Aminosavak, peptidek, fehérjék Az aminosavak a fehérjék építőkövei. A fehérjék felépítésében mindössze 20- féle aminosav vesz részt. Ezek általános képlete: Az aminosavakban, mint arra nevük is utal van amino- és karboxil-csoport. Az aminosavak kémiai tulajdonságait az amino- és karboxil-csoport jelenléte illetve az oldallánc tulajdonságai határozzák meg. amino-csoport karboxil-csoport A peptidek aminosavakból épülnek fel. Az aminosavak vízkilépés közben peptid kötéssel kapcsolódnak egymáshoz. A peptidekben az aminosavak száma kisebb mint 50. A fehérjék peptidekhez hasonló szerkezetű molekulák, de bennük az aminosavak száma nagyobb mint 50. A fehérjék fizikai és kémiai tulajdonságait elsődlegesen az határozza meg, hogy milyen aminosavakból épülnek fel és azok egymással milyen sorrendben kapcsolódnak össze. Aminosavak, peptidek és fehérjék reakciója Ninhidrin próba: Rendkívül fontos reakció, valamennyi aminosavra pozitív. A ninhidrin reakciót elterjedten használják aminosavak kimutatására és mennyiségi meghatározására. A ninhidrinnel az α aminosavakból képződő ammónia lilás színű festékké kondenzálódik. (A prolin és oxiprolin aminosavak kivételt képeznek, ezek sárgás színnel adják a reakciót). Fehérjék és peptidek esetén a ninhidrin a terminális aminocsoporttal és a lizin aminocsoportjával reagál. Minél nagyobb a fehérje molekulasúlya illetve minél kisebb a lizintartalma annál kevésbé érzékeny a módszer. A meghatározás menete: Kromatográfiás papírcsíkra egymástól néhány cm távolságra cseppentsünk fel különböző aminosavakból (glutaminsav, lizin. prolin, szerin) egy-egy cseppet. Szárítsuk meg a csíkot és ezután cseppentsünk
egy-egy csepp ninhidrin oldatot ugyanarra a helyre és ismét szárítsuk meg! A reakció 5-10 perc várakozás után játszódik le. Fehérjék reakciói: a. Biuret reakció: Általános reakció, valamennyi fehérjére pozitív. A reakció neve onnan ered, hogy a biuret ugyanolyan színnel adja a reakciót, mint a fehérjék. H a fehérjét lúgos közegben kevés CuSO 4 oldattal kezeljük (biuret reagens), ibolyás szín figyelhető meg, amelyet a peptid kötés Cu 2+ ionokkal képzett koordinációs komplexe ad. A meghatározás menete karbamiddal: tegyünk száraz kémcsőbe kevés (kb. 1g) karbamidot és óvatosan hevítsük. Az anyag előbb megolvad, majd ammóniagáz fejlődése közben megszilárdul, azaz a karbamid biuretté alakul. Megszilárdulás és lehűtés után az anyaghoz biuret reagenst (lúgos közegben CuSO 4 oldat) öntünk. meghatározás menete fehérje oldattal: Kb. 1ml fehérje oldathoz adjunk 1,5 ml biuret reagenst, rázzuk össze és figyeljük meg a színváltozást. Fehérjék kicsapása A fehérjék oldataikból könnyen kicsaphatók. A kicsapódás lehet reverzibilis és irreverzibilis. Reverzibilis kicsapásnál a fehérjék nem szenvednek mélyreható változtatás, ezért, a csapadékot az eredeti oldószerben újra feloldhatjuk. Irreverzibilis kicsapásánál a fehérjék mélyreható változáson mennek keresztül. Megváltozik a szerkezetük és nem oldódnak újra az eredeti oldószerben. A fehérjék reverzibilisen csaphatók ki kisózás útján, vagy alacsony hőmérsékleten rövid ideig tartó kezeléssel, irreverzibilisen pedig nehézfémsókkal, savakkal és melegítéssel csaphatjuk ki.
Fehérjék kisózása: A fehérjék hidrofil kolloidok, azaz nagymértékben hidratáltak. Ha a fehérjeoldathoz megfelelő koncentrációjú könnyű fémsót adunk (Na 2 SO 4, NaCl, (NH 4 ) 2 SO 4, MgSO 4 ) ezek a fehérjerészecskéket dehidratálják, aminek következtében a fehérjék kicsapódnak. Ezt a folyamatot kisózásnak nevezzük. Fehérjék kisózása A meghatározás menete:2 ml fehérjeoldathoz adjunk néhány NaCl kristályt. Rázzuk össze a kémcső tartalmát és rövid idő múlva figyeljük meg a változást. Ezután az anyag felét öntsük másik kémcsőbe és adjunk hozzá desztillált vizet. Fehérjék kicsapása alkohollal: A fehérjék számok neutrális oldószerben /etilalkohol, éter, aceton/ nem oldódnak. Ennek eredményeképpen, ha a fehérjék vizes oldatához pl. etilalkoholt öntünk, akkor az egyes fehérjék, meghatározott alkoholkoncentráció elérésénél kicsapódnak. Ez szintén a dehidratáció következménye. A meghatározás menete: Kémcsőbe kb. 2 ml fehérjeoldathoz adjunk néhány ml etilalkoholt és erősen összerázzuk. Rövid idő múlva figyeljük meg a változást. Ezután az anyag felét öntsük másik kémcsőbe, s adjunk hozzá desztillált vizet. Fehérjék kicsapása nehézfémsókkal: A fehérjék a nehézfémsókkal (Cu, Zn, Ag, Pb, Hg, Fe stb. sóival) komplex vegyületet alkotnak és oldatukból kicsapódnak. A nehézfémek a fehérjék kicsapódását igen kis koncentrációban előidézik, ellentétben a kisózáshoz használt alkáli-és alkáliföldfémekkel. A nehézfémsók a fehérjék fontos csoportjaival (főleg SH csoportokkal) reagálnak. A fehérjéknek ezt a tulajdonságát különböző mérgezéseknél használják fel. A meghatározás menete: Tegyünk két kémcsőbe 2-2 ml fehérjeoldatot. Adjunk az első kémcsőbe néhány csepp ólomacetátot, a másodikba néhány csepp rézszulfát-oldatot. Fehérjék kicsapása melegítéssel: A fehérjék hő hatására kicsapódnak, ha az oldat kémhatása semleges körüli. Erősen savanyú, vagy lúgos oldatból a fehérjék nem csapódnak ki. Magyarázat: A fehérjemolekulában lévő oldalláncok protonleadásra (savi csoportok) illetve protonfelvételre képesek, így pozitív és negatív töltésű helyek keletkeznek. A pozitív és negatív töltések száma az oldat ph-jától függ. Eredetileg a fehérjemolekulában pozitív és negatív töltésű helyek egyaránt találhatóak. Erősen savanyú oldatban a fehérjemolekulák pozitív töltésűek, míg
erősen bázikus oldatban pedig negatív töltésűek. Az azonos töltésű molekulák egymást taszító hatása biztosítja az oldatban maradást. A meghatározás menete: Négy kémcsőbe tegyünk 2-2 ml fehérjeoldatot és a következő kezeléseket alkalmazzuk: 1-es kémcső: 2 ml fehérjeoldat 2-es kémcső : 2 ml fehérjeoldat + 0,5 ml 1 %-os ecetsav 3-as kémcső: 2 ml fehérjeoldat + 0,5 ml 10 %-os ecetsav 4-es kémcső: 2 ml fehérjeoldat + 0,5 ml 10 %-os nátrium-hidroxid A kémcsövek tartalmát rázzuk össze és melegítsük! (A harmadik kémcsőben lévő oldatot forrásig melegítsük!) Fehérjék kicsapása savakkal: Híg oldatukból a fehérjék szerves savakkal /pl. triklórecetsav, csersav és pikrinsav/, vagy szervetlen komplex savakkal (pl. foszforvolfram sav) könnyen kicsaphatók. A különböző savak hatása azonban nem egyforma. A meghatározás menete: Két kémcsőbe tegyünk 2-2 ml fehérjeoldatot, majd az egyikbe adjunk néhány csepp csersavat, a másikba néhány csepp triklórecetsavat. Kis idő elteltével figyeljék meg a változást. A fehérjék pufferhatásának vizsgálata A fehérjék a szervezetben fontos és nagy kapacitású pufferrendszereket képeznek. Pufferhatásuknál fogva képesek közömbösíteni az oldatba kerülő kis mennyiségű savat, vagy bázist. A fehérjék pufferhatása élettanilag azért jelentős, mert az élő szervezetben a szabályozó rendszerek már kis ph változásra is reagálnak. Feladat. Négy kémcsőbe tegyünk a táblázat szerint oldatokat! Az első két kémcsőben levő oldatokhoz csepegtessünk osztott pipetta segítségével 0,1 mólos HCl oldatot, a másik két kémcső tartalmához pedig 0,1 ólos NaOH oldatot amíg a kémcsövekben levő indikátor színe átcsap. Írjuk fel a táblázatba, hogy mennyi reagens oldat kell a színátcsapáshoz! kezelések Sósavas kezelés Nátrium-hidroxidos kezelés Kémcső száma 1 2 3 4 Vizsgált oldat 10 cm 3 deszt. víz 10 cm 3 5%-os zselatin 10 cm 3 deszt. víz 10 cm 3 5%-os zselatin Metilnarancs, 1 1 ----- ----- csepp fenoftalein ----- ---- 1 1 Fogyott HCl ----- ----- oldat, cm 3 Fogyott NaOH oldat, cm 3 ----- ----
Ismétlő kérdések: 1. Rajzolja fel az aminosavak általános képletét! 2. Mik a peptidek és a fehérjék? 3. Rajzoljon fel egy dipeptid és tripeptid képződését! 4. Hogyan csaphatók ki a fehérjék reverzibilisen? Mi a folyamat magyarázata? 5. Hogyan csaphatók ki a fehérjék irreverzibilisen? 6. Melegítés hatására hogyan viselkedik a fehérje oldat különböző ph viszonyok mellett? Mi a jelenség magyarázata? 7. Mik a puffer oldatok? 8. Hogyan vizsgáltuk a fehérjék pufferhatását?