Doktori (PhD) értekezés Hegedűs Attila 2002
Doktori (PhD) értekezés ELTÉRŐ ÉRZÉKENYSÉGŰ NÖVÉNYTÍPUSOK ÉLETTANI VÁLASZAI KÜLÖNBÖZŐ STRESSZKÖRÜLMÉNYEK KÖZÖTT Írta: Hegedűs Attila Témavezető: Dr. Erdei Sára a biológiai tudományok kandidátusa Szent István Egyetem, Kertészettudományi Kar Molekuláris Növénybiológia Tanszék, Budapest, 2002.
A doktori iskola megnevezése: tudományága: vezetője: SZIE, Kertészettudományi Kar, Tanszék Témavezető: Dr. Erdei Sára tudományos főmunkatárs, a biológiai tudományok kandidátusa SZIE, Kertészettudományi Kar, Molekuláris Növénybiológia Tanszék...... Az iskolavezető jóváhagyása A témavezető jóváhagyása
Tartalomjegyzék Rövidítések jegyzéke 3 1. Bevezetés 4 2. Irodalmi áttekintés 6 2.1. Aktív oxigénformák a növényben 6 2.2. A növények antioxidáns hatású enzimatikus védelmi rendszere 8 2.2.1. Hidrogén-peroxidot bontó enzimek 9 2.2.1.1. Kataláz 9 2.2.1.2. Peroxidázok 9 2.2.1.3. Aszkorbinsav-peroxidáz 10 2.2.2. Az antioxidáns hatású enzimatikus védelmi rendszer egyéb tagjai 11 2.2.2.1. Glutation-reduktáz 11 2.2.2.2. Glutation-S-transzferáz 11 2.3. Oxidatív stressz és redox szignalizáció 12 2.4. Környezetszennyező fémek okozta stresszhatás 13 2.4.1. Nehézfémek okozta stresszhatás 13 2.4.1.1. Cink okozta stresszhatás 15 2.4.1.2. Kadmium okozta stresszhatás 17 2.4.2. Alumínium okozta stresszhatás 20 2.4.3. Alacsony hőmérsékleti stressz 23 2.5. Az oxidatív stresszel szembeni védelem fokozásának új lehetőségei 25 2.5.1. Ferritint túltermelő transzgénikus növények 26 2.5.2. Aldózreduktázt túltermelő transzgénikus növények 28 3. Célkitűzés 31 4. Kísérleti anyagok és vizsgálati módszerek 32 4.1. Növényanyag, nevelési körülmények 32 4.1.1. A cink és kadmium okozta stresszhatás vizsgálata 32 4.1.2. Az alumínium okozta stresszhatás vizsgálata 32 4.1.3. Alacsony hőmérsékleti stresszhatás vizsgálata 32 4.2. Vizsgálati módszerek 33 4.2.1. Fémtartalom vizsgálata 33 4.2.2. Klorofilltartalom meghatározása 34 4.2.3. Lipidperoxidáció meghatározása 34 4.2.4. Nem-fehérje tioltartalom meghatározása 34 4.2.5. Enzimaktivitások meghatározása 35
4.2.5.1. Kataláz 35 4.2.5.2. Gvajakol-peroxidáz 35 4.2.5.3. Aszkorbinsav-peroxidáz 36 4.2.5.4. Glutation-reduktáz 36 4.2.5.5. Glutation-S-transzferáz 36 4.2.5.6. Klorofilláz 36 4.2.6. Növekedési paraméterek meghatározása 37 4.2.7. Fluoreszcenciaindukció mérése 37 4.2.8. Ionkiáramlás mérése 37 4.2.9. Statisztikai analízis 38 5. Eredmények 39 5.1. Környezetszennyező fémek okozta stresszhatás 39 5.1.1. Cink és kadmium hatása különböző fejlődési állapotú növényekre 39 5.1.1.1. Új tudományos eredmények a cink és kadmium különböző fejlődési állapotú növényekre gyakorolt hatása terén 48 5.1.2. Alumínium okozta stresszhatás egy érzékeny és egy toleráns búza genotípus esetében 49 5.1.2.1. Új tudományos eredmények az alumínium egy érzékeny és egy toleráns búza genotípusra gyakorolt hatása terén 54 5.2. Alacsony hőmérsékleti stressz hatása transzgénikus dohánynövényekre 55 5.2.1. Új tudományos eredmények az alacsony hőmérsékleti stressz transzgénikus dohánynövényekre gyakorolt hatása terén 68 6. Az eredmények megvitatása 69 6.1. Környezetszennyező fémek okozta stresszhatás 69 6.1.1. Cink és kadmium hatása különböző fejlődési állapotú növényekre 69 6.1.2. Alumínium okozta stresszhatás egy érzékeny és egy toleráns búza genotípus esetében 76 6.2. Alacsony hőmérsékleti stressz hatása transzgénikus dohánynövényekre 80 7. Összefoglalás 88 8. Summary 91 9. Mellékletek 1 M1. Irodalomjegyzék 2 Köszönetnyilvánítás 21
Rövidítések jegyzéke ALR aldózreduktáz AOF aktív oxigénformák APX aszkorbinsav-peroxidáz CAT kataláz CDNB 1-klór-2,4-dinitro-benzol cdns komplementer DNS DHA dehidroaszkorbinsav DHN 1,4-dihidroxinonén DTNB 5,5'-ditio-bisz-(2-nitrobenzoesav) DTPA dietilén-triamin-pentaecetsav EDTA etilén-diamin-tetraecetsav F m F o F v fr.t. GR GSH GSSG GST HNE maximális fluoreszcencia kezdeti vagy prompt fluoreszcencia változó fluoreszcencia frisstömeg glutation-reduktáz redukált glutation oxidált glutation glutation-s-transzferáz 4-hidroxinonenal kat katal (1 mol átalakított szubsztrát vagy keletkezett termék / 1s) LA lipidaldehid LHC fénybegyűjtő klorofill-protein komplex LP lipidperoxid MDA malondialdehid MDHA monodehidroaszkorbinsav NADP + oxidált nikotinamid-adenin-dinukleotid-foszfát NADPH redukált nikotinamid-adenin-dinukleotid-foszfát pcmb p-kloromerkuri-benzoesav PPFD fotoszintetikus fotonfluxus-sűrűség POD gvajakol-peroxidáz PSI első fotokémiai rendszer PSII második fotokémiai rendszer SOD szuperoxid-dizmutáz sz.t. száraztömeg TCA triklórecetsav TRIS trisz-(hidroximetil)-amino-metán
1. Bevezetés Az elmúlt évszázadban az emberi tevékenység soha korábban nem látott mértékű hatást gyakorolt a természeti környezetre. Először az urbanizációs és ipari fejlődés következtében az atmoszférában, a természetes vizekben és a talajokban fölhalmozódó különféle mérgező elemek, vegyületek (Cu, Hg, Pb, Cd, Zn, O 3, SO 2 stb.) jelentettek problémát, míg a század vége felé már a kedvezőtlen éghajlati változások (pl. a savas esők, a hőmérsékleti szélsőségek, az aszály) kerültek a figyelem középpontjába. A súlyosbodó környezeti problémák következtében egyre nagyobb jelentőséget nyertek a stresszélettani kutatások, s az 1970-es évektől kezdve napjainkig mind több kísérleti adat látott napvilágot szinte valamennyi ismert abiogén stressz hatásmechanizmusát illetően. A különböző kísérleti körülmények (in vitro vagy in vivo végzett kezelés, a vizsgált növények fejlődési állapota, az alkalmazott nehézfémek és a kezelés erőssége) sok esetben egymásnak ellentmondó eredményekhez vezettek. A stresszfiziológiai kutatások következtében fény derült arra is, hogy a számos, meglehetősen különböző életfolyamatokat befolyásoló stressztényező hatásában közös jelenségek tapasztalhatóak. Ilyen általános stresszreakció az oxigénanyagcsere zavara következtében kialakuló, különböző mértékben redukálódott, aktív oxigénformák sejten belüli felhalmozódása, melyek károsító hatása olykor jelentősebb, mint az adott abiogén stressztényező egyéb hatásai. A felgyülemlő stresszfiziológiai ismeretek a korszerű növénynemesítési technikák egyre bővülő tárházával közösen mind több lehetőséget kínálnak a környezetét fokozatosan és visszavonhatatlanul megváltoztató emberiség számára ahhoz, hogy új utakat találjon a táplálékforrásul szolgáló növények produktivitásának fenntartása, a különböző stresszhatásokkal szembeni nagyobb ellenállósággal rendelkező növények előállítása érdekében. A század végén robbanásszerű fejlődésnek induló géntechnológia új korszakot nyitott azáltal, hogy különböző funkciójú gének izolálása és növényi sejtekben történő kifejeztetése révén sokkal tudatosabban, irányítottabb módon vált lehetővé bizonyos kedvező tulajdonságok kialakítása, fokozása. Mindezek után munkánkban érzékeny és különböző módokon előállított toleráns növénytípusok vizsgálata során a három kiválasztott, különböző stresszhatás következményeként egyaránt jelentkező oxidatív folyamatokra, valamint az antioxidáns enzimválaszokra kívántunk összpontosítani. Mindenekelőtt arra voltunk kíváncsiak, hogy a nehézfémek okozta károsodásban milyen különbségek adódnak annak megfelelően, hogy esszenciális vagy nem esszenciális mikroelemről van szó, s az adott
kísérleti rendszerben a károsodás mértékét mennyiben befolyásolja a kísérleti növények fejlődési állapota. Jóllehet a kutatások kezdetén in vitro körülmények között vizsgálták a nehézfémek különböző metabolikus folyamatokra gyakorolt hatását (pl. kimetszett levélkorongokon), a közelmúltban megjelent közlemények és az utóbbi években redezett stresszélettani konferenciák tanúsága szerint egyre inkább az ökologikusabb szemléletű, in vivo körülmények között (tápoldatos kultúrában, szennyezett talajban nevelt növényeken) végzett kísérletek felé fordult az érdeklődés. Jelen munka során mi is ezt a progresszív irányzatot kívántuk követni. Megpróbáltuk továbbá feltárni a szintén világszerte súlyos hozamkiesést előidéző alumínium hatásának fotoszintetikus és oxidatív következményeit, valamint egy alumíniumtoleranciára szelektált búzavonal nagyobb ellenállóságának lehetséges okait. Végezetül különböző, genetikai transzformáció útján létrehozott, oxidatív stresszel szemben ellenálló dohánynövények összehasonlító fiziológiai vizsgálata révén arra kerestünk választ, hogy a kialakított védekező mechanizmus hogyan befolyásolja a növények életfolyamatait, természetes antioxidáns védőrendszerét.
2. IRODALMI ÁTTEKINTÉS 2.1. Aktív oxigénformák a növényben Különös ellentmondásnak tűnik, hogy a földi élet számára nélkülözhetetlen oxigén, különböző redukált állapotaiban egyike az élő szervezetek számára legnagyobb veszélyt jelentő anyagoknak. Az oxigén négyelektronos redukciója valamennyi aerob szervezetben végbemegy, ahol az oxigén a légzési lánc végső elektronakceptora. A folyamat köztes lépései során részlegesen redukált termékek képződnek. Míg a molekuláris oxigén nem számít reakcióképes vegyületnek, ezen részlegesen redukált, úgynevezett aktív oxigénformák (AOF) igen reakcióképes, erősen oxidatív tulajdonságú anyagok: részben szabad gyökök, mint a szuperoxid- és hidroxilgyök, melyek párosítatlan (extra) elektronnal rendelkeznek; részben pedig olyan molekulák mint a hidrogén-peroxid és a szinglet oxigén, melyek reakciói során szabad gyökök képződhetnek (Cadenas, 1989). Élő szervezetekben az oxigén aktiválása fizikai és kémiai (enzimatikus és nem enzimatikus) úton következhet be. A fizikai aktiválás során az oxigénmolekula elektronszáma nem változik meg, mindössze paralel spinállapota válik antiparalellé. A gerjesztett pigmentmolekulák (klorofill) hatására képződő szinglet oxigén (Foote, 1976) telítetlen zsírsavakkal reakcióba lépve szerves peroxidokat képez, ami végső soron a membránlipidek degradációjához, mutagenezishez és az aminosavak oxidációjához vezet (Scandalios, 1990). Az oxigénmolekulák egyelektronos redukciójával történő kémiai aktiválás szuperoxid-anion (O 2 ) képződését eredményezi. Savas környezetben a szuperoxidgyök perhidroxilgyökké (HO 2 ) alakul. Szuperoxid képződhet megvilágított kloroplasztiszokban, ahol a PSI redukáló oldalán végbemegy a nagy mennyiségben jelenlévő O 2 molekulák egyelektronos redukciója, az ún. Mehler-reakció (Mehler, 1951); valamint bizonyos herbicidek (paraquat és nitrofen) hatására, továbbá különböző enzimek (aldehid-oxidáz, xantin-oxidáz, flavin-dehidrogenázok) által katalizált reakciók során. Károsító hatásai közé tartozik a membránlipidek peroxidációja, egyes enzimek gátlása, a poliszacharidok depolimerizációja (Scandalios, 1990). Az oxigénmolekula kételektronos redukciója révén hidrogén-peroxid (H 2 O 2 ) keletkezik spontán vagy enzim (SOD) által katalizált dizmutációval; illetve a glioxiszómákban, valamint a fénylégzés során a peroxiszómákban működő glikolsavoxidáz enzim hatására. Oxidálja a flavonolokat és a szulfhidril-csoportokat, mutagenezist okoz, gátolja a szén-dioxid-fixációt és a Calvin-ciklus enzimeit (a Rubiscót, a fruktóz-1,6-biszfoszfatázt, a glicerinaldehid-3-foszfát-dehidrogenázt, a
ribulóz-5-foszfát-kinázt stb.), így a kloroplasztiszokban a fotoszintetikus aktivitás megőrzéséhez nélkülözhetetlen a H 2 O 2 hatékony semlegesítése (Badger és mtsai., 1980; Scandalios, 1990; Asada, 1992). A hidrogén-peroxid szuperoxidgyök általi redukciója az egyik legveszélyesebb oxigén szabad gyök, a hidroxilgyök képződéséhez vezet az ún. Haber Weiss-reakció révén, melynek folyamata az alábbi egyenlettel szemléltethető (Elstner, 1982): H 2 O 2 + O 2 OH + OH + O 2 Hidroxilgyök képződhet Fenton-reakció útján is, amikor a H 2 O 2 kétértékű fémionokkal vagy a redukált ferredoxinnal lép kölcsönhatásba: H 2 O 2 + Me 2+ OH + OH 3+ + Me Az erősen roncsoló hatású hidroxilgyök DNS-töréseket, fehérjedegradációt okoz, szerepe van a membránlipidek peroxidatív bomlásában. Az AOF kialakulásához vezető redukciós lépéseket az 1. ábra mutatja (Scandalios, 1990): 1 O 2 +e - hv H + +e - +e - +e - +e - O 2 O! 2 H 2 O 2 OH H + H + H + H + H 2 O 1. ábra. Aktív oxigénformák képződése az oxigén négyelektronos redukciója során (Scandalios, 1990). A szerves vegyületek enzimatikus (pl. telítetlen zsírsavak lipoxigenáz által katalizált reakciója) vagy spontán reakcióba léphetnek az oxigén szabad gyökökkel, melynek eredményeként szerves szabad gyök molekulák képződnek. A szerves szabad gyökök oxigénnel reagálva szerves peroxidgyökké alakulnak, melyek újabb szerves vegyületekkel szerves szabad gyököt és szerves peroxidot képeznek. E folyamat néhány lépését követően megduplázódik az AOF mennyisége, így az oxidatív károsodás robbanásszerű láncreakciót indít be. A legelső közlemények humánpatológiai szempontból vetették föl az oxidatív stressz jelentőségét, melynek növényfiziológiai vonatkozásai csak néhány évvel később kerültek az érdeklődés homlokterébe. A növények számára az oxidatív stressz kialakulásának lehetősége kétszeres kockázatot jelent, miután a légzési, mitokondriális oxigénfogyasztáson kívül fotoszintetikus, kloroplasztidiális
oxigéntermeléssel, illetve fogyasztással is számolni kell. Normál fiziológiai működés esetén is jelentkezik az AOF képződése. A O 2 és a H 2 O 2 növényi mitokondriumokon belüli kialakulásának pontos helyét a NADH-dehidrogenázok és / vagy az ubikinon citokróm-b komponensek közötti régióban valószínűsítik (Elstner, 1982), ahol az oxigén közel 4 %-a alakulhat szuperoxiddá. A kloroplasztiszokban telítési fényintenzitáson a szinglet oxigén mennyisége megnövekszik, ha az elektrontranszportlánc működése gátolt, s a Mehler-reakció aránya a nem ciklikus elektrontranszport 10-25 %-át is kiteheti (Asada, 1992; Alscher és mtsai., 1997). Egyéb organellumokban, illetve citoplazmatikusan is keletkeznek aktív oxigénformák enzimatikus reakciók során. A sejten belül képződött AOF semlegesítése két módon (nem enzimatikus: glutation, aszkorbinsav, karotinoidok, tokoferol; enzimatikus: SOD, CAT, POD) lehetséges (Elstner, 1982; Cadenas, 1989). Az alábbiakban elsősorban a jelen dolgozatban vizsgált antioxidáns enzimek legfontosabb tulajdonságait összegeztük. 2.2. A növények antioxidáns hatású enzimatikus védelmi rendszere Az AOF elleni védelem első vonalát a szuperoxid-dizmutázok (SOD; E.C. 1.15.1.1.) jelentik, melyek a következő reakcióút katalízisében játszanak szerepet: 2 O 2 2 H + O 2 + H 2 O 2 Fémtartalmú enzimek, melyek a fém kofaktor alapján három csoportba sorolhatók: Cu/Zn-SOD, Mn-SOD és Fe-SOD. Növényekben a citoszólban, a peroxiszómákban, valamint a kloroplasztiszokban oldott és tilakoidmembránhoz kötött formában (Elstner, 1982) lokalizált Cu/Zn-SOD található meg legnagyobb mennyiségben. A Mn-SOD a növényi mitokondriumok mátrixában lokalizált, míg a Fe- SOD-ot néhány rendszertanilag egymástól távol eső növényfaj kloroplasztiszaiban írták le (Bowler és mtsai., 1994; Alscher és mtsai., 1997). Az általuk katalizált reakció termékeként létrejött, sok szempontból központi jelentőségű hidrogén-peroxid semlegesítésére különböző folyamatokban, különböző enzimek hatására kerülhet sor.
2.2.1. Hidrogén-peroxidot bontó enzimek 2.2.1.1. Kataláz A kataláz (CAT; E.C. 1.11.1.6.) négy alegységből álló, hem prosztetikus csoportot tartalmazó enzim, mely a peroxiszómákban, a glioxiszómákban és kukorica esetében a mitokondriumokban (Deisseroth és Dounce, 1970; Salin, 1987) a hidrogénperoxid hidrogéndonor nélküli bontását katalizálja: 2 H 2 O 2 2 H 2 O + O 2 A katalizált reakció sebessége meglehetősen nagy, viszont a kataláz szubsztrátaffinitása kicsi (Willekens és mtsai., 1995). A CAT kompartmentalizációja következtében elsősorban a fotorespiráció során képződő hidrogén-peroxid semlegesítésében játszik elsődlegesen szerepet, jóllehet a H 2 O 2 a membránokon általi diffúzióval könnyen eljut a sejt legkülönbözőbb részeibe (Willekens és mtsai., 1997). 2.2.1.2. Peroxidázok A növényi peroxidázok (POD; E.C. 1.11.1.7.) protohem prosztetikus csoportot tartalmazó, 33 kd tömegű glükoproteinek, melyek a következő reakciót katalizálják: DH 2 + H 2 O 2 (ROOH) D + 2 H 2 O (ROH + H 2 O), ahol DH 2 az elektrondonor, melyre a legtöbb növényi POD kevéssé specifikus: in vivo többek között különböző fenolokat, fenolszármazékokat; in vitro számos vegyületet (például gvajakolt vagy pirogallolt) oxidálnak. A legszélesebb körben alkalmazott vegyület miatt gvajakol-peroxidáznak is nevezik az ebbe a csoportba tartozó enzimeket. Számos élettani folyamatban vesznek részt (Asada, 1992), így a lignin bioszintézisében (Gross, 1978), az etilén képződésében, az indol-ecetsav bomlásában (Salin, 1987). Jelentős szerepük van az öregedési folyamatokban, ilyenkor az enzimaktivitás növekedésével együtt más hidrolitikus enzimek (proteázok, nukleázok) aktivitása is fokozódik (Wyen és mtsai., 1974). Élettani szerepüket ezenkívül jó néhány fiziológiai folyamatban, illetve az abiotikus és biotikus stresszhatások elleni védelemben is leírták (Van Assche és Clijsters, 1990; Mehlhorn és mtsai., 1996). A vakuólumban, a sejtfalban, a citoszólban és az apoplazmában lokalizáltak; a sejtorganellumokban, így többek között a kloroplasztiszban viszont nem találhatók meg. Sejtvédő hatásuk elsősorban az enzimreakció során létrejött oxidált termékek fiziológiai szerepében rejlik (Asada, 1992), de nem zárható ki a H 2 O 2 semlegesítésének jelentősége sem (Gaspar és mtsai., 1991). Nagyban növeli
az antioxidáns védekező rendszer rugalmasságát, hogy a POD az apoplazmatikus térben millimólos koncentrációban előforduló aszkorbinsav oxidálására is képes, ezáltal fontos szabályozási kapcsolópontot jelent a lignin bioszintézise és a hidrogén-peroxid eliminálása között (Mehlhorn és mtsai., 1996). A POD aktivitásának emelkedése általános válasz szinte valamennyi stressz (pl.: alacsony hőmérséklet, növényi patogének fertőzése, levegőszennyezés, a talaj növekvő nehézfémtartalma) esetében (Rabe és Kreeb, 1979; Van Assche és Clijsters, 1990; Prasad és mtsai., 1994; Blinda és mtsai., 1996). 2.2.1.3. Aszkorbinsav-peroxidáz Az aszkorbinsav-peroxidázok (APX; E.C. 1.11.1.11.) protohem prosztetikus csoportot és hemen kívüli vasat tartalmazó enzimek, melyek a következő reakciót katalizálják: 2 aszkorbinsav + 2 H 2 O 2 2 dehidroaszkorbinsav + 2 H 2 O A H 2 O 2 -ra nézve nagyobb affinitással rendelkezik, mint a CAT. Az APXizoenzimek aktivitása kimutatható a kloroplasztiszban, a citoplazmában és az apoplazmatikus térben. A kloroplasztidiális izoenzimnek tilakoidhoz kötött és sztrómában oldott formája létezik (Chen és Asada, 1989). Az APX génjeinek átíródását a plasztokinon redoxállapota szabályozza: a redukált plasztokinon részarányának növekedése, mintegy a magas fényintenzitás szenzoraként egy gyors jelátviteli mechanizmuson keresztül indukálja a gének átíródását (Karpinski és mtsai., 1997). Az APX jól elkülönül a klasszikus növényi peroxidázoktól (Mehlhorn és mtsai., 1996), aminosav-szekvenciája és más molekuláris tulajdonságai alapján inkább a gombákban előforduló citokróm-c-peroxidázokra emlékeztet (Asada, 1992). A kloroplasztiszban kimutatható izoenzimei elektrondonorként szinte kizárólag az aszkorbinsavat fogadják el, aszkorbinsavmentes közegben rövid élettartamúak, ellentétben a kevésbé specifikus citoplazmatikus izoenzimmekkel, amelyek például a pirogallolt is képesek oxidálni (Asada, 1992). Az aszkorbinsav glutation-ciklus során a SOD katalizálta reakcióban H 2 O 2 keletkezik, amit az APX semlegesít az aszkorbinsav monodehidroaszkorbáttá oxidálása mellett (Foyer és Halliwell, 1976; Nakano és Asada, 1981). A rövid életidejű MDHA vagy aszkorbáttá és dehidroaszkorbáttá alakul, vagy a tilakoidmembránban közvetlenül aszkorbinsavvá redukálódik. A redukció történhet fényhez kötött folyamatban, amelyben a ferredoxin az elektrondonor, vagy az elektrondonorként NADPH-t használó MDHA-reduktáz enzim hatására. A dehidroaszkorbinsavból a DHA-reduktáz enzim
hatására, GSH terhére regenerálódik az aszkorbinsav. A glutationt a GR enzim redukálja NADPH felhasználásával. Az aszkorbát glutation-ciklus enzimeit először a kloroplasztiszban mutatták ki, jóllehet jelen vannak mind a fotoszintetizáló, mind a nem fotoszintetizáló szövetek citoplazmájában és különböző sejtorganellumaiban is, így a ciklus működése a kloroplasztiszban és a citoplazmában is lehetséges (Anderson és mtsai., 1983; Gillham és Dodge, 1986; Edwards és mtsai., 1990; Foyer, 1993). A kloroplasztiszt határoló perisztrómiumban található aszkorbáttranszlokátor, valamint a redukáló erőt biztosító foszfáttranszlokátor működése révén megvalósul a két sejtkompartment közötti redox kapcsolat (Foyer, 1993). 2.2.2. Az antioxidáns hatású enzimatikus védelmi rendszer egyéb tagjai 2.2.2.1. Glutation-reduktáz A glutation-reduktáz (GR; E.C. 1.6.4.2) az aszkorbát glutation-ciklusban a GSH képződését katalizálja: GSSG + NADPH + H + 2 GSH + NADP + Borsólevélben a GR-aktivitás 70 %-át a kloroplasztiszban, 3 %-át a mitokondriumokban, 27 %-át pedig a citoplazmában mutatták ki (Edwards és mtsai., 1990). Az aszkorbát glutation-ciklusban fontos szerepet játszó GR aktivitásának stressz hatására történő növekedését számos esetben leírták (Esterhauer és Grill, 1978; Foyer és mtsai., 1994; Chaoui és mtsai., 1997; Foyer és mtsai., 1998; Clijsters és mtsai., 1999), ugyanakkor annak csökkenését (Gallego és mtsai., 1996) és változatlanságát (Wingsle és mtsai., 1992) is tapasztalták bizonyos esetekben. Az enzim fokozottabb aktivitása számos stresszhatással szemben nagyobb ellenállóságot biztosít (Harper és Harvey, 1978; Foyer és mtsai., 1995), ugyanakkor az is bizonyított, hogy a magasabb GRaktivitás, és az annak hatására megnövekedett GSH/GSSG arány önmagában nem képes az oxidatív stresszel szembeni ellenállóság javítására, csak abban az esetben, ha más antioxidáns hatású enzimek (pl. SOD) aktivitása is fokozódik (Malan és mtsai., 1990). 2.2.2.2. Glutation-S-transzferáz A glutation-s-transzferázok (GST; E.C. 2.5.1.18) olyan citoplazmatikus enzimek, amelyek a GSH tripeptid konjugációját katalizálják különböző hidrofób, a sejtekre nézve mérgező szubsztrátokkal (Mannervik és Danielson, 1988). A GSHkonjugátumokat a növényi membránok GSH-transzportrendszere felismeri, így azok vakuólumba vagy apoplazmába történő kiválasztása végbemehet. Néhány GST
glutation-peroxidázként is funkcionál, így közvetlen védőhatást fejt ki oly módon, hogy a szerves peroxidok inaktiválódását katalizálja glutation-diszulfid létrehozásával (Bartling és mtsai., 1993), valamint a GSH-szint növelésével feed-back szabályozás révén. A megnövekedett glutationszint a GST és más védőhatású vegyületek (pl. fitoalexinek) képződését indukálja (Wingate és mtsai., 1988). A legtöbb növényi GST nehézfémstressz, etilénkezelés, növénypatogének elleni stresszválasz, sebzés vagy ózon hatására indukálódik, amiből arra következtettek, hogy szerepüket az oxidatív stressz elleni védekező mechanizmus részeként kell értékelni (Marrs, 1996). Transzkripciójának serkentésében az elsődleges szignál szerepét a hidrogén-peroxid játssza. A növényi GST-k leggyakrabban két alegységből állnak. Ezek mindegyike rendelkezik egy elektrofil szubsztrát-kötőhellyel és egy szomszédos GSH-kötőhellyel, mely kizárólag GSH-t és szerkezetileg rokon molekulákat fogad el szubsztrátként. Az oxidatív stressz kivédésén kívül szerepet játszanak a sejt számos anyagcserefolyamatában: többek között az antociánok képződésében és az auxinok aktivitásának szabályozásában, sejtenbelüli transzportjukban (Marrs, 1996; Alfenito és mtsai., 1998). 2.3. Oxidatív stressz és redox szignalizáció Az oxidatív stressz kifejezés olyan sejtállapotra vonatkozik, amelyben az AOF koncentrációja megemelkedik. Kialakulásához az oxidatív körülményeket kiváltó mechanizmusok, valamint a sejt antioxidáns védelmi rendszere között fennálló finom egyensúly fölborulása vezet (Cadenas, 1989; Scandalios, 1990). Gyakran egymásnak ellentmondó adatok látnak napvilágot az antioxidáns enzimek aktivitásának stresszkörülmények közötti módosulásáról (Shaw, 1995; Gallego és mtsai., 1996; Chaoui és mtsai, 1997). Noctor és Foyer (1998) szerint a szakirodalom aránytalanul eltúlozza és egyoldalúan mutatja az antioxidáns enzimrendszerek szerepét, ami vélhetőleg nem merül ki az AOF semlegesítésében, hanem a sejt redoxállapotának szabályozásában rejlik igazi jelentősége. A H 2 O 2 például számos abiotikus és biotikus stresszhatás közös jelátvivő molekulája, melynek szerepe több stresszválaszban pl. hiperszenzitív reakcióban (Levine és mtsai., 1994), szisztemikus szerzett rezisztenciában (Chen és mtsai., 1993), chillingstresszel szembeni tolerancia esetén (Prasad és mtsai., 1994) jól ismert. Az antioxidáns enzimek stressz hatására bekövetkező gyors, nagymértékű aktivitásemelkedésének elmaradását igen gyakran a növény kedvezőtlen körülményekhez való rossz alkalmazkodóképességeként értékelték. Tudott viszont, hogy az aszkorbinsav és a GSH is részt vesznek bizonyos gének
expressziójának szabályozásában (Wingate és mtsai., 1988), így azok oxidált és redukált formáinak aránya szintén meghatározó lehet. Mindezek fényében sokkal valószínűbbnek látszik, hogy az antioxidáns védelem késedelme következtében felhalmozódó H 2 O 2 közvetlenül és közvetett módon szabályozza bizonyos gének átíródását (Foyer és mtsai., 1997; Noctor és Foyer, 1998). A következőkben a dolgozat keretei között vizsgált, AOF felhalmozódásával járó stresszhatások legfontosabb jellemzőit összegezzük. 2.4. Környezetszennyező fémek okozta stresszhatás 2.4.1. Nehézfémek okozta stresszhatás Ahogy világszerte, úgy hazánkban is jelentősen növekedett az elmúlt évtizedekben az ipari körzetek és városok talajának nehézfémtartalma (Kádár, 1993), ezért a nehézfémek növényekre gyakorolt hatásainak mind pontosabb föltérképezése megkerülhetetlen. A legjelentősebb környezetszennyező nehézfémek közé a kadmiumot, a rezet, a nikkelt, az ólmot és a cinket sorolhatjuk. Mindezek a talajképző kőzet és ásványok mállása során; műtrágyák, talajjavító anyagok, növényvédő szerek, szerves trágyák, szennyvizek, szennyvíziszapok kijuttatásával; az ipari és bányászati tevékenység, valamint a közlekedés következményeként kerülnek a környezetbe (Tuba és Csintalan, 1992; Csathó, 1994). A növények a légköri depozíció útján talajba jutó nehézfémionokat gyökereiken keresztül veszik fel (Tuba és Csintalan, 1992). A felvételt elősegíti a talajok savanyúsága, minimális szervesanyag-tartalma és a komplexképző vegyületek jelenléte. A talajban végbemenő csapadékképződéssel járó reakciók, valamint a semleges és lúgos ph-jú tartományokban az agyagásványok és szerves kolloidok felületén történő részleges megkötődés azonban csökkenti a nehézfémionok fölvehetőségét (Csathó, 1994). A nehézfémek a gyökerekből talajbeli koncentrációjukkal arányos mértékben a növény különböző részeibe transzlokálódnak. Az egyes szövetek nehézfémion-akkumulációja igen különböző lehet, annak mértéke erősen faj- és fajtafüggő (Bazzaz és Govindjee, 1974). Mindennek különös jelentőséget ad, hogy ezek a káros anyagok a növényeken, a tápláléklánc első tagjain keresztül az emberi szervezetbe is bejuthatnak. A nehézfémstressz szemmel látható tünetei a klorózis, a nekrózis, a növények deformált, csökevényes növekedése (Clijsters és mtsai., 1999). Elsődleges hatásuk a felvételükért felelős növényi szervben, a gyökérben mutatkozik meg, ahol az
ionfelvételi kompetíció megzavarja a növények ásványos táplálkozását és vízfelvételét (Clarkson és Rüttge, 1989; Moya és mtsai., 1993; Láng és mtsai., 1998). A gyökérnövekedés gátlását is részben a turgornyomás csökkenése következtében beálló mérsékelt megnyúlás, részben pedig a csökkent mitotikus aktivitás okozza (Chakravarty és Srivastava, 1992). A nehézfémek a növényi anyagcsere-folyamatokat több ponton befolyásolják. Széles körben vizsgálták a nehézfémek fotoszintézisre gyakorolt hatását (Krupa és Baszyński, 1995; Láng és mtsai., 1998; Ciscato és mtsai., 1999; Krupa, 1999). Általánosságban elmondható, hogy károsítják a membránokat, gátolják a klorofill bioszintézisét, továbbá a fotoszintézis sötét- és fényszakaszában végbemenő reakciókat, mivel kölcsönhatásba lépnek az elektrontranszportlánc komponenseivel és / vagy befolyásolják a Calvin-ciklus különböző enzimeinek szerkezetét és funkcióját. Az enzimgátlás oka lehet, hogy a nehézfém a katalitikus aktivitáshoz, illetve a stabil térszerkezet kialakításához nélkülözhetetlen szulfhidril-csoportokhoz kötődik, illetve hogy a metalloproteinekben az esszenciális fémionokat helyettesíti (Van Assche és Clijsters, 1990). Ugyanakkor számos enzim aktivitásának emelkedését is előidézhetik, néhány esetben de novo proteinszintézis indukálásával (Xiang és Oliver, 1998), mely hatásuk elsősorban annak tudható be, hogy a sejten belül oxidatív környezetet alakítanak ki (Gallego és mtsai., 1996; Clijsters és mtsai., 1999). A Cu 2+ - ionok közvetlenül vesznek részt az AOF szuperoxidgyökök, valamint a Fentonreakció katalizálásával hidroxilgyökök képzésében, ami a biomembránok telítetlen zsírsavainak peroxidatív károsodásához vezet (Sandmann és Böger, 1980; Halliwell és Gutteridge, 1984; Droppa és Horváth, 1990), míg más nehézfémek bizonyos enzimek aktivitásának módosításával idéznek elő oxidatív stresszhatást (Somashekaraiah és mtsai., 1992; Clijsters és mtsai., 1999; Sanitá di Toppi és Gabbrielli, 1999). A nehézfémek között egyaránt találhatóak biológiai szempontból esszenciális mikroelemek (Zn, Cu) és mérgező anyagok (Ni, Cd, Pb). Ha az esszenciális mikroelemek nem állnak rendelkezésre megfelelő mennyiségben, a növények fejlődése zavart, hiánytünetek mutatkoznak. Szupraoptimális koncentrációban azonban e biológiailag nélkülözhetetlen mikroelemek is fitotoxikussá válnak. A hat leggyakrabban előforduló környezetszennyező nehézfém vizsgálata során kiderült, hogy a szennyezés mértékétől függetlenül legkevésbé a Zn 2+, legerőteljesebben pedig a Pb 2+ toxikus (Chakravarty és Srivastava, 1992). A Cd 2+, Ni 2+ és Cu 2+ hatása jelentős mértékben a kezelés erősségének és hosszának függvénye. A biológiailag esszenciális Cu 2+ és Zn 2+
hatása összetettebb, mint a többi nehézfémé, viszont toxicitásuk mértéke jelentősen kisebb. A következőkben a két vizsgált esszenciális (Zn 2+ ) és nem esszenciális (Cd 2+ ) nehézfém hatásait ismertetem. 2.4.1.1. Cink okozta stresszhatás A cink egyike a napjainkban mind több gondot okozó nehézfémeknek. Elsősorban ipari tevékenységek (cinkkohászat) következményeként kerül a környezetbe, illetőleg különböző szerves trágyák kijuttatása révén. A sertéstrágya igen nagy mennyiségben tartalmaz rezet és cinket (Tuba és Csintalan, 1992). A dolgozat keretei között a szupraoptimális mennyiségben előforduló Zn 2+ káros hatásaival foglalkozunk, jóllehet a cink az összes földi életforma számára nélkülözhetetlen esszenciális mikroelem, melynek hiánya is súlyos fiziológiai károsodáshoz vezet. Optimális körülmények között a növények levelében 20-100 µg/g fr.t. Zn 2+ található (Fox és Guerinot, 1998). A talajban lévő cink mozgékonysága, ezáltal növények általi felvehetősége a ph csökkenésével párhuzamosan növekszik. A növények főleg kétértékű kationként vagy kelát típusú szerves vegyületek formájában veszik fel, nem egyszerűen az apoplazmatikus térben való megkötődés révén, hanem szimplazmatikus úton, elsősorban az ún. ZIP-családba tartozó transzporterekkel (Fox és Gueirnot, 1998; Clemens, 2001). A Zn 2+ kofaktora, illetve aktivátora közel 300 anyagcsere-folyamatot szabályozó enzimnek, így például a szénsavanhidráznak, a különböző enolázoknak, aldolázoknak, az oxálecetsav-dekarboxiláznak, a cisztein-deszulfidáznak, a SOD-nak stb., részt vesz a klorofill és a triptofán bioszintézisében. Hiányában gátolt a növekedésszabályozó indolecetsav képződése. Hiánytünetei a fiatal leveleken jelentkező érközi klorózis (nem reutilizálódó tápelem), a növekedés ütemének lassulása, a gyümölcsfák rövidszártagúsága, az ún. rozettabetegség (Szabó és mtsai., 1987). Számos nehézfém gátolja a klorofill bioszintézisét a Zn 2+ kofaktort tartalmazó δ-aminolevulinsav-dehidratáz enzim aktivitásának csökkentése révén (Van Assche és Clijsters, 1990). Kimutatták, hogy a gátlás oka sok esetben a nehézfémek által indukált cinkhiányban keresendő, amit az is alátámaszt, hogy a bab klorofilltartalma toxikus mértékű Zn 2+ -kezelés hatására sem csökkent (Van Assche és Clijsters, 1986a). Fieldes és Gerhardt (1994) igen magas cinkkoncentráció mellett (15 mm) sem tapasztaltak klorózist lenmagoncok esetében, jóllehet a csíranövények
növekedése erősen gátolt volt. A vízbontó centrum optimális működéséhez mangán szükséges. A tilakoidkötött cink- és mangánionok aránya normális esetben 1 körüli értéknek adódik. Cinkkel kezelt bab tilakoidmembránjában ez az érték 12-re növekedett, ami azt mutatja, hogy a Zn 2+ kiszorította a mangánt a vízbontó centrumból, így gátolta a víz fotolízisét (Van Assche és Clijsters, 1986a). Csökkent a fotofoszforiláció mértéke is, amit valószínűleg a fotoszintetikus elektrontranszportlánc gátlása eredményezett. Ciscato és mtsai. (1999) gyorsfluoreszcencia-indukciós mérésekkel meghatározták, hogy a Zn 2+ a PSII elsődleges kinonakceptorának redukcióját akadályozza. Azt is kimutatták, hogy az esszenciális Zn 2+ és Cu 2+ szubletális dózisban sem okoz olyan mértékű, permanens elváltozásokat, mint a nem esszenciális Cd 2+. Chakravarty és Srivastava (1992) napraforgó növényen végzett citológiai vizsgálataikban az Al 3+, Cd 2+, Cu 2+, Ni 2+, Pb 2+ és Zn 2+ közül szintén a rezet és a cinket találták legkevésbé toxikus hatásúnak. Nagy mennyiségű cink hatására bab csíranövényekben szignifikánsan csökkent a karboxilációs kapacitás, de az oxigenáció mértéke változatlan maradt (Van Assche és Clijsters, 1986b). A cinkkel kezelt babból izolált Rubisco enzim vizsgálatával bizonyították, hogy az enzim működéséhez nélkülözhetetlen Mg 2+ -ionok Zn 2+ -ionokkal való részleges helyettesítése okozta a gátlást. Ennek feltétele, hogy a kompetitív ionok hasonló koncentrációban legyenek jelen. In vivo körülmények között csak a Zn 2+ -ionok érhetnek el a Mg 2+ -ionokhoz hasonló koncentrációt a kloroplasztisz sztrómájában. Az enzimhez kötődést segíti, hogy a Zn 2+ oxigéntartalmú ligandumokhoz való affinitása nagyobb, mint a magnéziumé. Wenzel és Mehlhorn (1995) azt tapasztalta, hogy Zn 2+ -hiányos babok érzékenyebbek voltak az ózon okozta stresszhatással szemben. Megfigyelték, hogy a cinkhiány következtében a Cu/Zn-SOD enzim aktivitása igen alacsony volt a növényekben. Gyökérben Zn 2+ hatására valamennyi POD-izoenzim aktivitása megnőtt, és több új izoenzim is megjelent, ami más szervekben nem volt megfigyelhető. Van Assche és Clijsters (1990) ezzel szemben babnövények levelében mutattak ki Zn 2+ - kezelés hatására megjelenő új izoenzimeket. Chaoui és mtsai. (1997) tíznapos babnövényeken végzett vizsgálataik során 100 µm Zn 2+ hatására kaptak ugyanolyan mérvű növekedésbeni visszamaradást, mint 5 µm Cd 2+ hatására. Csökkent a CATaktivitás, nőtt a lipidperoxidáció mértéke. A POD-aktivitás csak a szárban növekedett, ahol újabb izoenzimek is megjelentek. A GR és az APX enzimek csak levélben mutattak a kontroll növényeknél mintegy 50 %-kal nagyobb aktivitást. Blinda és mtsai. (1996) árpa csíranövények leveléből készített teljes szövetkivonat POD-aktivitásában 800 µm Zn 2+ hatására sem mértek növekedést, jóllehet a levél apoplazmatikus POD-
aktivitása közel háromszorosára nőtt. Gyökérben kismértékű, nem szignifikáns aktivitásemelkedést mértek. 2.4.1.2. Kadmium okozta stresszhatás A környezeti kadmiumszennyeződés forrásai közé tartozik a kohászat, az acélgyártás, a szénégetés, a festékipar, a gumigyártás, de szennyvíziszappal és hulladékkal, illetve a gépjárművek gumiabroncsának kopása révén is nagy mennyiségű kadmium jut a környezetbe. Jelentős a foszforműtrágyák Cd 2+ -szennyezettsége, valamint a különböző szerves trágyák kadmiumtartalma (Nriagu és Pacyna, 1988). A Cd 2+ egyetlen ismert biológiai funkciójára a közelmúltban derült fény, mely szerint a tengeri kovamoszatok cinkhiányos körülmények között szintetizált speciális szénsavanhidráz enzimének kofaktora (Lane és Morel, 2000). A Cd 2+ kétértékű kation, egyike a növények számára legkönnyebben fölvehető nehézfémeknek (Chakravarty és Srivastava, 1992). Valószínű, hogy a növényi membránokban nem találhatók a toxikus fémionokra specializált transzporterek, így azok más, széles szubsztrátspecifitású transzporterek útján jutnak a sejtekbe (Thomine és mtsai., 2000; Clemens, 2001). A növénybe jutó Cd 2+ -ionoknak átlagosan 75 %-a valamilyen formában megkötődik a gyökerekben (Krupa és Baszyński, 1995). A rendelkezésre álló adatok szerint a szárban a felvett kadmiummennyiség mintegy 11 %- a, míg a levelekben fajtól függően közel 15 %-a található. Ennek is csak 0,6-1,4 %-a jut végül be a kloroplasztiszokba (Leita és mtsai., 1996; Krupa, 1999). A kadmium gátolja a csírázást (Rascio és mtsai., 1993), a csíranövények növekedését (Stiborova és mtsai., 1987; Moya és mtsai., 1993). A Cd 2+ -ionok felvételi kompetíciót jelentenek a kálium-, kalcium-, magnézium-, vas-, mangán-, réz- és cinkionok számára (Clarkson és Rüttge, 1989). Ouzounidou és mtsai. (1997) eredményei szerint a növekvő kadmiumkoncentrációval párhuzamosan csökkent a búza csíranövények gyökér- és hajtáshossza, frisstömege: 1 mm Cd 2+ majdnem teljes növekedésgátlást okozott. A gyökér növekedésbeni visszamaradása kifejezettebb volt, mint a hajtásé. A hajtás kadmiumtartalma nőtt, míg Fe-, Mg-, Ca- és K-tartalma csökkent. A Cd 2+ -stressz hatására megjelenő vizuális tünetekért (a fiatal levelek általános klorózisa, torzulása, a gyökerek barnás elszíneződése stb.) részben az esszenciális mikroelemek relatív hiánya a felelős (Greger és Lindberg, 1987). Fodor és mtsai. (1995) búzán és napraforgón végzett mérései szerint az in vivo és az in vitro kadmiumkezelés egyaránt a plazmamembrán ATP-áz aktivitásának csökkenéséhez vezetett. A Mg 2+ -függő ATP-áz aktivitása 3 mm Cd 2+ hatására teljes
gátlást szenvedett. A Cd 2+ mérsékelte a H + -függő ATP-áz működését is, ami a membránfluiditás megváltozásának, a lipidösszetétel módosulásának tulajdonítható, illetve annak, hogy a Cd 2+ kötődik a fehérjék tiolcsoportjához. A Cd 2+ kloroplasztiszon belüli fentebb említett kis koncentrációja ellenére a fotoszintézis egész folyamatát gátolja (Krupa, 1999). Csökkenti a klorofilltartalmat, a nettó fotoszintézis mértékét, közvetlenül vagy közvetett módon gátolva a fotoszintézis fény- és sötétszakaszának folyamatait (Sanitá di Toppi és Gabbrielli, 1999). A Cd 2+ -mal kezelt növények klorofilltartalma már 100 µm-os kezelés hatására szignifikánsan csökkent. E negatív hatást a vizsgált cukorrépalevelek Fe 2+ - és Mg 2+ - ellátási zavarával magyarázták, mivel mindkét elem szükséges a klorofill bioszintéziséhez (Greger és Lindberg, 1987). Horváth és mtsai. (1996) megfigyelték, hogy az etiolált árpamagoncok leveleit leválasztva és közvetlenül Cd 2+ -oldatba helyezve, a Cd 2+ koncentráció függvényében gátlódott a zöldülés folyamata. Baryla és mtsai. (2001) kadmiumszennyezett talajon nevelt olajrepce növényeken úgy tapasztalta, hogy a klorofilltartalom csökkenésének oka nem a klorofill bioszintézisének gátlása, nem a mikroelemhiány, és nem is a nehézfém okozta oxidatív stressz volt, hanem a kloroplasztiszok számában bekövetkezett csökkenés. A fotoszintetizáló rendszer első, Cd 2+ által károsított komponense az LHCII fénybegyűjtő klorofill-protein komplex. Kadmium hatására csökken a transz- 3 - hexadekánsav mennyisége, melynek fontos szerepe van az LHCII oligomerizációjában (Krupa, 1988). Az LHCII degradációjával a csökkenő kvantumhatékonyság mérsékli az elektrontranszportlánc működését. Továbbá, miután a tilakoidmembránok összes klorofilltartalmának közel 50-70 %-át az LHCII tartalmazza, a klorofill bioszintézisének gátlása szintén kihatással lehet a komplex funkciójára. Stobart és mtsai. (1985) a δ- aminolevulinsav keletkezésének, valamint a protoklorofillid klorofillid átalakulást katalizáló protoklorofillid-nadph-oxidoreduktáz enzim aktivitásának gátlását írták le. Ez utóbbi jelenséget figyelték meg Böddi és mtsai. (1995) is. Horváth és mtsai. (1996) arról számoltak be, hogy a Cd 2+ zöldülő árpa csíranövényekben sokkal inkább a stabil pigment-protein komplexek kialakulását zavarja meg, mintsem magát a klorofill bioszintézisét. A Cd 2+ a PSII donor és akceptor oldalát egyaránt gátolja (Clijsters és Van Assche, 1985; Van Assche és Clijsters, 1990; Krupa és Baszyński, 1995). In vitro mérések eredménye szerint a Cd 2+ egyik fő támadási pontja a vízbontó centrum, melynek degradációját okozza, vagy funkcionálisan gátolja a működéséhez szükséges Mn 2+ -, Ca 2+ - és Cl -ionokkal való kölcsönhatás révén (Skórzynska és Baszyński, 1993). A PSII reakciócentrumának redox komponensei is károsodhatnak (Baszyński és mtsai.,
1980). Kadmiumkezelés hatására gátlódhat a D 1 fehérje szintézise is (Franco és mtsai., 1999). A Cd 2+ a plasztokinon mennyiségének csökkentésével is rontja az elektrontranszportlánc hatékonyságát (Baszyński és mtsai., 1980). Az első fotokémiai rendszert sokáig rezisztensnek vélték, ám Siedlecka és Baszyński (1993) kimutatta, hogy közvetett módon a vashiány következtében lecsökkent ferredoxinaktivitás útján a PSI működését is gátolja. Weigel (1985) a kadmiumnak a Calvin-ciklus enzimeire kifejtett gátló hatását ítélte elsődlegesnek, míg a lineáris elektrontranszportlánc és a PSII aktivitásának sérülését pusztán ennek következményének vélte. A Cd 2+ csökkenti a CO 2 -asszimiláció számos enzimének akivitását, többek között a Rubiscóét, a glükóz-6-foszfátdehidrogenázét, a glutaminsav-dehidrogenázét, a foszfoenol-piruvát-karboxilázét, az almasav-enzimét és az izocitrát-dehidrogenázét (Van Assche és Clijsters, 1990 Krupa és Baszyński, 1995). A Cd 2+ közvetlenül nem képez aktív oxigénformákat, mint például a réz, néhány enzim aktivitásának gátlása (bizonyos esetekben fokozása) révén mégis oxidatív stresszt okozhat (Salin, 1987; Sanitá di Toppi és Gabbrielli, 1999). Növeli a lipidperoxidáz, valamint a lipoxigenáz enzim aktivitását, amit Somashekaraiah és mtsai. (1992) bab csíranövényeken végzett kísérlettel igazoltak. A többszörösen telítetlen zsírsavak lipoxigenázfüggő oxidációjakor felszabaduló szabad gyökök a kloroplasztisz membránstruktúrájának degradációját idézik elő (Sandmann és Böger, 1980). Gallego és mtsai. (1996) napraforgólevélen végzett in vitro kísérleteikben a különböző fémionok által kiváltott oxidatív stresszt vizsgálták. A felhalmozódó AOF a biológiai makromolekulák oxidatív károsodását eredményezték: nőtt a lipidperoxidáció mértéke és a lipoxigenáz aktivitása; csökkent a szövetek klorofill- és GSH-tartalma, valamint az antioxidáns enzimek (CAT, APX, GR, DHAR) aktivitása. Ennek oka vélhetőleg abban rejlik, hogy a nehézfémek az enzimek szulfhidril-csoportjaihoz kötődnek, így az enzimszerkezet megbontását, az enzim aktivitásának csökkenését vagy elvesztését eredményezik (Padmaja és mtsai., 1990; Van Assche és Clijsters, 1990). Más rendszerekben az antioxidáns enzimek aktivitásának fokozódását, illetőleg csökkenését egyaránt kimutatták. Chaoui és mtsai. (1997) 5 µm-os Cd 2+ - kezelés esetén babnövények gyökerében és levelében a CAT enzim aktivitásának csökkenését, a szárban a POD, levélben pedig az APX és GR aktivitásának emelkedését mérték. A lipidperoxidáció mértéke mindhárom növényi részben hasonló arányban nőtt.
In vitro nevelt és szuszpenziós kultúrában tartott sárgarépa szöveteiben viszont 1 mmos kezelés hatására sem tapasztaltak lipidperoxidációt (Sanitá di Toppi és mtsai., 1998). A tipikus stresszmarkernek tartott POD (Van Assche és Clijsters, 1990; Fieldes és Gerhardt, 1994) nehézfém hatására történő módosulásait vizsgálták Blinda és mtsai. (1996). A levél szövetkivonatának POD-aktivitása 100 µm Cd 2+ hatására közel háromszor, a levél apoplazmatikus POD-aktivitása 12-szer volt magasabb, míg gyökérben kismértékű, nem szignifikáns csökkenést mértek. Sejtkultúrákban viszont 5, ill. 100 µm Cd 2+ sem növelte, a nagyobb koncentráció kifejezetten gátolta a POD aktivitását. Macek és mtsai. (1996) Cd 2+ hatására nem tapasztalták új POD-izoenzimek megjelenését, ezzel szemben Chaoui és mtsai. (1997) arról számoltak be, hogy bab esetében 5 µm Cd 2+ hatására megjelent egy új, kis intenzitású sáv. A sokszor egymásnak ellentmondó enzimválaszok oka lehet a növénybe jutott Cd 2+ -ionok különböző mértéke; valamint a sejten belül rendelkezésre álló, vagy a Cd 2+ hatására indukálódó tiolcsoportok eltérő mennyisége (Sanitá di Toppi és Gabbrielli, 1999). A tiolok köztük a GSH erős antioxidáns hatásuk révén részt vehetnek az oxidatív stressz elleni védelemben (Wise és Naylor, 1987b). A Cd 2+ hatására ugyanakkor fokozódik a fitokelatin-szintáz aktivitása, mely enzim GSH felhasználásával nehézfémkötő fitokelatin polipeptidek képződését katalizálja (Steffens, 1990). 2.4.2. Alumínium okozta stresszhatás A savanyú és elsavanyodó talajok világszerte jelentős terméskiesést, hozamcsökkenést okoznak. A savanyú talajokon jelentkező stresszhatás elsősorban nem is a hidrogénion nagy koncentrációjának tulajdonítható, hanem az alacsony ph hatására megnövekedett oldható, ezáltal a növények számára fölvehető formába átalakult alumínium jelentős mennyiségének (Foy, 1988; Ritchie, 1994). Ez a probléma a világ termőterületeinek mintegy 40 %-án jelentkezik (Kochian, 1995). Az Al 3+ felhalmozódásának és hatásának elsődleges helye a gyökérmerisztéma. Alumínium hatására a gyökerek megnyúlásos növekedése a kezelést követő 1-2 órán belül gátlódik, így ez tekinthető az Al 3+ -toxicitás legelső tünetének (Horst és mtsai., 1983; Kochian, 1995). Jóllehet az Al 3+ -nak e gyökerekre kifejtett káros hatását már az 1930-as években leírták (Bortner, 1935), annak részletes mechanizmusa mind a mai napig ismeretlen. Annyi biztos, hogy az Al 3+ gátolja a sejtmegnyúlást (Ryan és mtsai., 1993; Le Van és mtsai., 1994) és a sejtosztódást (Clarkson, 1965). Károsíthat továbbá a membránlipidekkel (Viestra és Haug, 1978) és -fehérjékkel (Caldwell, 1989)
való kapcsolódása révén, a sejtmembránok fluiditásának (Viestra és Haug, 1978) és permeabilitásának (Siegel és Haug, 1983; Wagatsuma és mtsai., 1987; Chen és mtsai., 1991) megváltoztatásával, a membránhoz kötött ATP-áz aktivitásának csökkentésével (Matsumoto és mtsai., 1992), a Ca 2+ -felvétel gátlása (Huang és mtsai., 1992), valamint a DNS-hez történő kapcsolódása révén (Matsumoto és mtsai., 1977). Az Al 3+ toxikus hatása igen gyorsan (néhány másodperc illetve perc alatt) kialakul. Az Al 3+ -nak nem kell belépnie a citoplazmába ahhoz, hogy e károsító hatásokat kifejtse: megváltoztatja a Ca 2+ plazmamembránon keresztüli transzlokációját, aminek következtében csökken a citoplazma Ca 2+ -szintje. A mitózis gátlása a Ca 2+ másodlagos hírvivő szerepéből adódik: a citoszól Ca 2+ -egyensúlyának zavara a Ca 2+ - kalmodulin komplexek kialakulását, a kalmodulin aktiválását akadályozza (Rengel, 1992). Jones és Kochian (1997) eredményei szerint az Al 3+ -toxicitás elsődleges oka nem az alumíniumnak az enzimek katalitikus, fémkötő helyeihez; sokkal inkább bizonyos membránlipidekhez való kapcsolódásában keresendő. Kísérleteikben az AlCl 3 és Al 3+ -citrát alig csökkentette a Mg 2+ -kofaktort tartalmazó enoláz, piruvát-kináz, H + - ATP-áz; a Ca 2+ -iont tartalmazó proteináz-k, Ca 2+ -ATP-áz; valamint a Mn 2+ -függő argináz enzimek aktivitását. Az Al 3+ erős affinitást mutat a szignáltranszdukcióban jelentős szerepet játszó foszfatidilinozitol-4,5-biszfoszfát molekulához. Az Al 3+ károsító hatásának kivédésében fontos szerepe van a gyökerek által kiválasztott szerves savaknak. Delhaize és mtsai. (1993) 200 µm Al 3+ hatására a kezelt búzanövények megnövekedett almasav- és borostyánkősav-kiválasztását mérték. A toleráns genotípus 5-10-szer több almasavat termelt. Az almasav kiválasztása a kezelés után 15 perccel jelentkezett, és 24 órán át fokozatosan emelkedett. A kiválasztott almasav mennyisége arányban állt a külső Al 3+ -koncentrációval, és már 10 µm is indukálta a képződését. Az almasav legfőbb forrása a gyökércsúcs 3-5 mm-es szakasza. Kétórás kezelés alatt a toleráns csíranövények a kezdeti almasavszint közel négyszeresét választották ki, ami a szintézis folyamatosságára utal. Az almasav kiválasztását kizárólag az Al 3+ stimulálta, más háromértékű kationok (Fe 3+ és La 3+ ) alkalmazásával vagy P-hiány hatására nem következett be. Moustakas és Ouzounidou (1995) 37,1; 74,1 és 148 µm Al 3+ hatását egy toleráns és egy nem toleráns búzafajtán vizsgálva azt tapasztalta, hogy csökkent a szövetek Ca-, Mg-, K- és Fe-tartalma. A toleráns fajtában kisebb mértékű volt a csökkenés. Fluoreszcenciaindukciós mérések a toleráns fajtában is a fotoszintetikus elektrontranszportlánc részleges gátlását mutatták, a redukált elsődleges kinonakceptor
felhalmozódása következtében. A fotoszintézis gátlását az ionveszteség következményeként a tilakoidmembrán két oldala között kialakult óriási protongradiensnek, az intratilakoidális tér elsavanyodásának tulajdonították. Sasaki és mtsai. (1996) különböző Al 3+ -érzékenységű búzavonalak vizsgálatával a gyökerek megnyúlási zónájában a növekedés gátlása és a lignifikáció mértéke között szoros összefüggést tapasztaltak, akárcsak Hlídková és mtsai. (2000) szintén búzán végzett kísérleteikben. A gyökerek lignintartalma, oldható és sejtfalhoz kötött POD-aktivitása 12 óra múlva megfigyelhető volt, ami egyfajta mechanikai védelmi rendszer indukciójára utal. Cakmak és Horst (1991) 10-75 µm Al 3+ -mal kezelt szója gyökércsúcsaiban csak hosszabb kezelést követően mérték a lipidperoxidáció növekedését, ami Fe 2+ -ionok hatására fokozódott. A lipidperoxidáció és a gyökérnövekedés gátlásának mértéke szoros összefüggést mutatott. A SOD és a POD enzimek aktivitása növekedett, a katalázé viszont csökkent. Mindez AOF képződésére, és az ebből fakadó szöveti károsodásra utal. Az AOF kialakulásának oka az Al 3+ elsődleges, membránkárosító hatásában keresendő. A fentiekben taglalt membránkárosodások a hemoproteinek és más vastartalmú vegyületek diszlokációjához, s ennek következtében AOF kialakulásához vezetnek (Vladimirov és mtsai., 1980). Severi (1997) 1 mm Al 3+ hatására a vizsgált békalencse csökkent szaporodási rátáját, a POD-aktivitás és a lipidperoxidáció emelkedését tapasztalta. A POD aktivitásemelkedése citromsavval mérsékelhető volt. Az Al 3+ okozta stresszhatás elleni védelemben a citromsavval történő kelátolásnak nagyobb szerepe van, mint a stimulatív, antiszeneszcens hatású kinetinnek. Ezaki és mtsai. (1996) dohány cdns könyvtárból izoláltak egy pal201 nevű klónt, melynek kifejeződését az Al 3+ -kezelés és a foszfáthiány indukálta. A gén egy Al 3+ -stressz hatására indukálódó POD-izoenzimet kódol, így az Al 3+ okozta stresszhatásban, illetőleg annak kivédésében szerepe lehet. Richards és mtsai. (1998) alumíniumstressznek kitett Arabidopsis thaliana növények cdns-könyvtárából három oxidatív stressz hatására indukálódó gént izoláltak: egy POD és egy GST enzimet, valamint egy rézkötő fehérjét kódoló szekvenciát. Ezenfelül találtak még egy Al 3+ - stressz hatására átíródó SOD enzimet is. A gének ózon hatására is indukálódtak, bizonyítva, hogy az Al 3+ okozta stresszhatás fontos részét képezi az AOF felhalmozódása.