Néhány mikotoxin hatásmechanizmusának vizsgálata BioAréna rendszerben

Eötvös Loránd Tudományegyetem Természettudományi kar Néhány mikotoxin hatásmechanizmusának vizsgálata BioAréna rendszerben Doktori értekezés tézisei Móricz Ágnes Kémiai Doktori Iskola Vezetı: Prof. Dr. Inzelt György egyetemi tanár Analitikai, kolloid- és környezetkémiai, elektrokémiai doktori program Programvezetı: Prof. Dr. Záray Gyula egyetemi tanár Témavezetık: Horváthné Dr. Otta Klára egyetemi docens, Ph.D. doktor Prof. Dr. Tyihák Ernı tudományos tanácsadó, az MTA doktora Eötvös Loránd Tudományegyetem, TTK MTA Növényvédelmi Kutatóintézete Budapest 2007

1. Bevezetés A penészgombával fertızött növényeken keletkezett mikotoxinok globális elterjedésük és toxikus hatásuk miatt gazdaságilag és közegészségügyileg különösen káros vegyületek. A szakma által is különös figyelmet élvezı mikotoxinok kiemelkedı káros biológiai hatással rendelkeznek: az aflatoxin B1 (a legveszélyesebb természetes humán karcinogén), B2, G1 és G2 (AFB1, AFB2, AFG1, AFG2) karcinogén, mutagén és teratogén tulajdonságokat, az ochratoxin A (OA) vesekárosító, teratogén és immunoszupresszív hatásokat mutat különbözı fajokban. A mikotoxinok élelmiszerekbıl való teljes eliminálása lényegében nem lehetséges, ezért fontos a növényi eredető élelmiszerekben való folyamatos ellenırzésük. Hatásuk mechanizmusának vizsgálata és fıleg magyarázata, tisztázása elısegítheti az ellenük való védekezést, mezıgazdasági károkozásuk jelentıs csökkentését. A mai napig csak találgatások vannak a hatásmechanizmusukat illetıen, melynek megértését molekuláris szinten kell keresni, kölcsönhatási reakciók sorában (pl. nyomelemek, sejtazonos, sejtidegen anyagok és mikotoxinok között). A Dr. Tyihák Ernı és mtsai által kifejlesztett alternatív állatkísérleti modellnek is tekinthetı BioAréna rendszer új módon tesz lehetıvé hatásmechanizmus vizsgálatokat. Nagyon hatékony, valamint költségtakarékos módszer-rendszer, s a legkülönbözıbb kölcsönhatási reakciók generálására alkalmas, melyek nyomon követhetık pl. spektroszkópiás technikákkal. 2. Célkitőzések Antibiózis során a mikroorganizmusok antibiotikumokat illetve toxinokat termelnek életterük bıvítése, illetve védelme céljából. E két vegyületcsoport tagjai rokonságuk ellenére merıben eltérı hatással rendelkeznek, s mégsem lehet éles határt húzni közöttük, mivel a toxinok antibakteriális tulajdonságúak, azaz antibiotikumok, míg egyes antibiotikumok, mint pl. a penicillin lehet toxikus hatású az arra érzékeny egyedek számára. Munkám során az AFB1, AFB2, AFG1 és AFG2, valamint az OA toxicitásának alapját képezı antibakteriális (antibakteriális-toxikus) hatását tanulmányoztam a BioAréna rendszerben Pseudomonas savastanoi pv. phaseolicola (Psm) bab kórokozó baktériummal szemben. Az MTA Növényvédelmi Kutatóintézete laboratóriumában párhuzamosan folyó antibakteriális (antibiotikus anyagok hatásmechanizmusának újszerő megismeréséhez) vizsgálatokhoz hasonlóan a toxinok hatásmechanizmusának teljesen új megközelítése volt a

fı cél. Ehhez a kísérletek elsısorban a formaldehid (HCHO) és a hidrogén-peroxid (H 2 O 2 ) BioArénában való elıfordulásának bizonyítását célozták, s e két kis molekula kölcsönhatási reakciójából származó szingulett oxigén képzıdésének igazolását. Vizsgálataim továbbá a szingulett oxigén által a víz oxidációját feltételezve, ez utóbbi reakcióból származó, s közvetetten jobban mérhetı, alapvetıen fontosnak tőnı ózon tanulmányozására irányultak. Munkám során a következı vizsgálati célokat tőztem ki: 1. Az AFB1, AFB2, AFG1 és AFG2 elválasztására, valamint az OA kifejlesztésére egyszerő, gyors rétegkromatográfiás módszer kidolgozása, melyek segítségével kapott rétegkromatogramok a toxin foltokkal egy következı lépésben alkalmasak lehetnek a BioAréna rendszerben való felhasználásra hatásmechanizmus vizsgálatokhoz. 2. Az AFB1, AFB2, AFG1 és AFG2, valamint az OA baktériumellenes hatásának vizsgálata a BioAréna rendszerben rétegkromatográfiás kifejlesztés után. A toxinok mennyisége, az inkubációs idı és a baktériumok életkora, mint az antibiotikus hatást befolyásoló tényezı vizsgálata. 3. A HCHO és a H 2 O 2 kimutatása a BioArénában vizsgálatra kerülı réteglapokon (pl. inkubáció után). 4. Az aflatoxinok valószínősíthetı demetilezıdésének elméleti és spektroszkópiás tanulmányozása BioAréna rendszerben. 5. A BioArénás kísérletek során a baktérium sejt szuszpenzióban oldott HCHO-befogóeltávolító, HCHO prekurzor, HCHO-mobilizáló és O 3 -befogó-eltávolító anyagok hatásának vizsgálata a mikotoxinok antibakteriális-toxikus aktivitására. 3. Kísérleti módszerek és készülékek A munkám során az antibakteriális-toxikus hatás vizsgálatára alkalmazott BioAréna rendszer egy rétegen való elválasztást és egy azt követı biológiai detektálást foglal magába. A BioArénában végzett kísérletek elsı lépése a vizsgálni kívánt anyagok, esetemben a mikotoxinok (Sigma Aldrich Rt., Budapest, Hungary), rétegkromatográfiás kifejlesztése. Az OA, az AFB1 és AFG2 kromatográfiás kifejlesztéséhez vékonyréteg-kromatográfiát (TLC), míg az AFB1, AFB2, AFG1 és AFG2 együttes elválasztásához túlnyomásos rétegkromatográfiát (OPLC) használtam. A kromatográfiához minden esetben TLC-minıségő szilikagél állófázist (TLC silica gel 60 F 254, Merck, Darmstadt, Németország) és kromatográfiás tisztaságú (LiChrosolv,

Merck) oldószereket alkalmaztam. A mintákat Hamilton (Bonaduz, Svájc) mikrofecskendıvel vittem fel. TLC-kifejlesztés: Ehhez 3 órán át 130 o C-on szárított réteget alkalmaztam. Az AFB1, az AFG2 illetve az OA hagyományos rétegkromatográfiás kifejlesztését telítetlen kádban (200 mm x 100 mm, Desaga) végeztem. A toxinokat 20 cm x 10 cm mérető rétegre pontban vittem fel. A kromatografálást az AFB1 és AFG2 esetén kloroform-aceton 9:1 (v/v), az OA esetében kloroform-metanol 8:2 (v/v) mozgófázisok segítségével végeztem. OPLC-kifejlesztés: Az AFB1, AFB2, AFG1 és AFG2 OPLC-s elválasztása elızetesen impregnálással széllezárt 20 cm x 20 cm mérető, 3 órán át 130 o C-on szárított réteglapon történt. Az OPLC kifejlesztést Personal OPLC BS 50 (OPLC-NIT Kft., Budapest, Magyarország) önmőködı túlnyomásos rétegkromatográf segítségével az alábbi paraméterekkel végeztem el: mozgófázis, kloroform-aceton 9:1 (v/v); külsı nyomás, 50 bár; kezdeti térfogat, 400 µl; kifejlesztési térfogat, 4500 µl ; áramlási sebesség, 400 µl/min. A kifejlesztési idı 685 s volt. Aflatoxinok esetében 365 nm-en, OA esetében 330 nm-en végeztem el a kromatogramok denzitometriás értékelését (CS-930 pásztázó spektrofotométer, Shimadzu, Kyoto, Japán). A biológiai értékelés során a mikotoxin foltokat tartalmazó kifejlesztett, megszárított réteglapokat 20 másodpercre King s B folyékony táptalajon szaporított Pseudomonas savastanoi pv. phaseolicola baktérium (Biológiai Tudományok Tanszéke, Wye, Londoni Egyetem) sejt szuszpenzióba [OD 560nm =0,7 (optikai sőrőség), kb. 1,5 x 10 9 sejt/ml állapotról 50 % friss tápoldattal hígított] merítettem. Ezt követıen a réteglapok inkubátorba kerültek (28 o C, 100 % relatív páratartalom). Inkubálás után (2 vagy 18 óra), a mikotoxinok biológiai hatásának láthatóvá tételére, a bioautogramokat 5 másodpercre MTT (3-[4,5-dimetil-tiazol-2-il]-2,5-difenil-tetrazólium bromid, a.r. tisztaságú, Sigma) vizes oldatába merítettem, s ismét folytatódott az inkubáció. Az élı sejtek redukálják a sárga MTT-t kék színő MTT-formazánná. A háttérnél világosabb (általában fehér) folt sejtszaporodás gátló, míg a sötétebb szín sejtszaporodás serkentı hatást jelez. A rétegen történı változások figyelemmel kísérése 5-6 napig vagy tovább tart. A dokumentáció a réteglap képének digitalizálásával, valamint kvantitatív denzitometriás (λ=590 nm) értékelésével történik. Különbözı anyagok, mint HCHO befogók, elıanyagok, mobilizáló, O 3 befogók a mikotoxinok antibakteriális toxikus hatására való befolyásának vizsgálata során a kísérlet menete annyiban változott, hogy a réteg fertızése elıtt a baktérium sejt szuszpenzióban

feloldottuk a megfelelı endogén vagy exogén anyagot a következı koncentrációkban: L- arginin (> 98 %, Sigma) 1, 2, 4 illetve 8 mg/ml; redukált glutation (> 98 %, Sigma) 2 mg/ml; L(+)-aszkorbinsav (a.r., Reanal) 10, 50, 100 mg/100 ml; nátrium-szelenit (a.r., Reanal) 0,1; 0,5 illetve 1 mg/100 ml; dimedon (a.r., Sigma)10 illetve 20 mg/100 ml; N G -monometil-larginin (a.r., Serva) 1 mg/ml; N ε -monometil-l-lizin (a.r., Serva) 0,1; 0,5 illetve 1 mg/ml; kristályvizes réz-szulfát (a.r., Reanal) 5 mg/100 ml; indigókármin (> 75%, Sigma) 20; 30 illetve 40 mg/100 ml; (R)-(+)-limonén (> 97%, Sigma) 50; 250 illetve 500 µl/100 ml. A biológiai rendszerben kötött formákból felszabaduló HCHO mérését dimedon segítségével végeztem. A dimedon irreverzibilis reakcióban képez adduktot a HCHO-val, melynek során formaldemeton keletkezik. A BioArénában a kifejlesztett rétegeket dimedont tartalmazó (40 mg/ 100 ml) baktérium sejt szuszpenzióba merítettem. 18 óra inkubációs idı után kapartam le a toxin foltot és egy vele azonos területő toxinmentes, kontroll foltot. Az adszorbenst 75 µl kloroformmal extraháltam. A felülúszóból 25 µl-t vittem fel (Linomat IV- Y mintafelvivı, Camag, Muttenz, Svájc) 20 cm x 10 cm mérető TLC-minıségő szilikagél (Merck) állófázisra 2 µg formaldemeton tesztanyag (99,2 %, a Növényvédelmi Kutatóintézet laboratóriumában állították elı és tisztították) mellé. A réteg kifejlesztését telítetlen kádban, kloroform diklórmetán = 35: 65, v/v (a.r., Reanal, Budapest) eleggyel végeztem. Kvantitatív denzitometriás értékelést 265 nm-es hullámhosszon végeztem. A H 2 O 2 szintjének BioArénában való meghatározása folyamatosan áramló rendszerben, injektálásos technikával történt mintaelıkészítés után. A fertızött vagy vízbe merített rétegrıl inkubáció után lekapartam a toxin foltját, illetve egy vele azonos területő toxinmentes foltot. A lekapart adszorbenst 100 µl vizes nátrium-acetát pufferrel (a.r., 0,2 M, ph=6) extraháltam. A mintákból 10-10 µl-t 1990 µl 0,75 mg/100 ml ferrocén-monokarbonsavat (vezetısó) (Sigma) tartalmazó acetonitrilhez (HPLC minıségő, Carlo Erba) adtam. A HPLC pumpával áramoltatott (0,8 ml/perc) oldószerelegy 0,75 mg/100 ml ferrocén-monokarbonsavat és 0,5 % 0,2 M-os ph=6-os acetát puffert tartalmazó acetonitril volt. A mérés alapjául a H 2 O 2 katalitikus bontása szolgál, mely kataláz enzim segítségével a HPLC injektor mintahurkában megy végbe. A 0 illetve 2 percet az enzimcellában töltött minták amperometriás jeleit +590 mv polarizációs feszültség mellett mértük. A 2 jel különbsége valamint a mintában található H 2 O 2 mennyisége között lineáris összefüggés van.

FT-Raman és felületerısített FT-Raman elemzéseket a Bio-Rad (Hercules, USA) cég FT-Raman spektrométerén Nd YAG lézert alkalmazva 500 mw teljesítményen végeztem. In situ elemzésekhez baktériummentes (viszonyító) és 18 órás inkubációs idı után megszárított fertızött (nem festett!) rétegek toxin és háttérfoltjairól készültek spektrumok. A felületerısített FT-Raman kísérletekhez a vizsgált foltra Ag szol (10-5 M) (spektroszkópiai tisztaságú, Sigma) lett csöppentve, majd rászárítva. Ex situ felületerısített FT-Raman elemzésekhez a baktérium mentes és a fertızött réteglapokról lekapartam a vizsgálni kívánt foltokat. Az adszorbenst 500 µl metanollal (HPLC tisztaságú, Reanal) extraháltam. 20 µl felülúszót adtam 200 µl ezüst szolhoz (10-5 M). A felületerısített FT-Raman elemzés elvégzése az extraktumot tartalmazó ezüst szol 2 órás szárítása után történt. Az aflatoxinok demetilezési reakciójának kvantumkémiai vizsgálatához a számításokat a Gaussian 98 programcsomaggal hajtottuk végre. Töltéssőrőség módszert használtunk a Becke3P86 funkcionállal és a 6-31G* báziskészlettel. Meghatároztuk a négy aflatoxin és demetilezett származékaik optimalizált molekulaszerkezetét és a hozzájuk tartozó energiákat, valamint a demetilezési reakciók egyensúlyi állandóit. 4. Az értekezésben foglalt új kutatási eredmények 1. Egyszerő, gyors OPLC-módszert dolgoztam ki az aflatoxin B1 (AFB1), B2 (AFB2), G1 (AFG1) és G2 (AFG2) elválasztására, melyet eredményesen alkalmaztam az AFB1 és a 4 aflatoxin mennyiségének meghatározására piros paprikában és sikeresen kiterjesztettem alkalmazását komplex bioautográfiás (BioAréna) vizsgálatokhoz. 2. A BioAréna rendszerben az AFB1, AFB2, AFG1 és AFG2 valamint az ochratoxin A (OA) gátlóhatást mutatott a Pseudomonas savastanoi pv. phaseolicola (Psm) babkórokozó baktériumokkal szemben. Antibakteriális-toxikus hatásuk erıssége (gátló zónájuk nagysága) arányos volt a rétegre felvitt anyag mennyiségével, melyet mennyiségi denzitometriás meghatározással is bizonyítottam. Hatásuk nagyobb volt rövidebb inkubációs idıt, valamint fiatalabb, log fázisban lévı baktériumok alkalmazásával. 3. A fertızött rétegen a biológiai rendszerekben nélkülözhetetlen formaldehidet (HCHO) kimutattam formaldemetonként (dimedonnal alkotott adduktja) és denzitometriás

mennyiségi összehasonlítással azt kaptam, hogy a mikotoxinok (AFB1, AFG2 és OA) foltjaiban nagyobb mennyiségő HCHO volt jelen, mint az azonos területő kontroll foltokban. Ezt magyarázhatja pl., hogy a toxinok jelenléte stressz helyzet a baktériumok számára, mely során a metilezési-demetilezési egyensúly eltolódik a demetilezés irányába, s a sejtekben található kötött HCHO felszabadul. A demetilezési potenciál növekedésébıl adódhat a HCHO exogén forrásból, az O-metil csoportot tartalmazó AFB1, AFB2, AFG1 és AFG2 potenciális HCHO elıanyagokból, való felszabadulása is. 4. A fertızött rétegen a hidrogén-peroxid (H 2 O 2 ) jelenlétét, valamint annak jellemzı fogyását detektáltam 1 illetve 18 óra inkubációs idı elteltével, a mikotoxinok (AFB1, OA) kromatográfiás foltjában. 5. A 4 aflatoxin demetilezési reakciójára számított (izolált molekulákra) egyensúlyi állandók sorrendje: AFG1 >AFG2 >AFB1 >AFB2, ami egyben a HCHO termelés relatív sorrendjét is jelenti. Az aflatoxinok demetilezıdésére utaltak az ex- és in-situ FT-Raman spektroszkópiás kísérletek során kapott eredmények, ami szerint az AFB1 δch 3 rezgésére jellemzı sáv Psm jelenlétében csökkenı tendenciát mutatott. 6. A BioAréna vizsgálati rendszerben a különbözı típusú HCHO-befogók (L-arginin, redukált glutation, szelenit ionok, L(+)-aszkorbinsav és dimedon) jelenlétében az AFB1, AFB2, AFG1 és AFG2, valamint az OA antibakteriális-toxikus aktivitása általában az adagolt HCHO-befogó dózisától függıen csökkent. A HCHO elıanyagok (N G -monometil-l-arginin, N ε -monometil-l-lizin) adagolása, valamint a HCHO-t generáló, mobilizáló Cu(II) ionok jelenléte növelték a vizsgált mikotoxinok gátló zónáját. E kísérletek különösen megerısítették a HCHO alapvetı szerepét a mikotoxinok antibakteriális-toxikus hatásában. 7. A HCHO H 2 O 2 -vel való kölcsönhatási reakciója során keletkezı szingulett oxigén ( 1 O 2 ) hatására oxidálódott vízmolekulákból képzıdı dihidrogén-trioxid (H 2 O 3 ) bomlásával felszabaduló ózon (O 3 ) eltávolítására alkalmas vegyületek (indigókármin, d-limonén) csökkentették a vizsgált mikotoxinok baktériumellenes hatását. Ezen eredmények alátámasztották és megerısítették azt az eredeti, kiinduló feltételezést, hogy a HCHO-nak és reakciótermékeinek fontos szerepe lehet a mikotoxinok baktériumellenes és így toxikus hatásában.

6. Közlemények, poszterek és szakmai elıadások Tudományos közlemények: 1. Móricz Á., Otta K., H., Ott P., Tyihák E.: Separation and detection of aflatoxins using overpressured-layer chromatography and bioautography. J. Planar Chromatogr. 16 (2003) 417 420. 2. Tyihák E., Ott P., Móricz Á., Kátay Gy., Király-Véghely Zs.: Antibiosis, antibiotics, and the formaldehyde cycle: unique importance of planar chromatographic techniques to progress in this direction. J. Planar Chromatogr. 17 (2004) 84 88. 3. Tyihák E., Móricz Á.M., Ott P.G., Kátay Gy., Király-Véghely Zs.: The potential of BioArena in the study of the formaldehydome. J. Planar. Chromatogr. 18 (2005) 66-71. 4. Mincsovics E., Kátay Gy., Ott P.G., Király-Véghely Zs., Móricz Á.M., Tyihák E.: Isolation of some antimicrobial compounds of red wine by OPLC flowing eluent wall technique. Chromatographia 62 (2005) S51-S56 Suppl. S 5. Billes F., Móricz Á.M., Tyihák E., Mikosch H.: Simulated vibrational spectra of aflatoxins and their demethylated products and the estimation of the energies of the demethylation reactions. Spectrochimica Acta, Part A 64 (2006) 600-622. 6. Sárközi Á., Móricz Á.M., Ott P.G., Tyihák E., Kéry Á.: Chelidonium Alkaloids Investigated by a Complex Bioautographic System. J. Planar Chromatogr. 19 (2006) 267-272. 7. Móricz Á.M., Fatér Zs., Otta K.H., Tyihák E., Mincsovics E.: Overpressured layer chromatographic determination of aflatoxin B1, B2, G1 and G2 in red paprika. Microchem. J. 85 (2007) 140-144. 8. Tyihák E., Király-Véghely Zs., Kátay Gy., Móricz Á.M., Ott P.G.,: BioArena as biodetection system in the study of plant ingredients". Revista de Medicina si Farmacie, Orvosi és Gyógyszerészeti Szemle (Marosvásárhelyi Orvosi és Gyógyszerészeti Egyetem kiadványa) 53 (2007) 51-61. 9. Móricz Á.M., Ott P.G., Szilágyi M., Otta K.H., Tyihák E.: Opposite effect of Cu(II) and Se(IV) ions on the antibacterial-toxic action of mycotoxins. Acta Biol. Hung. 58 (2007) 301-310. 10. Tyihák E., Kátay Gy., Móricz Á.M., Ott P.G., Király-Véghely Zs.: A formaldehid és reakciótermékeinek szerepe a növényi hatóanyagok hatásmechanizmusában. Acta Pharm. Hung. 77 (2007) 53-58. 11. Móricz Á.M., Ott P.G., Billes F., Otta K.H., Tyihák E.: The influence of L-ascorbic acid on the antibacterial - toxic activity of aflatoxins on adsorbent layer J. Applied Microbiol. (megjelenés alatt, doi:10.1111/j.1365-2672.2007.03505.x) Könyvfejezet: 1. Tyihák E., Móricz Á.M., Ott P.G.: Bio-detection and determination of biological activity of natural compounds. // M. Waksmundzka-Hajnos, J. Sherma, T. Kowalska (szerk.) Thin layer chromatography in Phytochemistry. CRC Press (megjelenés: 2008.02.19.) Elõadások: 1. Tyihák E., Ott P.G., Móricz Á.M., Kátay Gy., Király-Véghely Zs.: Antibiosis, antibiotics, and Formaldehyde cycle: unique importance of planar chromatographic

techniques in this progress direction. // Nyiredy Sz. (szerk.) Proc. Int. Symp. on Planar Chromatography. Budapest (2003) 61-70. 2. Tyihák E., Ott P.G., Móricz Á.M., Király-Véghely Zs.: Antibiosis, antibiotics, and formaldehyde cycle: reactions of trans-resveratrol with formaldehyde in BioArena. 6th International Conference on the role of formaldehyde in biological systems 2003, Pécs, Hungary (Book of abstracts) 3. Móricz Á.M., Tyihák E., Ott P.G., Otta K.H..: Fõ aflatoxinok vizsgálata BioAréna rendszerben. Fiatal Analitikusok Elõadói Napja, 2003. nov. 25., Budapest 4. Móricz Á.M., Tyihák E., Ott P.G., Otta K.H..: Mikotoxinok újszerő vizsgálata BioArénában. Elválasztástudományi Ankét 2004. ápr. 22., Budapest 5. Tyihák E., Móricz Á.M., Ott P.G.: Role of formaldehydome in antibiotic effect: new approach to antibiotic activity of some metal ions. // Collery Ph. (szerk) Metal Ions in Biology and Medicine, Vol. VIII, John Cibbey Eurotext, Paris (2004) 131-134. 6. Tyihák E., Móricz Á., Ott P.G., Kátay Gy., Király-Véghely Zs., Billes F.: Formaldehydome and Special Biological as well as Chemical Reactions of Formaldehyde in Planar Sorbent Bed. // Nyiredy Sz. (szerk.) Proc. Int. Symp. on Planar Chromatography. Visegrád (2004) 137-146. 7. Mincsovics E., Kátay Gy., Ott P.G., Király-Véghely Zs., Móricz Á.M., Tyihák E.: Combination of BioArena with OPLC Flowing Eluent Wall Technique for the Isolation and Characterization of Antimicrobial Compounds from Grapes and Wine. // Sz. Nyiredy (szerk.) Proc. Intern. Symp. on Planar Chromatography, Visegrád, Hungary, (2004) 61-71. 8. Tyihák E., Móricz Á., Király-Véghely Zs., Ott P.G., Kátay Gy.: Plant antibiotic-like compounds and the formaldehydome. 4 th Iternational Symposium on Chromatography of Natural Products, Lublin (Poland), June 14-17, 2004 9. Tyihák E., Móricz Á., Ott P.G.: Study of S-adenosyl-L-methionine and 5- methyltetrahydrofolic acid as key molecules of formaldehyde cycle in a complex bioautographic system. // Sz. Nyiredy (szerk.) Proc. Intern. Symp. on Planar Chromatography, Siófok, Hungary (2005) 179-192. 10. Móricz Á.M., Otta K.H., Ott P.G., Tyihák E.: Time-dependent non-linearities of the mechanism of the action of mycotoxins. International Conference, Non-linear processes in life sciences September 21, 2005, Lublin, Poland 11. Móricz Á.M., Ott P.G., Billes F., Otta K.H., Tyihák E.: Influence of trace elements on antibacterial activity of aflatoxins. 5 th. Int. symp. on trace elements in human: new perspectives Athens Greece (2005) CD-ROM of Proceedings 12. Tyihák E., Móricz Á., Ott P.G., Király-Véghely Zs., Kátay Gy.: Trace elements, formaldehydome system and the human health. 5 th International Symposium on Trace Elements in Human: New Perspectives 13-15 October Athens Greece (2005) CD-ROM of Proceedings 13. Móricz Á.M., Otta K.H., Ott P.G., Tyihák E.: A BioAréna rendszer alkalmazhatósága a mikotoxinok hatásmechanizmusának vizsgálatában. Fiatal Analitikusok Elıadói Napja 2005. november 9. Budapest 14. Tyihák E., Móricz Á.M., Ott P.G., Király-Véghely Zs., Kátay Gy.: Double effect of trace elements. // Szilágyi M., Szentmihályi K. (szerk.) Proc. International Symposium on Trace Elements in the Food Chain (TEFC), Budapest, Hungary (2006) 394-399. 15. Móricz Á.M., Ott P.G., Szilágyi M.,Otta K.H., Tyihák E.: Concentration-dependent influence of metal ions on the antibacterial effects of mycotoxins. // Szilágyi M., Szentmihályi K. (szerk.) Proc. International Symposium on Trace Elements in the Food Chain (TEFC), Budapest, Hungary (2006) 400-405.

16. Tyihák E., Móricz Á.M., Ott P.G., Király-Véghely Zs., Kátay Gy., Szarvas T.: Az adszorbensréteg felhasználása különleges biokémiai reakciókhoz (BioArénarendszer). Magyar Elválasztástudományi Társaság, Prof. Dr. Nyiredy Szabolcs és Prof. Dr. Hajós Gyöngyi tiszteletére rendezett Tudományos Emlékülés, 2007. február 12., Budapest 17. Tyihák E., Mincsovics E., Kátay Gy., Király-Véghely Zs., Móricz Á.M., OTT P.G.: BioArena: unlimited possibility of biochemical interactions in adsorbent layer after TLC/OPLC separation. International Conference of Modern Physical Chemistry for Advanced Materials 2007. Kharkiv, Ukraine, 26-30 June Poszterek: 1. Móricz Á.M., Ott P.G.,Otta K.H., Tyihák E.: Bioautography of mycotoxins separated by OPLC. // Sz. Nyiredy (szerk.) Proc. Intern. Symp. on Planar Chromatography, Hévíz, Hungary, (2002) 341-347. 2. Móricz Á.M., Ott P.G.,Otta K.H., Tyihák E.: Separation and detection of some aflatoxins using overpressured layer chromatography and bioautography // Sz. Nyiredy (szerk.) Proc. Intern. Symp. on Planar Chromatography, Budapest, Hungary, (2003) 319-327. 3. Móricz Á.M., Ott P.G.,Otta K.H., Tyihák E.: Potential role of formaldehyde in the toxic activity of aflatoxins. 6th International Conference on the role of formaldehyde in biological systems 2003, Pécs, Hungary 4. Móricz Á., Otta K.H., Ott P.G., Tyihák E.: New horizon in the characterization of the action of mycotoxins separated by TLC or OPLC. // Nyiredy Sz. (szerk.) Proc. Int. Symp. on Planar Separations. Research Institute for Medicinal Plants, Visegrád (2004) 473-485. 5. Király-Véghely Zs., Kátay Gy., Móricz Á., Ott P.G., Tyihák E.: Analogies and Differences among Biological and Chemical Reactions of trans-resveratrol and trans- Piceatannol in TLC and OPLC. // Nyiredy Sz. (szerk.) Proc. Int. Symp. on Planar Separations. Research Institute for Medicinal Plants, Visegrád (2004) 415-427. 6. Tyihák E., Király-Véghely Zs., Ott G.P., Móricz Á.M., Kátay Gy.: Crucial role of formaldehydome in the beneficial effects of stilbenes from grapes and wine. XXVIII th World Congress of Vine and Wine, OIV-Congress 2004, 4-9. July, Hofburg, Vienna, Austria, CD-ROM of proceedings 7. Móricz Á.M., Király-Véghely Zs., Berente B., Ott P.G., Otta K.H., Tyihák E.: Detection and measurement of trans-resveratrol and ochratoxin A in Hungarian wines by overpressured-layer chromatography and BioArena system. XXVIII th World Congress of Vine and Wine, OIV-Congress 2004, 4-9. July, Hofburg, Vienna, Austria, CD-ROM of proceedings 8. Móricz Á.M., Király-Véghely Zs., Ott P.G., Otta K.H., Tyihák E.: The influence of L-ascorbic acid on the antibacterial activity of aflatoxins and trans-resveratrol on sorbent layer. // Nyiredy Sz. (szerk.) Proc. Int. Symp. on Planar Separations. Research Institute for Medicinal Plants, Siófok (2005) 477-489. 9. Sárközi Á., Móricz Á.M., Ott P.G., Tyihák E., Kéry Á.: Investigation of Chelidonium alkaloids by BioArena system. // Nyiredy Sz. (szerk.) Proc. Int. Symp. on Planar Separations. Research Institute for Medicinal Plants, Siófok (2005) 579-590. 10. Sárközi Á., Móricz Á.M., Ott P.G., Tyihák E., Kéry Á.: Antimicrobial activity of Chelidonium alkaloids investigated by BioArena system. Joint Meeting on Medicinal Chemistry, June 20-23, 2005, Vienna, Austria. Az összefoglaló a következı újságban jelent meg:

Sárközi Á., Móricz Á.M., Ott P.G., Tyihák E., Kéry Á.: Antimicrobial activity of Chelidonium alkaloids investigated by BioArena system. Scientia Pharmaceutica, 73 (2) (2005) 92. 11. Móricz Á.M., Fatér Zs., Otta K.H., Tyihák E., Mincsovics E.: Overpressured layer chromatographic determination of aflatoxin B1, B2, G1 and G2 in red paprika. XII. Hungarian Italian Symposium on Spectrochemistry 2005. Pécs, Október 23-27. 12. Király-Véghely Zs., Pernesz Gy., Kátay Gy., Móricz Á.M.: Compounds with Health Benefit Actions in Wines Produced from Red Grapes in Hungary. XXX th World Congress of Vine and Wine 2007. Budapest, 10-16. June, CD-ROM of proceedings