FOTORECEPTOROK ELOSZLÁSA ÉS FEJLŐDÉSE

FOTORECEPTOROK ELOSZLÁSA ÉS FEJLŐDÉSE Dr. Szepessy Zsuzsanna Semmelweis Egyetem Humánmorfológiai és Fejlődésbiológiai Intézet Budapest 2001

Tartalomjegyzék Összefoglaló...1 Summary...3 Bevezetés...5 A szem fejlődésgenetikai megközelítése...6 Fotoreceptorok...8 Színlátás...10 Célkitűzés...15 Irodalmi háttér...19 A fotoreceptorok eloszlása emlős retinában...19 A színspecifikus csapok eloszlása emlős retinában...21 Heterogenitás a csapok eloszlásában...23 A térbeli elkülönülés biológiai jelentősége...28 Az átmeneti zóna...29 A csapok fejlődése...30 A színspecifikus csapok megjelenési sorrendje...30 A csapok fejlődése in vitro...32 Retinatranszplantáció...32 Retinális szövettenyésztés...33 Az osztott retinájú egér fotoreceptorainak fejlődése...36 A homogén eloszlású patkány retina fotoreceptorainak differenciálódása..37 Módszerek...40 A retinális csapok elkülönítése...40 Immuncitokémia...42 Jelölési módszerek...43 Alkalmazott ellenanyagok...44 Lektincitokémia...46 A kísérleti állatok kiválasztása...47 A retina kísérleti előkészítése...48 Immuncitokémia és lektincitokémia alkalmazása...49 Kiértékelés...50 Számítógéppel segített feldolgozási folyamat...50 Eredmények...53 A nyúl retinájának vizsgálati eredményei...53 A denevér retinájának vizsgálati eredményei...61 Megbeszélés...64 A fotoreceptor-sejtek születése...64 A főemlősök fotoreceptorainak eloszlása...65 A fovea fejlődése...67 A színlátás hibái...69 Retinális degenerációk...70

A retinatranszplantáció kérdései...71 Két út a csapok differenciálódásában...72 A látópigment koexpresszió tér- és időbeli összehasonlítása...74 Köszönetnyilvánítás...76 Irodalomjegyzék...77 Előadások, poszterek...89 Az értekezés témájában megjelent saját közlemények...91

Összefoglaló A színlátást különböző látópigmenteket tartalmazó fotoreceptor-típusok határozzák meg. A fotoreceptorok közötti morfológiai és biokémiai különbségek lehetőséget adnak arra, hogy emlősökben feltérképezzük a színspecifikus csapok eloszlását. Az immuncitokémia, a spektrális érzékenység alapján, láthatóvá teszi a változatos csap-mintázatokat. Fontos kérdés, ezen csap-mozaikok fejlődése. A retinakutatásban széleskörben használt állatot, a nyulat választottuk ki, hogy a csaptípusok (rövidullám- és közép/hosszúhullám-érzékeny) differenciálódását, digitális képfeldolgozás segítségével, tanulmányozzuk fejlődő retinában. Vajon a fejlődő patkány és mongolhörcsög retinájában kimutatott időbeli, átmeneti látópigment koexpresszió általános érvényű valamennyi emlősben? A kérdés vizsgálatára két monoklonális látópigment-ellenes antitestet (COS-1 és OS-2) alkalmaztunk retinális wholemountokon és tangenciális sorozatmetszeteken. A COS-1 ellenanyag a közép- és hosszúhullám-érzékeny csapokra specifikus, míg az OS-2 a kék csapokat jelöli meg. A látópigmentek megjelenési sorrendje az egyedfejlődés során megegyezett azzal, amit az eddig vizsgált emlősökben találtak. Az első immunopozitív fotoreceptorok a pálcikák voltak. Az immunopozitív rövidhullám-érzékeny (S) csapok jelentek meg ezután, a 2.-3. posztnatális napon, és a közép/hosszúhullám-érzékeny (M/L) csapok alakultak ki utoljára. Fejlődő nyúl retinában átmeneti látópigment koexpressziót nem sikerült kimutatni. A csapok differenciálódása vizsgálataink szerint két különböző úton valósulhat meg. Az egyik lehetőség a csapok fejlődésére a transzdifferenciálódás. Először a fiatal posztnatális retinában minden csap S pigmentet termel, majd ezek közül sok csap a másik (M) pigmentet kezdi expresszálni. Egy ideig mindkét látópigment megtalálható ugyanabban a sejtben. Ezekből az ún. kettős csapokból, alakulnak ki a definitív zöld csapok, miután a kék fotopigmentek eltűnnek a kültagokból. Néhány csap azonban nem alakul át, hanem megőrzi a kék pigment termelését az egész élet folyamán, rövidhullámérzékeny marad. A másik útja a csapok fejlődésének transzdifferenciálódás nélkül zajlik le. Nem fordulnak elő kettős csapok, minden csap a látópigment-expresszió első pillanatától kezdve vagy csak S pigmentet vagy csak M pigmentet termel.

A nyúl mellett a gyümölcsevő Megachiroptera alrend denevérfajainak retináit is tanulmányoztuk. Ezen fajok fotoreceptor rétegének bel- és kültagjai nem egy síkban helyezkednek el, hanem sajátos kriptákat alkotnak. Lehetséges, hogy a retina ezen follikuláris szerveződése elsősorban a környezet fény-periodicitásának érzékelésére szolgál, mivel a gyűrt retina kétdimenziós képek dekódolására nyilvánvalóan nem képes.

Summary Color vision is mediated by photoreceptor cell classes housing different visual pigments. The differences of morphological and biochemical characteristics between various photoreceptor types enable us to map the distribution of color-specific cones across the retina. Immunocytochemistry provides a means to distinguish among spectrally different cone types. This method has revealed the occurence of various photoreceptor distribution patterns in mammals. An important question is the development of various cone mosaics. The rabbit, an animal widely used in retinal research was selected. The differentiation of short-wave and middle-to-long-wave sensitive cone types was studied with digital image processing in the developing rabbit retina. The primary goal of our investigations was to decide whether the temporary coexpression of cone visual pigments in the developing rat and gerbil retina is a universal feature of all mammals. Immuncytochemistry with two monoclonal anti-visual pigment antibodies, COS-1 and OS-2, respectively, was used on retinal wholemounts and consecutive tangential semithin sections. COS-1 is specific for middle-to-long (M/L) wave sensitive cones, whereas OS-2 selectively labels the short (S) wave sensitive cones. The sequence in which the visual pigments start to be expressed is the same as that observed in other mammals. The first immunopositive cells to appear were the rods. Immunopositive S-cones appeared on the 2 nd -3 rd postnatal days, and M/L-cones were the latest photoreceptor elements to be detected. No visual pigment coexpression was observed in the developing rabbit retina. Two different basic mechanisms are proposed for the differentiation of the cone types. One possible mechanism of cone development is via transdifferentiation. At first, in the early postnatal retina all cones contain only S pigment, then most of these cones start to express the other (M) photopigment. Temporarily, both pigments are present in the same cell. These cones are identified as dual cones. The dual cones turn to be definitive green cones, after the blue pigment disappears from the outer segments. Some cones still keep producing blue pigment throughout their lifetime. These latter cones that do not undergo the shift give the definitive shortwave-sensitive cones. The other

way, in which cones can develop is without transdifferentiation. There are no dual cones at any time in the juvenile animals of these species. All cones are predestined to be either S cones or M cones. Besides of the rabbit, the retina of the Megachiroptean fruit eating bats was studied. The retina of these species forms folds and crypts in its photoreceptor layer. Since a folded photoreceptor layer is obviously not viable for decoding two-dimensional images, we suppose that this organization serves for a photometer task of the eye.

Bevezetés A fénynek kitüntetett szerepe van az élőlények életében. Már a növények és a legalacsonyabb rendű állatok is képesek a fény érzékelésére. Jól ismert a növények fototaxisa, illetve az egysejtű állatok sejtplazma mozgása fény hatására. Az alacsonyabbrendű soksejtű élőlényekben (pl. egyes csalánozók, gyűrűsférgek, kagylók, tüskésbőrűek) a fényinger felvételét a kültakaróban elszórtan elhelyezkedő látósejtek végzik. Ezek a sejtek a fénynek kitett testfelszíneken vagy a test egészén megtalálhatók, azonban csak a fény intenzitásbeli különbségének elkülönítésére teszik alkalmassá az állatot. A fejlődés során a látósejtek csoportokba rendeződnek. Szerkezeti, működési egységet hoznak létre; ez lesz a retina, amelyre a külvilág képe vetül. Kiegészülve más sejtekkel és segédszervekkel létrejön a látószerv, a szem. A törzsfejlődés során fénylátásra (szemfolt), iránylátásra (pigmentkehelyszem, serlegszem) és képlátásra (hólyagszem, összetett szem) alkalmas szemtípusok alakultak ki. A csalánozók az első törzs, amelynek néhány faja már rendelkezik komplex fényfelfogó szervvel. A polip fajokban általában az epidermiszben még szétszórtan elhelyezkedő neuroszenzoros sejtek szolgálják a fényfelfogást. Más csalánozóknál, egyes medúzákon, már kifelé dudorodó érzékpárnát: pigmentfolt-ocellust, vagy ennek az epidermiszrésznek a mélybe süllyedt változatát, a serlegszemet találjuk. Itt figyelhető meg először a receptorsejtek és pigmentsejtek váltakozó elhelyezkedése, ami egyszerű formája lehet a retinának. Evolúciós szempontból fontos, hogy mikor jelenik meg az ún. inverz szem, amikor a fénynek az egész retinán át kell haladnia, mert az ideghártya fényérzékeny része a pigmentsejtek felé néz. Ez a laposférgek pigmentkehelyszeménél figyelhető meg először, ahol a pigmentsejtek kehelyszerűen veszik körül a látósejteket és csak bizonyos irányból jövő fénysugarat érzékelhetnek. A legfejlettebb, képalkotásra alkalmas szemtípusok az összetett szem és a hólyagszem. Az összetett szem az ízeltlábúak törzsére jellemző. Egységei az ommatidiumok, amelyekből egy-egy szemben fajtól függően néhány vagy több ezer darab található meg. Mindenegyes ommatidium rendelkezik egy fénytörő (kitinlencse, kristálykúp) és egy fényfelfogó résszel, amelyeket pigmentsejtek (pigmentköpeny) választanak el egymástól [113]. A

hólyagszem egyszerűbb formája a gyűrűsférgeken jelenik meg, legfejlettebb típusai pedig a puhatestűeken és a gerincesekben találhatók meg. A szem fejlődésgenetikai megközelítése Az elmúlt évtized molekuláris biológiai kutatásainak eredményei megváltoztatták az élővilág fényérzékelő szerveinek fejlődéséről, evolúciójáról alkotott képet. A látórendszer fejlődésének fontos kérdése az, hogy egyetlen közös őstől származnak-e a különböző szemtípusok. Sokáig azt tételezték fel, hogy az evolúció során egymástól függetlenül, mintegy negyven különböző ősből jöttek létre az élővilágban előforduló fényérzékelő szervek. Többen azonban a monofiletikus elméletet hangoztatták, azaz a közös őstől származást. Ezt az a tény is alátámasztja, hogy a fény feldolgozása, a jelátvitel, minden élőlényben ugyanúgy zajlik. Az opszin fehérjét a retinál molekulával minden szemben megtalálhatjuk. Az igazán meggyőző ok, amely miatt ma már a monofiletikus eredetet fogadják el, hogy az egész élővilágban a látórendszer fejlődését azonos szabályozó gének irányítják. A legújabb molekuláris biológiai kutatások is ezt bizonyítják. Az egyes fejlődési szakaszokért felelős gének az evolúció évmilliói alatt megmaradtak, konzerválódtak [70]. Az utóbbi évek eredményei közé tartozik, hogy fény derült az oculogenesisben jelentős szerepet játszó homeobox-gének feladatára. A homeobox-gének rendelkeznek egy 180 bázispárból álló szakasszal, amely egy 60 aminosavból álló homeodomént kódol. Ez a szakasz, a DNS molekulához tud kapcsolódni, azaz transzkripciós faktorként működik [42]. Ezen gének között nagyfokú hasonlóságot sikerült kimutatni az evolúció során már korán elkülönült fajok esetében is. A szem fejlődésbiológiájának tanulmányozására az ecetmuslicát (Drosophila melanogaster) használják széles körben. Ez a faj ideális modellje a fejlődésbiológiai kutatásoknak, mert nagyon szapora, sok utód származhat egy pártól, az egyedek olcsón, egyszerűen fenntarthatók. Összesen négy kromoszómájuk van, tehát genomjuk igen kicsi, ezért is kedvezően használhatók genetikai vizsgálatokban. A Drosophilában több homeotikus génről bizonyították, hogy szerepük van az oculogenesisben. A Drosophila gének többségének homológjait pedig az emlősökben is megtalálták.

Az egyik fő szabályozó gén, a Pax-6, amelynek a muslicagenomban lévő megfelelője az eyeless (ey) döntő fontosságú a szem kialakulásában. A Pax-6 homológja egérben a small eye (sey), amely elnevezés jól kifejezi a heterozigóta egyedek jellegzetességét, a normálisnál kisebb szemet. A homozigóta egyedekben egyáltalán nem fejlődik ki a látószerv. A mutáns allélek emberben is hibás fejlődést idéznek elő. Heterozigótákban az irisz hiányát mutatták ki, míg a homozigóta egyedek életképtelennek bizonyultak [23]. Egerekben funkcióvesztéses mutációkkal bizonyították, hogy a Pax-6 homológja nélkül, megkezdődik ugyan a szemhólyag fejlődése, de hamar elcsökevényesedik, a lencseplakod pedig már ki sem alakul. A kutatások nemcsak a funkcióvesztéses mutánsok vizsgálatára tértek ki, hanem arra is, hogy mi történik, ha a Pax-6-ot, illetve homológját ektópiásan fejezik ki. Ha Drosophilában a csápot létrehozó imaginális korongba ültették ezt a gént, akkor a csápok helyén összetett szem alakult ki. Ha a szárnykorongban fejezték ki, akkor a szárny egy része vált szemmé. Olyan kísérletet is végeztek, amikor más faj Pax-6 homológját ültették Drosophila lábimaginális korongjába. Ebben az esetben is szem fejlődött ki a lábak helyén. Mindezen adatok azt bizonyítják, hogy a Pax-6 gén az egész állatvilágban konzerválódott [73, 103]. A Pax család egy másik tagja, a Pax-2, is részt vesz a szem fejlődésében. Ez a gén a szemserlegnyél kialakulásában játszik szerepet. Kimutatták, hogy ezen gén hiányában a retinák fúziója következik be, vagyis létrejön az egyszeműség (cyclopia) [54,55]. A Six-3 gén, amelynek Drosophilában előforduló megfelelője a sine oculis (so), kiemelt szerepet tölt be az oculogenesisben, még a fülhólyag területén is képes szemlencsét indukálni. Kiemelnék néhány további homeobox gént, amelyek a retina fejlődésében jelentős szerepet játszanak. A retina progenitorsejtjeinek proliferációjában, és a különböző sejttípusok differenciálódásában vesz részt az otx2 az Rx génekkel együttműködve [57]. A Spa gén, amely ugyancsak a Pax család tagja, a fejlődő csapsejtek prekurzorában található és hiányában a fotoreceptorok degenerálódnak. Chx 10 a retina bipoláris és pálcika-sejtjeinek differenciálódásában játszik fontos szerepet, míg a Shh a ganglionsejtek rétegének keletkezéséért felelős. Az otx és CRB1 géneket kapcsolatba hozzák a retinitis pigmentosa nevű betegség kialakulásával [103].

Természetesen további vizsgálatok folynak annak érdekében, hogy a szabályozó folyamatokat felderítsék. Ha a szabályozó folyamatok is általánosnak bizonyulnak, és az evolúció egésze alatt megmaradtak, akkor biztosan állíthatjuk, hogy az oculogenesis törzsfejlődésére a monofiletikus elmélet érvényes. Fotoreceptorok A retina fényérzékelő látósejtjei a megnyúlt, neuroepitheliális fotoreceptorok, amelyek a fényenergiát felvéve, képesek azt feldolgozni és kémiai energiává alakítani. Feltételezik, hogy az első fotoreceptor-jellegű sejtszervek a zöld színtestek lehettek. Egyes elméletek szerint a fotoreceptorok olyan sejtekből fejlődtek ki, amelyek rendelkeztek ostorral és az ostor alapi részéhez pigmentgranulumok kapcsolódtak. A zöld szemes ostoros (Euglena viridis) testfelületi szemfoltja (stigma) ezt az elméletet támasztja alá. A gerincesek retinájában előforduló fotoreceptorok két fő típusát ismerjük, ezek a pálcika és a csap. Ezt az empirikus tényt, a duplicitási elv fogalmazza meg. Mind a pálcikákban, mind a csapokban megkülönböztetünk külső szegmenst (kültag), belső szegmenst (beltag), valamint szinaptikus végződést. A külső szegmensek membránból álló, ellapított korongocskákból (sacculus) épülnek fel, amelyek egy felületsokszorozó membránrendszert alkotnak. A fotopigmenteket és a fototranszdukciós kaszkád más elemeit (pl. transzducin, foszfodiészteráz) is ez a rész tartalmazza. A fotopigmentek integráns membránfehérjék, amik egy protein-részből, az opszinból és egy fényérzékeny prosztetikus csoportból, a kromofórból (11-cisz retinál vagy 11-cisz 3,4 dehidro-retinál) tevődnek össze. A kromofór kovalensen kötődik az opszin meghatározott részéhez. A kültagok membránrendszerében zajlik a fototranszdukció folyamata, amelyet röviden a következőképpen írhatunk le: Fény hatására megváltozik a retinál konformációja és foszforilálódik, amely aktivál egy G-proteint, a transzducint. Ez aktiválja a kaszkád következő enzimét, a cgmp foszfodiészterázt, aminek következtében a kültagban csökken a cgmp szint. Ennek hatására pedig a nátriumcsatornák záródnak és hiperpolarizáció jön létre. A reakció leállításában számos

fehérje vesz részt, a legismertebb az arrestin és a fosducin. Az arrestinről kimutatták, hogy csak pálcikákban és kék színre érzékeny csapokban található meg [52, 65]. A pálcikák korongocskái zártak, elkülönülnek egymástól (zárt membránkorong), membránjaik nem folytatódnak a fotoreceptor plazmamembránjában. Ezek a korongok eredetileg a kültag sejtmembránjának betüremkedései voltak, de a fejlődés folyamán attól teljesen elváltak, lefűződtek. A kültag megújulása során a beltag bázisa felől pótlódnak, majd megközelítik a pigmenthámot, ahol az elöregedett rész leválik és a pigmentsejtek fagocitálják őket. A csapok kúp alakú külső szegmensének sacculusai ezzel szemben egymásba, majd a plazmamembránba is átmennek (nyitott membránkorong). Egy összefüggő membránrendszert alkotnak és így az extracelluláris térrel is közlekednek. A kültagokat a retinális pigmenthám nyúlványai veszik körül, amelyek a fotoreceptorok táplálásáról is gondoskodnak. A külső és a belső szegmens között található egy speciális, nem mozgó, rövid cilium, amelyből a központi tubulusok hiányoznak, így csak a 9 2 perifériás mikrotubulus található meg benne. Valójában a kültag ennek a csillónak a módosulataként fogható fel. A belső szegmens része az ellipszoid, amely sok mitokondriumot foglal magába és ezáltal a fotorecepció energiaigényét is biztosítja; a myoid, amelynek endoplazmás retikulumában a proteinek, így a látópigmentek és a fototranszdukciós-lánc fehérjéinek termelése is folyik; valamint a nukleáris régió, amelynek fő eleme a fotoreceptor sejtmagja [32]. A pálcikák gyenge megvilágítási körülmények között, sötétben, félhomályban is képesek a fényingereket felfogni, a szkotópikus látás meghatározói. Mélytengeri vagy éjszakai életmódot folytató, nokturnális állatoknak a homályhoz, sötét fényhez kell alkalmazkodniuk, ezért retinájukban a pálcikák dominálnak. Esetleg tiszta pálcika retinájuk van, megnyúlt kültagokkal vagy két sorban elhelyezkedő fotoreceptorral (pl. éjszakai gekkó). A halaknál, az óceánok mélyén, kb. 750 méter alatti mélységben nincsen semmiféle fény. Több itt élő faj saját jeleket hoz létre, maga gondoskodik a világításról ahhoz, hogy tájékozódni tudjon. Egyesek lumineszkáló vegyi anyagot képesek előállítani, más fajok szerveiben foszforeszkáló baktériumok élnek. Egész telepeket tartanak fenn a fejük, testük oldalán vagy különleges zacskóban. A baktériumok állandóan világítanának, de a tápanyaguk csökkentésével kioltható működésük. Az óceánok mélyén kialvó és felvillanó ritmikus fények ezeknek a baktériumoknak a

működését tükrözik. Az apró lámpáshalak, amelyek a szemük alatti zacskóban tartják baktériumaikat, ezzel a fénnyel képesek biztosítani a raj együttmaradását [111]. A madarak és a hüllők fotoreceptorai különös figyelmet érdemelnek, mivel beltagjaikban olajcseppek találhatók, amelyek színszűrőként funkcionálnak. Természetesen az éjjeli madaraknak nincs szükségük ilyen olajcseppekre, vagy csak egyes fotoreceptorokban fordulnak elő [111]. Bizonyos nokturnális állatok (pl. macska) jellegzetessége a tapetum lucidum, egy erőteljes fényvisszaverő képességgel rendelkező réteg, amely reflexió révén megnöveli a retinára jutó fény mennyiségét. A csapok nappali fényben aktívak, a fotópikus látásért felelősek. Képesek a különböző hullámhosszúságú fénysugarakat megkülönböztetni, azaz a színlátásban van döntő szerepük. A nappal aktív, diurnális fajok között vannak olyanok is (pl. mókuscickány), amelyek csap-gazdag retinával rendelkeznek. A főemlősök retinájának érdekessége, hogy a retina nagy részén a pálcikák vannak túlsúlyban, de rendelkeznek egy speciális területtel, a fovea centralis-szal, ahol kizárólag csapok fordulnak elő. Ez az éleslátás helye. Színlátás A színlátás elméletének megalkotása Helmholtz és Young nevéhez fűződik [1]. A XIX. században feltételezték, hogy az adott színérzetet embernél a három alapszínre (vörös, zöld, kék) maximálisan érzékeny fotopigmentekből eredő impulzusok relatív gyakorisága határozza meg. Mára ezt a feltevést sikerült bizonyítani és egyre inkább megismerjük a színlátás molekuláris genetikai hátterét is. A színdiszkrimináció alapja ugyanis két vagy több csaptípus együttes jelenléte, amelyek a látható fénytartomány különböző részeire érzékeny látópigmenteket tartalmazzák. A látópigmentekben az opszin fehérje az, ami változékony és meghatározza a spektrális érzékenységet. Az állatvilágban előforduló színváltozások létrejöttében azonban a kromofórok is szerepet játszanak. A mimikri, elsősorban az egyed védelme érdekében végbemenő folyamat, de színváltozás a különböző szexuális magatartásokhoz kapcsolódóan is kialakulhat. Bizonyos halfajok pl. az ívás idején gyakran megváltoztatják színeiket, hogy elijesszék vetélytársaikat, felkeltsék a másik nem érdeklődését. A feltűnés, de egyben a megadás jele is lehet a szín megváltoztatása. A látópigment funkciója ezekben

az esetekben nemcsak az opszin-fehérje mutációjával változhat meg, hanem a kromofórok biokémiai átalakulásával is. Halakban, kétéltűekben migráció, metemorfózis során az A1 vitamin aldehidjének (11 cisz-retinál) és az A2 vitamin aldehidjének (11 cisz-3,4-dehidroretinál) aránya változhat meg. Ebben a változásban a fénynek, hőmérsékletnek, hormonoknak lehet fontos szerepük [111]. A csapokat annak alapján osztályozhatjuk, hogy milyen hullámhosszúságú fényre érzékenyek, azaz milyen opszin fehérjét tartalmaznak. A legtöbb emlős fajban kétféle csaptípus van, a dikromácia terjedt el a legszélesebb körben. A kétféle csaptípus: a rövidhullám-érzékeny (kék vagy ultraibolya szenzitív) és a közép-hosszúhullámérzékeny (vörös vagy zöld szenzitív) csap-populáció. A rövidhullám-érzékeny csapokat S-csapoknak, az általuk termelt fotopigmentet S-pigmentnek nevezzük. A közép- és hosszúhullámra specifikus látópigmenteket termelő fotoreceptorok pedig az M/L csapok. A megfelelő abszorpciós maximumok fajonként kismértékben eltérnek egymástól. Főemlősökben általában három különböző csaptípus hosszúhullám- (L), középhullám- (M), és rövidhullám-érzékeny (S) található. Ez a trikromácia. 1. ÁBRA A csapok látópigmentjeinek abszorpciós görbéi

Az abszorpciós görbékből leolvasható, hogy a vörös színre specifikus fotoreceptorok leginkább 560 nm-es hullámhosszra érzékenyek (tulajdonképpen narancssárga színtartomány), a zöldek 530 nm-re, míg a kékek abszorpciós maximuma 440 nm-nél található [82]. A rodopszin abszorpciós maximuma 495 nm-nél van. A görbék széles lefutása azt mutatja, hogy egy bizonyos hullámhossz hatására egyidejűleg több csaptípus is aktivált állapotba kerülhet. Sokáig azt tartották, hogy az emlősök szemlencséje nem engedi át az UVsugarakat, így UV-érzékeny csapok sem fordulhatnak elő retinájukban. A rágcsálókban azonban biztosan vannak ilyenek. Jacobs és munkatársai kísérletei nyomán nemrégiben derült csak fény arra, hogy egyes rágcsálókban nem kék, hanem ultraibolya (UV)- érzékeny csapok találhatók [44,45]. Az emlős retina rövidhullám-érzékeny csapjai vagy kék vagy UV érzékenyek lehetnek, ugyanabban a fajban egyszerre mindkettő nem fordul elő. Madaraknál UV-érzékeny csapok már régóta ismertek. Egyes ragadozó madarak áldozatuk, az egerek elterjedését, azok vizelete alapján tudják nyomon követni, a vizelet nyomai ugyanis az UV-fényt nagyobb mértékben verik vissza [99]. A nem-emlős gerincesek színlátásáról csak annyit említenék meg, hogy halakban vagy madarakban négy, illetve öt különböző spektrális érzékenységű látópigment is jelen lehet [26]. Ezekben az állatokban ultraibolya-érzékeny csapok is előfordulnak a kékek mellett, és olyan vörös-érzékeny csapok is vannak, amelyek abszorpciós maximuma ténylegesen a vörös színtartományba esik. Bizonyos állatok fotoreceptor mozaikja, színspecifikus csapjainak eloszlása a retinában szabályos, jól elrendezett geometriai alakzatot mutat. Halakban a különböző fényérzékenységű fotoreceptorok elrendeződése általában a fajra jellemző fenotípusos bélyeg, míg a magasabbrendű gerincesekben, emlősökben általában nem beszélhetünk geometriailag szabályos fotoreceptor eloszlásról [5, 18, 85, 86]. A gerincesek ősei adaptálódtak a különböző fényviszonyokhoz, és ennek megfelelően látórendszerük is módosult. A fotopigmentek evolúcióját vizsgálva, valószínűsíthető, hogy közös őstől származtak (2.ábra).

vörös opszin zöld opszin rodopszin kék opszin 2. ÁBRA Az emberi látópigmentek evolúciója. A kék pigment és a rodopszin illetve a vörös és a zöld pigment közös eredete jól látható. A csappigmentek feltehetőleg kb. 500 millió évvel ezelőtt válhattak szét egymástól. Az L és M opszin génjei valószínűleg duplikálódással keletkeztek, ami magyarázhatja nagyfokú homológiájukat. Ez a homológia az emberi vörös- és zöldérzékeny csappigmentek között kb. 96%-ra tehető. A rodopszin és a kék látópigment génje, illetve a vörös-zöld fotopigment génjei között mindössze 47-49%-os a homológia. A kék fotopigment génje a 7., a rodopszin génje a 3., míg a vörös és zöld opszin génjei az X kromoszóma q karján egymáshoz közel, tandem sorrendben találhatók. 1984-86-ban sikerült a humán rodopszin, vörös, zöld, kék opszinok génjeit azonosítani és klónozni [66, 67]. A fotopigmentek mellett komplett, jól fejlett neuronhálózat nélkülözhetetlen a színlátáshoz. A retinára eső fény feldolgozása már a színspecifikus csapokból és pálcikákból felépülő fotoreceptor-mozaikban elkezdődik, és ezen receptorok szoros térbeli kapcsolatára van szükség a színek megfelelő érzékeléséhez. A fotoreceptorok vertikális, a retinára merőleges információátadásán kívül, amely a bipoláris- és a ganglionsejteken keresztül történik, nagyon fontosak a horizontális összeköttetések is. Az ingerületnek a retina síkjával párhuzamos feldolgozása olyan asszociációs neuronokkal történik, amelyek nyúlványai ugyanazon sejtrétegen belül elhelyezkedő, távoli sejtekkel szinaptizálnak. Az amakrin sejtek a stratum plexiforme internum rétegben létesítenek kapcsolatot a bipoláris sejtek között, míg a horizontális sejtek a stratum plexiforme externum rétegben a ganglionsejteket kapcsolják össze. Ezek a sejtek végzik a különböző érzékenységű csaptípusokból érkező szignálok nagyobb

területre történő kiterjedését vagy éppen gátlását, a receptív mezők (opponent color unit) létrehozását, amelyek a színkontrasztok érzékeléséhez szükségesek [60]. A központi idegrendszer segítségével pedig a fényérzékeny elemek térbeli elrendeződésén alapuló színdiszkrimináció is megvalósul.

Célkitűzés A fotoreceptor-típusok morfológiailag és biokémiailag is eltérnek egymástól. Ez segíthet abban, hogy a csapok, pálcikák térbeli eloszlását a különböző fajok retináiban megvizsgáljuk és feltérképezzük. Morfológiai megfigyelésen nyugszik az a tény, hogy a főemlősök fovea centralis-ában, mely a fotópikus látás központja, a pálcikák részleges vagy teljes hiánya mutatható ki. 1866-ban Schultze demonstrálta, hogy emberben ezen a helyen kizárólag csapok vannak, míg a retina más területein mindkét fotoreceptor-típus megtalálható. A csapok hisztológiailag jól láthatóan elkülönülnek a pálcikáktól. Ilyen jellegzetes tulajdonság a beltag nagyobb átmérője, a kültag kisebb hossza, a sejtmag membrana limitans alatti közvetlen elhelyezkedése, a kültag nyitott membránkorongjai. Ezek a jellemvonások tették lehetővé, hogy a csapok eloszlását és elkülönítését a pálcikáktól könnyen meg lehetett valósítani, a fotoreceptorok térbeli és időbeli feltérképezése korán elkezdődhetett. Alacsonyabbrendű gerincesekben az olajcseppek jelenléte, valamint a retinálismozaik szabályossága, és a szigorúan meghatározott térbeli eloszlás nemegyszer már az egyes csaptípusok megkülönböztetését is lehetővé teszi. Az azonosítást megkönnyítik a kettős vagy ikercsapok, amelyek főtagja nagyobb, mint a járulékos kisebb tag, így radier metszeten jól felismerhetők [5, 18, 85, 86]. A hisztokémiai módszerek térhódításával pedig a pálcikák és csapok elkülönítésén túl emlősökben is azonosíthatóvá váltak az egyes csaptípusok. Látópigment-ellenes antitestek és az immuncitokémia megjelenésével rengeteg új információ látott napvilágot. Többek között lehetőség nyílt a retinán belül a különböző hullámhosszra érzékeny csapok térbeli orientálásának felderítésére is. A megkülönböztetés alapját nemcsak a látópigmentek képezhetik, hanem a fototranszdukciós kaszkád pálcika-, illetve csap-specifikus enzimei. Ezen enzimek elleni antitestek segítik a szelektív kimutatást. A lektincitokémia, amely egyes szénhidrátcsoportok jelölésére alkalmas, további módszert biztosít a pálcikák és csapok, illetve egyes csapféleségek elkülönítésre [61, 81]. A fotoreceptorok az ún. interfotoreceptor mátrixon keresztül kapcsolódnak a pigmentsejtekhez, amely sejtkapcsoló struktúrákat, kötőszövetes lemezeket nem

tartalmaz, voltaképpen egy proteoglikán rétegnek fogható fel [9]. A pálcikák és a csapok esetében eltérőnek találták a mátrix szénhidrát komponensét, a pálcika- és csaphüvelyeket. Ezt felhasználva különíthető el egymástól a két fő fotoreceptor-típus. Pl. a földimogyoró lektin (PNA) a csapokat jelöli meg, míg a búzacsíra lektinje (WGA) a pálcikákra specifikus. Az utóbbi években derült fény arra, hogy lektineket használva bizonyos emlős fajokban a kétféle csaptípus között is mutatkozik különbség [96]. A fényérzékelő sejtek retinán belüli feltérképezése, és az így kimutatható mintázat tanulmányozása mellett, a fotoreceptorok differenciálódásának kutatása is nagy lendülettel folyik a látópigment-ellenes antitestek segítségével. A retinális-mozaik normál fejlődésének tanulmányozásakor felvetődnek a következő kérdések: Mikor jelennek meg a különböző fotoreceptorok? Hogyan alakul térbeli elrendeződésük az életkor függvényében? A fotoreceptorok fejlődéséről sok újdonságot sikerült ebben az évtizedben kideríteni. A különböző korú állatok retináinak összehasonlításával nyomon követhetjük a normál fejlődést, míg kísérletes feltételek mellett (retinatranszplantációk, illetve szövettenyészetek, retinális degenerációk vizsgálata) a kóros fejlődés és a szabályozó mechanizmusok felderítése válik lehetővé. Munkacsoportunk immuncitokémiai módszerekkel (látópigment ellenes antitestekkel, lektincitokémiával) emlősök retinájában tanulmányozza az egyes fotoreceptorok térbeli elrendeződését, a különböző színspecifikus csapok eloszlását. Feltérképezzük az emlős retinák fotoreceptor mintázatát. Meghatározzuk a fotoreceptorok számát, amely számítások alapján izodenzitás térképek készíthetők. Tanulmányozzuk a fotoreceptor-mozaik kialakulását [II]. Elsősorban a következő kérdésekre keresünk választ: Milyen sorrendben jelennek meg a fotoreceptorok? Milyen életkorra tehető a különböző színspecifikus csapok megjelenése? Hogyan alakul számuk a retinában a fejlődés során? Munkám során elsősorban a nyúl, mint igen gyakran vizsgált kísérleti állat, fotoreceptorainak, színspecifikus csapjainak feltérképezésével, fejlődésével foglalkoztam. A nyúlon végzett retinatranszplantációk keltették fel érdeklődésemet ezen állat szeme iránt. Vajon természetes körülmények között mikor jönnek létre az egyes fotoreceptorok? Célom az volt, hogy meghatározzam, mikor jelennek meg a

posztnatálisan fejlődő nyúl retinájában a különböző színspecifikus csapok, azaz milyen sorrendben differenciálódnak. Célul tűztem ki azt is, hogy meghatározzam a színspecifikus csapok számát az életkor függvényében. Felmerült az a kérdés is, hogy a csapokat körülvevő csaphüvely szerkezetében van-e különbség a két színspecifikus csap között nyúlban, illetve lektincitokémiával (PNA) elkülöníthetők-e a rövid- és középhullám-érzékeny csapok. Az utóbbi évek eredményei azt mutatják, hogy a csapok fejlődése során egyes fajoknál létezik egy olyan állapot, amikor nemcsak egy látópigmentet expresszálnak, hanem egyszerre, egyidőben kettőt is (átmeneti látópigment koexpresszió). Patkányban és mókuscickányban munkacsoportunk már korábban kimutatta ezt a jelenséget. Joggal tételeztük fel, hogy ez a jelenség általános érvényű a dikromata emlős fajok között. Nem volt azonban az sem kizárható, hogy létezik olyan faj is, amelyben nem figyelhető meg a fejlődés során a fotopigmentek átmeneti koexpressziója. Vizsgálataim egyik leglényegesebb kérdése annak eldöntése volt, hogy a fejlődő nyúl színspecifikus csapjainál megfigyelhető-e ez a folyamat. Ezekre a kérdésekre a hagyományos hisztokémiai módszereket kiegészítve, digitális képfeldogozást alkalmazva próbáltam válaszolni. Célom volt a digitális képfeldolgozás nyújtotta előnyök kihasználásával igazolni a fejlődés során kialakuló átmeneti látópigment koexpresszió meglétét vagy hiányát. Egy egyszerű és gyorsan reprodukálható csapszámláló program, egy új számítógépes technika kifejlesztése is szerepelt a terveim között, hogy a hagyományos időrabló számolást megkönnyítsem, illetve annak eredményeit ellenőrizhessem. A nyúl mellett egy másik emlősfaj, a denevér retináját is tanulmányoztam. A denevérek kitűnő térbeli tájékozódása már az 1700-as években az érdeklődés középpontjába került. A denevérek éjjel aktív életmódot folytatnak, amihez kifinomult ultrahangos navigációs rendszer szükséges. Ez rendkívül hatékony visszhanglokátorként működik. Ezen hangokat az emberi fül nem is képes érzékelni. Az egyes kibocsátott jelek visszhangjából, a körülöttük lévő tárgyak helyzete mellett, a repülő zsákmány pozícióját is tévedhetetlenül meg tudják határozni. A denevérek (Chiroptera) rendjében két alrendet különítenek el, az egyik a Microchiroptera alrend, amelybe a fajok nagy része besorolható, és amelyek rovarokkal

táplálkoznak, a másik a Megachiroptera alrend, amelyhez a gyümölcsevő repülőkutyafélék tartoznak [98]. Ezek a legnagyobb denevérek; bundájuk vörösesbarna, nagy szemük, apró fülük hívja fel magukra a figyelmet. Vajon van-e különbség a retinák felépítésében az egyes alrendek, illetve az egyes fajok között? Ennek kiderítése érdekében néhány denevérfaj retinájának finom szerkezetét vizsgáltuk meg fény- és elektronmikroszkóppal.

Irodalmi háttér A fotoreceptorok eloszlása emlős retinában Az immuncitokémia elterjedése jelentős eredményeket és változásokat hozott a fotoreceptorok eloszlására és fejlődésére vonatkozó ismereteinkben. Az emlősök nagy részének pálcika-domináns retinája van. A csapok aránya ezekben a fajokban 1%-tól (pl. patkány) 13-14%-ig (pl. mongol hörcsög) terjed [90,39] (3.ábra). Mindössze néhány fajban fordul elő csap-domináns retina (pl. mókuscickány, ürge), ahol a fotoreceptorok kb. 95%-a csap [65,72] (4.ábra). Fotoreceptorok eloszlása pálcika-domináns retinában Csap Pálcika 3. ÁBRA

Fotoreceptorok eloszlása csap-gazdag retinában Csap Pálcika 4. ÁBRA A főemlősök ideghártyája azért érdekes, mert nagy része pálcikában gazdag, de kifejlődött bennük egy kis terület, az éleslátás helye, a fovea centralis, amely csapgazdag. Így tulajdonképpen mindkét retina-típus (csap-gazdag, pálcika-gazdag) jellemzőit hordozza. A legtöbb emlős ideghártyáján található egy olyan terület, ahol a fotoreceptorok sűrűsége jelentősen nagyobb, mint a retina többi részén. Ez a főemlősöknél a pálcikamentes fovea, más állatoknál, ahol pálcikák is előfordulnak, area centralis-nak nevezik. Számos fajban foltszerűen jelentkezik, de vannak olyanok is, ahol a retina közepén végighúzódó horizontális zónát alkot (pl. nyúl). Ezt a területet látócsíknak (visual streak) nevezzük [47]. A látócsík a horizont leképezésében vesz részt és elsősorban azokra az állatokra jellemző, amelyeknek nyílt területen széles látókörben kell mozogni, tájékozódni. Olyan fajok is léteznek (pl. patkány), ahol nincsen fotoreceptorokban gazdag központi rész, area centralis, de itt is megfigyelhető egy centroperifériás grádiens, vagyis a centrális rész felé a fotoreceptor-sűrűség megnövekszik a perifériáshoz képest [90].

A színspecifikus csapok eloszlása emlős retinában Csap-domináns állatok közül ürgében immuncitokémiai technikával kimutatták, hogy a teljes retina 91%-át zöld csapok, 6%-át kék csapok, míg 3%-át pálcikák népesítik be [2]. A mókuscickány retinájában is hasonló eredményt kaptak, a kék csapok 4-10%-ban fordulnak elő. Az egyes fotoreceptorok eloszlásában csak kisebb regionális eltérések mutatkoztak. A kék csapok denzitását az alsó retinarészben észlelték a legmagasabbnak, míg a legkisebbnek az area centralis-hoz közeli a temporális részen. Az alsó részben a pálcikák sűrűsége is nagyobbnak bizonyult [72]. Számos fajban a retina csapjai nem mutatnak területi elkülönülést, de a kék csapok aránya az alsó félben valamivel magasabb, mint felül (kutya, macska). Immuncitokémiai vizsgálatokkal kiderült, hogy az ürge retina fotoreceptorai sem teljesen homogén eloszlásúak [49]. Pálcika-domináns emlősök közül az első faj, a patkány volt, amit részletesen megvizsgáltak és retinájukat feltérképezték. Meghatározták mindenegyes kvadránsból az immunopozitív kék és vörös-zöld csapok számát, arányát. Az S csapok 5-10%-ban fordultak elő, legmagasabb arányban a retina centralis részén [90]. A hörcsög, a kutya, a macska, a mókuscickány esetében is homogén csap-eloszlást mutattak ki, kb. 5-10%-os átlagos S csap előfordulással a teljes retinában. Tehát a két csaptípus a legtöbb emlős retinájában, akár pálcika-, akár csapdomináns, viszonylag állandó arányban található meg. Az M/L csapok 90%-ban, míg az S csapok csak általában 10%-ban vannak jelen [II] (5.ábra).

Színspecifikus csapok eloszlása emlős retinában Zöldérzékeny csap Kékérzékeny csap 5. ÁBRA Több feltevés sok évtizeden keresztül tartotta magát a retina kutatásában, mind a csapok eloszlása, mind a fotoreceptorok differenciálódása terén. Ezek közül néhányat említenék, amelyek a munkám során előtérbe kerültek és téves voltukra csak az utóbbi években derült fény: A két csaptípus minden emlősben homogén módon népesíti be a retinát, és csak a centroperifériás grádiens miatt jelentkezik kisfokú heterogenitás a területi eloszlásban. Nincs a retinának olyan része, ahol csak egyféle csap található, kivéve a főemlősök fovea centralisának legközépső része, ahonnan a kék csapok hiányoznak. Emlősökben minden egyes csap kültagja csak egyféle látópigmentet tartalmaz. Nem léteznek olyan emlős fajok, amelyeknek csapjaiban több látópigment egyszerre, egyidőben van jelen. Látópigment-koexpresszió nem lehetséges. (Halak és kétéltűek esetében ez a jelenség már korábban ismert volt, hiszen metamorfózissal, az életstílus megváltozásával gyakran jár együtt koexpresszió illetve kolokalizáció, ami egyben a szem színérzékenységének életkor szerinti megváltozását is eredményezi [111].) Az utóbbi években fogalmazódott meg tehát a kérdés, hogy a színspecifikus csapok minden emlősben homogén módon népesítik-e be a retinát. Nem létezik-e olyan

faj, ahol heterogén eloszlás figyelhető meg? Nincs-e a főemlősök fovea centralisához hasonlóan más emlősben is olyan terület, ahol valamelyik színérzékeny csap hiányzik [27,91,108]? Heterogenitás a csapok eloszlásában A háziegér (Mus musculus), mint az emlős géntérképezés és génmanipuláció gyakran vizsgált modellje, volt az első faj, amely ezeket a hipotéziseket megcáfolta. Az immuncitokémia mellett, elektroretinográfiás vizsgálattal is igazolták, hogy kétféle csap létezik a retinájában, egyikük 360-365 nm-es, míg a másik csoport 510 nm-es érzékenységi csúccsal rendelkezik [45]. 1994-ben Chiu és munkatársai molekuláris biológiai módszerrel is bizonyították az S és M/L fotopigmentek jelenlétét. Az egér közismerten pálcika-domináns retináját, amelyben kb. 3% csap fordul elő, feltérképezve egy nem várt térbeli eloszlás mutatkozott a rövid- és középhosszúhullámú csapok között. A dorzális és ventrális retinafélben ugyanis nem egyenletesen oszlottak el a színspecifikus csapok. A dorzális retinában még a korábban feltételezett jellegzetes 1:10 arány mutatkozott az S és M/L csapok között, a ventrális retinában azonban szokatlanul magas volt az S csapok száma, a zöld csapok pedig teljesen hiányoztak [91,93]. Calderone és Jacobs fiziológiailag megerősítette, hogy a ventrális retinában az UV érzékenység dominál, míg a dorzális részen a zöldérzékenység. Az idézett szerzők vizsgálatának lényege az volt, hogy összehasonlították a szem különböző kvadránsaiban zöld illetve ultraibolya fény megvilágítására keletkező elektromos aktivitást és a spektrális érzékenységet [16]. Ezzel a korábban feltételezett egyenletes eloszlás elve végképp megdőlt. A két csaptípus más-más retina területeken van jelen, a színspecifikus csapok markánsan eltérő eloszlást mutatnak. Azt a területet, ahol csak kék csapok vannak és a zöldek teljesen hiányoznak, kék- illetve S-mezőnek nevezzük. Kiterjedése, területének nagysága az eddig vizsgált emlős fajokban nem azonos, de konzekvensen a legventrálisabb retinarészt foglalja el. A két retinafél között egereken egy átmeneti zónát lehet meghatározni. A jelenségre némiképpen emlékeztet a galamb retinája, amelyben az ún. vörös mező (pecking field) található meg. Ez a szem dorzális részén elhelyezkedő terület nagy számban tartalmaz

közép- és hosszúhullám-érzékeny csapokat. Élettani jelentősége az, hogy a földön kapirgáló madár retinájának ez a része a talaj képét tükrözi le [26]. Több albino és pigmentált egérfaj (M. spicilegus, M. spretus, M. macedonicus) esetében is hasonló, osztott retinát mutattak ki. A határvonal a két retinafél között nagyjából a horizontális meridián területén helyezkedik el. Ezzel ellentétben számos nem európai egérfajban (pl. M. caroli, M. cooki, M, plathythrix, M. pahari) a csapok eloszlása homogén. Sőt ezek közül néhány fajban (M. plathythrix, M. pahari) kizárólag M csapokat találtak, rövidhullám-érzékenyek egyáltalán nem fordultak elő. Még egy meglepő eredmény, hogy az Apodemus rend (erdei egér) tagjainak nem osztott a retinája, a színspecifikus csapok homogén módon népesítik be a teljes retinát. A Mus spicilegus és az Apodemus sylvaticus fajok közös morfológiai és fiziológiai tulajdonságokkal bírnak, ugyanott élnek, hasonlóan táplálkoznak, a szemük felépítése azonos, ideghártyájuk csapeloszlásában mégis különböznek. Egy renden belül sincs azonos fotoreceptor-eloszlás, ugyanis az Apodemus sylvaticus mind M és S csapokkal rendelkezik, de az Apodemus microps retinájában azonban nincsenek S csapok [87]. Vajon a kék csapok nem nélkülözhetetlenek ezen éjszakai állatok látófunkciójához? Úgy tűnik, hogy nem. Ezekből az eredményekből azt is megállapíthatjuk, hogy a retina osztottsága egy faj-specifikus jellemző, ami független a környezeti tényezőktől. Eddig csak az európai egérfajokban sikerült a csapok heterogén eloszlását bizonyítani, de számos rágcsálófaj retináját még egyáltalán nem vizsgálták. Egyes rágcsálókban (pl. patkány, hörcsög, pocok) nem találtak elkülönült retinát. Eleinte azt tartották, hogy a laboratóriumi egerek különleges osztott retinája a mesterséges megvilágítás eredménye, mivel a jelenséget először olyan laboratóriumi törzsek felnőtt egyedeiben írták le, amelyek generációkon keresztül mesterséges fényviszonyok között nevelkedtek. Ezt azonban egyértelműen cáfolja az a tény, hogy a laboratóriumi patkányban, amelynek egyedeit ugyanolyan sajátos megvilágítási körülmények között tenyésztik, nincs heterogenitás a retinában és elektrofiziológiailag sem mutattak ki dorzo-ventrális asszimmetriát. További cáfolat az, hogy a közönséges házi egérnél is megfigyelhető dorzo-ventrális elkülönülés, annak ellenére, hogy ez a faj nyilvánvalóan természetes körülmények között él és folyamatosan természetes megvilágítást kap [87].

Logikus következtetés, hogy az osztott retinával rendelkező állatokban egy közös csaptípus vonul végig az egész retinán, amely mindkét opszint termeli, de a két opszin szintje különböző és ez határozza meg a csapok fenotípusát [38]. Kimutatták, hogy az UV csapok nagy része M pigmentet is termel, míg a ventrális részen vannak kizárólag olyan csapok, amelyek csak UV-érzékenyek [16]. Valószínűleg az S és M opszin expressziójának kontrollja más a dorzális és ventrális területeken, ezért jön létre a területi különbözőség, az osztott retina. Van színlátása ezeknek az állatoknak? Magatartásuk alapján ma csak annyit mondhatunk, hogy a két spektrális érzékenység jelen van, de ez még nem elegendő bizonyíték a valódi dikromatikus színlátás meglétéhez vagy hiányához. Az egéren kívül több emlősnél bizonyítást nyert a heterogenitás a csapok mintázatának kialakulásában. A tengeri malac retinájában, és az általam kiválasztott és vizsgált nyúl retinájában egyaránt megtalálható ez a területi eloszlásbeli különbség [47,80]. Felnőtt nyúl retináját feltérképezve azt mutatták ki, hogy jellegzetes pálcikadomináns retinával rendelkezik. Lektincitokémiával bizonyították, hogy a fotoreceptorok kb. 5%-a csap. A nyúl retina látócsíkja, ahol a csapok és a ganglionsejtek denzitása a legmagasabb, horizontálisan, középtájon helyezkedik el, valamivel a discus nervi optici alatt [47]. Különböző fiziológiai vizsgálatok alátámasztották a nyúl dikromatikus látását, két spektrális csúccsal a kék (425 nm) és zöld (520 nm) tartományban. Tehát a nyúl retinában háromféle fotoreceptor található: pálcika, S csap, M/L csap. A színspecifikus csapok eloszlásának tanulmányozásakor figyeltek fel arra, hogy az ora serratához közeli legventrálisabb retinarészben egy keskeny, félhold alakú terület van, kb. 5%-a a teljes retinának, ahol csak kék csapok találhatók. A nyúlnál ez egy horizontális retinasávnak felel meg, ezért kék csíknak is nevezzük. Ez teljesen ekvivalens az egérben lévő S- mezővel, bár a területe jóval kisebb a teljes retinafélnél. Famigletti kimutatta, hogy a kék csík kiterjedése különböző nyúl alfajokban eltérő lehet [34]. Ezt a területet leszámítva, a csapok többsége zöld-specifikus pigmentet expresszál, az M/L csapok száma meghaladja az S csapok számát. Az egész retinát figyelembe véve végül is az emlősökre jellemző 1:10 arány mutatkozik a különböző színérzékenységű csapok között. A látócsík, az area centralis, területén is ugyanilyen az arány, viszont a

fotoreceptor-kültagok kisebbnek bizonyulnak, és jóval sűrűbben helyezkednek el. A látócsík felett található a nervus opticus rostjainak kisugárzása, ami a vakfoltnak felel meg. A maradék felső retinarész és egy keskeny sáv a látócsík és a kék mező között kevésbé specializálódott területei a nyúl retinának (6. ábra). discus nervi optici látócsík kék csík 6. ÁBRA Nyúl retina sematikus ábrája. A látócsík, amely az éleslátás helye, a discus nervi optici alatt horizontálisan helyezkedik el. A kék csík, ahol csak rövidhullámérzékeny csapok vannak, a legventrálisabb része a retinának. Rovarevő fajokban olyan mintázatot is leírtak, amelyben a ventrális retinában az S csapok 50-70% körül is jelen lehetnek fajtól függően, de az M csapok sehonnan sem hiányoznak. Tehát nem rendelkeznek tényleges S-mezővel, de a csapok eloszlása mégsem az általános 1: 10 arányt mutatja [71]. A dorzo-ventrális asszimmetria mellett megfigyelhető egy temporo-nazális grádiens is. Ürgében a nazális területen mutattak ki jelentősen magasabb S csap előfordulást. Néhány pozícionális marker is tükrözi ezt az eloszlást. Pl. kizárólag a retina temporális felén található ganglionsejtekben fordul elő egy TRAP nevű antigén [59]. A palackorrú delfin vizsgálatával arra kerestek választ, hogy színlátása vajon, megegyezik-e a szárazföldi emlősökével. Ebben a fajban is a kék csap teljes hiányát sikerült kimutatni, méghozzá az egész retinában. A többi nokturnális állathoz hasonlóan, ez a faj is monokromát, vagyis csak pálcikákkal, és zöld opszint termelő csappokkal rendelkezik. A kék opszin génje azonban jelen van, ha nem is

expresszálódik a deléciók miatt. Tehát olyan diurnális emlősről van szó, amely rövidhullámú csapokat nem tartalmaz [36]. Vannak más emlősök is, amelyekben kék-érzékeny csapok nincsenek. Leszögezhetjük tehát, hogy az emlősök között akad néhány olyan faj is, amelyre nem jellemző a dikromácia, hanem csak monokromatikus színérzékenységgel rendelkezik [36,71,92]. Összegzésképpen a következő ábrán tüntetjük fel a különböző csapmintázatokat, egy-egy jellegzetes példával illusztrálva: házi egér nyúl A B patkány C erdei egér D 7. ÁBRA Színspecifikus csapok eloszlása emlős retinában. A függőlegesen vonalkázott területen csak kék-érzékeny csapok, a vízszintesen vonalkázott területen csak zöld-érzékeny csapok, míg a keresztekkel jelölt területen mind a kétféle csaptípus megtalálható. A Háziegér osztott retinája. B Nyúl osztott retinája, ahol a kizárólag kék csapokat tartalmazó mező jóval keskenyebb. C Patkány homogén eloszlású retinája, ahol mindkét csaptípus egyenletes eloszlásban van jelen. D Erdei egér homogén retinája, ahol csak zöld-érzékeny csapok vannak.

A térbeli elkülönülés biológiai jelentősége A csapok heterogén eloszlásának biológiai jelentőségére talán megadhatja a magyarázatot az, hogy a ventrális retinára a felső látótér, azaz az ég képe vetül. Így az S-érzékeny csapok az eget figyelve, az állatra leselkedő veszélyekről, a felülről támadó ragadozókról adnak gyors információt, hiszen ez a rész a kék és ultraibolya sugarakra igen érzékeny. Míg a dorzális, M csapokban gazdag retinarész a horizontot szemlélve a füves, zöld területek megfigyelője [II]. Ezekre a logikusnak tűnő érvekre azonban nincsenek bizonyítékok. Miért élnek egymás mellett pl. olyan egérfajok, amelyek egyike osztott retinával rendelkezik, míg a másik nem? Ha az életben maradáshoz előnyt jelent a kék csapokban gazdag retinarész, akkor a homogén retinával bíró fajok az evolúció folyamán eltűntek, kipusztultak volna, a heterogén mintázat sokkal elterjedtebb lenne az állatvilágban. Az eddigi vizsgálatok szerint pedig inkább a homogén eloszlás az általános [92]. Ezt figyelembe véve más magyarázata, más biológiai előnye lehet az osztott retinának. Ez azonban még nem ismert. Felvetődik a kérdés, hogy miképpen érzékeli a színeket az egyetlen csaptípussal rendelkező S-mező, hiszen zöld látópigmentet tartalmazó receptorok nem találhatók ezen a területen, márpedig a kétféle csap lokális közelsége mindenféle kontraszttevékenység alapja kell, hogy legyen. Azt lehet feltételezni, hogy hasonló mechanizmus működik az S-mezővel rendelkező állatokban (így az egér ventrális retinájában is), mint egy bizonyos színlátási zavarban szenvedő emberben. Szemészeti kutatások bizonyították, hogy csak a kék csappal rendelkező monokromát páciensek képesek egy bizonyos tartományban színeket megkülönböztetni. Ezen betegeknél genetikailag hiányzik a vörös- és a zöld-érzékeny pigmentek génje, mégis 440 és 500 nm hullámhossz között, ahol a pálcikák és kék csapok szimultán aktívak, meg tudnak különböztetni színeket. Ebből az következik, hogy a pálcikák és a kék csapok valószínűleg közös utat is használnak az információk feldolgozására, továbbítására [75].