A Magyar Tudományos Akadémia Állategészségügyi Kutató Intézete, Budapest

Parasit. Hung. 4. 23-46. 1971 A humorális ellenanyagok tanulmányozása nyulakban kísérletileg létesített Cysticercus pisiformis (Bloch, 1780)-fertőzöttség esetén í. A precipitin-válasz jellemzése Dr. NÉMETH István A Magyar Tudományos Akadémia Állategészségügyi Kutató Intézete, Budapest Először MILLER és KERR (18) állapította meg 1932-ben, hogy a Taenia pisiformis (Bloch, 1780) Gmelin l790(taeniidae, Cestoda) lárvaalakjával, a Cysticercus pisiformis (Bloch, 1780) -szal fertőzött nyulakban immunitás alakul ki a reinfekciókkal szemben. További vizsgálatok kiderítették, hogy az immunitás esetenként annyira kifejezett, hogy a fertőzésen egyszer már átesett állatok sikerrel állnak ellen a parazita később bekövetkező támadásával szemben. Máskor viszont az immunitás csupán redukálja a reinfekció esetén a kifejlődő élősködők számát, de ilyenkor is elejét veszi a súlyosabb cysticercosis kialakulásának (11, 12, 17, 21, 22, 27). Galandféreg- vagy cysticercus-anyag, vagy in vitro mesterségesen keltetett és aktivált oncosphaerák parenterális bevitelével sikerült nyulakat immunizálni a fertőzéssel szemben. A mesterségesen indukált immunitás azonban rendszerint gyengébb védettséget eredményezett, mint a természetes fertőződések nyomán ki alakult immunitás ( l, 8, 9, 11, 12, 18, 27). Passzív immunizálási kísérletek eredményei alapján már korábban több kutató is arra következtetett, hogy e féregfaj támadása protektiv tulajdonságú humorális ellenanyagok termelődését Indukálja (1, 4, 11, 12, 15» 16, 17, 20, 27). Az ellenanyagokat később szerológiai módszerekkel, igy gyürüs-precipitációs próbával (4, 30), a mesterségesen kikeltetett aktiv oncosphaerák-

kai végzett in vitro lárvaprecipitációs próbával (24,25), komplementumköté si (30), géldiffuziós-precipitációs (19), valamint indirekt hemagglutinációs próbával (19, 30) is sikerült kimutatni a fertőzött állatok vér savójában. Noha az eddig végzett vizsgálatokban kétségtelenül beigazolódott, hogy a fertőzés kiállása az ujabb fertőzéssel szemben specifikus védettséget eredményez ( l, 8, 11, 12, 17, 18, 21, 22, 27), még ma is hiányosan ismert a szervezetnek a reinfekcióval szemben megnyilvánuló felfokozott védekező reakciójának mechanizmusa. Több irodalmi adat arra utal, hogy ebben a folyamatban lényeges szerepet töltenek be a humorális ellenanyagok ( l, 4, 8, 11, 12, 15, 16, 20, 24, 25, 26, 27). Ennek részleteiről a- zonban meglehetősen keveset tudunk, igy a T. pisiformis-oncosphaerák támadására jelentkező humorális ellenanyagválasz sincs még pontosan jellemezve. Még egyáltalán nem ismerjük e féregfaj antigénszerkezetét, antigénjeinek kémiai természetét, továbbá azt sem tudjuk, hogy e féregfaj antigentérmészetü somaticus a- nyagai és/vagy a fejlődő és aktiv élettevékenységet folytató é- lősködők produktumai közül végső soron melyek felelősek a humorális ellenanyagok termelődésének megindításáért. E problémakör tisztázásához kivántunk további adatokat szolgáltatni T. pisiformis-petékkel mesterségesen fertőzött nyulakon végzett kísérletekben a primer és szekunder fertőzésre jelentkező humorális ellenanyagválasz főbb sajátosságainak tanulmányozása révén. Ez a közlemény a fertőzött állatok vérsavójában géldiffuziós-precipitációs próbával kimutatható ellenanyagokra vonatkozó vizsgálatokat foglalja össze. Anyagok és módszerek A) Antigének A féreg- és lárvaantigének készítéséhez kiindulási anyagként mesterségesen fertőzött kutyákból származó kifejlett galandférgeket és fertőzött nyulakból gyűjtött fertőzőképes cysticercusokat használtunk. 24

A cysticercusokkal végzett fertőzést követő 10-12. héten a kutyákat leöltük, és a bélcsatornájukhói kiszedett férgeket áramló csapvizben, majd többször váltott desztillált vizben történő mosás után 1000 NE/ml kristályos penicillint és 0,5 mg/ml streptomicint tartalmazó desztillált vizben egy órán át inkubáltuk 37 C-on. Az antibiotikum-oldatból kiemelt férgeket ezután ster i l desztillált vízzel végzett 4-5-szöri mosás után steril dróthálóra helyeztük a mosófolyadék eltávolítása érdekében, és a felhasználásukig -20 C-on megfagyasztva tároltuk. A kötőszöveti tokjukból ép állapotban kiszabadított cysticercusokat mérőhengerben steril izotóniás konyhasóoldatban történő ülepítéssel többször mostuk. Az utolsó ülepitést követően a folyadékot teljesen eltávolítottuk, és a lárvákat -20 C-on megfagyasztva tároltuk. Taenia pisiformis-homogenizátum (TpH) Apró darabkákra vagdalt nyers galandférgékből 50 g-ot 50 ml pufferolt izotóniás sóoldatban (PBS, 0,04 M,pH 7,3) homogenizátorral"^ 20 percig homogenizáltunk, miközben a homogenizátor e- dényét jéggel hűtöttük. Az anyagot ezután 45 percig roncsoltuk 2 ) o ultrahanggal, és a felhasználásig -20 C-on megfagyasztva tároltuk. Cysticercus pisiformis-homogenizátum (CpH) A fertőzőképes cysticercusokból a TpH-mal azonos módon készült, azzal a különbséggel, hogy az ultrahanggal végzett roncsolás 30 percig történt. Omni-Mixer Homogenizer, Ivan Sorvall, Inc. Norwalk, Conn. USA MSE Ultrasonic Disintegrator, Measuring and Scientific Equipment Ltd. London (kimenő teljesítmény 60 watt, rezgésszám 18-20 Kc/sec,).

Taenia pisiformis-nyerskivonat (TpK) Egy rész galandféreg-homogenizátumot (TpH) három rész PBS-oldattal (0,04 M, ph 7,3) kevertünk, majd 10 percig homogenizáltuk, és 15 percig ultrahanggal kezeltük a fent emiitett módon. A szuszpenziót ezután 20 percig 3000,majd ujabb 20 percig 15000 fordulattal centrifugáltuk +4 C-on. Az alakos elemektol mentes felüluszót dializáló hártyán keresztül történő párologtatással (pervaporizáció) 15-30 mg/ml fehérjetartalomra koncentráltuk, majd PBS-oldattal szemben egy napig dializáltuk, és 0,3 % for- malinnal konzerválva +4 C-on tároltuk. Cysticercus pisiformis-nyerskivonat (CpK) A TpK-tal azonos módon CpH-ból készült. Cysticercus pisiformis-kivonat savban oldódó frakciója Ezt az antigénoldatot a CpK-ból állítottuk elő a következő módon. A CpK kémhatását cseppenként hozzáadott 0,5 N sósavval ph 4,5-re állítottuk be, aminek következtében fehér, laza, pelyhes csapadék keletkezett. A precipitátumot ezután 4000 fordulattal végzett 15 perces centrifugálással eltávolítottuk, és az enyhén opaleszkáló felüluszót mágneses keverővel folyamatosan kevert és többször váltott PBS (0,04 M, ph 7,3) ellen 6 órán át diali- zálva használtuk antigénként. Az anyagot 0,3 % formalinnal konzerválva +4 C-on tároltuk. Taenia pisiformis-"secretum és excretum antigén" (TpSE) Kifejlett cysticercusokkal fertőzött kutyákat a fertőzésüket követő 7-8. héten kiirtottuk. A bélcsatomából ép állapotban kiemelt férgeket a fentebb leirt módon megtisztítottuk, majd 500 NE/ml kristályos penicillint és 0,3 mg/ml streptomicint,

valamint 200 NE/ml mycostatint tartalmazó HANKS-oldatban (ph 7,2) 37 C-on 72 óráig inkubáltuk, 100 ml oldatra 3 férget számítva. A férgekről leöntött oldatot 3000 fordulattal 15 percig végzett centrifugálás után 30-40-szeresre koncentráltuk ultraszüréssel +4 C-on, majd a koncentrátumot többször váltott PBSoldattal (0,04 M,pH 7,3) szemben egy napig diálizáltuk, és 0,3% formaiinnal konzerválva +4 C-on tároltuk. Cysticercus pisiformis-"secretum és excretum antigén" (CpSE) A fentebb leirt módon megtisztított és sterilezett ép, fertőzőképes cysticercusokat antibiotikumos HANKS-oldatba helyeztük, 100 lárvát számítva 50 ml oldatra, és 72 óráig 37 C-on tartot tuk. Ezután a lárvákról a folyadékot leöntöttük, és a továbbiakban a TpSE-antigennél leírtakkal azonos módon jártunk el. B) Sérumok Fertőzött nyulakból származó vérsavók Harminc, azonos tenyészetből származó, 6-7 hetes korú, 700-900 g sulyu, fehér uj-zélandi nyulat egyenként 500 T. pisiformispetével fertőztünk. A petéket mesterségesen fertőzött kutyákból spontán Ürülő gravid izekből a korábban leirt módon izoláltuk (20), és fecskendőre szerelt szondával közvetlenül a gyomorba adtuk be. A nyulakat a szokásos módon ketrecekben dróthálón tartottuk. Kísérletbe állításukkor a coccidiosis megelőzésére 10 %-oa olajos szulfakvinoxalin-szuszpénzlóból 0,5-1,0 ml-t oltottunk bőr alá, egyhetes időközökkel, három alkalommal. Ezenkívül az állatok a fertőzést követő első héten eritromicint tartalmazó ivóvizet (62,5 g eritromicin-tiocianát 1 Vüter) kaptak. Ezt a kezelést a harmadik héten megismételtük. Gallimycin, Abbott Laboratories, International Veterinary Division, France

A kísérleti nyulak felét az első fertőzés után a 60. napon újra fertőztük 10 000 petével, majd a 100. napon valamennyi állatot elvéreztettük, és a cysticercus-fertőzöttség intenzitásának meghatározása érdekében felboncoltuk. Az első fertőzéstől kezdve a 20. napig 3-5 naponként, ezután pedig 10 naponként az állatok fülvénájából vért vettünk. A vérsavókat a felhasználásukig -20 C-on megfagyasztva tároltuk. A fertőzés következtében öt nyul elhullott, ezeknek a vérsavóját nem vizsgáltuk. Az anti-taenia -pisiformis nyulimmunbavó előállítása (anti-tp) A galandférgek homo -reniz át urnát (TpH) izotóniás nátriumkloridoldattal 1:5 arányban higitva Al(OH)-^-gélhez adszorbeáltuk, és ebből az anyagból hat héten keresztül hetenként egyszer IS mg fereghomogenizátum-szárazanyagnak megfelelő mennyiséget oltottunk 3-4 kg-os nyulak bőre alá, több helyre elosztva. Az immunizálás 10. hetében az állatok 25 mg fehérjét tartalmazó TpK-ot kaptak bőr alá, majd öt egymást követő napon át emelkedő adagokban összesen 100 mg fehérjének megfelelő TpK-ot oltottunk fülvénába. Egyheti szünet után az utolsó oltássorozatot megismételtük, és az utolsó intravénás oltást követő 9«napon az állatokat elvéreztettük. A vérsavókat -20 C-on tároltuk. Az anti-cysticercus pisiformis nyulimmunsavó előállítása Az anti-tp nyulimmunsavó előállítása c. bekezdésben leirt immunizálási séma szerint CpH-mal és CpK-tal immunizáltunk nyulakat. Az ellenan.yagok kimutatása A precipitáló antitesteket a vérsavókban géldiffuziós-precipitációval mutattuk ki, amit 0,01 % mertiolátot és 0,003 % metilnarancsot tartalmazó PBS-ben (0,01 M,pH 7, l) oldott 1,5 %-os a- gar-gélben"^ végeztünk. 1 ^Special Agar-ÏToble, Difco Laboratories,Detroit, Michigan, USA 28

Az ellenanyagok tlterének meghatározása érdekében PETRI-csészékben 1,5-2,0 mm vastag agarrétégben a kör alakú reagenstartályokat rozettaszerüen helyeztük el. A centrális és a perifériás tartályok középpontja közti távolság 10 mm, a tartályok átmérője pedig 5 mm volt. A centrális rezervoárba mindig a vizsgálandó vérsavót, a perifériásokba pedig az antigénként használt 10 mg/ml fehérjetartalmú CpK-törzsoldat felező léptékű higitásait mértük. Az antigénhigitások PBS-oldattal (0,01 M, ph 7,1) készültek. Kontrollként biztosan nem fertőzött nyulakból származó vérsavókat, illetve PBS-oldatot alkalmaztunk. A lemezeket szobahőn tartottuk, és az eredményt a reagensek bemérése után 7 nap múlva biráltuk el. Azokban az esetekben, amikor a vizsgált vérsavók erre az időre nem idéztek elő precipitációt, a reagenseket ujratöltöttük, és az eredményt akkor tartottuk negatívnak, ha ujabb 7 napi inkubálás után sem alakult ki látható precipitációs vonal. Az ellenanyagok titereként az antigénnek azt a legnagyobb higitását adjuk meg, amely az ellenanyag-tartalmú vérsavóval még jól látható precipitációs vonalat hozott létre. Az l_j_ és 2. ábrán közölt átlagtitereket az egyes kisérieti csoportok állataiból azonos időpontokban vett vér savók egyedi vizsgálatával kapott titerek alapján számítottuk ki (14). Géldiffuziós analízisek Az immundiffuziós analíziseket radiális kettős diffúziós módszerrel 1,5 mm vastag agarrétegben végeztük, amit 0,01 % mertiolátot és 0,003 % metilnarancsot tartalmazó PBS-ben (0,01 M, ph 7,l) oldott 1,5 %-os agaroldatból különböző méretű üveglemezeken képeztünk. A 10 mm átmérőjű kör alakú rezervoárok középpontja közti távolság 14-18 mm között változott. A vér savókat mindig higitatlanul, az antigéneket pedig PBS-oldattal (0,01 M, ph 7,1) különböző mértékben higitva alkalmaztuk. Az immundiffuziós lemezeket szobahőn,nedveskamrában tartottuk, naponta vizsgáltuk, és a precipitációs vonalak teljes kialakulása, rendszerint 6-7 napi inkubálás után a szokásos módon (2) mostuk, szá-

ritottuk, majd amidofekete 10 B -vei vagy savanyu fukszinnal festettük meg. A vérsavók koncentrálása ammóniumszulfátos kisózással A precipitin-aktivitás növelése érdekében a fertőzött nyulak vérsavóját ammóniumszulfátos kisózással koncentráltuk ugy, hogy a desztillált vizzel egyenlő arányban higitott vérsavókat t e l i tett ammóniumszulfát-oldattal ana partes kevertük, majd 100 ml "féltelitett" oldathoz 17-20 g finoman poritott ammoniumszulfátot adtunk, és a keveréket másnapig szobahőn hagytuk állni. Ezután a precipitátumot lecentrifugáltuk, a vérsavó eredeti térfogatának egyhatodát kitevő mennyiségű PBS-ben (0,02 M, ph 7,2) feloldottuk, majd ugyanezzel a pufferrai szemben +4 C-on végzett dializálással az oldatból az ammóniumszulfátot eltávolítottuk. A koncentrátumot 1 ml-es adagokban -20 C-on megfagyasztva tároltuk. A precipitinek adszorbeálása a vérsavókból Az adszorbeálandó vérsavó l - l ml-éhez liofilizált CpK-ot adtunk 0,5-1,0 mg-os adagokban. A keveréket 30 percig 37 C-on, és másnapig +4 C-on inkubáltuk, majd a képződött precipitátumot 20 percig 4000 fordulattal végzett centrifugálással eltávolítottuk. A müveletet addig ismételtük, amikor az antigén hozzáadására több csapadék már nem keletkezett. Az adszorbció teljes voltáról antigénhigitási sorral végzett géldiffuziós-precipitációs próbával győződtünk meg. E. Merck AG, Darmstadt, Germany 2) Chroma, Stuttgart, Germany

Ultraszürés Az ultraszürést vákuumdializissel 50-100 Hgm negativ nyomáson 8-as méretű dializáló cső"^ felhasználásával a leirt módon végeztük (6). Fehérj emeghatározás A fehérjemeghatározásokat biuret-reakcióval végeztük a leirt módon (5). Eredmények A parazitológiai boncolás eredménye A T< pisiformis-peték beadását követő 100. napon végzett boncolás során minden nyul cysticercusokkal fertőzöttnek bizonyult. Az egyszer fertőzött csoport állatainak hasüregében átlagosan 210,8 (78-377), az ujrafertőzött csoport állataióban pedig átlagosan 397,3 (142-438) Cysticercus volt. Az előbbi csoportban valamennyi Cysticercus betokozódott állapotban zömmel a csepleszen és a medenceüreg hashártyája alatt volt található, és t e l jesen kifejlett scolexszel rendelkezett. Az utóbbi állatcsoportban viszont teljesen kifejlett hólyagférgek (borsókák) mellett a hasüregben még szabadon lévő, véglegesen még meg nem telepedett, fiatal cysticercusok is előfordultak, amelyek a többinél lényegesen kisebbek és fejletlenebbek voltak, s igy nyilván a reinfekcióból származtak. A precipitáló ellenanyagok dinamikája Precipitáló antitesteket legkorábban a fertőzést követő második Union Carbide ^Corporation, Chicago, Illinois, USA

héten, rendszerint a 10. és 14. nap között lehetett a vérsavókban CpK-tal kimutatni. A vizsgált 25 állat közül a 11. napon 3, a 14. napon 11, a 20. napon 16 nyul vérsavója adott pozitiv reakciót, a 30. naptól kezdve pedig minden állat vér savója az antigénoldattal precipitációt hozott létre agargélben. 1. ábra fertőzés utáni napok - days after infection 1. ábra: A precipitációs titer alakulása 500 petével fertőzött nyulak vér savójában. A nyil a fertőzés időpontját jelöli. Pig. 1: Precipitin activity in serum from rabbits infected with 500 eggs of T. pisiformis. The arrow indicates the time of infection. A primer fertőzés nyomán kialakult precipitin-válasz dinamikáját az 1. ábra mutatja, amely 10 állatból sorozatosan vett vérsavók egyedi vizsgálatával kapott titerek átlagértékeit tünteti fel. A fertőzést követő második héttől kezdve az ellenanyagok mennyisége a vér savókban fokozatosan emelkedett, és a 60. napon 1:36,8 átlagtiterrel (szélső értékek 1:16-1:128) elérte a maximumot. Ettől kezdve az ellenanyag-titer fokozatosan csökkent,a megfigyelési idő végén (100 nappal a fertőzés után) azonban még minden állat vérsavója tartalmazott, bár alacsony, átlagosan

1:5,3 titerben (szélső értékek 1:2-1:16), precipitáló antitesteket. A szekunder fertőzésre jelentkező precipitin-választ a 2.ábra szemlélteti, amely 15 állat folyamatos vizsgálatával kapo'tt át- 2. ábra 7-6 - 5-4- 0 3- S -S 2- a Ö 0 "S S l 0 20 40 60 fertőzés utáni napok days after infection m 100 2. ábra: A precipitációs titer alakulása 500 petével fertőzött, majd 60 nap múlva 10 000 petével ujrafertőzött nyulak vérsavójában. A nyilak a fertőzések időpontját jelölik. Pig. 2: Precipitin activity in serum from rabbits infected with 500 eggs of T. pisiformis and reinfected 60 days later with 10 000 eggs. lagos precipitin-titert tünteti fel. Az első fertőzést követően az ellenanyag-titer alakulása az előző kisérleti csoportéhoz hasonló volt. A precipitin-titer 1:33,4 átlagértékkel a fertőzést követő 50. napon érte el a maximumot, majd ezután némileg

csökkent. Az ábrán jól látható, hogy a 60. napon 10 000 petével végzett második fertőzésre az ellenanyagszint újból emelkedett, és a 40. napon (az utolsó vizsgált időpont) a vérsavók átlagosan 1:116,7 titerben (szélső értékek 1:32-1:512) adtak reakciót. Ez az érték megközelítően két kitevővel haladta meg a primer - fertőzés után észlelt maximális átlagtitert, és négy és fél kitevővel magasabb volt, mint a csak egyszer fertőzött állatokban ugyanebben az időpontban észlelt precipitin-titer. Géldiffuziós vizsgálatok A géldiffuziós vizsgálatok folyamán a CpK-tal szemben maximum négy precipitációs sáv alakult ki (4/A és 4/B ábra). A vér savók precipitin aktivitása azonban állatonként lényegesen eltért, sőt egyazon állat esetében is erősen változott attól függően, hogy,egyrészt egy vagy két fertőzést kapott-e, másrészt, hogy a fertőzés és vérvétel között mennyi idő telt el. A fertőzöttség korábbi időszakából származó vér savók esetében csupán egy-egy halvány precipitációs vonalat lehetett megfigyelni, amely a későbbi időpontokban vett vérsavóknál fokozatosan erősebbé vált. A fertőzés utáni 30. naptól kezdve legalább egy jól kifejezett precipitációs vonalat valamennyi állat vérsavója- kialakitott. A fertőzöttség későbbi időszakából, valamint az ujrafertőzött állatokból származó vérsavókban viszont szélesebb antigén-spektrum ellen ható precipitáló ellenanyagokat lehetett kimutatni. Egyes állatok esetében ugyanis az első fertőzést követő 30. és 60. nap között a vér savók kettő, a második fertőzés utáni 20. naptól kezdve pedig a legtöbb állat vérsavója három, egyeseké pedig négy precipitációs vonalat létesített, ha agarlemezben CpK-tal.szemben diffundáltak. Az immundiffuziós vizsgálatokhoz általában alkalmazott antigénkoncentrációk esetében (10-15 mg/ml fehérje tartalmú CpK) a precipitációs sávok a következőképpen helyeződtek el. Amint a 3. és 4. ábrán látható, valamennyi precipitációs vonal közül a legerősebb rendszerint a vérsavótartály közelében helyeződött.

Ez a vonal a precipitáló vérsavók esetében mindig kialakult, és a fertőzöttség 30. napjától kezdve valamennyi állat vérsavója következetesen létrehozta. Ettől a vonaltól az antigéntartály felé haladva két precipitációs sávot lehetett megfigyelni. Ezek erőssége azonban vérsavónként változott, rendszerint az előzőnél gyengébbek voltak, a diffúzió során később is fejlődtek k i, és következetesen csak az ujrafertőzött állatok vérsavói alakították ki. Az emiitett vonalakon kivül a 15 ujrafertőzött állat közül ötnek a ráfertőzést.követő 40. napon vett vérsavója még egy nagyon vékony precipitációs sávot alakitott ki közvetlenül a vérsavótartály mellett (4/A és 4/B ábra). A különböző precipitin-aktivitásu vérsavókat kombinált rendszerben CpK-tal szemben összehasonlítva, az egyes vérsavók által précipitait vonalak egymással összefolytak (3«ábra), jeléül annak, hogy a vérsavókban azonos antigénkomponenssel vagy komponensekkel reagáló ellenanyagok voltak. A CpK-tal agarlemezben pozitiven reagáló vérsavók precipitációt hoztak létre a TpK, CpSE és a TpSE antigénoldatokkal is. A négy antigénpreparátumot kombinált rendszerben összehasonlítva az e- gyes antigénoldatokkal szemben kialakult precipitációs sávok a- zonossági reakciót adtak (4. ábra). Hangsúlyoznom kell azonban, hogy az egyes precipitációs vonalak a különböző vérsavók esetében - mivel a vérsavók ellenanyag-tartalma erősen változott - más és más antigénkoncentrációnál alakultak k i optimálisan. Ennélfogva valamennyi precipitációs vonalat egyrészt nem lehetett egyetlen lemezen demonstrálni, másrészt a nativ, nem koncentrált vérsavók használatával a nagyon gyenge vonalak fúzióját nem mindig lehetett megnyugtató módon elbirálni. A vér savók ammóniumszulfátos kicsapással végzett koncentrálása után azonban a precipitációs sávok sokkal kifejezettebbekké váltak, s e- zért a koncentrátumok segítségével kétségtelenül meg lehetett állapítani, hogy a CpK, TpK, CpSE és a TpSE antigénoldatokban egyaránt azonos komponensek precipitálódtak. A fertőzőképes cysticercusok teljes kivonatának savban oldódó frakciójával szemben ugyanazok a precipitációs vonalak alakul-

3. ábra: A precipitinek kimutatása a fertőzött nyulak vér savójában agargéldiffuziós-precipitációs próbával. A rezervoárok a következő reagenseket tartalmazzák: 1, 2.» 2» 4 és 5«Az első fertőzést követő 50.~ napon vett vér savók: 7, 8, 9. és 10. A második fertőzés utáni 40. napon vett ve"rsavók: 11. CpK (10 mg fehérje/ml). Fig. 3: Detection of antibodies in serum of infected rabbits by gel diffusion precipitin test. Wells were filled as follows: 1, 2, 3, 4 and 5: serum samples taken on the 50th day after primary infection; 6, 7, 8, 9 and 10: serum samples taken on the 40th day after secondary infection; 11: CpE (10 mg protein/ml). 4. ábra: A T. és C. pisiformis antigénjeinek géldiffuziós analízise fertőzött nyulakból származó vérsavókkal. A rezervoárok a következő reagenseket tartalmazzák: l_j_ és 7. CpK (15, illetve 10 mg fehérje/ml); 2_j_ TpK I (14 mg fehérje/ml); 3_ és 4- A második fertőzés után a 40. napon vett vér savók: 5_ és 9_. Normál nyul vér savó; 6. CpSE (9 mg fehérje/ml)^ ^8 TpSE (9 mg fehérje/ml); 10 és 11_. A második fertőzés utáni 20. napon vett vér savók; 12_. A CpK savban oldódó frakciója (10 mg fehérje/ ml). Fig. 4: Gel diffusion analysis illustrating reactions between different antigen preparations of T. and C. pisiformis and serum samples from infected rabbits. Wells were f i l l e d as follows: 1 and 7: CpE (15 and 10 mg protein/ml, respectively); 2: TpE (14 mg protein/ ml); 3 and 4: serum samples taken on the 40th day after secondary infection; 5 and 3: normal rabbit serum; 6: CpSE (9 mg protein/ml); 8: TpSE (9 mg protein/ml); 10 and 11: serum samples taken on the 20th day after secondary infection; 12: acid soluble fraction of CpE (10 mg protein/ml). 5. ábra: C. pisiformisszal mesterségesen immunizált nyulak vérsavojanak géldiffuziós vizsgálata. A rezervoárok a következő reagenseket tartalmazzák: 1, 2_, 3 és 4. Anti-Cp nyul immunsavók; 5«Normál nyulvérsavo; 6. CpK (15 mg fehérje/ml); 7. PBS (0,01 M,pH 7,1). Fig. 5: Gel diffusion analysis illustrating reactions between CpK and anti-cp serum. Wells were filled as follows: 1, 2, 3 and 4: serum from rabbits artificially immunized with C. pisiformis antigens; 5: normal rabbit serum: 6. CpE (15 mg protein/ml); 7: PBS (0,01 M, ph 7.l).

4. ábra

tak ki, mint amik a CpK-tal szemben is kifejlődtek, és az egyes precipitációs sávok egymással teljesen összefolytak (4/B ábra). Az ellenanyagok CpK-tal végzett adszorbeálása teljesen megszüntette a vérsavók reaktivitását valamennyi antigénpreparátummal szemben. A T. pisiformisszal, illetve C. pisiformisszal mesterségesen immunizált nyulak precipitin-titere nagyon magas volt. Az anti- Tp, illetve anti-cp nyulimmunsavók még az lí2 *" ^ higitásu TpK-tal, illetve CpK-tal (15 mg fehérje/ml) is jól látható precipitációs csikót alakítottak ki;a homológ kivonatokkal reagáltatva 6-9 precipitációs vonalat hoztak létre (5. ábra). Megbeszélés CAMPBELL (4) mutatta ki először, hogy a T. pisiformis (Bloch, 1780) Gmelin 1790 lárvaformájával fertőzött nyulak vér savója o- lyan ellenanyagokat tartalmaz, amelyek e féregből készített specifikus poliszacharid-antigénnel (3) gyürüs-precipitációs próbában reagálva precipitációt hoznak létre. TRAWINSKI (31) leirása szerint preparált lárvakivonattal később SUL'C és ISZ- MAGILOVA (30) kapott pozitiv reakciókat a fertőzött nyulak vérsavójából ugyancsak gyürüs-precipitációs technikával. SILVERMAN (23, 24, 25) lárvaprecipitációs módszerrel tudott ellenanyagokat kimutatni. Az in vitro kikeltetett oncosphaerákat a fertőzött állatok vérsavójába helyezve, az aktiv oncosphaerák teste és az un. penetrációs mirigy secretumai körül mikroprecipitátumok képződtek, amit e szerző az élő oncosphaerák antigénhatásu produktumai és a vérsavókban lévő adekvát ellenanyagok közti reakció következményének tartott. Ilyen reakciókat legkorábban a fertőzést követő második héten észlelt, maximum 1:16-1:32 a- rányban higitott vérsavókban. A reakció titere azonban függött az állatok fertőzöttségének erősségétől, és esetenként pozitiv reakciók l:64-es higitásu vérsavókban is előfordultak.

Géldiffuziós precipitációval végzett vizsgálatok során a fertőzött állatok vérsavója agargélben precipitációs hozott létre a somaticus antigénkivonatokkal, s ezért az agargéldiffuziós-precipitációs próba is alkalmas módszernek bizonyult e féregfaj antigénjei ellen ható antitestek kimutatására (19). T. pisiformí3-oncosphaerák inváziója nyomán kialakuló precipitin-válasz jellemzésére ezideig nem történtek részletes vizsgálatok. Csupán a precipitáló ellenanyagok dinamikájáról közölt SUL'C és ISZMAGILOVA (30) adatokat. Különböző erősségű fertőzéseknek kitett nyulakon végzett kísérletekben e szerzők csőprecipitációs próbával már a fertőzést követő második napon kimutattak ellenanyagokat a vérsavókban. A reakció a fertőzöttség 10-20. napja között volt a legkifejezettebb, ebben a periódus- 7 bah vett vérsavók még az 1:10 higitásu lárvakivonattal is pozitívan reagáltak. Később a reakció fokozatosan gyengült, és a 90. napon a próba rendszerint negativ volt. A fertőző petedózistól függetlenül a reakció dinamikája az egyes állatokban általában hasonló volt, és semmilyen összefüggést sem találtak a fertőzés intenzitása ás az ellenanyagok mennyisége, illetve e- zek kimutathatóságának időtartama között. A reinfekció nem idézett elő észrevehető ellenanyag-szaporulatot, bár az ismételt fertőzések után észleltek némi erősödést a reakció intenzitásában. Ez azonban egyáltalán nem állt arányban a fertőző dózissal, rendszerint gyorsan eltűnt, és a 90. napra a reakció éppúgy negatiwá vált, mint a csak egyszer fertőzött állatok esetében* Ebben a dolgozatban közölt vizsgálataink eredményei több kérdésben is ellentétesek SŰL»C és ISZMAGILOVA (30) előbb emiitett megállapításaival, Igy a fertőzés után 11. napnál korábban e- gyetlen esetben sem tudtunk precipitáló antitesteket a vérsavókban agargéldiffuziós-precipitációval CpK segítségével kimutatni, a 30. naptól kezdve viszont egészen a megfigyelési idő végéig (100. nap a fertőzés után) minden kisérleti állat vér savója précipitait. Az ellenanyag-termelés lefolyását is általában az jellemezte, hogy a fertőzöttség második hetétől kezdve a vérsavók precipitin-tartalma fokozatosan emelkedett, és a 4O-

70. nap között érte el a maximumot. Ebben a periódusban fordultak elő a legnagyobb ellenanyag-titerek, amelyek azonban soha nem haladták meg az antigénként használt 10 mg/ml fehérjetartalmú CpK 1:128-as higitását. A fertőzöttség 70. napjától az ellenanyag-tit er csökkent, de még a fertőzést követő 100. napon is minden állat vérsavója kimutatható mennyiségben tartalmazott precipitáló antitesteket. Ez a titercsökkenés feltehetően az élősködő ama biológiai sajátságával van szoros kapcsolatban, hogy a májból kijutott cysticercusok végleges tartózkodási helyükön, a hashártyán megtelepedve betokozódnak, éé mintegy 7 hét alatt elérve a fertőzőképes stádiumot, fejlődésük befejeződik. Ettől az időponttól kezdve növekedésük lényegében megáll, anyagcseréjük is lassabb ütemű, ennélfogva megszűnik, vagy legalább is tetemesen lecsökken az a massziv antigénhatás, amely a fertőzöttség korábbi szakaszában éri a megtámadott gazdaállatot annak folytán, hogy a fiatal, növekedésben lévő, élénk anyagcserét folytató élősködők antigénhatésu produktumai közvetlenül a keringésbe kerülnek. Az ujrafertőzött állatok vérsavóival kapott eredmények alapján arra következtethetünk, hogy az oncosphaerák ismételt támadása nyomán fokozott mértékű ellenanyag-termelés indul meg, ami nyilván a reinfekcióval bejutott élősködők szolgáltatta antigénstimulusra vezethető vissza. Ezt a reakciót azonban nehéz "klasszikus" másodlagos immunválaszként felfogni, mivel abban nyilvánult meg, hogy egyrészt a precipitin-titer a reinfekció után fokozatosan emelkedett, és a 40. napon átlagosan két kitevővel volt magasabb, mint az első fertőzés után észlelt t i t e - rek, másrészt az immundiffúziós analízisek tanúsága szerint az ujrafertőzött nyulak vérsavója olyan antigénkomponensek ellen ható precipitineket is tartalmazott, amelyek a csak egyszer fertőzött állatok vérsavójában nem fordultak elő. Sajnos, későbbi időpontokban a vérsavókat nem vizsgáltuk, ezért arra vonatkozóan, hogy a reinfekciót követően a továbbiakban miként a- lakul a vérsavók precipitin-tartalma, még ujabb vizsgálatok szükségesek. k precipitinek dinamikáját illetően SUL'C és ISZMAGILOVA (30)

fent említett megállapításai és a saját észleleteink között le vő eltérések nem magyarázhatók a kísérlethez felhasznált állatok és a peteanyag, továbbá az antigén-preparátumok különbözőségével, hanem valószínűleg az alkalmazott szerológiai módszerek eltérő érzékenységének tulajdonithatók. A T;_ és C. pisiformis ellen ható anti-vérsavókkal végzett immundiffúziós analízisek eredményei alapján azt állapithatjuk meg, hogy a féregfajnak és lárvaformájának sómat1 eus kivonata komplex antigenitásu, minimálisan 6-9 komponenst tartalmaz. A fertőzött nyulak vér savójában található antitesteknek a különböző antigén-preparátumokkal elvégzett immundiffúziós analíziséből pedig egyértelműen az a következtetés vonható le, hogy a T. pisiformis-oncosphaerák inváziója a nyulakban komplex precipitin-választ indukál, ami összhangban van más féregfertőzöttségek esetében tett megfigyelésekkel (28). A vérsavókban legalább négy eltérő specifitásu precipitáló antitest fordul elő. Hangsúlyozandó azonban, hogy a vér savók precipitin-aktivitása egyedenként erősen változott, amit a kisérleti állatok eltérő egyedi reagálóképességén kivül elsősorban talán annak a körülménynek lehet tulajdonítani, hogy - bár a fertőzéseket mindig azonos módon, ugyanazokkal az eszközökkel és főleg ugyanabból az anyagból származó petékkel végeztük - az egyes állatokban különböző számú élősködő telepedett meg. A különböző számú e- gyedből álló parazitapopulációk pedig kvantitative eltérő antigénhatásu anyagot produkálhattak, ami aaután eltérő mennyiségű precipitin termelődésére vezetett. Azt, hogy a termelődő ellenanyagok mennyisége szorosan az antigén-dózistól függ, többféle antigén-ellenanyag rendszer esetében is igazolták (2, 7, 10, 13, 29). Arról azonban, hogy a vérsavók precipitin-aktivitása és a fertőzöttség intenzitása között a féregfaj esetében ilyen közvetlen kapcsolat valóban fennáll-e, nincsenek kisérle,ti adatok. A fertőzött nyulak vérsavójában kimutatott négy eltérő specifitásu precipitinnel specifikusan reagáló antigén-determinánsokat hordozó komponenseket a kifejlett férgek és a cysticercusok somaticus kivonatában, valamint az un. "secretum és exeretum an-

tigének"-ben egyaránt megtaláltuk, és ugy látszik, hogy ezeket az antigénö'ssze tevőké t a somaticus kivonat savban oldódó frak ciója tartalmazza. Az a megfigyelésünk, hogy az ujrafertőzött állatok több antigéntipus ellen ható precipitint produkáltak, mint a csak egyszer fertőzöttek, több módon magyarázható. Lehet, hogy az egyszer fertőzött állatok vérsavójában meg nem ta lált ellenanyag-tipusok termelődéséért felelős antigének a primer fertőzés során egyáltalán nem képződnek, hanem csak a reinfekció folyamán, a megelőző fertőzés nyomán már bizonyos fokú immunitásra szert tett gazdaszervezet fokozott védekezése folytán elpusztuló és széteső parazitákból szabadulnak fel. Az is lehetséges, hogy képződnek ugyan, de mennyiségük alatta marad annak a küszöbértéknek, ami az agargéldiffuziós-precipitációs próbával kimutatható ellenanyag-mennyiség termelésének megindításához szükséges. Erre vonatkozóan azonban semmilyen direkt bizonyítékkal nem rendelkezünk. Egyáltalán nem ismerjük e féregfaj teljes antigénmozaikját, és azt sem tudjuk, hogy a somaticus anyagok és az élő paraziták produktumai között p_itigenitás tekintetében milyen Összefüggés van. Az általunk készitett "secretum és excretum antigén"-ben és a somaticus antigénkivonatokban a fertőzött nyulak vérsavója azonos komponenseket mutatott ki. Ezeknek a kérdéseknek a tisztázása azonban csak a parazita antigénszerkezetének teljesebb megismerése révén lesz lehetséges. Köszönetnyilvánítás. A szerző ezúton is hálás köszönetét fejezi ki HALASI Ilona és CSÁSZÁR Istvánné laboratóriumi asszisztenseknek a munka során nyújtott értékes technikai segitségért. NÉMETH, I.: Studies on Humoral Antibodies in Experimental Infections of Rabbits with Cysticercus pisiformis (Bloch, 1780) I. General Characteristics of Precipitin Response The precipitin response of rabbits to experimental infection with Cysticercus pisiformis has been studied by agar gel diffusion precipitin test using somatic extracts and "secretions and

excretions" of Taenia pisiformis and Cysticercus pisiformis as antigens. Rabbits 6 to 7 weeks old, weighing 700-900 gm, were infected orally with 500 T. pisiformis eggs, and 60 days later some of them received a reinfection with 10 000 eggs. On the 100th day after the primary infection, all animals were killed and examined. Serum samples were taken at different times after the infection and were tested for the presence of precipitins to somatic and "metabolic" antigens of T. pisiformis and C. pisiformis by double diffusion method, using the combined system. Precipitating antibodies could f i r s t be detected on the 11th day after the infection, and all rabbits produced detectable amounts of precipitins from the 30th day. The dynamics of the antibody response were characterized by a gradual increase of the mean titre from the second week of infection, with a peak between days 4-0 to 70 followed by a noti ceable decrease. Rabbits responsed to reinfection with an increased synthesis of precipitins. The invasion of T. pisiformis oncosphaeres induced a complex precipitin response in the rabbits: four precipitating antibodies of different specificity were detected. The precipitin activity of the serum samples from individual rabbits varied considerably. The serum from reinfected rabbits contained precipitins against wider spectrum of antigens than serum from rabbits that received only a single infection. Antigenic components reacting specifically with precipitins in the serum of infected animals were found in both whole extracts and "secretions and excretions" of T. pisiformis and C. pisiformis, and also seem to be contained in the acid-soluble fraction of Cysticercus extract. Saline-soluble whole extracts of T.pisiformis and C. pisiformis are antigenically complex, each consisting of at least 6 to

9 antigens, as show with antiserum produced in rabbits against tapeworm and Cysticercus material. The significance of these findings is discussed in terms of the antigenic composition of T. pisiformis and C. pisiformis. Irodaiom 1. BACHMANN, P. A.: Versuche zur Immunisierung von Kaninchen gegen Cysticercus pisiformis. - Thesis Diss. Berlin, 1964. 2. BACKHAUSZ, R.: Immunodiffusion und Immunoelektrophorese. - Akadémiai Kiadó, Budapest, 1967. 3. CAMPBELL, D. H.: The immunological specificity of a polysaccharida fraction from some common parasitic helminths. - J. Parasit., 23_, 348-353. 1937. 4. CAMPBELL, D. H.: The specific absorbability of protective antibodies agains Cysticercus crassicollis in rats and C. pisiformis in rabbits from infected and artificially immunized animals. - J. Immunol., 3_5_, 205-217. 1938. 5. CHASE, M. W. - WILLIAMS, C. A.: Protein analysis. - In: Methods in Immunology and Immunochemistry. Vol. I I., Ed. by C.A. Williams and M.W. Chase, Acad. Press, New York and London, 1968. 6. CRAIG, L.C.: Dialysis and ultrafiltration. - In: Methods in Immunology and Immunochemistry. Vol. I I., Ed. by C.A. Williams and M.W. Chase, Acad. Press, New York and London, 1968. 7. EDSALL, G.: Immunization. - Ann. Rev, Microbiol., 9, 347-368. 1955. 8. GEMMELL, M.A.: Natural and acquired immunity factors inhibiting penetration of some hexacanth embryos through the intestinal barrier. - Nature, 194, 701-702. 1962.

9. GEMMELL, M. A.: Immunological responses of the mammalian host against tapeworm infections. I I. Species specificity of hexacanth embryos in protecting rabbits a- gainst Taenia pisiformis. - Immunology, 8, 270-280. 1965. 10. JOHNSON, A. G.: Effect of massive antigen dosage on antigen retention and antibody response in rabbits. - Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 88, 421-427. 1955. 11. KERR, K. B.: Immunity in rabbits against one of its cestode parasite, Cysticercus pisiformis. - J. Parasit., 20, 328 (suppl.). 1934. 12. KERR, K. B.: Immunity against a cestode Darasite, Cysticercus pisiformis. - Am. J. Hyg., 22, 169-182. 1935. 13. KRAFT, S. C. - ROTHBERG, R. M.: The effect of single low antigen doses on immunologic responsiveness in adult rabbits. - J. Immunol., 102, 100-106. 1969. 14. KÜHN, 0.: Methode der Titerberechnung mit Hilfe duadischer Logaritmen. - Z. Immunitätforsch. Exp. Ther., 116, 429-438. 1959. 15. LEONARD, A.B.: The accelerated tissue response to Cysticercus pisiformis in passively immunized rabbits. - Am. J. Hyg., 32, 117-124, 1940. 16. LEONARD, A. B. - LEONARD, A. E.: The intestinal phase of the resistance of rabbits to the larvae of Taenia pisiformis. - J. Parasit., 27, 375-378. 1941. 17. LIEBMANN, H. - BOCH, J.: Untersuchungen an Cysticercus pisiformis-befallenen Kaninchen. - Berl. Münch. Tierärztl. Wschr., T3, 123-125. I960. 18. MILLER, H. M., Jr. - KERR, K. B.: Attempts to immunize rabbits against a larval-cestode, Cysticercus pisiformis. - Proc.Soc. Exp.Biol.Med., 2_9_, 670-671. 19. NÉMETH, I. : Immunological study of rabbit cysticercosis, I. The suitability of agar gel diffusion precipitation and indirect hemagglutination tests. - Z. Immun- und Allergieforsch., 128, 468-482. I965. 20. NÉMETH, I. : Immunological study of rabbit cysticercosis,ii. Transfer of immunity to Cysticercus pisiformis(bloch, 1780) with parenterally administered immune serum or

lymphoid cells. - Acta Vet. Acad. Sei. Hung., 20, 69-79. 1970. 21. POCELUEVA, V. A.: Znacsenie faktora intenszivnoszti invazii V immunitete pri ciszticerkoze krolikov. - Trud.Inszt. Vet. Kazfiliala. VASZHNIL., 7, 225-251. 1955. 22. POCELUEVA, V. A.: 0 szuperinvazionnom i vozrasztnom immunitete u krolikov k ciszticerkozu. - Szborn. Rab. po Gel'mint. 60 - l e t i j u szo gnja rozsdeniia R.Sz. Sul ca, Kazakszkoe Gosz. Izd. 348-355. 1956. 23. SILVERMAN, P. H.: Studies on the biology of some tapeworms of genus Taenia. I. Pactors affecting hatching and activation of taeniid ova, and some criteria of their viability. - Ann. Trop. Med. Parasit., 48, 207-215. 1954. 24. SILVERMAN, P. H.: A technique for studying the in vitro effect of serum on activated taeniid hexacanth embryos. - Nature, 176, 598-599. 1955. 25. SILVERMAN, P. H.: Specific and non-specific in vitro serum reactions to active taeniid hexacanth embryos. - Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg., 0, 8. 1956. 26. SILVERMAN, P.H.: A concept of host-parasite immunologic relationships. - In: Proc. 20th Annual Biol.Colloquium, Corvallis, Oregon State University Press, 117-126. 1965. 27. SIMA, I. : A Taenia és Cysticercus pisiformis elleni immunitás. - Állatorvosi Lapok, 1-4. 1937. 28. SINCLAIR, I. J.: The relationship between circulating antibodies and immunity to helminthic infections. - In: Adv. in Parasitology. Vol. 8., Ed. by B. Dawes, Acad. Press, London and New York, 1970. 29. STEVENS, K. M. : Some considerations of the antigen dose-antibody response relationship. - J. Immunol., 76, 187-191. 1956. 30. SUL'C, R. Sz. - ISZMAGILOVA, R. G.: Izucsenie immunologicseszkih reakcij na ekszperimental'noj model! krolik- -ciszticerk piziformnüj. - In: Parazitü 1 parazitozü cseloveka i zsivotnüh, Kiev, 1965.

31. TRAWINSKI, A.: Über Anwendung der Präcipitinreaktion Nachweis der Schweinezystizerkose. - Zbl. Bakt., 136. 116-120. 1936. Érkezett: 1971. május 3. Dr. NÉMETH I. MTA. Állategészségügyi Kutató Intézete Budape st XIV., Hungária krt 21.