelyeit találhatjuk. A forró pontok kommunikálnak egymással. Például, a T-cap a Z-vonal közelében és az M-vonalban is kötődik a titinhez, így hírvivő szerepet tölthet be [70]. Ehhez hasonlóan, a calpain-3 képes kötődni az M-vonalban található titin régióhoz és az I- szakaszbeli titinhez is. Az izom hosszú ideig tartó megfeszítettsége az Ankrd2 [71] és a CARP [72] expressziós szintje megemelkedik. Ezen fehérjék a szarkomerben lévő más fehérék expresszióját szabályozzák. Azt még nem tudjuk pontosan, hogy mi a feszültséget érzékelő szenzor. Ha figyelembe vesszük azonban, hogy mindkét fehérje kötődik a titinhez, amely egyértelműen együtt nyúlik a szarkomerrel, joggal feltételezhetjük, hogy a titin lehet ez az egyelőre ismeretlen és fontos érzékelő fehérje. A titin funkciójában nagyon fontos szerepe lehet a PEVK aktin asszociációnak. A szívizomban található titin izoforma PEVK szakasza kötődik az F-aktinhoz [73, 74]. Ezt a kölcsönhatást a Ca 2+ /S100 fehérje szabályozza [75]. A vázizom PEVK C-terminálisa kötődik ugyan az aktinhoz, de jóval kisebb látszólagos affinitással, mint az említett, szívizomban található PEVK [74]. Megjegyzendő, hogy a vázizomban található titin izoforma PEVK domén C-terminálisának utolsó 163 aminosava megegyezik a szívizom-titin PEVK szekvenciájával. A PEVK szegmens aktinkötésének pontos mechanizmusa és kötés fiziológiai szerepe még nem ismert. Nem tudjuk, hogy ennek a kölcsönhatásnak szabályozó vagy miofibrillum mechanikai sajátságát meghatározó (esetleg mindkettő) szerepe van-e. A PEVK domén és az aktin közötti kölcsönhatás pontos megismerése ezért nagyon fontos a titin illetve a PEVK domén szarkomerben betöltött szerepének megértése érdekében. A titin számos fehérjével lép kölcsönhatásban, ám elsősorban és alapvetően rugófehérje. Tekintsük át a titin rugalmasságának molekuláris alapjait. 22
1.7. A titin rugalmassága A titin molekuláris rugó, amely kifeszülve a Z- és M-vonalak között, rugalmasan sorbakapcsolja a szarkomereket. Mint láttuk, a titin fiziológiás körülmények között csak a szarkomer I-szakaszában nyúlik meg. A titin rugalmas sajátságainak tárgyalása szempontjából a leghelyesebb, ha három szakaszra bontjuk ezt a szakaszt: egy egyedi szekvenciák alkotta részből, amelyek közül a legjelentősebb a nevét alkotó aminosavakban gazdag, ún. PEVK szekvencia. Ezen szakaszokra jellemző, hogy nem rendelkeznek stabil másodlagos szerkezettel. A random szakaszt két oldalról a proximális és disztális tandem Ig régió szegélyezi. Labeit és Kolmerer szerint a tandem Ig szakaszok merev rudaknak tekinthetők, mivel az Ig domének igen stabil háromdimenziós szerkezettel rendelkeznek [27]. Ezzel szemben a PEVK szakasz és az egyéb egyedi szekvenciák lazább rugóként működhetnek. A PEVK szakasz különleges szerkezetének és viselkedésének felfedezése előtt azt feltételezték, hogy a titin rugalmasságának alapja az Ig-domének reverzíbilis kitekeredése [76]. Granzier és munkatársai kísérleti eredményai azonban azt mutatták, hogy a titin izoforma hossza megszabja a az izom passzív rugalmas tulajdonságait [77]. Nyugalmi állapotban a szarkomerben a titin I-szakaszbeli rész felgombolyodott állapotban van [66, 78]. Granzier és Trombitás modellje szerint a titin ezért egy entropikus rugóként működhet, melyben nyújtás hatására csökken a konformációs entrópia [79]. Gautel és Goulding [80] valamint Linke és társai [81] monoklonális ellenanyagok alkalmazásával vizsgálták az egyes titin szakaszok relatív nyújthatóságát. Megfigyelték, hogy a szarkomer megnyújtásának kezdeti szakaszában először a PEVK szakaszt szegélyező tandem Ig-régiók egyenesednek ki. Figyelembe véve, hogy ezen szakasz jóval rugalmatlanabb, merevebb mint a laza szerkezetű PEVK szakasz, ez az eredmény első látásra meglepő is lehet. 23
1997-ben három, úttörő jellegű munka született, amely addig elképzelhetetlen pontossággal, egyedi molekula szinten tette mérhetővé a titin rugalmasságát [82-84]. Az egyedi-molekula manipulációs technikákkal (atomerő mikroszkóppal és lézercsipesszel) végzett mérések alapján azt a következtetést lehetett levonni, hogy a titin rugalmassága (erőmegnyúlás függvénye) nemlineáris, és a titin entrópikus polimerlánc viselkedésével magyarázható. Egy entrópikus polimerlánc termikus eredetű hajlító hatások eredményeként csökkenti a végpontjai közötti távolságot. Ebből kifolyólag, ha adott polimerlánc hajlítómerevsége elegendően kicsi, kompakt formát vesz föl, összegombolyodik. Egy ilyen lánc kinyújtása csökkenti a lánc szerkezeti rendezetlenségét (entrópiáját), vagyis a kiegyenesítéshez munkát kell befektetni. Az egyedi molekulák esetén mért erő-megnyúlás görbék az entrópikus rugalmasságát leíró, ún. féregszerű lánc (wormlike chain, WLC) modellel jól illeszthetőek voltak. A féregszerű lánc modell a láncot egy deformálható kontínuumként kezeli, amelynek alakját annak hajlítómerevsége, illetve az ezt jellemző perzisztenciahossz határozza meg. A merev polimerek szerkezeti entrópiája alacsony, így megnyújtásuk pedig kis erőt igényel, míg ennek ellenkezője igaz a flexibilis, kis hajlítómerevségű polimerekre. Figyelembe véve ezeket az eredményeket, Gautel és Goulding valamint Linke antitestekkel végzett, a titin relatív megnyúlását vizsgáló kutatásainak eredményei könnyen magyarázhatók. A titin I-szakaszbeli régiójában található PEVK szegmenst felfoghatjuk egy eleve kitekeredett szerkezeti elemként. Az egyedi-molekula kísérletek eredményei azt mutatták, hogy a titinen belül valóban van egy ilyen szakasz [27], amelyet később a PEVK szakasszal azonosítottak [85]. A PEVK rendezetlen, kitekeredett voltát az a tény is alátámasztja, hogy elektronmikroszkópos felvételeken ez a szakasz sosem látható, valószínűleg azért, mert vastagsága alatta marad a mikroszkópok és a technika felbontóképességének [86]. Az új eredmények figyelembevételével, és azok alátámasztására in situ vizsgálták a tandem Ig-régiók és a PEVK nyújthatóságát immunoelektronmikroszkópos technikák segítségével humán soleus [87, 88] és patkány m. psoas [89] izmokon. Az eredmények szerint a nem kitekeredett Ig-domének alkotta lánc is entrópikus rugóként viselkedik. A tandem Ig 24
szakasz viselkedése önmagában nem magyarázta a megfigyelt rugalmasságot, mivel nagyobb erők és a szarkomer nagyobb relatív megnyúlása esetén a PEVK szakasz megnyúlása vált dominánssá. A PEVK szakasz rugalmasságának hátterében megbúvó mechanizmusok még nem ismertek pontosan. Bizonyos eredmények arra mutatnak, hogy ez a rugalmasság tisztán entropikus eredetű [88]. Más eredmények szerint ez a modell csak akkor a szarkomer kismértékű megnyújtottsága esetén működik jól [90], és nagyobb mértékű megnyújtottság esetén entalpikus tényezőket is figyelembe kell venni a titin rugalmasságának leírásakor. Ezek a tényezők a PEVK szakaszon belüli elektrosztatikus vagy hidrofób kölcsönhatások eredményeképpen jelenhetnek meg. A mai tudásunk szerint a vázizomban, fiziológiás körülmények között az Ig-domének nem tekerednek ki, vagyis Ig-domének kitekeredése nem lehet a titin rugalmasságának alapja. Tekintsük át, milyen szerepe van a PEVK szakasznak, illetve a tandem Ig-régiónak a passzív izomerő kialakításában. A szarkomerben, nyugalmi állapotban a tandem Ig szakaszok összegombolyodott állapotban vannak jelen (6. ábra). Kismértékű szarkomer megnyúlás esetén a passzív izomerő felépüléséért ezen szakaszok entrópikus rugóként való viselkedése felelős. 25
Z-vonal vékony filamentum vastag filamentum tandem Ig szegmens kiegyenesedik rövidülés nyugvó szarkomer megnyúlás tandem Ig szegmens kiegyenesedik megnyúlás PEVK és N2 szakaszok megnyúlnak 6. ábra. A titin I-szakaszbeli részének viselkedése a szarkomer megnyújtása során. Nagyobb megnyúlás esetén a merev rugónak tekinthető PEVK szakasz megnyúlása befolyásolja döntő mértékben passzív izomerőt. A PEVK szakasz mellett, ahhoz hasonlóan működnek az N2A és N2B egyedi szekvenciák. Különböző rugalmas tulajdonságaik miatt a PEVK és az N2A/N2B szakaszok által alkotott régió többkomponensű rugónak tekinthető, amelynek részei különböző mértékben járulnak hozzá a titin nyújthatóságához [91, 92] A titin az izomösszehúzódást követően visszaállítja a szarkomer nyugalmi hosszát. A PEVK elaszticitása igen aktívan kutatott terület. A legjobban ismert és jellemzett PEVK domén a szívben expresszálódó mindössze 163 aminosav hosszúságú N2B izoforma PEVK domén [93, 94]. Az N2B izoforma PEVK domén szekvenciája teljes egészében megegyzik a m. soleusban található hatalmas, 2174 aminosav hosszúságú PEVK C- terminálisának utolsó 163 aminosavával. A m. soleus PEVK domén rugalmassága kevéssé kutatott terület. E domén sokkal nagyobb, mint bármely egyéb titin izoformában található PEVK domén, és elasztikus tulajdonságainak felderítése, mechanikai jellemzése közelebb vihet bennünket a PEVK domén funkciójának megértéséhez. 26
2. Célkitűzések Munkánk során az m. soleusban lévő titin izoforma PEVK doménjének aktinkötő képességét kívántuk vizsgálni. Szintén célul tűztük ki ezen domén mechanikai tulajdonságainak vizsgálatát egyedi molekula módszerekkel. Legfőbb kérdéseink azok voltak, hogy hogyan változik a PEVK domén aktinkötő képessége a domén mentén, illetve van-e eltérés a PEVK domént alkotó szekvencia motívumok (polye, PPAK) aktinkötő képességében. Ehhez hasonlóan meg kívántuk határozni, hogy a PEVK domén mechanikai sajátságait tekinteve homogén, vagy esetleg a szekvencia motívum-összetételtől függően mutat-e eltéréseket. Céljaink a következőek voltak: különböző PEVK szakaszok klónozása, expressziója, tisztítása és fluoreszcens jelölése; a PEVK domén - F-aktin kölcsönhatás vizsgálata többféle (in vitro motilitási próba, szilárd felszínhez való kötődési próba (solid-state surface binding assay) és aktin-keresztkötési próba, aktin-pevk koszedimentáció vizsgálat, steady-state aktin-aktivált ATP-áz mérés) módszerrel; az egyedi molekula mechanikai vizsgálatokhoz a PEVK darabok végeinek specifikus megragadásához szükséges molekuláris fogantyúk kialakítása, illetve a specifikus megragadást lehetővé tevő felszín kialakítása; a PEVK darabok mechanikai jellemzése egyedi-molekula atomerőmikroszkópiával. 27
3. Alkalmazott anyagok, módszerek, elméleti számítások 3.1. A humán vázizom PEVK-darabok klónozása, expressziója és tisztítása A humán vázizom cdns könyvtár Dr. Siegfried Labeit ajándéka volt. A m. soleus titin izoforma PEVK domén három, megközelítőleg egyforma hosszúságú darabban (a továbbiakban szegmensek) (PEVK I: 16852-19074, II: 19075-21192 és III: 21193-23373, (GenBank hivatkozása szám: X90569 (X90569.1 verzió) expresszáltuk. A PEVK domént felépítő polye-"gazdag" (20305-20757) és PPAK (17413-18015) fragmentumokat, illetve egy csak polye-szekvenciából ("tiszta"-polye) álló rekombináns fehérjét (a továbbiakban fragmentumok) is expesszáltunk, mely utóbbi a X90569 GenBank hivatkozási számú PEVK cdns 20305-20520 közé eső szakaszának megkettőzése. Az expresszált rekombináns fragmentumok doménen belüli elhelyezkedése az 7. ábrán látható. PEVK I PEVK II PEVK III PPAK 2 "tiszta"-polye fragmentum polye-"gazdag" fragmentum 7. ábra. Az expresszált rekombináns m. soleus PEVK darabok. A sárga négyzetek a PPAK, a pirosak a polye szekvenciákat jelölik. Az expresszálni kívánt fragmentumokat kódoló DNS-darabokat megfelelő restrikciós endonukleázzal végzett emésztés után pet-28a (Novagen) vektorba ligáltuk, majd BL21(DE3)pLysS E. coli (Promega) sejtekbe transzformáltuk, majd e sejtvonalban 28
expresszáltuk. Mindegyik rekombináns fragmentum N-terminálisán His-tag, C-terminálisán két szomszédos cisztein aminosav található. A rekombináns fehérjéket Ni 2+ -affinitás kromatográfiával tisztítottuk NTA-oszlopon (Novagen). Az esetlegesen szükséges további tisztítást Sephadex G25-ös vagy G75-ös (Sigma) gélszűrő vagy DE52 ioncserélő (Sigma) oszloppal végeztük. A fragmentumok koncentrációját Bradford reagenssel (Sigma) határoztuk meg. 3.2. Fehérjepreparálás Az aktint [95], a miozint [96] valamint a HMM-et [97] korábban ismertetett eljárások alapján preparáltuk. Az F-aktint fluoreszcens jelölését tetramethylrhodamineisothiocyanatephalloidinnal (TRITC-phalloidin, Molecular Probes) végeztük. A natív vékony filamentumokat glicerinezett nyúl szemölcsizomból állítottuk elő korábban ismertetett eljárás alapján [98]. 3.3. In vitro motilitási próba Az in vitro motilitási próbát korábban ismertetett eljárások alapján hajtottuk végre [64, 85, 98, 99] A mérés során használt folyadékcella ~ 10 µl térfogatú volt. 40 µg/ml koncentrációjú HMM oldatot áramoltattunk át a folyadékcellán, majd mosás után különböző HMM/PEVK arányok mellett videora rögzítettük a fluoreszcensen jelölt F-aktin filamentumok mozgását. A videofelvételt digitalizáltuk, és egy házilag fejlesztett Pascal-program segítségével határoztuk meg az aktin filamentumok sebességét. 29
3.4. Szilárd felszínhez való kötődési próba (solid-state surface binding assay) és aktin-keresztkötési próba A kötődési próbát korábban ismertetett eljárások alapján hajtottuk végre [64]. A mérés során a felszínhez abszorbeált PEVK fragmentumokhoz kötődő, fluorszcensen jelölt aktinfilamentumok hosszát határoztuk meg. A kölcsönhatás ionerőtől és Ca-koncentrációtól való függését megfelelő KCl és Ca 2+ koncentrációjú pufferekkel való mosás segítségével határoztuk meg. Az aktin-keresztkötési próba során a fluoreszcensen jelölt aktin filamentumokat és PEVK fragmentumokat tartalmazó oldatokat összekevertük, és a kialakuló kötegekről készítettünk felvételeket. A felvételeket epifluoreszcencia (Zeiss) teljes belső visszaverődés fluoreszcencia mikroszkópokkal (TIRFM, Olympus) készítettük. 3.5. Aktin-PEVK koszedimentáció vizsgálat A phalloidinnal stabilizált F-aktint 140 mm KCl-ot tartalmazó pufferben különböző PEVK fragmentumokkal kevertük össze, majd 60 perc inkubálás után 100 000 g-vel centrifugáltuk. A felülúszót és a csapadékot 12%-os SDS-poliakrilamid gélen futtattuk meg és Coomassie Brilliant Blue R-250-vel festettük. A denzitogrammot Syngene MultiGenius BioImaging rendszer GeneSnap és GeneTools szoftvereivel készítettük ill. értékeltük ki. 3.6. A miofibrillumok előállítása, jelölése és vizualizálása A PEVK II-es fragmentumot a C-terminálisán lévő cisztein aminosav oldalláncán jelöltük meg iodoacetamido-fluoresceinnel (IAF, Molecular Probes) a gyártó által javasolt módszer szerint. Az izolált miofibrillumokat [100] negyed órán át inkubáltuk a fluoreszcensen jelölt PEVK fragmentummal. Az üvegfelszínre kitapadt fluoreszcens titinmolekulák leképezéséhez lézerpásztázó konfokális mikroszkópot használtunk (Bio-Rad MRC-1024ES, Nikon Eclipse 30
TE300 inverz mikroszkóp, Nikon Plan Fluor 40/0,75NA olajimmerziós objektív). A mintát Ar-ion lézerrel (488 nm) gerjesztettük. 3.7. Steady-state aktin-aktivált ATP-áz mérés A HMM steady-state ATP-áz aktivitását NADH-csatolt reakció (Coupled Assay) segítségével határoztuk meg. A mérést Jasco V-550 UV-VIS spektrofotméterrel végeztük. 3.8. Kémiailag módosított üvegfelszín kialakítása egyedi molekula manipulációhoz A PEVK szegmensek N-terminálisának specifikus megragadásához a tárgylemezt alapos tisztítás, majd szilán alapú funkcionalizálás (3-glycidiloxypropyl-trimethoxisylane, Glymo, Sigma-Aldrich) után N-(5-amino 1-carboxypenthyl)-iminodiecetsavval (NTA; Dojindo, Tokyo, Japan) vontuk be. Az így bevont felszínhez Ni 2+ hozzáadását követően a N- terminálisán His-tagot hordozó PEVK szegmensek specifikusan kitapadtak. 3.9. Atomerő-mikroszkópia A mechanikai manipulációs kísérletekhez Asylum Research Molecular Force Probe típusú erőmérő atomerő-mikroszkópot használtunk (MFP1D, Asylum Research, Santa Barbara, CA). A méréseket vizes közegben, AB-pufferben (25-300 mm KCl, 25 mm NaH 2 PO 4, 4 mm MgCl 2, 1 mm EGTA, 0,3% NaN 3 ) végeztük. A specifikus rugólapka PEVK kölcsönhatás kialakulásának édekében arannyal boríott rugólapkákat használtunk (Bio-Lever, Olympus, Tokyo, Japán). Az aggregáció csökkentése érdekében a pufferhez 0,2% Tween-20-at adtunk. A rugólapka tűjét a 10-100 µg/ml fehérjekoncentrációjú AB-pufferrel tíz percig inkubáltuk. 31
Az inkubálás után a rugólapkát alaposan mostuk az aspecifikusan felkötődött fehérjék eltávolítása érdekében. A mérés során a rugólapkát lassan a Ni-NTA-val borított üvegfelszín felé közelítettük. Miután sikerült megérintenunk a felszínt, a rugólapkát konstans, 500 nm/s sebességel emeltük fel, illetve engedtük vissza, hogy a végein specifikusan megragadott molekulákat meghúzzuk. Annak érdekében, hogy csak a végein megragadott molekulák meghúzásából származó adatokat értékeljük ki, a következő stratégiát alkalmaztuk: csak azokat az adasorokat értékeltük ki, ahol az illesztésből származó kontúrhossz megfelelt az elméletileg számolt értéknek. Az erőt a rugólapkák elhajlásából, a rugólapka rugóállandójának ismeretében számoltuk ki. A rugólapka rugóállandóját termikus kalibrációval határoztuk meg A rugóállandók termikus kalibráció során meghatározott értéke ~ 6-30 pn/nm volt. 3.10. Az erő - megnyúlás görbék kiértékelése Az erő - megnyúlás görbékre a féregszerű lánc (Wormlike Chain, WLC) modellt illesztettük [82, 101]: FL P k B T = z 1 + L C 4(1 z /L C ) 1 2 4, (1) ahol A - perzisztenciahossz, kb - Boltzmann állandó, L - kontúrhossz, T - abszolút hőmérséklet, F erő, z vég-vég távolság.. A nem specifikusan megfogott és meghúzott molekulák adatait nem értékeltük ki. Az illesztészt 0 50 pn tartományban végeztük. 32
3.1.1 Immun-elektronmikroszkópia A kísérletek korábban publikált lépések szerint történtek [66, 87, 88, 102]. Röviden, a soleus izomrostokat adott hosszúságra nyújtását követően 20 perc inkubálás után fixálás történt 3% para-formaldehidet tartalmazó PBS pufferrel. Mosás és BSA-val történő blokkolás után 24 órás ellenanyag kezelés történt. A kísérlet során a következő antitestek kerültek felhasználásra (19. ábra): anti-i2/i3 (T12), anti-i80/81 (N2A), anti-pevk C-terminális antitest (514), anti-i111/i112 (Ti-102). Mosás, másodlagos antitesttel történő kezelés, OsO4 festés és beágyazás után a minte metszése történt. Az elektronmikroszkópos felvételek JEOL 1200 elektronmikroszkóppal (JEOL, Tokyo, Japán) készültek. 3.12. A PEVK domén, mint polielektrolit lánc A PEVK domén számos töltött oldalláncot tartalmaz, ezért polielektrolit láncként viselkedik. A PEVK domén perzisztenciahosszát [103] a töltések közötti vonzó, illetve taszító kölcsönhatások nagy mértékben befolyásolhatják. A Odijk-Skolnick-Fixman (OSF) elmélet [104] értelmében az azonos töltések kimerevítik a polielektrolit láncot, így annak perzisztenciahossza megnő. Egy adott polielektrolit lánc perzisztenciahossza [105] az elasztikus (L 0 ) és az elektrosztatikus (L e ) komponensek összegeként írható le: Az elektrosztatikus komponens (Le) kifejezhető, mint: L P = L 0 + L e. [105] L e = l B κ 2 τ 2 /4, (3) ahol a l B a Bjerrum hossz (az a távolság, amelyen belül a töltések interakciós energiája egyenlő a termikus energiával k B T. l B = 0,7 nm vízben, szobahőmérsékleten), τ a töltések sűrűsége (a töltések közötti távolságok átlagának inverze), és κ -1 a Debye távolság: κ 1 = ( 4πl B I) 1 2, (4) ahol, I az oldat ionereje. Az L 0 és a τ paraméterek meghatározása érdekében, a κ -1 függvényében ábrázolt L p adatokat a (4) egyenlettel illesztettük. A τ paramétert a PEVK 33
doménen belüli átlagos glutaminsav glutaminsav, illetve lizin lizin távolságok (d r ) alapján is meghatároztuk: d r = N r s r, (5) ahol N r az adott glutaminsavhoz legközelebb eső glutaminsav, illetve az adott lizinhez legközelebb eső lizin átlagos távolsága, S r egy aminosav átlagos hossza (0,38 nm). Az egyes PEVK harmadok, illetve a tandem Ig-régió részleges megnyúlását a WLC egyenletből levezethető, sorbakapcsolt rendszerek erőekvivalencia elve alapján számítottuk ki: Ext P A P + 1 + 1 = Ext Ig 1 + 4A P ( 1 Ext P ) 2 4A P A Ig 4A Ig 1 Ext Ig ( ) 2 + 1 4 A Ig, (6) ahol az Ext P és az Ext Ig az adott PEVK harmad és a tandem Ig-régió relatív megnyúlása, A P és A Ig pedig az adott PEVK harmad és a tandem Ig-régió perzisztenciahossza (15 nm). A számítás során a relaxált szarkomer hosszát (SL) a különböző titin régiók relatív vég vég távolságaiból számítottuk ki: SL = 2T12 + 2Ext Ig L Ig + 2Ext PI L PI + 2Ext PII L PII + 2Ext PIII L PIII + A, (7) ahol T12 a megnyújthatatlan Z-vonal T12 epitóp távolság (0,1 µm), A az A-szakasz szélessége (1,6 µm), Ext és L adott titin szakaszok relatív megnyúlása és kontúrhossza (Ig tandem Ig-régió, PI PEVK I, PII PEVK II, PIII PEVK III). A tandem Ig-régiók (a proximális és disztális tandem Ig-régiók együtt) hossza 0,465 nm (93 darab Ig domén, egyenként 5 nm-es hosszal számolva). A PEVK harmadok kontúrhosszát a szekvencia alapján számoltuk ki (PEVKI=0.281 µm, PEVKII=0.268 µm, PEVKIII=0.276 µm). 34
4. Eredmények Vizsgálatainkat humán m. soleusból származó titin izoforma PEVK doménjén végeztük. Az titin izoformák közül ez a típus tartalmazza a legnagyobb PEVK szakaszt. E szakaszt 106 exon kódolja, hossza 2174 aminosav. 4.1. A PEVK szakasz klónozása és expressziója A titin PEVK szakaszának expressziójakor prokarióta rendszerrel dolgoztunk. Ez az expressziós rendszer számos előnnyel bír (gyors, egyszerű, gazdaságos), ám a nagyméretű (nagyobb, mint 100 kda) fehérjék esetében nem működik megbízhatóan. A titin PEVK szakaszának klónozásakor ezért azt a stratégiát választottuk, hogy a szakaszt nem egyben, hanem három darabban fogjuk megtermeltetni. A rekombináns fehérjék N-terminálisát Histaggal láttuk el. A His-tag segítségével a PEVK harmadok tisztítását végeztük el, valamint a mechanikai mérések során a His-tagon keresztül ragadtuk meg specifikusan a fehérjék N- terminális végét. A harmadok C-terminálisára két cisztein aminosavat illesztettünk. A PEVK szakasz nem tartalmaz cisztein aminosavat. A cisztein oldallánca viszonylag reaktív, specifikus kémiai módosításokra alkalmas, így ezen két oldallánc segítségével az expresszált fehérjéket fluoreszcens festékekkel jelölhettük, illetve, az atomerő mikroszkópos mérések során e két aminosav oldalláncon keresztül rögzítettük specifikusan és erősen a PEVK harmadok C-terminálisát. A titin PEVK domén vizsgálatakor klónoztuk, expresszáltuk és tisztítottuk annak alapköveit is, a PPAK motívumot és a polye szekvenciát is (Részleteket lásd az Anyagok, módszerek fejezetben, illetve 7. ábra). A 8. ábrán a tisztított PEVK harmadok, valamint a PPAK és polye szekvenciák elektroforetogrammjai láthatóak. 35