Biobiztonság 6. Dr. Szatmári István
Pharmacokinetics and Metabolism Study of the fate of the drugs Absorption, Distribution, Metabolism and Excretion ABSORPTION: reaching the circulation after oral, transdermal, intramuscular, rectal, etc. administration DISTRIBUTION: reaching organs, tissues, binding to proteins METABOLISM: change of the chemical structure by liver enzymes mainly ELIMINATION: clearing the body from xenobiotics through kidney or bile Biobiztonság 6. Dr. Szatmári István 2
Új gyógyszerek kutatása Korai fázis Késői fázis A biológiai célpont azonosítása A biológiai célpont validálása A LEAD molekula azonosítása A LEAD molekula optimalizálás a Preklinikai fejlesztés Klinikai fejlesztés PIA C 1 év 2 év 0.4 év 2.7 év 1.6 év 7 év 165 M$ 205 M$ 40 M$ 120 M$ 90 M$ 260 M$ ~ 15 év és ~ 1000 M$ Biobiztonság 6. Dr. Szatmári István 3
Gyógyszerdiszpozíció Végső soron az a célunk, hogy emberek számára hatásos és biztonságos gyógyszert fejlesszünk. Ehhez a fejlesztés előrehaladtával In silico módszerekkel becsüljük meg a gyógyszerjelöltek sajátságait In vitro vizsgálatokból vett adatokból következtetünk In vivo állatkísérletekkel modellezünk In vivo humán klinikai vizsgálatokból megerősítjük az ismereteinket Matematikai módszerekkel modellezzük a szervezetben lezajló folyamatokat Biobiztonság 6. Dr. Szatmári István 4
Gyógyszerdiszpozíció Az ADME vizsgálatok segítik a hatásossági vizsgálatok értelmezését, mivel A biokémiai (in vitro receptorkötési-, enzimgátlási-, ioncsatorna-) teszteken hatásosnak talált vegyületek várhatóan akkor lesznek hatásosak emberben, ha Felszívódnak, áthaladnak különböző szöveti membránokon és elérik a receptort, enzimet, ioncsatornát, stb. Kellő koncentrációban és kellő ideig jelen tudnak maradni a molekuláris hatáshelyen A farmakológiai (in vivo állatkísérletek) teszteken hatásosnak talált vegyületek várhatóan akkor lesznek hatásosak emberben, ha A vegyület sorsa a szervezetben jelentős hasonlóságot mutat a vizsgált állatfajban és az emberben Biobiztonság 6. Dr. Szatmári István 5
Gyógyszerdiszpozíció Az ADME vizsgálatok segítik a biztonsági vizsgálatok értelmezését is, mivel A biztonsági (toxikológiai és biztonság-farmakológiai) állatkísérletes teszteken biztonságosnak talált vegyületek várhatóan akkor lesznek biztonságosak emberben, ha A vegyület sorsa a szervezetben, de elsőképpen a vegyület biotranszformációja, jelentős hasonlóságot mutat a vizsgált állatfajban és az emberben Biobiztonság 6. Dr. Szatmári István 6
Gyógyszerdiszpozíció A gyógyszerdiszpozició a gyógyszerek élő szervezetbeni sorsát vizsgáló tudomány, szokták ADME mozaikszóval is rövidíteni A Felszívódás (Absorption) D Megoszlás (Distribution) M Biotranszformáció (Metabolism) E Kiürülés (Excretion) Farmakokinetika a mennyiségi (sebességi és koncentráció) kérdéseket vizsgálja Metabolizmus a szervezetben lezajló kémiai átalakulásokat Biobiztonság 6. Dr. Szatmári István 7
Felszívódás A gyógyszereknél ugyan leggyakrabban a szájon át történő (orális, vagy per os) adagolást alkalmazzák, de számos más adagolási módszer is ismert. Lehet közvetlenül a keringésbe (intravénásan) adni, izomba (intramuszkulárisan), vagy bőr alá (szubkután) fecskendezni, lehet a bőr felületére (dermálisan) kenni vagy tapasztani, vagy kúp formájában (rektálisan, vagy vaginálisan) felhelyezni. Adható egy hatóanyag a hasüregbe (intraperitoneálisan), de cseppenthető a szembe vagy orrba is. A lényeg, hogy a gyógyszernek, ha nem lokális hatást akarunk kifejteni, el kell érnie a szisztémás keringést. Biobiztonság 6. Dr. Szatmári István 8
Felszívódás Felszívottnak tekintjük azt a szert, mely változatlan formában éri el a szisztémás keringést. Ehhez számos membránon át kell jutnia, vagyis kellő permeábilitást és metabolikus stabilitást kell mutatnia. A felszívódás vizsgálatára számos in vitro (Sartorius, PAMPA, egyszeres sejtrétegek), in situ (perfúziós modell), ex vivo (bélzsák és transzdermális modell) és in vivo (bélzsák modell) technika létezik, a gold standard -nak azonban a CaCo-2 modell számít. Biobiztonság 6. Dr. Szatmári István 9
CaCo-2 egy humán vastagbél karcinóma sejtvonal, mely képes meghatározott körülmények között szorosan illeszkedő sejtekből egy egyrétegű, zárt, membránt képezni, miközben rendelkezik a vékonybélbél-sejtekre jellemző enzimrendszerrel, mikrobolyhokkal, aktív transzporterekkel (pl. P- glikoprotein). Ca-Co-2 modell Biobiztonság 6. Dr. Szatmári István 10
Caco-2 modell In vivo felszívódás [%] 100 50 0 0,1 1 10 100 1000 Log Papp [*10-7 cm/s] Biobiztonság 6. Dr. Szatmári István 11
Felszívódás A felszívódást jól lehet jellemezni a vérszintek alakulásának nyomon követésével is. Biobiztonság 6. Dr. Szatmári István 12
Megoszlás A szervezetbe került anyag többé, vagy kevésbé megoszlik a szervezet szervei, szövetei között. A szervi-szöveti eloszlás legelterjedtebb vizsgáló módszere az un. teljes-test autoradiográfia, mely a korábbi szemi-kvantitatív technikából napjainkra kvantitatív módszerré vált. A teljes-test autoradiogramok információt adnak arra, hogy mely szövetek és szervek vannak leginkább kitéve az anyag hatásának, de következtethetünk arra is, hogy kiürül-e az anyag az állatból, vagy esetleg kumulálódik. Biobiztonság 6. Dr. Szatmári István 13
Teljes-test autoradiográfia 0,5 óra AGY SZÍV MÁJ MELLÉKVESE VESE HERE Biobiztonság 6. Dr. Szatmári István 14
Megoszlás A megoszlás egy új, modernebb vizsgálati módszere, bár bonyolultabb is, a Positron Emission Tomography, azaz a PET Elsősorban diagnosztikai célból (daganatok helyének és típusának megállapítása, központi idegrendszeri folyamatok vizsgálata Alzheimer betegség) Pozitron = az elektron antirészecskéje Legfontosabb pozitron sugárzók: 11 C, 13 N, 15 O és 18 F Jellemző rájuk a nagyon rövid felezési idő (néhány perc) Biobiztonság 6. Dr. Szatmári István 15
PET A diagnosztikum (pl. 18 F-FDG) előállítása ciklotronban történik Biobiztonság 6. Dr. Szatmári István 16
Fehérjekötődés A megoszlás során az anyagok nem csak áthaladnak membránokon, hanem kötődhetnek is hozzájuk. Bejuthatnak a sejtekbe, s kötődhetnek a szöveti fehérjékhez is. A megoszlást leginkább befolyásoló kötődés az anyagok szérumfehérjékhez (elsősorban az albuminhoz és az alfa-1 savas glikoproteinhez) kötődése. Ennek mértékét in vitro technikákkal (egyensúlyi dialízis, ultraszűrés, ultracentrifugálás) vizsgáljuk. A megoszlást sokszor jól lehet számítani a vérszintek alakulásának nyomon követésével is. Biobiztonság 6. Dr. Szatmári István 17
Fehérjekötődés Albumin és alfa-1 savas glikoprotein Biobiztonság 6. Dr. Szatmári István 18
Vér-agy gát modell Egy gyógyszermolekula fontos sajátossága az, hogy bejut-e a központi idegrendszerbe, vagyis átjut-e az un. vér-agy gáton. CNS-re ható szerek esetén a hatás kifejtéséhez kell Nem CNS-re ható szerek esetén a mellékhatás-profil miatt fontos tudni A folyamat modellezhető Biobiztonság 6. Dr. Szatmári István 19
Átjutás a placentán A placenta nem csak a magzat vérellátását, s ezen keresztül az oxigén- és tápanyag ellátását biztosítja, nem csak a terhesség fenntartását elősegítő hormonokat termel, hanem fontos szerepe van abban is, hogy a káros anyagok, vagy akár a mikroorganizmusok egy részét kiszűrje a vérből magzat védelme érdekében Hogy szedhet-e egy kismama egy gyógyszert, részben attól függ, hogy a méhlepényen át tud-e jutni az adott szer Biobiztonság 6. Dr. Szatmári István 20
Biotranszformáció - metabolizmus A szervezetbe kerülő testidegen anyagokat a szervezet enzimrendszere rendszerint átalakítja polárosabb molekulákká, az un. metabolitokká, hogy minél hamarabb meg tudjon szabadulni tőlük. Az első fázisú metabolizmust (pl. oxidáció, hidroxiláció, dealkilezés, dehidrogénezés, stb.) gyakran második fázisú metabolizmus követi, vagyis a molekula endogén molekulákhoz kapcsolódik (glükuronsav, acetil-csoport, szulfát-csoport, glutation, glicin, stb.) Biobiztonság 6. Dr. Szatmári István 21
Biotranszformáció - metabolizmus Fázis I. Metabolikus reakciók - oxidáció Biobiztonság 6. Dr. Szatmári István 22
Biotranszformáció - metabolizmus Fázis I. Metabolikus reakciók - dealkiláció Biobiztonság 6. Dr. Szatmári István 23
Biotranszformáció - metabolizmus Fázis I. Metabolikus reakciók N-oxidáció Biobiztonság 6. Dr. Szatmári István 24
Biotranszformáció - metabolizmus Fázis II. Metabolikus reakciók glükuronidáció Biobiztonság 6. Dr. Szatmári István 25
Biotranszformáció - metabolizmus Fázis II. Metabolikus reakciók szulfatálás, N-acetilálás Biobiztonság 6. Dr. Szatmári István 26
Biotranszformáció - metabolizmus A metabolizáló enzimek szinte minden szervben szövetben megtalálhatók. A fő metabolizáló szerv a máj, de jelentős metabolizáló kapacitással rendelkezik a vese, tüdő, bél, a vér és az agy is. Biobiztonság 6. Dr. Szatmári István 27
C [Kiindulási koncentráció %-ban] Plazma stabilitás in vitro 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 Egér plazma Kutya plazma Humán plazma Hörcsög plazma Patkány plazma 0 20 40 Idő [perc] 60 Biobiztonság 6. Dr. Szatmári István 28
Biotranszformáció - metabolizmus A gyógyszerek és egyéb testidegen anyagok (de egyes endogén anyagok is) metabolizmusában a szervezet számos enzime részt vesz, de a legfontosabbak a CYP, UGT, észterázok, FMO, NAT és MAO CYP UGT esterase FMO NAT MAO Biobiztonság 6. Dr. Szatmári István 29
Cytochrom P450 enzimcsalád Eredetileg egy enzimnek gondolták, mely a nevét onnan kapta, hogy 450 nm-en egy jelentős abszorbanciát mutatott, ha CO-val reagáltatták Ma több mint 11500 CYP450 izoenzim ismert Biobiztonság 6. Dr. Szatmári István 30
Cytochrom P450 enzimcsalád Biobiztonság 6. Dr. Szatmári István 31
Cytochrom P450 enzimcsalád Az egyes CYP450 izoenzimek nem azonos mértékben vesznek részt a gyógyszerek metabolizmusában A legtöbb gyógyszermolekulát a 3A4, a 2D6 és a 2C9 izoenzim módosítja, de a legtöbb esetben egy molekula több enzimnek is szubsztrátja 2A6 2C19 2C8 2C9 3A4 2D6 1A2 2E1 2B6 Biobiztonság 6. Dr. Szatmári István 32
Cytochrom P450 enzimcsalád A Human CYP1A2 enzim két nézetből, középen látható a vastartalmú hem makromolekula, mely minden CYP enzimre jellemző Biobiztonság 6. Dr. Szatmári István 33
HEM Biobiztonság 6. Dr. Szatmári István 34
Biotranszformáció - metabolizmus A biotranszformációt első lépésben in vitro módszerekkel vizsgáljuk. A máj különböző preparátumai S9 frakció Mikroszómális frakció Májsejt preparátumok (primer kultúra, cry-preserved kultúra) Májszeletek Máj-perfúziós modell Genetikailag módosított élesztőgomba-, rovar-, vagy emlőssejtekkel, de főleg bakteriális sejtekkel Az Escherichia coli-t és a Salmonella typhimurium-ot elterjedten használják Minden lényeges humán CYP izoenzim már kifejezhető bakteriális sejtekkel (1A1, 1A2, 1B1, 2A6, 2A13, 2B6, 2C8, 2C9, 2C18, 2C19, 2D6, 2E1, 3A4, 3A5, 3A7, 3A43 Biobiztonság 6. Dr. Szatmári István 35
Biotranszformáció - metabolizmus Escherichia coli Salmonella typhimurium Biobiztonság 6. Dr. Szatmári István 36
cpm cpm Metabolit profil A metabolitok megjelenése és egymáshoz viszonyított arányuk meghatározása különböző fajokban, nemekben, biológiai mátrixokban SAR154025 (O-demetyl) (M21) 400.00 350.00 300.00 250.00 SAR167112 (amine) (M28) SAR154025-sulphate (M31) SAR154025-glucuronide (M34) SAR137272-OH (M18) SAR107017 (N-demetyl) (M12) SAR137272 (UD) SAR166310 (N-oxide) (M10) Typical plasma profiles Male rat plasma AUC pool 200.00 150.00 100.00 50.00 0.00 700.00 600.00 500.00 400.00 300.00 Female rat plasma AUC pool 200.00 100.00 0.00 1600.00 1400.00 Biobiztonság 6. Dr. Szatmári István 37 1200.00
Metabolit profil Biobiztonság 6. Dr. Szatmári István 38
C [Kezdeti koncentráció %-ban] In vitro metabolizmus máj mikroszóma preparátummal 100 80 60 40 20 Kutya Nyúl Egér Humán Patkány Hörcsög 0 0 20 40 Idő [perc] 60 Biobiztonság 6. Dr. Szatmári István 39
Metabolitok szerkezetazonosítása NH C CH N-metil-propargilamin NH 2 C CH Propargilamin O CH C CH Propiolaldehid HO Konjugátum CH N O C CH Deprenyl-N-oxid CH N C CH Deprenyl CH NH CH Metamfetamin 3 CH NH C CH Demetil-deprenyl CH NH C CH p-oh-demetil-deprenyl CH NH 2 Amfetamin HO CH N C CH N OH N-OH-metamfetamin CH CH NH OH Efedrin Pszeudoefedrin OH N-OH-demetil-deprenyl CH NH p-oh-metamfetamin CH Konjugátum CH NH OH O CH N N-[(1-metil-2-fenil)etil]- metánimin N-oxid CH2 O CH N N-[(1-metil-2-fenil)etil]- etánimin N-oxid C CH CH3 N Fenilaceton-oxim OH CH OH 1-Fenil-2-propanol HO HO CH NH 2 p-oh-amfetamin CH CH NH 2 OH p-oh-norefedrin p-oh-norpszeudoefedrin CH CH NH 2 OH Norefedrin Nor-pszeudoefedrin O CH NH C N-acetil-amfetamin CH CH NH Biobiztonság 6. Dr. Szatmári István 40 HO OH p-oh-efedrin p-oh-pszeudoefedrin O C Hippursav NH COOH N-OH-amfetamin OH C Benzoésav O C O NH COOH Fenilecetsavglicin konjugátum C O Fenilaceton C OH Fenilecetsav O
Ürülés A szervezetből a testidegen anyagok leginkább a vizelettel és az epével választódnak ki. Vizelet - vesében glomeruláris szűrés és/vagy tubuláris kiválasztás (fontos a tubuláris visszaszívás) Epe májban a poláros, nagy molekula tömegű (300-500 Da) anyagok választódnak ki (enterohepatikus körfolyamat) Nyál jód, kokain megtalálható a nyálban (gyomor-nyál körfolyamat Kilégzés a tüdőn át illékony anyagok tudnak távozni (alkohol, dietil-éter, stb.) Anyatej a gyógyszerek többsége nem választódik ki Verejték leginkább ionokat választ ki, de az orálisan adott metamfetamin és amfetamin is megjelenik a verítékben Könny fenobarbitál, carbamazepine, methotrexate, ampicillin, rifamycine, acetil-szalicilát megjelenik a könnyben Biobiztonság 6. Dr. Szatmári István 41
Klinikai vizsgálatok Fázis I vizsgálatok egészséges önkénteseken Egyszeri, emelkedő dózisú tolerancia vizsgálat farmakokinetikával Ismételt, emelkedő dózisú tolerancia vizsgálat farmakokinetikával Étel-interakciós vizsgálat Egyes esetekben bioequivalencia vizsgálat Fázis II vizsgálatok néhány tucat betegen Hatékonysági és mellékhatás felderítési vizsgálatok Humán metabolizmus vizsgálatok Interakciós vizsgálatok (enzim-induktorok, inhibitorok, fogamzásgátlók, stb.) Új terápiás alkalmazások Gyógyszerformák fejlesztése Biobiztonság 6. Dr. Szatmári István 42
Klinikai vizsgálatok Fázis III vizsgálatok több ezer betegen Hatékonysági és mellékhatás felderítési vizsgálatok Új indikációk vizsgálata Speciális betegcsoportok (vesebeteg, májbeteg, idős, gyerek, rasszok, stb.) Bioequivalencia vizsgálatok Fázis IV vizsgálatok a már forgalomban lévő gyógyszerrel Új gyógyszerformák (once-a-day, controlled release, szirup, kúp, stb.) Fix kombinációk (pl.: Algoflex-M, Quarelin) Generikus készítmények fejlesztése Új indikációk vizsgálata Biobiztonság 6. Dr. Szatmári István 43
Predikció, modellezés Az ADME vizsgálatok alapja a hatóanyagok és metabolitok koncentrációjának meghatározása a különböző biológiai folyadékokban, mint a vér (plazma), a szervek-szövetek, a vizelet, széklet, epe, de esetenként más mátrixok is (nyál, broncho-alveoláris váladék, stb.). A bioanalitikai méréseket napjainkban leginkább LC-MS/MS technikával végzik, mely módszerrel akár néhány pg/ml méréshatár is elérhető. Korábban a egyéb kromatográfiás (HPLC, GC, GC-MSD, TLC, Elektroforézis, SC-kromatográfia, stb.) és spektroszkópiás (UV-VIS, FD) módszerek is elterjedtek voltak. Biobiztonság 6. Dr. Szatmári István 44
Predikció, modellezés A koncentrációk alapján un. farmakokinetikai paramétereket határozunk meg. Ezek teszik számszerűen is összehasonlíthatóvá a készítményeket, s ezek alapján lehet meghatározni a gyógyszerek alkalmazási módját is (dózis, dózis-intervallum, éhgyomri szedés, interakció, ellenjavallat, stb.) A leggyakrabban meghatározott farmakokinetikai paraméterek: Maximális koncentráció (C max ) A maximális koncentráció eléréséhez szükséges idő (T max ) A koncentráció-idő görbe alatti terület (AUC) A (terminális) látszólagos felezési idő (T 1/2 ) A felszívódási állandó (k e ) Biohasznosíthatóság (F) Biobiztonság 6. Dr. Szatmári István 45
Modellezés Egyszeri dózis után mért koncentráció adatokból lehet következtetni az ismételt dózisú kezelésre Biobiztonság 6. Dr. Szatmári István 46
Az ADME biobiztonsági vonatkozásai In vitro vizsgálatok CaCo-2 humán karcinóma sejtvonal felszívódás és transzporter vizsgálatokhoz MDCK (kutya vese) sejtvonal transzporter vizsgálatokhoz Endothel sejt co-kultúra (patkány) a BBB vizsgálatokhoz Sejtes és szubcelluláris preparátumok emberből és állatfajokból származó májból, metabolizmus vizsgálathoz Humán és majom különös elbírálást igényel Génmódosított bakteriális sejtek metabolizmus vizsgálathoz Vér- és véralkotók emberből és állatfajokból, stabilitás vizsgálathoz Biobiztonság 6. Dr. Szatmári István 47
Az ADME biobiztonsági vonatkozásai In vivo vizsgálatok Toxikológiai és farmakológiai állatok (egér, patkány, kutya, nyúl, majom, hörcsög, tengerimalac, sertés, stb.) Génmódosított laboratóriumi állatok Farmakológiai cél (diabetesz) ADME cél (transzporter knock-out egér) Szervek, szövetek, vér- és véralkotók, exkrétumok a fenti állatfajokból Vér- és véralkotók, exkrétumok emberből Egészséges önkéntesek Betegek Biobiztonság 6. Dr. Szatmári István 48
Biobiztonság és Szellemi tulajdon védelme Nem kockázat, mert biztosan bekövetkezik: A jövő héten vizsga Ugyanitt és szintén 17.15-kor kezdünk Biobiztonság 6. Dr. Szatmári István 49