TOXIKUS FÉMEK ÉS NANO TITÁN-DIOXID HATÁSÁNAK VIZSGÁLATA TETRAHYMENA PYRIFORMIS

TOXIKUS FÉMEK ÉS NANO TITÁN-DIOXID HATÁSÁNAK VIZSGÁLATA TETRAHYMENA PYRIFORMIS TESZTORGANIZMUSSAL TDK dolgozat Készítette: Farkas Éva Témavezető: Dr. Feigl Viktória egyetemi tanársegéd Konzulens: Dr. Molnár Mónika egyetemi adjunktus Budapest 2014

Köszönetnyílvánítás Ezúton szeretnék köszönetet mondani témavezetőmnek, Dr. Feigl Viktóriának, aki rengeteget segített a kísérleteim kivitelezésében és kiértékelésében, és bármikor fordulhattam hozzá segítségért. Külön szeretnék köszönetet mondani konzulensemnek, Dr. Molnár Mónikának, aki értékes tanácsaival lehetővé tette a dolgozatom létrejöttét. Hálával tartozom a BME ABÉT Környezeti Mikrobiológia és Biotechnológia Csoport valamennyi dolgozójának segítőkészségükért, amelyet a laboratóriumi munkáim során nyújtottak. Emellett köszönöm Mucza Norbertnek és Takács Enikőnek a méréseim során nyújtott segítségüket. 2

Tartalomjegyzék 1. Bevezetés és célkitűzés... 4 2. Irodalmi áttekintés... 6 2.1. Környezettoxikológia... 6 2.2. Tetrahymena pyriformis tesztorganizmus... 8 2.3. Toxikus fémek a vizekben... 10 Kadmium... 10 Cink... 10 Arzén... 10 Ólom... 11 Réz... 11 2.4. Nanoanyagok a környezetünkben és ökotoxikológiai hatásuk... 12 2.5. Nano titán-dioxid és ökotoxikológiai hatása... 13 2.6. Fémek és nanoanyagok hatásának vizsgálata környezettoxikológiai módszerekkel... 14 3. Anyagok és módszerek... 15 3.1. Alkalmazott fémoldatok... 15 3.2. Alkalmazott nano titán-dioxid szuszpenzió... 16 3.3. Tetrahymena pyriformis szaporodásgátlási teszt... 16 3.4. Aliivibrio fischeri biolumineszcencia-gátlási teszt... 20 3.5. Sinapis alba (fehér mustár) gyökér- és szárnövekedés gátlási teszt... 23 4. Eredmények és értékelés... 24 4.1. Toxikus fémek hatása különböző trófikus szintekről származó tesztorganizmusokra... 24 4.1.1. Aliivibrio fischeri biolumineszcencia-gátlás teszt eredménye... 24 4.1.2. Sinapis alba gyökér- és szárnövekedés gátlás teszt eredménye... 25 4.1.3. Tetrahymena pyriformis szaporodásgátlási teszt eredményei... 28 4.1.4. Eredmények összefoglalása... 33 5. Fémek és nano titán-dioxid együttes hatása Tetrahymena pyriformis tesztorganizmusra... 34 5.1. A titán-dioxid nanoszuszpenzió típusának és koncentrációjának kísérleti meghatározása..... 34 5.2. Fémek és nano titán-dioxid együttes hatásának vizsgálata Tetrahymena pyriformis tesztorganizmusra... 38 6. Összefoglalás... 54 7. Felhasznált irodalom... 56 3

1. Bevezetés és célkitűzés Az elkövetkező években-évtizedekben az emberiségnek sok környezetszennyezéssel kapcsolatos problémával kell szembenéznie, azonban mindezek között a legsürgetőbb a tiszta ivóvíz biztosításának kérdése. Egyre több szennyezőanyag kerül mind a felszíni mind felszín alatti vizekbe, ezáltal közvetett módon pedig kapcsolatba kerülhetnek az ivóvízbázisokkal is. A megnövekedett ipari tevékenységek, nem megfelelő hulladékkezelés és a környezetvédelmi előírások nem betartásának következménye a nehézfémek nagy mennyiségének a vízbázisokba jutása. Az elmúlt évtizedekben szárnyat kapó nanotechnológia sem maradt hulladékok, melléktermékek nélkül, azonban hosszú távú környezeti hatásai nem teljesen tisztázottak. A nanoanyagok ökoszisztémára gyakorolt hatásáról a kutatások által egyre több információval rendelkezünk, de még mindig rengeteg megválaszolatlan kérdés áll előttünk. Például a nanovegyületek erősíthetik a jelenlevő egyéb szennyezőanyagok, például toxikus fémek az eredetileg is számottevő negatív hatását. Ezért kiemelten fontos, hogy környezettoxikológiai módszerekkel vizsgáljuk hatásukat az ökoszisztémára és az emberre. Kutatásom célja az volt, hogy egy, már jól bevált, környezettoxikológiában széles körűen alkalmazott modellorganizmussal vizsgáljam, hogy milyen káros hatása lehet a toxikus fémeknek akkor, ha nanoanyaggal együtt kerülnek a környezetbe. Kutatási munkám első lépcsőjében méréseket végeztem annak meghatározására, hogy az általam választott tesztorganizmus, a Tetrahymena pyriformis, milyen érzékenységgel rendelkezik az egyes fémekre. Célom volt öt kiválasztott toxikus fémre (arzén, cink, kadmium, ólom, réz) meghatározni szaporodásgátlási teszt alapján a gátlást okozó hatásos koncentrációkat (EC20 és EC50 értékek) és összevetni az irodalomban fellelhető adatokkal. Emellett a fémek toxikus hatását vizsgáltam két más trofikus szinten lévő organizmussal is: a Sinapis albával (fehér mustár) gyökér- és szárnövekedés gátlási tesztet, az Aliivibrio fischeri, tengeri mikroorganimussal pedig lumineszcencia gátlási tesztet kiviteleztem. Ez utóbbi tesztorganizmusokkal meghatározott hatásos koncentrációkat összevetettem a T. pyrifomis szaporodásgátlási teszttel kapott értékekkel és értékeltem a különböző tesztorganizmusok, módszerek érzékenységét a fémekre. Kísérleti munkám második fázisában a toxikus fémekre kapott eredményeket felhasználva léptem tovább, és teszteltem T. pyriformis-szal a már nano titán-dioxidot és fémeket is tartalmazó keverék modelloldatokat. 4

A kiterjedten alkalmazott nanovegyületek közül azért ezt választottam, mert szennyezőanyagként számos humán felhasználású forrásból (krémek, kozmetikumok stb.) és ipari alkalmazásból (textil-, festék- és műanyagipar stb.) is nagy mennyiségben kerülhet a vízi ökoszisztémákba. Komplex kísérletsorozatban, 72 órás kísérletekben vizsgáltam meg a fémek és a titándioxid nanorészecskék együttes hatását az állati egysejtű (protozoa) tesztorganizmus szaporodására. A protozoák az ökoszisztéma fontos szereplői, a természetben lévő viselkedésük és jelenlétük összefüggésben van a szennyezőanyagok jelenlétével, a levegő, víz és talaj minőségével. A Tetrahymena pyriformis vizes közegből veszi fel a táplálékát, így vízben oldódó szennyezőanyagok közvetlenül hatnak életműködésére. Mivel az irodalomban a nano TiO 2 és toxikus fémek együttes hatását kimutató mérési eredmény állati egysejtűvel még nem található, újdonságként ezzel céloztam meg modellezni e két szennyezőanyag kollektív hatását az ökoszisztéma tagjaira, felhívva a figyelmet az ilyen jellegű szennyezések környezeti kockázatára. 5

2. Irodalmi áttekintés 2.1. Környezettoxikológia A környezettoxikológia a környezetbe került vegyi anyagoknak az ökoszisztéma tagjaira gyakorolt hatását méri és ebből törekszik előrejelzést adni a teljes ökoszisztémára Mivel a teljes ökoszisztéma vizsgálata nem megvalósítható, ezért a felmérés egy-egy kiválasztott jellemző faj, vagy laboratóriumi tesztorganizmusok válasza által történik. Ez alapján következtetünk a teljes ökoszisztémára (Gruiz et al., 2001). A környezetünkbe kerülő vegyi anyagok globális veszélyt jelentenek, mivel az ökoszisztéma szerkezetére, funkciójára, ezen keresztül az emberre is hatással vannak; a környezettoxikológia/ökotoxikológia pedig ezeknek a vegyi anyagoknak káros hatását hivatott kimutatni. Nem csak a xenobiotikumok (természetidegen anyagok) jelenléte, hanem természetes eredetű szerves és szervetlen anyagok előfordulása a megszokottól eltérő eloszlásban is terhelheti a környezetet, ha extrém nagy értékek kerülnek a földi anyagforgalomba. Az ökotoxikológiai tesztek eredményéből következtethetünk vegyi anyagoknak az emberre és az ökoszisztémára gyakorolt hatásaira, úgy, hogy az emberi anyagcserével hasonlóságot mutató, jól bevált tesztorganizmusokkal kivitelezett tesztek eredményét megkapva, extrapolációt végzünk. A környezettoxikológia a vegyi anyagok környezeti kockázatának meghatározásához szükséges alapvető adatokat szolgáltatja, vagyis a vegyi anyag hatására vonatkozó információkat. A vegyi anyag hatásán a dózis-válasz, illetve a koncentrációválasz összefüggés ismerete alapján meghatározható károsan még nem ható környezeti koncentráción kell alapulniuk a környezeti minőségi kritériumoknak, a határértékeknek is. A környezettoxikológia egy multidiszciplináris tudományágnak tekinthető, mivel számos tudományterület közreműködésére szüksége van a környezeti toxikológiának pl.: mikrobiológia, biokémia, biometria, szerves és szervetlen kémia, matematika, ökológia, biológia. A vegyi anyagok hatásának három fontos alapfolyamata van: 1. Miután a vegyi anyag bekerül a környezetbe, kölcsönhatásba lép a környezetével. A különböző fázisok között terjed, megoszlik, átalakul, degradálódik, stb. Ezek a folyamatok határozzák meg a vegyi anyag környezeti koncentrációját. 6

2. Molekuláris szinten is kölcsönhatásba lép a vegyi anyag az élőlénnyel és elérheti annak létfontosságú szerkezeti részét vagy valamely fontos feladatot ellátó molekuláját pl.: enzimfehérje, genom. 3. A hatás ebből következően magasabb szintekre is átterjedhet és megjelenik pl.: biokémiai vagy fiziológiai szinten, viselkedés szintjén, a populáció vagy akár az egész ökoszisztéma szintjén (Gruiz et al., 2001). A környezettoxikológiai mérések végpontja sokféleképpen megválasztható, a biokémiai végpontoktól az organizmus szintjén keresztül az ökoszisztéma szintjéig bárhol. A végpont eredményei alapján általában további származtatott értékeket is felhasználunk a kockázat mértékének megállapítására. A hagyományosan mért végpontok közé tartozik a tesztorganizmus mozgásképtelenné válása (immobilitás) és halála (letalitás). Az ökotoxikológiai teszteket időtartam szerint is csoportosíthatjuk: lehet akut (rövid expozíciós/ kitettség idejű) vagy krónikus (hosszú expozíciós/ kitettségi idejű) tesztek. Az akut teszteket elterjedtebben alkalmazzák, melynek időtartama, tesztorganizmustól függően 24 72 óra. A tesztek eredményeiből határozzuk meg a koncentráció-válasz összefüggést úgy, hogy a vizsgált vegyi anyag növekvő koncentrációinak függvényében mérjük a hatást. A koncentráció-hatás görbéről olvashatjuk le a 10, 20, 50 vagy 90%-os gátlást okozó koncentrációt, ennek megfelelően az alábbi vizsgálati végpontokat szokták, mint eredményt megadni (Gruiz et al., 2001): LC (letális koncentráció), EC (hatásos koncentráció), LD (letális dózis), ED (hatásos dózis). Sok esetben előfordulhat az, hogy a vegyi anyag hatása nem jelenik meg ilyen rövid idő alatt, csak az akut teszt lejárta után, ezért célszerű hosszabb idejű, krónikus tesztek elvégzése is. Ezeknél a koncentráció-hatás görbe alapján grafikusan vagy statisztikai módszerekkel megállapított értékek adhatók meg. Ezek a NOEC (No Observed Effects Concentration), a NOEL (No Observed Effects Level), a NOAEC (No Observed Adverse Effects Concentration), a NOAEL (No Observed Adverse Effects Level), a LOEC (Lowest Observed Effects Concentration), a LOEL (Lowest Observed Effects Level), és a MATC (Maximum Allowable Toxicant Concentration). A környezettoxikológia jelentős hatással bír manapság mind ipari, mind a környezetvédelmi területeken, így már sok ASTM (American Standards for Testing Materials), ISO (International Office of Standardisation) és OECD (Organisation for 7

Economic Cooperation and Development) szabvány foglakozik a vegyi anyagok hatásának, valamint a talajok és vizek minőségének értékeléséhez kapcsolódó biológiai vizsgálatokkal (ASTM, ISO, OECD). Az REACH (EU területén előállított vagy forgalmazott vegyi anyagokra vonatkozó új egységes szabályozás) is kiemelt hangsúly fektet az ökotoxikológiai tesztek által szolgáltatott eredményekre, információkra (Gruiz et al., 2001). 2.2. Tetrahymena pyriformis tesztorganizmus A Tetrahymena pyriformis (1. ábra) az Oligohymenophoreák osztályába, a Hymenostomiák alosztályába, a Hymenostomatidák rendjébe és a Tetrahymenina alrendbe tartozó csillós eukarióta egysejtű, vízi protozoa, mely az ökotoxikológiai tesztek és sejtfiziológiai kutatások közkedvelt tesztorganizmusa (Sauvant et al, 1999). Népszerűségét annak köszönheti, hogy könnyen fenntartható laboratóriumi körülmények között, rövid sejtciklus idővel rendelkezik, receptorai és jelátviteli útvonalai szempontjából nagymértékű hasonlóságot mutatnak fejlettebb gerinces modellekhez (Láng et al., 2004). Fejlettebb élőlényekhez hasonlóan a Tetrahymena pyriformis is termel bizonyos hormonokat, például inzulint és adrenalint (Sauvant et al, 1999). Könnyen vizsgálható emellett a kemotaxisa és a fagocitózisa is. Érzékenyen reagál a környezetben előforduló szerves- és szervetlen molekulák jelenlétére (Arndt et al., 1998). Ezek a tulajdonságok teszik alkalmassá arra, hogy a környezetben megtalálható gyógyszerhatóanyagok élettani hatásait vizsgáljuk rajta. 1. ábra: Lugollal megfestett Tetrahymena pyriformis 8

A sejtek általánosságban 50 60 μm hosszúak és 30 μm szélesek, alakjuk körtére emlékeztet, felszínüket csillók borítják. A Tetrahymena pyriformisra jellemző még a nevüket adó és a sejtszájat körülvevő négy hártyaszerű képlet. Tenyésztésük hőmérsékleti optimuma, ahol leggyorsabbak az életfunkcióik 28 C. Generációs ideje 150 160 perc (Sauvant et al, 1999). Mivel édesvízi környezetben mindenhol megtalálható és érzékenyen reagál a környezeti változásokra, a csillós Tetrahymena pyriformis évtizedek óta a legkedveltebb tesztorganizmusok között volt különböző ökotoxikológiai, fizikológiai, biológiai és farmakológiai kutatásoknak. Tulajdonságai a tesztorganizmusok összes kritériumának megfelelnek, eukarióta, jól ismertek a biológiai válaszreakciói, könnyen fenntartható laboratóriumi körülmények között, és a generációs ideje is kellően rövid (Nicolau et al, 2001). Az ökotoxikológiai tesztek végpontjának sokszor választják a sejtszámot, a szaporodási képességet, illetve a sejtek méretét és mozgásképességét. A Tetrahymena pyriformis szaporodása a számára optimális körülmények között, korai (Lag), exponenciális (Log), és végső telítési stacioner (Stat) növekedési fázisokkal jellemezhető. Sejtszám-változás szempontjából a Log fázisban a sejtszám logaritmikusan növekszik, itt érdemes kísérleteket elvégezni (ez a fázis akár két napig is tarthat). A következő, stacioner fázisba a tápanyagszint csökkenése és a ph emelkedése miatt jutnak el. A sejtszámlálás többféle módon is történhet: manuálisan mikroszkóppal, automata sejtszámlálóval, vagy akár spektrofotometriás módszerrel is meg tudjuk számolni (Sauvant et al., 1999). A sejtszámból, mely a környezettoxikológiai tesztek gyakori végpontja, növekedési görbe készíthető, melyből a generációs idő (3 7 óra) is meghatározható. Ebből meg tudjuk határozni a szennyezőanyagnak azt a koncentrációját, amely a sejtek számát a kontrollhoz képest 50%-kal csökkenti, azaz az IC50 értéket. Ökotoxikológiai teszteknél végpont lehet a makronukleusz DNS tartalma is. A Tetrahymenák több törzsénél (pl. Tetrahymena termophila) a makronukleolusz mellett mikronukleolusz is előfordulhat. A makronukleusz a mikronukleusz DNS tartalmának 12 14-szeresét tartalmazza, így, hiába érzékeny mindkettő DNS állománya a külső behatásokra, gyakorlatilag, ha csak a makronukleusz DNS tartalmát vizsgáljuk, akkor jó közelítéssel, a sejt teljes DNS tartalmára következtethetünk ebből az értékből (Stefanidou et al., 2008). 9

2.3. Toxikus fémek a vizekben A kohászat, bányászat és az egyéb ipari tevékenységek melléktermékeiként nagy mennyiségű nehézfém és egyéb toxikus vegyület juthat a talajokba és felszíni élővizekbe. A talajokból a felszín alatti vizekbe mosódnak a szennyeződések, veszélyeztetve az ivóvízbázisokat és a felszíni vizeket, így még több élőlény számára is kockázatot jelentenek. A toxikus bekerülhetnek a táplálékláncba, ezáltal az emberhez is eljutva. Kadmium A kadmium különböző természetes utakon, mint erózió, hévforrások stb. is a környezetbe juthat, de a legnagyobb hányad az ipari tevékenységek (acélgyártás, kohászat, festékgyártás) folytán jut a környezetbe. Ezen kívül ipari és háztartási hulladékkal, műtrágyázás folyamán is kijuthat (Fergusson, 1990; Pálné, 2003). Emberek számára főként azért toxikus a kadmium, mivel a cinkkel való nagyfokú kémiai rokonságot mutat. A szervezetbe elsősorban gabonanövények, zöldségek, diófélék, hüvelyesek, tengerből származó élelmiszer burgonya, húsok és hústermékek, vadon nőtt gombák fogyasztásával jut be. Károsítja a vesét, az idegrendszert, csontelváltozásokat, emésztőrendszeri és légzési zavarokat okoz (Sohárné, 2009; Feigl, 2011). Cink A talajokba, talajvizekbe cink elsősorban ipari tevékenységek miatt juthat (bányászat, kohászat, fosszilis tüzelőanyagok elégetése) de a mezőgazdasági tevékenység során is kerülhet a talajokba, talajvizekbe (Adriano, 1986). Embereknél a cinkhiány csökkenti a termékenységet, gyengíti az immunrendszert, gátolja a gyermekek növekedését (Pálné, 2002), viszont a cink túladagolása hosszútávon emésztőrendszeri és szexuális problémákhoz vezethet, továbbá károsodik az immunrendszer és a reprodukciós szervek is (www.advance-health.com; Feigl, 2011). Arzén Az arzén természetes úton (vulkáni tevékenység, kőzetek mállása) és mesterséges úton (ipari tevékenységek: kohászat, bányászat, vegyipar) is kikerülhet a környezetbe, az emberi szervezetbe pedig tengeri élőlények fogyasztásával, ivóvízzel és akár a levegőből is bekerülhet (www.epa.gov). A gyógyászatban is használták roborálószerként és pl. a szifilisz visszaszorítására alkalmas arzéntartalmú gyógyszerekben, ezen felül régóta ismert és használt méreg. Krónikus 10

mérgezés esetén raktározódhat a körömben, bőrben és a hajban, és nagyon lassan ürül ki a szervezetből a vizelettel, esetleg az epeváladékkal. Karcinogén, főként tüdő- és bőrrákot, de egyéb daganatos megbetegedéseket is okozhat (Pálné, 2002; Wagner és Hencsei, 2001; Feigl, 2011). Ólom Mint a legtöbb nehézfém, az ólom környezetbe jutásáért is elsősorban a kohászat és a bányászat a felelős, de az ólom ezen felül a festékgyártásból, műanyagok égetéséből és közlekedés során korábban használt és elégetett ólmozott üzemanyagok elégetésével is a környezetbe kerülhetett (Adriano, 1986). Az emberi szervezetbe húsok és gabonafélék továbbá szennyezett ivóvíz fogyasztásával juthat: ólommérgezéskor vérszegénység lép fel, a krónikus ólommérgezés pedig idegrendszeri zavarokhoz vezet (Feigl, 2011). Az IARC az ólmot és szervetlen ólomvegyületeket a valószínűleg rákkeltő csoportba sorolta, míg a szerves ólomvegyületeket nem tekinti a rákkeltő vegyületek csoportjába sorolhatónak (www.inchem.org). Réz Nagy adagú réztrágyázás, réztartalmú fungicidek ismételt alkalmazása, szennyvíziszap adagolása, illetve a bányászat, kohászat, fémelőállítás következében fellépő légköri ülepedés eredményezhet toxikus rézkoncentrációt a talajban. A talajban lévő réz legnagyobb része a szerves anyagokhoz kötött, de egy része a vasoxidokhoz és más talajkolloidokhoz kapcsolódik. A réz savanyú talajokban a legoldhatóbb, a ph-érték emelésével csökken az oldhatósága (Atkári, 2006). Kis mennyiségben esszenciális, nagyobb mennyiségben toxikus elem. A réz jelentős szerepet játszik a biokémiai folyamatokban (pl. a molekuláris oxigén rézfogyasztás 3 5 mg, melynek nagy része kiürül). Mivel a szervezetben a vas anyagcseréjét a réz befolyásolja, hiánya vérszegénységet okoz. Szembe kerülve a réz kalkózist okoz, amely vaksághoz vezet. A bordói lével permetezők között gyakori a tüdő- és májkárosodás (Fergusson, 1990). 11

2.4. Nanoanyagok a környezetünkben és ökotoxikológiai hatásuk A nanotechnológiai módszerekkel előállított nanorészecskék, nanoszemcsék elsősorban méret szempontjából sorolhatóak egy csoportba. Azokat az anyagokat nevezzük nanoanyagoknak, melyeknek legalább egy dimenziója kisebb 100 nm-nél. Szerzőnként változik a publikációkban megadott definícióban szereplő mérethatár. Vannak, akik 50 nm-t, vagy 1 μm-t adnak meg felső határként. Ennek oka, hogy anyagtípustól függően más tartományban kezdenek szignifikáns különbségek jelentkezni a nano, és normálméretű részecskék viselkedésében (Buzea et al., 2007; Pándics, 2008). Nanorészecskék lehetnek amorf, vagy kristályos elrendezésűek, felületük hordozóként szolgálhat más anyagok, gázok és folyadék cseppek számára. Különleges tulajdonságaik miatt nagy fajlagos felület, kvantum kölcsönhatások tekinthetnénk rájuk úgy is, mint az anyag egy sajátos új halmazállapotára (Buzea et al., 2007). A nanorészecskék kémiai összetételüket tekintve rendkívül széles skálán mozognak, lehetnek elemek, vegyületek vagy akár biológiai struktúrák is. Különböző nanorészecskék keletkezhetnek természetes úton, vagy emberi (antropogén) tevékenység következtében. Ez történhet célzott előállítás során, vagy pedig nem kívánatos melléktermékként (Pándics, 2008). Természetes folyamatok során kőzetmállások, erdőtüzek, vulkánkitörések során kerülhetnek a környezetbe (Maros, 2011). Felhasználást tekintve legnagyobb előnye a méret csökkenésével egyenes arányban a fajlagos felület növekedése, ezt használják ki az iparban leginkább. Kozmetikumokban, napvédő krémekben nagy mennyiségben használják fel őket, mivel kis méretük révén a bőr mélyebb rétegeibe képesek behatolni, ezáltal különböző, akár regenerálódást serkentő anyagokat is be tud juttatni vivőanyagként (Maros, 2011). Ezen kívül adalékanyagként is felhasználhatjuk őket: festékeknél, vakolatokban vagy gumiabroncsokban. Fontos szerepük van az elektronikában, mikroelektronikában, félvezetőkként. Egyéb gyorsan fejlődő alkalmazási területek az üzemanyagcellák fejlesztése, speciális bevonatok készítése és a katalitikus folyamatokban való alkalmazásuk. Ígéretes felhasználási területek vannak még az energia tárolás és átalakítás területén is. Nanoanyagok segítségével lehetséges öntisztuló bevonatok létrehozása, vagy szennyezőanyag taszító textilek fejlesztése (Gellein et al., 2009; Maros, 2011). 12

A humán egészségügyi alkalmazások fejlesztése a nanoanyagok alkalmazásának egyik legtöbbet kutatott és legígéretesebb területe. Egyre nagyobb mennyiségben használnak nanoanyagokat a diagnosztikában (képalkotó eljárások) is és a terápiás eljárásokban is (gyógyszerhatóanyagok célba juttatása) (Gellein et al., 2009; Maros, 2011). Környezettoxikológiai hatásuk még nem igazán ismert, csak az utóbbi időben kezdtek el foglalkozni a kutatók a kockázatuk felmérésével. Mivel speciális tulajdonságú anyagokról van szó, ezért nehéz megjósolni a hatásukat. Többek között szinte lehetetlen diszpergálószer használata nélkül oldatokat készíteni belőlük, ezért az várható, hogy természetes vizekben aggregálódni fognak. Ezen felül az, hogy egy adott nanoanyagnak nincsen akut toxicitása, nem feltétlenül jelenti azt, hogy hosszútávon sincs. Ezen felül különböző szinergista hatások léphetnek fel más szennyezőanyagokkal is (la Farré et al., 2008). 2.5. Nano titán-dioxid és ökotoxikológiai hatása Titán-dioxid nanorészecskéket széles körben használnak, mint fehér pigment anyagot, ételszínezéket, napvédő krémet, egyéb kozmetikai célú krémek, valamint fogkrémek összetevőjét. Legtöbb alkalmazása esetében UV elnyelő képességét aknázzák ki. Használják még textilek, papír és műanyagok előállításánál, ahol ugyancsak UV védelem a célja, valamint élelmiszerek és gyógyszerek alkotóelemeiként (Maros, 2011). Nano titán-dioxid hatásának leginkább a vízi ökoszisztémák vannak kitéve, és mivel aggregálódásra hajlamos, a fenéklakók ennek nagyobb mértékben áldozatul esnek, de a vízfelszínén élő növények és állatok is nagyobb expozíciónak vannak kitéve, mint a víztestben élők. Táplálékkal, légzéssel juthatnak a szervezetükbe, de abszorbeálódhatnak vagy aggregálódhatnak is az itt élő organizmusok felszínén. Szárazföldön leginkább a szállítás során sérülő tartályokkal kerülhetnek kölcsönhatásba az ott élő organizmusok. Szárazföldi növények felvehetnek nano titán-dioxidot tartalmazó vizet, vagy nőhetnek szennyezett talajon, például víztisztító üzem iszapjával kezelt területen (EPA 2009). 13

2.6. Fémek és nanoanyagok hatásának vizsgálata környezettoxikológiai módszerekkel A nanoanyagok újdonsága miatt nagyon kevés kutatást végeztek eddig fémek és nanovegyületek együttes hatásának vizsgálatára, ezért indítottam ezt az átfogó kísérletsorozatot, melyben több fém hatását is tanulmányoztam nano titán dioxiddal szuszpenzióval együttesen tesztelve. Tetrahymena thermophila-val végeztek már olyan kísérleteket, ahol nano-zno és nano-cuo toxikus hatását vizsgálták (Mortimer et al., 2010). Azt találták, hogy a toxikus hatás a részecske méretétől és koncentrációjától függ leginkább. A kitettség idejének hatása fontos tényezőnek bizonyult: a ZnO esetében 1,5-szer kisebb toxikus hatást mértek az adaptáció miatt 24 óra elteltével, mint 4 óra után, CuO-nál viszont egyáltalán nem volt változás az idő előrehaladtával. A BME-n is folytak kutatások nanoanyagokkal kapcsolatban (Maros, 2011). Ekkor nano titán-dioxid hatását vizsgálták meg különböző trófikus szintekről származó ökotoxikológiai tesztorganizmusokkal, így átfogóbb képet adva ennek a vegyületnek a környezetre gyakorolt hatásáról. Fémek, többek között alumínium hatását is vizsgálták már T. pyriformisra akut toxicitási tesztben (Sauvant et al., 2000). Ennek során egy 9 órás tesztet alkalmaztak, ahol három alumínium só IC50 értékeit határozták meg, de indult olyan tesztsorozat is ahol átfogóan határozták meg fémek egész sorára az IC50 értékeket (Sauvant, 1997). Nanovegyület és fémek kombinált hatását is tanulmányozták kutatók: arzén és nano vas(iii)-oxid toxicitását figyelték meg Kínában Zou et al. (2013), és arra ez eredményre jutottak, hogy a nano-vas önmagában serkentette a T. pyriformis szaporodását, arzénnel kombinálva viszont gátló hatásuk lett. Ez a hatás az idő előrehaladtával csökkent. 14

3. Anyagok és módszerek Dolgozatom fő célkitűzése volt megvizsgálni fémek/félfémek (cink, kadmium, ólom, réz és arzén) hatását a Tetrahymena pyriformis tesztorganizmus szaporodására önmagában, továbbá a napjainkban kiterjedten alkalmazott nanoanyaggal, a nano titán-dioxiddal együttesen alkalmazva. Központi kérdés volt, hogy a nano titán-dioxid fokozza-e a kiválasztott fémek és arzén hatását, ha együtt vannak jelen a környezetben. Ehhez kapcsolódóan kutatásaim során toxikus fémek hatását vizsgáltam különböző tesztorganizmusokra. Kísérleti munkám fő részében a Tetrahymena pyriformis csillós egysejtűvel végeztem szaporodásgátlási teszteket. Azonban ezen túlmenően, más trófikus szintek képviselőivel is vizsgáltam a toxicitást, abból a célból, hogy az eredményeimet összevethessem velük, és információt kapjak az állati egysejtűt alkalmazó módszer érzékenységéről az adott szennyezőanyagok esetén. Ehhez kettő, az állati egysejtűtől különböző egy alacsonyabb és egy magasabb - trófikus szintről származó tesztorganizmust alkalmaztam: a fehér mustár növényt (Sinapis alba) és egy tengeri baktériumot (Aliivibrio fischeri). Mindkét módszer rutinszerűen alkalmazott eljárás napjainkban környezeti minták toxicitásának jellemzésére. Munkám második részében pedig a nano titán-dioxid toxikus hatását vizsgáltam együtt a kiválasztott fémekkel 72 órás rázatott lombikos kísérletekben. 3.1. Alkalmazott fémoldatok Méréseim során különböző koncentrációjú fémoldatokkal dolgoztam, melyekhez a törzsoldatokat én készítettem el. Ezekből készítettem a megfelelő hígításokat a teszteléshez. Az összeállított törzsoldatok a következőek voltak: 5000 p-es és 1000 -es Cd-ion tartalmú oldat CdCl 2.2,5H 2 O-ból 5000 p-es és 1000 -es Pb-ion tartalmú oldat Pb(NO 3 ) 2 -ből 5000 p-es és 1000 -es Zn-ion tartalmú oldat ZnCl 2 -ből 5000 p-es és 1000 -es Cu-ion tartalmú oldat CuCl 2.2H 2 O-ből 5000 p-es és 1000 -es As-ion tartalmú oldat Na 2 HAsO 4.7H 2 O-ból 15

3.2. Alkalmazott nano titán-dioxid szuszpenzió Neve: CYL 3039/2 (Forgalmazó: Evonik, korábban Degussa) Elsődleges kristályméret: 14 nm A diszperzióban található halmazok 50%-ának összesített térfogata (tömege) az adott méret alatt, 50 %-a e feletti tartományban található: 89 nm. A diszperzióban található halmazok 50%-a (szám szerint) az adott méret alatt, 50 %-a e feletti tartományban található: 73 nm Szuszpenzió koncentrációja: 4,00 m/m % Fajlagos felület: 90 m 2 /g. 3.3. Tetrahymena pyriformis szaporodásgátlási teszt A módszer alapja az, hogy a Tetrahymena pyriformis (2. ábra) mikroszkopikus állatka szaporodása nagyban gátolt toxikus anyagok jelenlétében. Az állatok számának, azaz a sejtszám változásának nyomon követésével a szennyezőanyagok toxikus hatása vizsgálható. Az eredeti módszert Gruiz és Leitgib (2006) fejlesztették ki talajok környezettoxikológiai tesztelésére, majd a BME ABÉT Környezeti Mikrobiológia és Biotechnológia Csoportban fejlesztették később tovább. Toxikus fémek vízmintákban való vizsgálatára a kísérleteim előtt a tesztrendszer összeállítását probléma-specifikusan módosítottam. 2. ábra: Tetrahymena pyriformis Bürker-kamrás számoláskor 16

A Tetrahymena pyriformis fenntartása: A Tetrahymena pyriformis fenntartása folyadékkultúrában, folyamatos heti átoltással történik, PP tápoldatban. Az átoltás során 30 ml PP tápoldatba 1,6 1,8 ml sejtszuszpenziót teszünk a szuszpenzió felső, oxigéndúsabb rétegéből, illetve 76 μl antibiotikum mix (AB mix: 0,2% penicillin, 2% sztreptomicin, 1% nisztatin) oldatot a befertőződés elkerülése érdekében. A tenyészetet sötét termosztátban, 22±1 C állandó hőmérsékleten tartjuk. A PP tápoldat összetétele (fenntartáshoz és teszteléshez): 10 g tripton 1 g élesztő kivonat 1000 ml csapvíz ezután sterilezés autoklávban 121 C-on, 10 percig. A tesztrendszer összetétele: 100 ml-es Erlenmeyer lombikban indítottam a méréssorozatokat, melyhez egy napos, előzetesen meghatározott sejtszámú Tetrahymena pyriformis szuszpenziót használtam fel. 300 µl steril fémoldat, megfelelő koncentrációban, steril desztillált vízzel hígítva. Szennyezetlen kontrollként steril csapvizet használtam. 200 µl antibiotikum mix oldat 14,5 ml steril csapvíz Inokulum: előzetes sejtszámlálás alapján meghatározott T. pyriformis mennyiség, úgy, hogy a sejtek kiindulási koncentrációja a tesztrendszerben 2500 db/ml legyen 15-x ml PP tápoldat A tápoldat és a csapvíz aránya azért 1:1-hez, mert a fél tápoldat alkalmazásával érzékenyíthetünk a teszten. Ha teljes tápoldatban dolgoztam volna, a T. pyriformis esetleges gátlási reakcióit kiegyenlítette volna a nagy feleslegben adott tápoldat serkentő hatása. 17

A mérés menete: Az egyes tesztrendszerekből két-két párhuzamos mérést indítottam. A különböző koncentrációjú és összetételű tesztelegyeket tartalmazó lombikokat (3. ábra) ezután rázógépbe helyeztem, ahol 150 rpm-en és 22±1 C hőmérsékleten rázattam 72 órán át, 24 óránként pedig steril körülmények között mintát vettem belőle. 3. ábra: Rázatásra előkészített tesztelegyek A sejtszámláláshoz a tesztkultúrából kivett 1 vagy 0,5 ml mintához 1,5%-os formalin oldatot mértem, rendre 30 µl-t ill. 15 µl-t. Ezután lombikonként 2 db 2 µl-es cseppben számláltam meg a sejteket Bürker-számlálókamra (4. ábra) segítségével. 4. ábra: Bürker-kamrás számolás mikroszkóppal 18

Eredmények kiértékelése: Az adatokat excel táblázatban rendeztem és kiszámoltam a gátlási százalékokat a következő módon: Ahol: I% - a szaporodásgátlás %-ban kifejezett értéke; K a kontrollként használt csapvizes tesztrendszerben mért sejtszámok átlaga F a vizsgált fémtartalmú tesztrendszerben mért sejtszámok átlaga A kiértékelés ezután kétféle módon folytatódott. Azokban a mérési összeállításokban, ahol csak fémoldattal dolgoztam, azaz az adott fém gátló hatását vizsgáltam önmagában, koncentráció-válasz görbéket készítettem az OriginPro 8 program segítségével, és leolvastam a 20%-os és az 50%-os gátláshoz tartozó koncentráció értékeket. Ez a grafikus módszer látható az 5. ábrán. 5. ábra: Grafikus módszer az EC20 és EC50 értékeinek leolvasásához 19

Azokban az összeállításokban, ahol nano TiO 2 -fém keverékeket készítettem, a nanoanyag és fém együttes hatásának vizsgálatát célozva, STATISTICA12 szoftverrel határoztam meg, hogy melyek azok a fém-nano TiO 2 keverékek, melyek szignifikánsan különböznek az adott csak fémet, illetve csak nano TiO 2 -t tartalmazó tesztrendszerektől. Eredmények statisztikai kiértékelése A titán-dioxid nanorészecskéket és fémoldatot is tartalmazó keverékekből származó adatokat STATISTICA 12 szoftverrel értékeltem ki. ANOVA variancianalízist alkalmaztam 95% konfidencia intervallum megadásával. Az általam Post Hoc analízisként alkalmazott Duncan s próba eredményeiből megbízhatóan meg tudtam állapítani, melyek azok a keverékek, melyek szignifikánsan különböznek az azonos koncentrációban vagy csak fémoldatot, vagy csak nano-titánt tartalmazó kontrolloktól. A Duncan próba az egyik leggyakrabban alkalmazott többszörös összehasonlító teszt napjainkban. 3.4. Aliivibrio fischeri biolumineszcencia-gátlási teszt Az Aliivibrio fischeri biolumineszcencia-gátlási teszt egy fajt alkalmazó, in vitro bakteriális, akut toxicitási teszt, mely alkalmazható felszíni vizek, pórusvíz, üledék, talajkivonat és teljes talaj vizes szuszpenziója toxicitásának meghatározására. Az Aliivibrio fischeri érzékeny nehézfémekre, szerves makro- és mikroszennyezőkre. A módszer az Aliivibrio fischeri tengeri baktérium által emittált lumineszcens fény intenzitásának mérésén alapul. Gátló anyag jelenlétében a fényemisszió csökken, amelynek mértékét luminométerrel mérjük. Mivel az Aliivibrio fischeri tengeri organizmus, fontos, hogy a kísérlet során fenntartsuk a számára szükséges ozmózisnyomást. A biolumineszcencia élő rendszer általi lumineszcens fénykibocsátást jelent. A bakteriális lumineszcens fénykibocsátás alapegyenlete: FMNH 2 +O 2 + RCHO FMN+RCOOH+H 2 O+fény ahol az FMNH 2 a redukált, az FMN az oxidált flavin mononukleotid. 20

A minta hígítási sorából EC 20, EC 50 (hatásos koncentráció, mely a mérési végpont 20, ill. 50 %-os csökkenését okozza) határozható meg, melyekkel jellemezhető a vizsgált minta toxikussága. A módszer előnye, hogy jól reprodukálható, alkalmas előzetes és részletes állapotfelmérésre, kockázatfelmérésre, remediáció követésére, ellenőrzésére, utómonitoringra (Gruiz et al., 2001). Aliivibrio fisheri tápoldat összetétele: 1. táblázat: Aliivibrio fischeri tápoldat összetétele 30 g NaCl 6,1 g NaH 2 PO4.H 2 O 2,75 g K 2 HPO 4 0,204 g MgSO 4.7H 2 O 0,5 g (NH) 2 HPO 4 5 g pepton 0,5 g élesztőkivonat 3 cm 3 glicerin 7,2 ph Aliivibrio fischeri biolumineszcencia-gátlási teszt menete: A vizsgálathoz használt baktérium-szuszpenzió előállítása két lépésben történt. Első lépésben 24 órán át, 28 C-on, lombikban rázatott inokulumot állítottam elő, majd ennek 1 cm 3 -ével 30 cm 3 tápoldatot oltottam be. 24 órás, 28 C-on történő rázatás után használtam a sejtszuszpenziót mérésre. A mérés érzékenységének kezdeti beütésszámtól és hőmérséklettől való függése miatt egy standard réz-sort is készítettem. A standard sor készítéséhez felhasznált réz vegyület: CuSO 4.5H 2 O. A hígításhoz 2%-os NaCl-oldatot használtam. Az alkalmazott Cu-sor tagjainak koncentrációja: 20, 40, 80, 120, 160, 200 és 400 (6. ábra). A lumineszcencia mérését LUMAC Biocounter M1500 P luminométerrel végeztem. A mérés kontrolljaként 2%-os NaCl oldatot és desztillált vizet használtam. 21 6. ábra: Kontroll rézoldat-sor hígítási sorának elkészítése

A mérés első lépéseként meghatároztam az inokulum kezdeti beütésszámát, hogy szükség szerint hígíthassam. (Előzetes mérések szerint, ha a kezdeti beütésszám 600 000 felett van érdemes a sejtszuszpenziót hígítani). Második lépésként a készülék mintatartóiba 200 200 µl sejtszuszpenziót pipettáztam, majd megmértem a lumineszcencia intenzitását (I0). Ezután a higított mintáimból 50 50 µl-t pipettáztam a sejtszuszpenziókhoz, minden esetben alaposan homogenizálva a kémcsövekben lévő mintákat. A rézsorból szintén 50 50 µl-t adtam a megfelelő sejtszuszpenziókhoz. A kontroll mintákhoz a mérési sorozat elején és végén 50µl NaCl-ot mértem be. 30 perces kontaktidő elteltével megmértem a lumineszcencia intenzitást (I30). Eredmények kiértékelése: A 3. táblázat szerint számoltam a mért intenzitások segítségével a vizsgált minta okozta %-os lumineszcencia- intenzitáscsökkenéseket (H%). 2. táblázat: táblázat az A. fischeri mérés kiértékeléséhez Minta I0 I30 f=i30k/i0k Iszám=f*Io H%=100%*(Iszám- I30)/Iszám NaCl kontroll 1 I0k1 I30k f= (I30k1+I30k2)/ Cu1 Cu2 Cu3 Cu4 Cu5 minta1 minta2 NaCl kontroll 2 I0Cu1 I0Cu2.. Iom1 Iom2 I0k2 I30Cu1... I30m1. (I0k1+I0k2) Ahol: I0 a mintatartóba mért inokulum kezdeti lumineszcencia intenzitása; I30 30 perccel a minta hozzáadása után mért lumineszcencia intenzitás; f a kontroll minta 30. illetve 0. percben mért lumineszcencia intenzitásának hányadosa; Iszám azon lumineszcencia intenzitás, amelyet a vizsgált minta venne fel 30 perces behatási idő után, ha toxikus anyag nem lenne jelen; H% a vizsgált minta okozta %-os lumineszcencia intenzitás-csökkenés. 22

Az eredmények interpretálásához, a számított adatokból az OriginPro 8 szoftver segítségével H% - fémkoncentráció görbét szerkesztettem, és erről leolvastam a 20%-os és az 50%-os gátláshoz tartozó koncentráció értékeket (EC 20, EC 50 ). Ez a grafikus módszer látható a 4. ábrán. 3.5. Sinapis alba (fehér mustár) gyökér- és szárnövekedés gátlási teszt A fehér mustár (Sinapis alba) egy, a szennyezőanyagokra igen érzékeny növény, ezek jelenlétében növekedése gátolt, így vizek, talajok szennyezettségének vizsgálatára alkalmas. A tesztmódszer az MSZ 22902-4:1990 és az MSZ 21976-17:1993 szabványokon alapul (Feigl, 2010). A módszer segítségével, a gyökér-, illetve a szár növekedése alapján becsülhető a toxikus hatás mértéke. A fehér mustármag vetőmagboltból, bioboltból származó friss mag, melynek csírázóképessége minimum 95%. Vizsgálat menete: A kiválasztott fémoldatból elkészítettem az általam vizsgálni kívánt hígítási sort, majd alapos vortexelés után 5 ml-t mértem 9 mm-es átmérőjű Petri csészébe helyezett szűrőpapír korongra és mindegyikre 25 db életképes mustármagot helyeztem el egyenletes elrendezésben. Két párhuzamos mérést végeztem, kontrollként desztillált vizes szűrőpapírt használtam. A mintákat ezután 72 órán át sötétben termosztáltam. Eredmények kiértékelése: A kiértékelés során vonalzóval mértem a gyökér- és szárhosszakat, majd a párhuzamosakat átlagoltam. A gyökér- és szárnövekedés-gátlást százalékában adtam meg, a kezeletlen kontrollhoz viszonyítva az alábbi módon: Ahol: I a gyökér-, illetve szárnövekedés gátlás %-ban kifejezett értéke; K a kontrollként használt desztillált vizes szűrőpapíron csírázott magvak gyökér-, illetve szárhossza; M a vizsgált fémoldattal átitatott szűrőpapíron csírázott magvak gyökér-, illetve szárhossza. Az eredmények kiértékeléséhez OriginPro 8 szoftver segítségével gátlási százalékfémkoncentráció görbét szerkesztettem, ahonnan leolvastam az EC 20 és EC 50 értékeket. 23

4. Eredmények és értékelés A nanotechnológia rohamos térhódításának köszönhetően, a széles körben alkalmazott nanoanyagok kikerülnek az ökoszisztémákba és kifejtik gyakran káros hatásaikat a benne élő szervezetekre, így az emberre is. Egyre nagyobb az igény ezeknek az anyagoknak önmagában és más szennyezőanyagokkal együtt fellépő hatásaiknak minél pontosabb megismerésére, kockázatuk előrejelzésére. Kutatási munkám fő célja a toxikus fémek és a nano titán-dioxid együttes hatásának vizsgálata volt Tetrahymena pyriformis tesztorganizmussal. Ezen felül az alkalmazott fémek káros hatásának feltérképezésére két másik módszert is használtam, hogy a módszer érzékenységét összehasonlítsam a kutatócsoportban és a környezettoxikológiában is rutinszerűen alkalmazott egyéb eljárások érzékenységével. Ez a két méréssorozat alacsonyabb és magasabb trófikus szintekről származó tesztorganizmusokkal, Aliivibrio fischerivel és Sinapis albával (fehér mustár) történt. Elsőként ezek eredményeit értékeltem ki, és ennek alapján végeztem el a nano TiO 2 fémoldat keverékekre vonatkozó kísérleteket. 4.1. Toxikus fémek hatása különböző trófikus szintekről származó tesztorganizmusokra 4.1.1. Aliivibrio fischeri biolumineszcencia-gátlás teszt eredménye Az Aliivibrio fischeri biolumineszcencia-gátlási módszer, egy akut toxicitási teszt, mely a baktérium fénykibocsátás-gátlásán alapul szennyezőanyag jelenlétében. Több mérési sorozatban teszteltem a tengeri baktérium érzékenységét a kiválasztott toxikus fémekre/félfémre (Cu, Cd, As, Pb, Zn). Ugyanakkor csak a kadmiumra és a rézre sikerült meghatároznom EC 20 és EC 50 értékeket, míg arzén és ólom esetén azt tapasztaltam, hogy a tesztorganizmus adott mérési körülmények között nem érzékeny ezekre a fémekre, mivel az alkalmazott legnagyobb, 4000 -es koncentráció sem váltott ki gátló hatást a fénykibocsátásban. 24

Gyökér- és szárhossz (mm) Az általam meghatározott hatásos koncentráció értékek a 3. táblázatban találhatóak: 3. táblázat: Lumineszcencia-gátlási tesztből származó EC értékek EC 20 EC 50 Határérték felszín [] [] alatti vízre* Réz 7,0 7,3 0,2 Kadmium 2277 4085 0,005 *6/2009 (IV. 14.) KvVM-EüM-FVM együttes rendelet Ugyanakkor a réz és főleg a kadmium esetén, a tengeri baktériummal meghatározott hatásos koncentráció értékek is jelentősen nagyobbak voltak, mint a magyarországi felszíni vízre vonatkozó határértékek. 4.1.2. Sinapis alba gyökér- és szárnövekedés gátlás teszt eredménye A teszt során 2 25 db mustár növény gyökér- és szárhosszát vizsgáltam meg különböző koncentrációjú fémoldatokkal átitatott szűrőpapíron, 72 óra inkubálás után, a magyar szabványnak megfelelően. A következő ábrákon láthatók a gyökér- illetve szárhosszak a különböző toxikus fémek koncentrációinak függvényében. 35 Kadmium hatása a gyökér- és szárhosszra 30 25 20 15 10 gyökér szár 5 0 0 20 40 60 80 100 120 Koncentráció () 7. ábra: Kadmium hatása a gyökér- és szárhosszra A kadmiumra nem mutatott jelentős környezetben előforduló koncentrációkkal egyező nagyságrendű - érzékenységet a mustár (7. ábra). 50 -nyi kadmium hatására gyökér esetén 54%-os gátlás volt tapasztalható, szárra 29%. A felszín alatti vizekre vonatkozó határérték 0,001. 25

Gyökér- és szárhossz (mm) Gyökér- és szárhossz (mm) 30 Arzén hatása a gyökér- és szárhosszra 25 20 15 10 5 gyökér szár 0 0 20 40 60 80 100 120 Koncentráció () 8. ábra: Arzén hatása a gyökér- és szárhosszra Az arzén hatásának vizsgálatánál azt tapasztaltuk, hogy míg 0,1 -nél serkentette a növekedést, 0,5 -nél már 40%-os volt a gátlás a gyökérre, 26% a szárra, viszont 10 arzénkoncentrációnál ~95%-os gátlást tapasztaltam a gyökér- és szárnövekedésben (8. ábra). 30 Réz hatása a gyökér- és szárhosszra 25 20 15 10 gyökér szár 5 0 0 20 40 60 80 100 Koncentráció () 9. ábra: Réz hatása a gyökér- és szárhosszra A réz 1 koncentrációban serkentette a gyökér és szár növekedését is, de a tesztelt nagyobb koncentrációk esetén már a koncentráció növekedésével nőtt a gátló hatás mértéke. Réz esetén a határérték felszín alatti vizekre 0,2 ; és ennek megfelelően 20 rézkoncentrációnál majdnem teljes gátlás (>90%) alakult ki (9. ábra), viszont ez a határérték 26

Hosszúság (mm) Hosszúság (mm) 100-szorosa, amely csak extrém esetekben fordulhat elő. A réz esetén a növények gyökérnövekedése érzékenyebb volt, mint a száré. 20 Ólom hatása a gyökér- és szárhosszra 15 10 5 gyökér szár 0 0 50 100 150 200 250 300 Koncentráció () 10. ábra: Ólom hatása a gyökér- és szárhosszra Még 250 ólomkoncentrációnál is képes volt 14 mm-es szárat növeszteni a tesztnövény, azonban a gyökérnövekedést tekintve érzékenyebb volt az ólomra: 250 ólom koncentrációnál 74% gátlást mértem a gyökérnövekedésben (10. ábra). 30 25 Cink hatása a gyökér- és szárhosszra 20 15 10 5 gyökér szár 0 0 100 200 300 400 500 Koncentráció () 11. ábra: Cink hatása a gyökér- és szárhosszra 27

Cinkre a Sinapis alba tesztnövény igen érzékeny, 1 cink esetében a gyökérnél 20% a szárnál 37% gátlás figyelhető meg (11. ábra). A gyökér érzékenyebbnek bizonyult a cink toxikus hatására. A desztillált vizes kontrollhoz képest számított gátlási százalékokat felhasználva a koncentráció-válasz görbéről leolvastam az EC 20 és EC 50 értékeket, melyek a 4. táblázatban láthatóak. 4. táblázat: Sinapis alba gyökér- és szárnövekedés gátlási teszt alapján meghatározott EC értékek EC 20 [] Gyökér Szár Határérték felszín alatti vízre* [] EC 50 EC 20 EC 50 [] [] [] Réz 2,3 3,7 2,6 5,0 0,2 Arzén - 3,5 1,8 5,0 0,01 Kadmium 34,6 61,3 75,4 81,5 0,005 Ólom - 124,3 226,0-0,01 Cink 37,6 80,1 0,8 204,6 0,2 *6/2009 (IV. 14.) KvVM-EüM-FVM együttes rendelet Az általam meghatározott EC értékek mindegyik fém esetén jóval a felszín alatti vizekre érvényes határérték felett vannak. Réz estén a gyökér és a szár körülbelül egyforma érzékenységet mutatott, akárcsak az arzén esetében. Ezzel szemben a kadmiumnál a gyökér volt az érzékenyebb, az EC értékek a szárra vonatkozóénak kb. a fele. Ugyanez mondható el az ólom esetében is. 4.1.3. Tetrahymena pyriformis szaporodásgátlási teszt eredményei Átfogó kísérletsorozatommal az volt a célom, hogy megvizsgáljam azt, hogy a nano titán-dioxid befolyásolja-e a toxikus fémek hatását T. pyriformisra, és ha igen, milyen irányban és mértékben, fellép-e esetleg szinergista hatás, mely a környezeti kockázat szempontjából fontos lehet. Ehhez szükségem volt arra, hogy meghatározzam azokat a fémkoncentráció-tartományokat, ahol jól megfigyelhető a gátló hatás változása. A teszteléshez ideális koncentrációtartományok előzetes becslésénél irodalmi adatokra támaszkodtam. A kapott eredményekből ezután meghatároztam OriginPro 8 szoftver segítségével az ED 20 és ED 50 értékeket, melyeket összehasonlítottam az irodalmi adatokkal. A szaporodás-gátlási teszt során 24, 48 és 72 óránál meghatározott sejtszámokból fémoldatot nem tartalmazó kontrollhoz képest gátlási százalékokat számoltam, melyek a következő ábrákon láthatóak. 28

Gátlás [ %] Gátlás [ %] 100 Koncentráció - válasz diagram arzénre T. pyriformis szaporodás gátlási tesztben 80 60 40 20 24 h 48 h 72 h 0-20 0,05 0,5 5 50 500 Koncentráció 12. ábra: T. pyriformis szaporodásgátlása arzén hatására Az 12. ábrán látható az arzén gátlási százalékának változása a koncentráció függvényében. 24 óránál még nem tapasztalható a koncentrációval arányos gátló hatás, de 48 és 72 óránál az arzén koncentrációjával arányosan nő a toxikus hatás. 5 -től megfigyelhető a hatásos koncentráció növekedése az időben előrehaladva. 100 Koncentráció - válasz diagram cinkre T. pyriformis szaporodás gátlási tesztben 80 60 40 20 0-20 -40-60 -80 0,5 Zn 5 Zn 25 Zn 50 Zn 250 Zn Koncentráció 24 h 48 h 72 h 13. ábra: T. pyriformis szaporodás gátlása cink hatására Az 13. ábrán a gátlási százalék változása látható cink esetében a koncentráció függvényében. Jól látható, hogy kis (0,5 25 ) cink koncentráció alkalmazása serkentő hatású a T. pyriformis szaporodására, azonban a koncentrációt növelve a gátlás nő, 250-29

Gátlás [ %] nél már majdnem teljes gátlás alakul ki. Látható, hogy az idő előrehaladtával a gátló hatás nő, illetve a serkentő hatás csökken. 250 -nél látható, hogy a hatásos koncentráció 48 óra elteltével növekedést mutat, viszont utána kismértékben csökken. 100 80 Koncentráció - válasz diagram rézre T. pyriformis szaporodás gátlási tesztben 60 40 20 24 h 48 h 72 h 0 0,5 Cu 5 Cu 20 Cu 35 Cu 50 Cu Koncentráció 14. ábra: T. pyriformis szaporodásgátlása réz hatására A fenti, 14. ábrán a réz hatását figyelhetjük meg a Tetrahymena pyriformis szaporodására. Jól látszik, hogy az idő előrehaladtával a gátlás növekszik, és már igen kis mennyiség (0,5 ) esetén is 20% fölött van a gátlás értéke már 24 óra elteltével, ami 72 órára majdnem a duplájára nő. Ugyanakkor két nagyságrenddel nagyobb, 50 -es rézkoncentrációnál 50 90%-os gátlást tapasztaltam, tehát T. pyriformisra nézve a réz koncentráció-válasz diagramjának lineáris szakasza több mint két nagyságrendet ölel át. 30

Gátlás [ %] Gátlás [ %] 100 Koncentráció - válasz diagram kadmiumra T. pyriformis szaporodás gátlási tesztben 80 60 40 20 24 h 48 h 72 h 0-20 0,5 Cd 1,325 Cd 2,75 Cd 3,875 Cd 5 Cd Koncentráció 15. ábra: kadmium T. pyriformis szaporodás gátlása kadmium hatására A kadmium gátló hatását szemlélteti a 15. ábra.. Már 0,5 kadmium koncentrációnál is 40%-os a gátló hatás, ami 5 -nél eléri a 100% közeli értéket. A kitettségi idő hatásának tekintetében látható, hogy mindegyik koncentráció tartományban létrejön egy adaptálódás a tesztorganizmus részéről, a 72 óra alatt a gátló hatás mindegyik összeállításban csökken, de az 5 -es elegynél ez a hozzászokás a toxikus anyaghoz nem történik meg. A hatásos koncentráció pedig az időben előrehaladva csökken. 100 80 60 40 20 0-20 -40-60 -80-100 Koncentráció - válasz diagram ólomra T. pyriformis szaporodás gátlási tesztben 0,5 Pb 5 Pb 25 Pb 50 Pb 250 Pb Koncentráció 24 h 48 h 72 h 16. ábra: T. pyriformis szaporodásgátlása ólom hatására 31

Az ólomnál a tesztelt 0,5 és 5 koncentráció között csaknem egy 100%-os gátlásnövekedés zajlik le (16. ábra), majd a hatás koncentráció növekedésével szinte teljesen változatlan marad. A kitettségi idő növekedésével kismértékű növekedést tapasztaltunk a gátló hatásban. A mért sejtszám értékekből ezután gátlási százalékokat határoztam meg fémet nem tartalmazó kontrollhoz hasonlítva, majd grafikus módszerrel meghatároztam az EC 20 és EC 50 értékeket. A táblázatokból hiányzó adatok abból erednek, hogy az általam kirajzolt koncentráció-hatás görbe nem minden esetben érte el a 20%-os gátlást, ezeket az eseteket kihúzással jelöltem. 5. táblázat: T. pyriformis 72 órás szaporodásgátlási tesztből meghatározott EC értékek Saját mérés Saját mérés Sauvant et al. (1997) Határérték felszín alatti vizekre* [] EC 20 EC 50 EC 50 [] [] [] Arzén 24h 4,1 5,9 4 0,01 48h - 10,3 72h 13,0 20,2 Cink 24h 49,6 53,6 43 0,2 48h 46,4 49,2 72h 47,7 51,5 Réz 24h 13,2 31,6 30 0,2 48h - 33,0 72h - 17,9 Kadmium 24h 0,3 1,7 24,3 0,005 48h 0,3 1,7 72h 2,4 4,3 Ólom 24h - 3,2 180 0,2 48h - - 72h - 3,3 *6/2009 (IV. 14.) KvVM-EüM-FVM együttes rendelet 32

Az 5. táblázatból az látható, hogy az általam kimért EC 50 értékek csak a réz és a cink esetében egyeznek meg közelítőleg az irodalomban megtalálható értékekkel, az arzénnál a 24 órás eredmény áll a legközelebb ehhez az értékhez. A kadmium és az ólom esetében az általam alkalmazott szaporodásgátlási teszt jóval érzékenyebb Sauvant et al. (1997) módszerénél. Az összes kimért érték körülbelül két nagyságrenddel a felszín alatti vizekre vonatkozó határérték felett van. 4.1.4. Eredmények összefoglalása A kísérleti munka első fázisában meghatározott EC 20 és EC 50 értékek jól szemléltetik az adott tesztorganizmusok érzékenységét az egyes fémekre. A rézre a legnagyobb EC értéket a T. pyriformisnál mértem, ez a legkevésbé érzékeny erre a fémre. Ezután következik az A. fischeri majd a S. alba. A legnagyobb EC értékeket kadmiumra mértem a tengeri baktériummal, ez a tesztorganizmus az ólomra és az arzénre nem volt érzékeny. A kadmiumra ennél kisebb volt az EC érték mustárnál és ennél egy nagyságrenddel kisebb az állati egysejtűnél, így ez a legérzékenyebb erre a félfémre. Cinkre a Tetrahymena pyriformis érzékenyebb, mint a mustár. Az ólomnál a protozoánál két nagyságrenddel kisebb EC-ket mértem, így ez az érzékenyebb organizmus erre a fémre, mint a mustár. Arzénre a két tesztorganizmus körülbelül azonos érzékenységet mutat. 33