Korszerű vizsgáló eljárások és terápiás lehetőségek Stargardt macula-dystrophiában Doktori értekezés Dr. Hargitai János Semmelweis Egyetem Klinikai Orvostudományok Doktori Iskola Témavezető: Dr. Farkas Ágnes Hivatalos bírálók: Dr. Kőhidai László Dr. Kerényi Ágnes Szigorlati bizottság elnöke: Szigorlati bizottság tagjai: Dr. Szende Béla Dr. Radó Gábor Dr. Lukáts Ákos Budapest 2008
Tartalom 1. Rövidítések jegyzéke 4 2. Bevezetés 5 3. Célkitűzések 15 4. Módszerek 16 4.1. A retina morfológiai változásainak vizsgálata Stargardt 16 macula-dystrophiában optikai koherencia tomográfiával 4.2. A maculapigment változásának vizsgálta Stargardt macula-dystrophiában scanning laser ophthalmoscop segítségével. 17 4.3. Az ABCA4 gén vizsgálata a magyar Stargardt macula-dystrophiás 18 betegcsoportban, és annak összehasonlítása a betegek fenotípusával 4.4. A GFP gén bejuttatásának lehetőségei a retinális pigmenthámba és a 20 retina szöveteibe in vitro és in vivo körülmények között 4.4.1. A vírusvektor létrehozása 20 4.4.2. Retina pigmenthám sejttenyészet 21 4.4.3. In vitro transzdukció 22 4.4.4. In vivo transzdukció 22 4.4.4.1. In vivo transzdukció immunszupprimálás nélkül 23 4.4.4.2. In vivo transzdukció immunszupprimálással 24 4.4.5. ELISA vizsgálat 24 4.4.6. A retina in vivo vizsgálata 25 4.4.7. Szövettani vizsgálatok 26 5. Eredmények 27 5.1. A retina morfológiai változásainak vizsgálata Stargardt 27 macula-dystrophiában optikai koherencia tomográfiával 5.2. A maculapigment változásának vizsgálta Stargardt 33 macula-dystrophiában scaning laser ophthalmoscop segítségével 5.3. Az ABCA4 gén vizsgálata a magyar Stargardt macula-dystrophiás 39 betegcsoportban, és annak összehasonlítása a betegek fenotípusával 5.4. A GFP gén bejuttatásának lehetőségei a retinális pigmenthámba és a 40 retina szöveteibe, in vitro és in vivo körülmények között 2
5.4.1. In vitro transzdukció 40 5.4.1. In vivo transzdukció 42 5.5. A GFP fehérje által kiváltott immunválasz áthidalására alkalmas 47 módszerek vizsgálata 6. Megbeszélés 53 6.1. A retina morfológiai változásainak vizsgálata Stargardt 53 macula-dystrophiában optikai koherencia tomográfiával 6.2. A maculapigment változásának vizsgálta Stargardt 55 macula-dystrophiában scanning laser ophthalmoscop segítslgével 6.3. Az ABCA4 gén vizsgálata a magyar Stargardt macula-dystrophiás 57 betegcsoportban, és annak összehasonlítása a betegek fenotípusával 6.4. A GFP gén bejuttatásának lehetőségei a retinális pigmenthámba és a 59 retina szöveteibe, in vitro és in vivo körülmények között 6.5. A GFP fehérje által kiváltott immunválasz áthidalására alkalmas 61 módszerek vizsgálata 7. Új eredmények és klinikai jelentőségük 64 8. Köszönetnyilvánítás 65 9. Irodalomjegyzék 66 10. Összefoglalás 89 11. Summary 90 12. Publikációk jegyzéke 91 12.1. Az értekezés témájához kapcsolódó közlemények 91 12.2. Egyéb közlemények 91 12.3. Idézhető absztaktok az értekezés témájában 92 12.4. Az értekezés témájában elhangzott előadások 95 13. Az értekezés témájához kapcsolódó közlemények másolatai 95 3
1. Rövidítések jegyzéke ABCR: ATP-ase binding casette reporter AMD: időskori macula degeneráció ATP: adenozin trifoszfát A2E: N-retinilidin-N-retinil-etanolamin CMV promoter: cytomegalovírus promoter CRD: csap-pálcika dystrophia DMEM: Dulbecco s modified Eagle s medium EGPF: enhanced green fluorescent protein ELISA: enzyme-linked immunosorbent assay EPON: szövettani beágyazó anyag ERG: elektroretinográfia FACS: fluorescent cell sorter FT: foveola vastagság (foveolar thickness) GFP: green fluoresceint protein HRP: torma-peroxidáz (horseradish-peroxidase) HSV: herpes siplex vírus MV: macula térfogat (macular volume) OCT: optikai koherencia tomográfia (optical coherence tomography) OCT-compound: alacsony hőmérsékleten haszálható szövettani beágyazó anyag (fagyasztott metszethez) PBS: phosphate buffered saline RAL-PE: retina foszatidil-entanolamin RmP: rim fehérje RP: retinitis pigmentosa SLO: scanning laser ophthalmoscop (scanning laser ophthalmoscope) STGD: Stargardt macula-dystrophia (Stargardt macular dystrophy) TBS: trishydroxymethylaminomethane buffer solution UV: ultraibolya 4
2. Bevezetés A leggyakrabban előforduló öröklött, fiatal korban tüneteket okozó macula-dystrophiát Karl Stargardt írta le 1907-ben (Stargardt 1909, 1918). A betegség jellegzetes tünete a centrális látás csökkenése, amely általában a huszadik életév előtt jelentkezik. A távoli látóélesség a betegség végállapotában általában 2-3 méter ujjolvasásás és 0,1 között stabilizálódik (Markham et al. 1998). Súlyosan károsodik az olvasóképesség, amelyet azonban nem kísér a színlátás zavara. A betegek Ganzfeld ERG válaszaiban jellemző a fotópikus funkció károsodásának dominanciája, de gyakori panasz a sötétadaptáció megnyúlása is. A korai stádiumban a szemfenéki kép nem mindig patognomikus, a klinikai diagnózis gyakran csak a betegség előrehaladtával állítható fel a jellegzetes sárgásfehér foltozottság snail slime vagy/és az atrófiás beaten bronze macula elváltozások alapján. (1. ábra) 1. ábra Snail slime és beaten bronze macula-dystrophiák (Hargitai et al. 2005) A betegség előforulását 1:10000 re becsülik; túlnyomóan autoszomális recesszív, ritkán autoszomális domináns módon öröklődik. (2.ábra) Előfordulás gyakorisága Stargardt macula-dystrophia 1:10000 Progresszív csap-dystrophia 1:10000-1:15000 Best-féle vitelliform macula-dystophia nincs adat X kromoszómához kötött retinoschisis 1:5000-1:25000 1. táblázat A leggyakrabban előforduló öröklött macula-dystrophiák 5
Allikmets és munkatársai 1997-ben találták meg azt a gént, amelynek hibája a betegség autoszomális recesszív módon öröklődő formájának (STGD vagy arstgd) kialakulásához vezethet (Kaplan et al. 1993; Allikmets 1997 et al.). Az ABCR gén az 1. kromoszómán helyezkedik el és egy transzmembrán fehérje, a rim fehérje (RmP) kódolásáért felelős, amely az adenozin-trifoszfát (ATP)-kötő kazetta transzporter család egyik tagja (Azarian et al. 1997). Az RmP fehérjét először béka csap-sejtek külső tagjában írtak le (Papermaster et al. 1978). Ez a fehérje a fotoreceptorok és a retina pigmenthámja között zajló energiaigényes transzportfolyamatokban vesz részt (Weng et al. 1999). 2. ábra Az RmP fehérje működése (rho: rodopszin; ops: opszin; PE: foszfatidilenatolamin; atral: csupa-transz retinál; arrol: csupa-transz retinol; N-RPE: N-retinidil- foszfatidil-enatolamin; DM: lemezkék membránja; PM: plazma membrán) Weng et al. 1999. Fény hatására a rodopszinból csupa-transz retinál szabadul fel a külső tagok lemezkéiben. A csupa-transz-retinál a lemezkék membránjában található foszfatidiletanolaminhoz (PE) kapcsolodik. Az így keletkezett termék a N-retinilidin-PE (N-ret- PE). Az RmP egészséges működése estén az N-ret-PE-t kiüríti a lemezkékből, majd a csupa-transz retinal csupal-transz retinollá (atrol) alakul, amit a pigmenthám sejtek alakítanak ismét 11-cis-retinallá. (2. ábra) Amennyiben az RmP fehérje hiányzik vagy működése nem megfelelő, N-ret-PE halmozódik fel a lemezkék közötti térben. A felhalmozódás egyik következménye az lesz, hogy az opszint a lemezkékben lévő nagy mennyiségű felesleges csupa-transz retinál aktiválja, melynek során opszin-csupa-transz retinál (ops/atral) keletkezik. Ez 6
az aktiváció jelenlegi ismereteink szerint a zajos fotoreceptorok kialakulásához vezet, amely a sötétadaptáció megnyúlásában nyilvánul meg (Fishman et al. 1991). A kóros anyagcsere további következménye lehet az N-retinilidin-N-retinil-PE (A2PE- H 2 ) képződése, ami akkor alakul ki, ha az N-ret-PE-hez egy második csupa-transz retinál molekula kapcsolódik. A pigmenthám sejtekben - amelyek egészséges anyagcsere esetén a lemezék fagocitózisában vesznek részt az A2PE-H 2 molekula N- retinilidin-n-retinil-etanolaminná (A2E) hidrolizál. Az A2E lipofuszcin formájában halmozódik fel a pigmenthám sejtekben, és a macula lutea túlterhelt pigmenthám sejtjei a sejtmembrán károsodásának következtében elpusztulnak (Mata et al. 2001). Az ABCA4 gén hibája előfordul még csap-pálcika dystrophiában (CRD), retinitis pigmentosában (RP) és időskori macula degenerációban (AMD) is (Cremers et al. 1998; Martinez-Mir et al. 1998; Maugeri et al. 2000; Surya et al. 1995, Allikmets et al. 2000). A betegség súlyossága jelenlegi ismereteink alapján a megmaradt rim fehérje funkció függvénye (Martinez-Mir et al. 1998). Ha a beteg heterozigóta formában hordozza a hibás ABCA4 allélt, időskori macula degeneráció kialakulása valószínűsíthető. Amennyiben két enyhe vagy mérsékelt allélt hordoz, STGD kialakulása várható. Két súlyos allélt hordozó betegeken nagy a valószínűséggel CRD vagy RP fog kialakulni. A patogenezis fenti, részben egyszerűsített elmélete alól több kivétel is ismert (Birch et al. 2000). Kimutatták, hogy CRD és STGD is kialakulhat azonos genotípus mellett. Különböző munkacsoportok a klinikailag bizonyított esetek körülbelül 30-70 százalékában találtak kóros genetikai eltérését, és eddig több mint 500 betegség-okozó genetikai variánst fedeztek fel (Lewis et al. 1999; Papaionnau et al. 2000; Rivera et al. 2000; Simonelli et al. 2000; Heckenlively et al. 2001; Fukui et al. 2002). (Az ABCR gén hibája gyakran kimutatható heterozigóta formában időskori macula degeneráció esetén.) A Stargardt betegség autoszomális dominánsan öröklődő formájának kialakulásáért jelenlegi ismereteink szerint az ELOVA4 gén felelős, ami hosszúláncú zsírsavak anyagcseréjében játszik szerepet (Zhang et al. 2001). A szemészeti diagnosztika új módszerei a kórkép pontosabb morfológiai megértését tették lehetővé. Az 1990-es évek elején Huang és munkatársai számoltak be egy új vizsgálati módszerről, az alacsony koherenciájú interferometria elvén működő optikai koherencia tomográfiáról, mely a biológiai rendszerek nagy felbontású leképezését tette lehetővé. A berendezés egy szuperlumineszcens diódalézer segítségével speciális, 7
alacsony koherenciájú fénynyalábot generál, melynek hullámhossza az infravörös tartományban van. A szemgolyón keresztülhaladó fény a szem különböző struktúráiról, azok optikai denzitásának függvényében verődik vissza. Az optikai koherencia tomográfia (OCT) segítségével az ideghártyában lezajló változásokat sejtréteg illetve a legújabb készülékek segítségével már - sejtszinten lehet vizsgálni, és így a betegség progressziójáról is pontosabb képet kaphatunk. Az OCT vizsgálat gyors és könnyen kivitelezhető, a leképezés időtartama hozzávetőleg 1 másodperc (Huang et al. 1991; Hee et al. 1995; Jaffe et al. 2004). A klinikai használatban alkalmazott berendezések közül az első és második generációs készülékek axiális és transzverzális felbontása 10-20 μm közötti, a harmadik generációs OCT felbontása 10 μm alatti. Egy másik vizsgáló eljárás, a scanning laser ophthalmoscopia (SLO), amely nagy felbontású tomográfiás felvételek készítésére alkalmas a szemfenékről, non-invazív módon. A készülék voltaképpen egy monokromatikus funduskamera, melyben azonban a képalkotás nem a hagyományos funduskamerához hasonló módon - ahol a képalkotás időtartama alatt a szemfenék egész felszíne egy időben van megvilágítva - hanem a fundusnak lézerfénnyel pontról-pontra való "letapogatásával" történik. A készülék vizsgáló fényének megválasztásával (infravörös: 780 nm, hélium-neon 630 nm, argon-kék és -zöld 514, illetve 488 nm) a retina rétegeinek és a látóidegfőnek a morfológiai vagy metabolikus változásait akár sejtszinten tudjuk vizsgálni (Németh et al. 1999; Seres et al. 1999). A macula lutea sárgás színéről először Buzzi írt 1782-ben (Buzzi et al. 1782). Wald 1945-ben megjelent munkájából ismerjük a macula területében található sárgás pigmentek abszorpciós spektrumát (430-490 nanométer) (Wald et al. 1945). Humán retinából kimutatta a xantofilleket, amelyek fényelnyelés maximuma 465 nanométer. A xantofillek a karotinoidok egy alcsoportját képezik, amelyek többek között a zöldségek, a gyümölcsök, a lazacok, a kanári madarak és a flamingók élénk színéért felelősek. A xantofillek az egyenes láncú szénhidrogén karotinoidok oxigenizált formái (Goodwin et al. 1980). Bone az 1980-as években írta le a luteint és annak szerkezeti izomerjét a zeaxantint, mint a retina specifikus xantofilljeit (Bone et al. 1980). A lutein és a zeaxatint csupán kettő a több mint 600 eddig ismert karotinoid közül. 8
Szerkezeti felépítése alapján a lutein az α-karotinoidok, míg a zeaxantin a β- karotinoidok közé tartozik. Mindkettő vegyjele azonos (C 40 H 56 O 2 ), de eltérő szerkezetük miatt kötődnek eltérő módon, különböző membránokhoz (Bone et al. 1980). Táplakozásunkban a karotinoidok legfőbb forrásai a növényi táplálékok (hüvelyesek és a zöldpaprika) valamint a tojás sárgája, a tej és a baromfihús (Müller et al. 1996). A táplálékok felszívódását követően a vér karotinoid szintjét több tényező is befolyásolja: a szervezet zsírtartalma, a stressz, a nem, a táplálék zsírtartalma és több még nem ismert tényező (Erdman et al. 1993; Broekmans et al. 2002; Hammond et al. 1997; Zaripheh et al. 2002; Khachik et al. 1997). Az egyes karotinoidok eloszlása a szervezetben nagy különbséget mutat, amely alapján arra következtetnek, hogy az egyes molekuláknak más ás más szervspecifikus feladata lehet. A retinának van a legmagasabb xantofill tartalma a szérumban mért érték 10000- szerese és szinte kizárólagosan csak luteint és zeaxantint tartalmaz (Bhosale et al. 2004). A magas koncentráció kialakításában nagy szerepe lehet az aktív transzport folyamatoknak és specifikus xantofill-kötő fehérjéknek, mint pl. a tubulin (Bernstein et al. 1997; Yemelyanov et al. 2001). A lutein és a zeaxantin koncentrációja a foveolában a legmagasabb és attól a periféria felé haladva egyre csökken (Bone et al. 1988, 1993, 1997). A retinában megtalálható még a zeaxantin királis izomerje az ún. mezozeaxantin, amely luteinből keletkezik és a vérben nem mutatható ki (Bone et al. 1993, 1997). A lutein és a zeaxantin a fovea területében a csapok axonjában helyezkednek el, amelyek a Henle köteget alkotják (Segal et al. 1950; Snodderly et al. 1984 A, B; Wolbarsht et al. 1976), de megtalálhatóak még a külső magvas rétegben (Rapp et al.) 2000 és a pálcikák külső tagjában is (Snodderly et al. 1984 A). Hasonlóan kimutatták a pigmentek jelenlétét a fovea Müller sejtjeiben is, amelyek hálózatot képeznek a csapok axonjaival, ezzel is biztosítva a fovea integritását (Gass et al. 1992,1999; Ezra et al. 2001). A macula lutein és zeaxantin tartalmának in vivo, nem invazív mérésére több módszert dolgoztak ki, amelyek közül a legismertebbek: a heterokromatikus flikker fotometria (Snodderly et al. 2004) és a Raman-spectroscopia (Bernstein et al. 1998). A macula xantofill tartalmának legfontosabb meghatározója a táplálkozás. Ha magas lutein és zeaxantin tartalmú táplálkozást folytatunk, több mint három hónapon keresztül, 9
akkor mind a vérben, mind a retinában megemelkedik a fentiek koncentrációja (Johnson et al. 2001; Koh et al. 2004). Bizonyítékok vannak arra, hogy a férfiak retinájában a lutein felhalmozódás gyorsabb, és a maculapigement mennyiség magasabb (Broekmans et al. 2002, Hammond et al. 1996 A). Az örökletes tényezők is meghatározói lehetnek a maculapigment mennyiségének: kékszürke szivárványhártya esetén alacsonyabb koncentrációkat mértek, mint sötét színű iris esetén (Hammond et al. 1996 B). A dohányzás szintén csökkentheti a maculapigment mennyiségét (Hammond et al. 2000). Az életkor előrehaladtával a xanthofillek csökkenését írták le, amely meghatározó lehet az időskori macula degeneráció kialakulásában (Beatty et al. 2001; Eye Disease CaseControl Study Group 1992). A maculapigement élettani funkciója még nem teljesen ismert. Feltételezhető funkcióit a már ismert biológiai, optikai és fotokémiai tulajdonságaiból vezették le. Szerepet játszhatnak a kék fény megszűrésében (Howarth et al. 1986), a káprázás csökkentésében (Sujak et al. 2000), a kontrasztérzékenységben (Wooten et al. 2002) és a reaktív oxigéngyökök semlegesítésében (Conn et al. 1991). A pigmentek megfelelő elrendeződésben -amelyet a membrán fehérjékhez történő kötődésük biztosít a fotoreceptorok előtt elhelyezkedő fényszűrő rétegként működnek (Ezra et al. 2001; Naylor et al. 1954; Stanworth et al. 1950; Yemelyanov et al. 2001). Az éleslátás fenntartásában elengedhetetlen szerepe van a pigmentek jelenlétének és azok megfelelő elrendeződésének. Idős korban, albinismusban és retinitis pigmentosa esetén amikor a maculapigment mennyisége csökkent igen gyakori panasz a szemkáprázás (Hammond et al. 1998). A maculapigment zsírban oldódó antioxidánsok tagjaként, fontos szerepet játszik a szervezet antioxidáns rendszerében az enzimek (kataláz, glutation-peroxidáz, szuperoxid-dizmutáz) és a vízoldékony antioxidánsok (glutation, C-vitamin) mellett (Conn et al. 1993, De La Paz et al. 1992). A retina kifejezetten érzékeny az oxidatív streszre, mert igen magas az oxigén koncentrációja és folyamatos nagy energiájú kék fény behatásának van kitéve. A reaktív oxigén gyökök keletkezésében kiemelt szerepe van az UV és a kék fényt nagyfokban elnyelő molekuláknak, mint pl. lipofuszcinnak. Ezek az oxigén gyökök a hosszúláncú telítetlen zsírsavak károsításán keresztül lipid-peroxidációt okoznak, amely 10
DNS károsodáshoz, fehérjék és transzmembrán glikoproteinek oxidációjához vezethetnek (Winkler et al. 1999). A karotinoidok a szabad gyökök eltávolításában játszanak kiemelt szerepet (Stahl et al. 1997; Leibler et al. 1997; Sundelin et al. 2001). Lipidoldékonyságuknak köszönhetően sejtmembránokhoz kötődve, a fotoreceptorok külső tagjában lévő magas telítetlen zsírsav tartalmú membránok védelmének alappilléreit képezik (Winkler et al. 1999; De La Paz et al.1992; Leibler et al. 1997). A korral előrehaladó pigementhámsejt pusztulás, a maculapigment mennyiségének csökkenése, és lipofuszcin felhalmozódása a retina oxidatív károsodásához és következményes látóélesség csökkenéshez vezet (Boulton et al. 1991; Curcio et al. 1993). Kísérletes körülmények között, ha a pigmentsejt kultúrákat luteinnel és zeaxantinnal kezelték, csökkenthető volt a lipofuszcin képződés és a kék fény által előidézett apoptosis (Boulton et al. 1993). A lutein és zeaxantin tartalmú étrend-kiegészítők folyamatos szedése a vér, majd később a retina xantofill tartalmának emelkedéséhez vezet. Néhány tanulmányban kimutatták, hogy magasabb szérum xantofill koncentráció esetén alacsonyabb arányban alakul ki időskori macula-degeneráció (Seddon et al. 1995, Snellen et al. 2002; Gale et al. 2003). A maculapigment bevitel optimális mennyiségének meghatározására további tanulmányok vannak folyamatban. Jelenleg a Stargardt betegség a többi macula-dystrophiával együtt a gyógyíthatatlan betegségek közé tartozik. Ezek a kórképek a betegre, családjára és a társadalom egészére komoly terheket rónak. A korai diagnózis elősegítheti azt, hogy az érintettek megfelelő pályaválasztással könnyebben tudjanak beilleszkedni a társadalomba, és teljes életet élhessenek. A mai napig az egyetlen javasolt terápia STGD esetén olyan multivitamin készítmények alkalmazása, amelyek megfelelő összetételben tartalmazzák a retina és a fotoreceptorok korai öregedését hátráltató vitaminokat, nyomelemeket, antioxidánsokat és fotopigmenteket. A leggyakrabban használt optikai rehabilitációs lehetőségeinket jelenleg az alábbi segédeszközök képezik: távcsőszemüveg, nagyító TV és színszűrős szemüveg (Fonda et al. 1985; Zrenner et al. 2002). A retina betegségek diagnosztikus lehetőségeinek kibővülésével párhuzamosan egyre több kísérlet kezdődött, amely a betegségek gyógyítását tűzte ki céljául (Rattner et al. 1999) Ezekben a kísérletekben a szövetátültetés, az őssejt beültetés és a retina 11
protézisek mellett egyre nagyobb számban jelentek meg olyan próbálkozások, amelyek a betegséget sejt és/vagy gén szinten próbálják kezelni. A génterápia az öröklött és szerzett betegségek gyógyításában ígéretes módszernek tűnik. A génterápiás vizsgálatok első lépcsőben egy nyomjelző fehérje termelődéséért felelős gén sejtekbe történő bejuttatásának lehetőségeit vizsgálták. Ezen kísérletek sikere lehetővé tette, hogy a további kutatások egy adott betegségben meghibásodott gén vagy génszakasz, és ezen keresztül a fehérjetermék korrigálásának irányában folytatódjanak (Naldini et al. 1996 A,B; Miyoshi et al. 1997; Bennett et al. 1999). Jelenleg a génterápiás kísérletek túlnyomó része valamely vírus-vektort használ a transzgén bejuttatásához (Relph et al. 2004). Több olyan vírus-vektort sikerült kifejleszteni, amely képes a terápiás transzgén hosszú távú és biztonságos expresszálódásának elindítására az adott célsejtekben. A génterápiának különös jelentősége van a központi idegrendszer betegségeiben, mivel az idegi eredetű sejtek nem osztódnak és kifejezett védelmi rendszer veszi őket körül. Az adenovírus-vektor képes az elérhető magas vírus-koncentrációknak köszönhetően a célsejtek széles spektrumának eredményes transzdukciójára, de alkalmazásakor kifejezett immunválasz várható (Cao et al. 2004; Volpers et al. 2004; Thomas et al. 2001; Schagen et al. 2004). A vektor toxicitására hívta fel a figyelmet az a fatális kimenetelű humán kísérlet, amelyben az ornitin-traszkarbamiláz hiányát próbálták kezelni első-generációs adenovírus-vektor segítségével (Lehrman et al. 1999). A továbbfejlesztett gutless (tehetetlen) adenovírus-vektorból kiiktatták az összes a transzdukcióhoz nélkülözhető vírus alkotórészt, de a vírus kapszid fehérje továbbra is immunválaszt vált ki (Sakhukja et al. 2003; Kochanek et al. 2001, McKelvey et al. 2004). Az adenovírus-vektor másik hátránya, hogy a transzgén episzomálisan integrálódik, így krónikus betegségek kezeléséhez szükséges folyamatos gén-expresszió nem érhető el, de a célsejt genomja nem módosul a terápia következtében. Az adeno-szatellita vírus (AAV) a célsejtek széles spektrumának kezelésére nyújt lehetőséget (Kaplitt et al. 1994; Lu et al. 2004). A beültethető transzgén mérete kicsi (4-5kb) és a vektor immunválaszt nem vált ki. Amennyiben nagyobb méretű transzgén bejuttatására van szükség, akkor eredmény csak a gént feldarabolásával, két AAV vektor egyidejű transzdukciójával érhető el (Nakai et al. 2000; Duan et al. 2000; Sun et al. 2000). 12
A vektor másik hibája, hogy több esetben elégtelennek bizonyult a transzgén expressziója, ami valószínűleg abból adódott, hogy a transzgén a célsejt nem kódoló régiójába integrálódott (Nakai et al. 2003). Jelenleg két klinikai kísérlet van folyamatban Parkinson betegség kezelésére AAV vektor alkalmazásával (During et al.2001; Luo et al. 2002). A herpes simplex vírus (HSV) alapú vektorok eredményesen képesek az idegi sejtek transzdukciójára, köszönhetően a vírus ismert neurotrofizmusának. A hordozható transzgén mérete itt jóval nagyobb lehet (akár 50kb), és az integráció ebben az esetben is episzómális (Glorioso et al. 2004). A HSV vektor esetén is kifejezett immunreakcióra számíthatunk, és az expresszió is csak átmeneti jellegű, ezért a vektort jelenleg csak a daganatok kezelésére irányuló kísérletekben használják (Post et al. 2004). Hosszú távú transzgén expresszió elérésére - jelenlegi ismereteink alapján leginkább a retrovírus és lentivírus alapú vektorok alkalmasak. Ezekben az esetekben a transzgén stabilan integrálódik a célsejt genomjába (Naldini et al. 1996A). A lentivírus-vektor képes nem osztódó, idegi eredetű sejtek nagyobb méretű (8-10kb) transzgénnel történő transzdukciójára, immunreakció kiváltása nélkül (Lever et al. 2004; Martin-Rendon et al. 2001; Azzouz et al. 2004). A vektor egyedüli kockázata az, hogy a genomba történő beépülés mutációk kialakulásához, vitális gének sérüléséhez és nyugvó promoter vagy enhancer régiók aktiválásához vezethet. Ez a mellékhatás jelentkezett azokban a gyerekekben, akiket az X-kromoszómához kötött kombinált immundeficiencia (CID) miatt kezeltek lentivírust alkalmazva. Három betegen a kezelés mellékhatásaként leukémia alakult ki, ami részben LIM-only2 (LMO2) onkogén aktiválódására vezethető vissza (Hacein-Bey- Abina et al. 2003). A lentivírus-vektorokat két nagy csoportba oszthatjuk: főemlős eredetű vektorok és nem főemlős eredetű vektorok. Az előbbibe a humán immundeficiencia vírus (HIV) és a majom immundeficiencia vírus (SIV) tartozik. Az utóbbiba a lófertőző vérszegénység vírus (EIAV), a macska immundeficiencia vírus (FIV) és a szarvasmarha immundeficiencia vírus (BIV) vektorok tartoznak. Az első generációs lentivírusokat olyan vektorok követték, amelyből eltávolítottak minden olyan vírusrészt, amely immunválaszt okozhat a célszövetben. A vírusok pszeudotipizálása lehetővé tette, hogy a vírus-vektor retrográd transzportját kihasználva 13
távoli vagy elzárt idegsejt csoportokat lehessen kezelni (Dull et al. 1998; Kim et al. 1998; Poeschala et al.1998; Rohll et al. 2002). A legújabb lentivírus-vektok képesek a transzgén expresszálódásának ki és bekapcsolására a Tet (tetracyclin) szabályozó rendszer segítségével (Pluta et al. 2005). Ez a tulajdonság kifejezetten fontos lehet abban az esetben, ha akut betegséget kívánunk kezelni. Jelenleg -többek között- a következő neurodegeneratív betegségekben történnek génterápiás kísérletek lentivírus-vektor alkalmazásával: Alzheimer betegség (Marr et al. 2003), Parkinson betegség (Kirik et al. 2004), Huntington betegség (Kells et al. 2004) és amyotrophiás lateralsclerosis (Kaspar et al. 2003). A szem több szempontból is ideális célszerve lehet a génterápiának: sebészileg könnyen megközelíthető és a terápia in vivo könnyen nyomon követhető. Több öröklött retina betegségben sikerült már állatkísérletes modellben részleges anatómia és funkcionális rehabilitációt elérni az utóbbi években (Leber-féle congenitális amaurosis, retinitis pigmetosa, Stargardt macula-dystrophia) (Takahashi et al. 1999; Acland et al. 2001; Bemelmans et al. 2006; Kong et al. 2007). A Stargardt betegség kisérletes állatmodelje az abcr -/- knock out egér, amelyben az RmP fehérje génjét törölték. Ezekben az egerekben lipofuszcin felhalmozódást és a sötétadaptáció megnyúlását írták le (Weng et al. 1999). A abcr-/- egér vizsgálatai során kimutatták, hogy az A2E felhalmozódás csökkent, abban az esetben, ha az állatokat sötétben tartották (Weng et al. 1999). Ennek alapján javasolhatjuk a betegnek, hogy az erős fényt a lehető legnagyobb mértékben kerüljék. Kísérletek indultak olyan gyógyszerek kifejlesztésére, amelyek az A2E felhalmozódást gátolják a pigmenthám sejtekben. Az abcr-/- egérben izotretinoinnak ilyen hatását mutatták ki (Radu et al. 2003). 14
3. Célkitűzések Kutatásunk célja a Stargardt betegség klinikai morfológiai vizsgálata és progressziójának megítélése új szemészeti diagnosztikus eszközökkel, valamint a betegség genetikai hátterének feltérképezése, és egy nyomjelző fehérje génterápiás módszerrel történő bejutásának in vitro és in vivo vizsgálata volt. Vizsgálatainkban a következő kérdésekre kerestünk választ: 1. Alkalmas módszer-e az OCT a retina morfológiai változásainak vizsgálatára Stargardt macula-dystrophiában? 2. Nyomonkövethető-e SLO segítségével a maculapigment mennyiségének változása Stargardt macula-dystrophiában? 3. Az ABCA4 gén melyik mutációi fordulnak leggyakrabban elő a magyar Stargardt macula-dystrophiás betegcsoportban, és azok hogyan befolyásolják a betegek fenotípusát? 4. Képes-e a lentivírus-vektor a GFP nyomjelző fehérje (green fluorescent protein) génjének a retina pigmenthámjába és egyéb rétegeibe történő bejuttatására in vitro és in vivo körülmények között? 5. Milyen módszer alkalmas a GFP fehérje által kiváltott immunválasz áthidalására? 15
4. Módszerek Stargardt macula-dystrophiásnak (STGD) diagnosztizált betegeken és hasonló korú kontroll személyeken a következő klinikai vizsgálatokat végeztük: 4.1. A retina morfológiai változásainak vizsgálata Stargardt macula-dystrophiában OCT segítségével A Semmelweis Egyetem II.sz. Szemészeti Klinikáján harmincöt 15-55 éves (átlag: 28,3±7,6 év) hagyományos klinikai módszerekkel STGD-ának ítélt beteg 70 szemét és 25 hasonló korú (14-51 év; átlag: 27,6±8,7 év) egészséges kontrollszemély 50 szemét vizsgáltuk. A vizsgálatok mindegyike az intézet szabályzatának és a Helsinki Nyilatkozatnak megfelelően történt. Az összes résztvevő személy a vizsgálatok részletes ismertetését követően beleegyező nyilatkozatot írt alá. A betegek beválogatása a korábban ismertetett kritériumok alapján történt (Allikmets et al. 1997; Lewis et al. 1999). A kontroll csoportban egyik személynek sem volt szemészeti betegsége. A betegek között 19 nő és 16 férfi, míg az egészségesek között 13 nő és 12 férfi szerepelt. A betegség jelentkezésének idejét és a betegség fennállást minden beteg esetén rögzítettünk. A betegség kezdetének vagy a látásromlás észlelésének az idejét vagy a diagnózis felállításának időpontját tekintettük. A páciensek rutin szemészeti ellenőrzése a következőket tartalmazta: távoli korrigált látóélesség (Snellen tábla), az elülső és hátsó szegmentum biomikroszkópos vizsgálata, szemfenéki fénykép készítése. Pupillatágítást követően optikai koherencia tomográfiát végeztünk második generációs OCT berendezéssel (OCT2, Hunphrey-Zeiss Instruments, San Leonardo, CA, USA). Minden szem vizsgálata során hat, a vizsgáló személy által manuálisan a foveára centrált, 6 mm-es letapogatást végeztünk. A manuális centrálásra a betegek rossz fixációs képessége miatt volt szükség. A foveoláris vastagságot (FT) és a macula térfogatot (MV) -3500μm átmérőnek megfelelően- a készülék beépített szoftverének segítségével határoztuk meg. Az így kapott eredményeket összehasonlítottuk a betegek legjobb korrigált távoli látóélességével. 16
A statisztikai feldolgozáshoz, lineáris regressziót alkalmazva a Statistica 6.0 szoftvert használtuk (Statsoft Inc. Tusla, USA), és szignifikancia szintjének a p< 0,05 értéket tekintettük. 4.2. A maculapigment változásának vizsgálta STGD-ában SLO segítségével A Columbia Egyetem (New York, NY, USA) Szemészet Tanszékén tizenhat (11-63 éves; 11 nő és 5 férfi) STGD-ás beteg 32 szemét vizsgáltuk. A maculapigment jelenlétét scanning laser ophthalmoscop (SLO; Rodenstock, Munich, Germany) segítségével állapítottuk meg. A SLO vizsgálat előtt, meghatároztuk az összes vizsgált szem legjobb korrigált látóélességét Snellen tábla segítségével. A vizsgálatokat az intézet etikai bizottságának előzetes jóváhagyásával, a Helsinki Nyilatkozat elveinek betartása mellett végeztük. Minden vizsgált személy belegyező nyilatozatot írt alá a vizsgálatokat megelőzően. Négy különböző hullámhosszú fényforrást használva és azok eredményeit összehasonlítva (kék argon-lézer: 488 nm; zöld neon-lézer: 514 nm; vörös hélium neonlézer: 633; infravörös dióda-lézer: 780nm) határoztuk meg a maculapigment jelenlétét vagy annak hiányát a foveában. A kapott eredményeket 3 csoportba osztottuk: 1. Normál mennyiségű pigment a foveában: ha egyenletes eloszlású, körkörös elrendezésű, a foveára centrált sötét pigment volt megfigyelhető, amely a kék fényt teljes mértékben, a zöld és vörös fényt csökkenő mértékben nyelte el, míg az infravörös fény számára teljesen áttetsző volt. (Ezt az eredményt kaptuk mind a huszonöt egészséges kontroll személy esetén.) 2. Csökkent mennyiségű pigment a foveában: ha a pigment mennyiségében vagy eloszlásában a normál állapothoz képest eltérést találtunk, a normál pigment mennyiség mellett leírt fényelnyelési tulajdonságokkal. 17
3. A maculapigment teljes hiánya a foveában: ha a kék fénnyel történő megvilágítás során sötét színű pigment nem volt látható, vagy ha a kék fény mellett észlelt sötét pigment hasonló képet mutatott az infravörös megvilágításnál is. A betegek maculapigment mennyiségét összehasonlítottuk a legjobb korrigált látóélességgel. A látóélesség és a pigmenttartalom összefüggését 3x3-as Chi-négyzet teszttel vizsgáltuk az alábbi csoportok szerint: 0,1- és annál rosszabb, 0,1-0,5 közötti, 0,5 és annál jobb látóélesség, valamint normál mennyiségű pigment, csökkent mennyiségű pigment és a maculapigment teljes hiánya. 15 beteg ABCA4 genotípusát viszgáltuk az ABCR 350 gén-chippel (Allikmets et al. 2001). 4.3. Az ABCA4 gén vizsgálata a magyar STGD-ás betegcsoportban, és annak összehasonlítása a betegek fenotípusával A Semmelweis Egyetem II.sz. Szemészeti Klinikájánának harmincöt 8-45 éves (átlag: 28 év) STGD-ás betegét vizsgáltunk a Columbia Egyetem Szemészeti Tanszékével együttműködésben (New York, NY, USA) a genetikai háttér feltérképezésének céljából. Minden betegtől előzetes beleegyezés után 6 ml friss vénás vért vettük, amelyből a DNS-t QAIGEN DNA Maxi Preparációs csomag (QIAGEN Inc., valencia, CA, USA) segítségével izoláltuk. A betegek genetikai hátterének feltérképezését ABCR400 microchip segítségével végeztük, majd az eredményeket szekvenálással ellenőriztük. Az ABCR400 microchip képes az összes ABCA4 variáns (jelenleg ismert több mint 450 génhiba) egyidejű vizsgálatára (Allikmets et al. 2001; Jaakson et al. 2003). A microchip az arrayed primer extension (APEX) elvét alkalmazza és az összes ismert ABCA4 allél szekvencia-specifikus oligonukleotidjának szintézisével, és azok felhasználásával működik. A minták (templátok) előállításához, az ABCA4 gén összes exonját PCR módszerrel sokszorosítjuk, a korábban ismertetett módszerrel (Kurg et al. 2000). Az amplifikációs oldatban a dttp 20 százalékát dutp-vel helyettesítettük. A sokszorosított mintákat koncentrálása és tisztítása tisztító oszlopon történt (MIPSpin 18
PCR kit; Genotein Inc., Szöul, Dél-Korea). A minták fragmentációjához hőkezelést követően hőlabilis uracil-n-glikozilázt használtunk (Epicentre Biothechnologies, Madison, WI, USA). Az APEX módszerrel végzet genotipizáláshoz az amplifikált minták egyharmadát használtuk a primer extenziós reakcióban. Az APEX reakció oldata minden esetben a következőket tartalmazta: a fragmentált és denaturált PCR mintát, 4 U DNS-polimerázt (ThermoSequenase; GE Healthcare, Amersham, Nagy-Britannia), egyszeres reakció puffert és 1,4 µm koncentrációban fluorescensen jelzett ddntp-ket: Texas-vörös ddatp, fluoreszcein-ddgtp (GE Healthcare), Cy3-ddCTP és Cy5-ddUTP (NEN, Boston, MA, USA). A reakciós oldatot 58 C-on 15 percen keresztül inkubáltuk a ABCR400 microchip felületén. Az inkubációt a tárgylemez 95 C-os desztillált vízzel (Milli-Q; Millipore, Bedford, MA, USA) történő öblítésével állítottuk le. A tárgylemezeket Genorama QuattroImagerrel (Asper Biotech Ltd., Tartu, Észtország) vizsgáltuk, és az ABCA4 szekvencia-variánsokat a műszer szoftverének (Genorama Genotyping Software, Asper Biotech Ltd., Tartu, Észtország) segítségével azonosítottuk (Tonisson et al. 2002). Az azonosított variásokat direkt szekvenálással, (Taq Dyedeoxy Terminator cycle Sequencing; Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) ABI 377 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) automata szekvenálón ellenőriztük. A genotípus-fenotípus összehasonlítás során a betegeket a funduskép alapján a Fischman által javasolt csoportokba (Fischman et al. 1999) : Fenotípus I: apró atrófiás terület a foveában, finom pigmentzavarral és perifoveális sárgás-fehér foltozottsággal. Fenotípus II: számos sárgás-fehér folt a macula területében. Fenotípus III: kifejezett atrófiás elváltozás a fovea területében. A betegek genetika adatait a legjobb korrigált látóélességgel és az OCT vizsgálat eredményeivel hasonlítottuk össze lineáris regresszió módszerével. A statisztikai számításokat a Statistica 6.0 szoftverrel (Statsoft Inc. Tusla, USA) végeztük és szignifikáns eltérésnek a p< 0,05 értéket tekintettük. 19
Elemeztük egy adott genetikai hiba lehetséges hatását a betegség progressziójára a vizsgálati csoportban. Alapkutatásainkat humán pigmenthám tenyészeteken és kísérleti nyulakon végeztük: 4.4. A GFP gén bejuttatásának lehetőségei a retinális pigmenthámba és a retina szöveteibe in vitro és in vivo körülmények között 4.4.1. A vírus-vektor létrehozása A vírusokat a humán vese eredetű 293T sejtvonal három plazmiddal történő egyidejű transzfekciójával nyertük, a kálcium-foszfát módszer alkalmazásával (Chen et al. 1987; Naldini et al. 1996A,B). Az első plazmid (pcmvδr8.2) tartalmazza a cytomegalovírus promotert és az inzulin poladenilációs jelet, amely az összes vírusfehérje a köpenyfehérje (envelope) és a Vpu kivételével- transz formában történő expresszálódásához szükséges. A második plazmid (phr -CMV-GFP) tartalmazza az összes cisz állapotban lévő fehérje kódolásáért felelős szekvenciát, amely a vírus sejtbe jutásához és génjeinek a célsejt genomjába történő integrációjához szükséges. Ebben a plazmidban az expressziós kazetta a Rev (vírus replikációját szabályozó fehérje) kötőhelyekkel és CMV promoterrel együttesen felelős az EGFP expresszálódásáért. A harmadik plazmid (pmd.g) a vesicularis stomatitis vírus köpeny-fehérjéjének termeléséért felelős, amely a vírus stabilitását és a lehetséges célsejtek számát határozza meg. 40 darab 10 cm átmérőjű petricsészébe egyenként 1,5x10 6 293T sejtet helyeztünk egy éjszakára, majd a tápoldatot a transzfekció előtt két órával friss médiumra cseréltük. A kálcium-foszfátos precipitációhoz 15μg pcmvδr8., 20μg phr -CMV-GFP és 5 μg pmd.g DNS keverékét használtuk. A tápoldatot a transzfekciót követően 18 órával friss médumra cseréltük. Újabb 48 óra elteltével a vírust tartalmazó tápoldatot összegyűjtöttük a negyven 10 cm-es petricsészéből. A sejttörmeléket lassú centrifugálással távolítottuk el. Ezt követően az oldatot 0,45μm pórus-méretű filteren szűrtük keresztül, majd ultracentrifugálást végeztünk 50000g-n 90 percig. Az így kapott vírusmasszát feloldottuk 600 μl vírus inkubációs oldatban (50mM Tris-HCL, ph 7.8, 20
130mM NaCl, 10 mm KCl, 10 mm MgCL 2, 0,1 dezoxinukleotid-trifoszfát [dntps], 3mM spermin, 0,3mM spermidin), majd 37 C-on 2 órán át inkubáltuk. Az oldatot ezt követően TBS-sel hígítottuk (50mM Tris-HCL, ph 7,8, 130mM NaCl, 1mM KCl, 5mM MgCl 2 ), amelyet 50000g-n 90 percig tartó újabb ultracentrifugálás követett. A végső vírusmasszát 100μl 8μg/ml Polybrene (kationos polymer, mely a retrovírus fertőzés hatékonyságát emeli a sejtkulturában) tartalmú TBS-ben oldottunk fel újra. A lentivírus-vektor titerét a 293 sejtek infekciójával határoztuk meg. 1x10 5 sejtet helyeztünk el petricsészénként, majd a 4 μg/ml Polybrene tartalmú vírusoldat különböző hígításait helyeztük a tápoldatokba. Egy éjszakán át tartó inkubációt követően a tápoldatot frissre cseréltük, és a sejteket további 48 óráig inkubáltuk. A GFP fluoreszcenciát áramlási citométerrel (FACS) határoztuk meg. A vírus-titer meghatározásához azokat a sejttenyészeteket használtuk, amelyekben a GFP fluoreszcenciát mutató sejtek száma megközelítőleg 5% volt. A koncentrációt az aktuális sejt-floureszcencia százalék és a hígítás mértékének arányából számoltuk ki. Az így nyert vírusoldatok fertőző egység (IU) koncentrációja 10 6 10 10 IU/ml között változott. 4.4.2. Retina pigmenthám sejttenyészet A humán pigmentepithel sejteket 18-22 hetes magzatok szeméből nyertük az Albert Einstein Orvosi Egyetemről (New York, NY, USA). A terhesség megszakítást megelőzően az anya minden esetben beleegyező nyilatkozatot írt alá a szerv felhasználásáról. A szerveket az Albert Einstein Orvosi Egyetem és a Columbia Egyetem (New York, USA) közötti megállapodás alapján használtuk fel. A szemeket először 70%-os alkoholban, majd PBS oldatban tisztítottuk meg. A pigmenthám eltávolítása a korábban már ismertetett módszerrel történt (Gouras et al. 1994). A pigmenthám darabokat 37 C-on inkubáltuk 95% páratartalom és 5% CO 2 koncentráció mellett. A 20% fötális bovin szérum tartalmú Dulbecco modifikált Eagle tápoldatot (DMEM) 3 naponta cseréltük a sejttenyészeten. 21
4.4.3. In vitro transzdukció Annak érdekében, hogy az osztódó és a nyugalomban lévő sejtek transzdukciójának arányát össze tudjuk hasonlítani, a vírusoldatot az elsődleges pigmenthám tenyészet tápoldatába juttattuk. Ezáltal megfigyelhettük mind az eredeti erősen pigmentált sejtcsoport, mind az ebből kirajzó, már csökkent pigmenttartalmú osztódó sejtek viselkedését. A transzdukció előtt a tápoldatot friss, 20% fötális bovin szérum tartalmú DMEM oldatra cseréltük, amely 4 μg/ml koncentrációban Polybrent és a vírusoldat különböző koncentrációit (10 7 10 9 IU/ml) tartalmazta. A sejteket 14 órán keresztül inkubáltuk a vírusoldatban, majd annak kimosását követően a közeget friss tápoldatra cseréltük. Mind a fluoreszkáló, mind a nem fluoreszkáló sejteket egy meghatározott (0,4 x 0,8 mm) területen összeszámoltuk a tenyésztőedény alábbi három részén: 1. az eredeti pigmenthám lemez közepének megfelelően 2. az eredeti lemez szélének megfelelően, ahol az osztódó sejtek vonala indult 3. a sejttenyészet széli részének megfelelően, ahol nagy mennyiségű osztódó sejt volt megfigyelhető. A fenti vizsgálatokat hetente, tizenöt különböző tenyésztőedényben végeztük el, három héten keresztül. Öt sejttenyészetben 6 hétig, míg egy tenyészetben három hónapig folytattuk a vizsgálatot. 4.4.4. In vivo transzdukció Kísérleteinkben holland öves nyulakat használtunk az ARVO irányelveinek megfelelően (ARVO 2002). A nyulakat intramuszkulársian 20mg/kg ketamin és 10mg/kg xylazin keverékével altattuk el. Az állat egyik pupilláját 2 %-os cyclopentolat és phenilephrin hydrochlorid keverékével kitágítottuk, és a kísérleteket a tágított pupillájú szemeken végeztük, fénymikroszkópos ellenőrzés mellett. (3. ábra) 22
3. ábra A szubretinális és az intravitreális injekció bejuttatásának módja (Ralph et. al 2006) A kötőhártya sebet és a sclerotomiás nyílást a limbus mögött 3 mm-rel készítettük. A vizsgálathoz a nyulak szemére kontaktlencsét helyeztünk hialuronsav (Healon, Santa Ana, CA, USA) segítségével. A scleraseben keresztül egy 50µm átmérőjű üveg mikropipettát juttattunk az üvegtesti térbe. A pipetta végét a retina felszínére óvatosan rányomva, a vírus oldatot a neuroretinán keresztül a szubretinális térbe juttattuk. Minden esetben arra törekedtünk, hogy kb. 1-2 mm átmérőjű, kerek neuroretina leválást képezzünk. Ezek után a pipettát eltávolítottuk,a sclera és kötőhártya sebeket 9-0 nylon varrattal zártuk. 4.4.4.1. In vivo transzdukció immunszupprimálás nélkül A kísérleteket 27 nyúl egyik szemén végeztük különböző vírusoldatokat juttatva a szubretinális térbe: A oldat: CMV promóterrel ellátott GFP gént tartalmazó lentivírus 10 6-10 9 IU/ml koncentrációjú oldatát használtuk 16 szemben B oldat: CMV promótert tartalmazó lentivírust jutattunk be, amely nem tartalmazta a GFP génjét három szembe 23
C oldat: csak Polybrene oldatot injektálunk két szembe D oldat: rodopszin promótert tartalmazó lentvírus-gfp-t jutattunk be két szembe Az A oldatot használtuk, azt lehetőség szerint a neuroretina rétegei közé adtuk négy szemben. 4.4.4.2. In vivo transzdukció immunszupprimálással A kísérleteket 9 nyúl 12 szemén végeztük. Az előzőekben leírt A oldatot injektáltuk a nyulak szubretinális terébe. Négy nyúl a műtét napjától kezdődően a következő immunszuppressziós terápiában részesült: intramuszkuláris metylprednisolon sodium-succinat (Solu- Medrol; 6,25mg/nap), azathioprin (8mg/nap) és orális cyclosporin (Neoral oldat 50mg/nap) egy hónapon keresztül. Az immunszuppressziót egy hónap elteltével leállítottuk. Két immunszupprimált és két nem immunszupprimált nyúl fülvénájából három naponként vért vettünk az esetleges GFP ellenanyag ELISA módszerrel történő kimutatására. Két immunszupprimált és egy nem immunszupprimált nyúl az első operáció után 6 hónappal újabb szubretinális vírusinjekciót kapott a másik szembe. Ezekben az esetekben újabb immunszuppressziót nem alkalmaztunk. 4.4.5. ELISA vizsgálat Maxicorp 96 osztatú tenyésztőedények alját (Nalge Nucl International, Rochester, NY, USA) 1μg regfp (Clontech Laboratories, Palo Alto, CA USA) 100μl 50mM koncentrációjú nátriumkarbonát oldattal (ph 9,8) vontunk be. A fluoreszcencia blokkolására a tenyésztőedényt 0.05% Tween és 3% bovin szérum albumin tartalmú PBS oldattal kezeltük. A nyulak vérét a fenti oldattal hígítottuk és az oldatból lyukanként 100 μl-t helyeztünk el. Kilencven percig tartó 37 C-os inkubáció után, a 24
lyukakat PBS-sel kimosva 100 μl másodlagos anti-nyúl immunglobulin G-t adtunk hozzá, amely 0,1μg/ml torma-peroxidáz (HRP) konjugátumot tartalmazott. A HRP kimutatására 3,3, 3,5 tetrametilbenzidin szubsztrátot (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) használtunk, amelyet kolorimetriás analízis követett a Multiscan RC plate reader (Labsystemsm, Helsinki, Finnország) segítségével. 4.4.6. A retina in vivo vizsgálata A nyulak retináját hetente vizsgáltuk scanning laser ophthalmoscoppal (SLO), indirekt ophthalmoscoppal és réslámpával. A GFP gén expresszálódásának vizsgálatához 488 nm hullámhosszúságú argon lézer gerjesztő-fényt és olyan filtert használtunk, mely csak az 500 nm-t meghaladó hullámhosszú fényeket engedi át. A fluoreszcens módban használt SLO képek alapján a GFP gén expresszálódásának mértékét (relatív fluoreszcencia) 0-3-ig osztályoztuk az injektált területnek megjelenő különálló fluoreszkáló pontok száma szerint: Ha az SLO képen legalább 50 különálló fluoreszkáló pontot láttunk az injektált területen, akkor az expresszálódás mértéke: 3; 10-50 fluoreszkáló pontot esetén: 2; 10 pontnál kevesebb esetén: 1; a fluoreszencia hiánya esetén a gén expesszió mértéke: 0. Az ideghártyán az injektált területnek megfelelően kialakult károsodás (relatív retina pigmenthám károsodás) mértékét szintén a 488nm hullámhosszú fény használata mellett állapítottuk meg, az alábbiak szerint: IV fokozat: 10 vagy annál több pigmentált (sötét) pont és ezek körül több atrófiás terület; III fokozat: 5-10 pigmentált pont és ezek körül néhány atrófiás terület; II fokozat: 2-5 pigmentált pont; I fokozat: 1 pigmentált pont; 0 fokozat: a szubretinális injekció helyén pigmentáció változás nem látható. 25
4.4.7. Szövettani vizsgálatok A nyulak szemének szövettani vizsgálatára a fluoreszcencia megszűnését követően a kilökődési reakció jeleinek megjelenése után került sor. Ennek időpontja a nem immunszupprimált esetekben az injekciót követő 1-8. hónapra esett. Az immunszupprimált nyulak szövettani feldolgozása 12 hónap után történt. A szemek nagy részét 3%-os glutáraldehidet tartalmazó PBS oldatban fixáltuk, úgy, hogy a bulbust a limbusnak megfelelően 3 nyíláson keresztül töltöttük fel. A szemeket 2 napon keresztül + 4 C-on tartottuk a fixáló oldatban. A lencsét és az üvegtestet puffer-oldatos öblítés után eltávolítottuk. Ezt követően a kezelt területet fénymikroszkóp ellenőrzése mellett kivágtuk, majd újabb öblítést követően dehidráltuk, majd Epon-ba ágyaztuk és fénymikroszkópos metszeteket készítettünk. Azokban az esetekben, amikor fagyasztott metszeteket készítettünk, a szövetdarabokat 4%-os paraformaldehid tartalmú PBS oldatban fixáltuk, majd OCT-kompanddal feltöltve száraz jéggel fagyasztottuk meg. A Leica 1850 cryotommal (Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Németország) készített metszeteket zselatinnal kezelt tárgylemezeken rögzítettük fluoromount-g fedőanyagot használva, majd a fluoreszcenciát epifluoreszcens mikroszkóppal (Zeiss Axiovert S100; Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Göttingen, Németország) vizsgáltuk. Az excitációhoz 480 ± 20 nm hullámhosszú fényforrást használtunk, a barrier-filter csak az 535 ± 25 nm hullámhosszú fényeket engedte át. Az immunhisztokémiai vizsgálatokhoz poliklonális GFP ellenanyag (Clontech Laboratories, Palo Alto, CA, USA) 1:1000 hígítását alkalmaztuk. Negatív kontrollként lentivírus-gfp oldattal nem kezelt retina pigmenthám sejttenyészeteket használtunk. 26
5. Eredmények 5.1. A retina morfológiai változásainak vizsgálata Stargardt macula-dystrophiában OCT segítségével Az átlagos legjobb korrigált látóélesség a vizsgált Stargardt betegcsoportban 0,16 volt (0,08-0,63) míg az egészséges kontroll csoportban 1,0. Minden beteg elülső szegentuma ép volt. A szemfenéki elváltozások az alábbi megoszlást mutatták: Fischman I.: 3 beteg Fischman II.: 21 beteg Fischman III.: 11 beteg Fischman III. csoportba tartozó betegek látóélessége volt a legrosszabb, hasonlóan a korábbi vizsgálatokhoz. A STGD-ás betegek foveolája nagyfokban elvékonyodott (71,86±32,85 μm) az egészséges személyekhez képest (161,26±15,90 μm; p<0,001). A macula térfogat szintén szignifikáns módon csökkent a betegcsoportban a kontrollokhoz viszonyítva (169±0,32 mm 3 vs. 2.45±0,13 mm 3 ; p< 0,001). Egy 25 éves egészséges kontroll személy macula OCT vizsgálatának eredményét mutatja a 4. ábra, amelyen látható, hogy sem a neuroretina sem a pigmenthám nem mutat kóros eltérést. A foveoláris vastagság 186 μm, a macula térfogat 2,66 mm 3. 4. ábra 25 éves egészséges kontrollszemély macula luteájának OCT felvétele (Hargitai et al. 2005) 27
A 5. ábra egy szintén 25 éves, de STGD-beteg maculájának OCT képét mutatja. Látható, hogy a foveoláris behúzottság kiszélesedett. A legjobb korrigált látóélesség 0,63, foveoláris vastagság 81 μm, macula térfogat 1,94 mm 3. 5. ábra 25 éves STGD-beteg bal macula luteájának OCT felvétele (21. beteg) A zöld nyíl a kiszélesedett foveoláris behúzottságra és az elvékonyodott neuroretinára mutat. (Hargitai et al. 2005) Egy 28 éves STGD-ában szenvedő beteg macula OCT lelete látható a 6. ábrán. Az érintett szem látóélessége 0,25. A fovea területének elvékonyodása és a behúzottság jelentős kiszélesedése ábrázolódik (zöld nyíl). A foveola vastagsága 49 μm, a macula térfogata 1,83 mm 3. 6. ábra 28 éves STGD-beteg jobb macula luteájának OCT képe (18. beteg) (Hargitai et al. 2005) 28
A 7. ábra egy 15 éves beteg OCT eredményét szemlélteti. A bemutatott szem legjobb korrigált látóélessége 0,1. Az előző beteghez képest a fovea további elvékonyodása és kimélyülése figyelhető meg (zöld nyíl). A foveola vastagsága 38 μm, a macula térfogat 1,3 mm 3. 7. ábra 15 éves STGD-beteg jobb macula luteájának OCT képe (28. beteg). (Hargitai et al. 2005) 29
A betegcsoport vizsgálati eredményeit az II. táblázat foglalja össze. Beteg Kor (év) Nem Betegség fenállása (év) Látóéleség (jobb szem) Látóélesség (bal szem) Fenotípus (Fischmann) FT jobb szem (µm) FT bal szem (µm) MV jobb szem (mm 3 ) MV bal szem (mm 3 ) Allél 1 Allél 2 1 18 M 10 0.42 0.50 I 90.00 76.00 1,7 1,67 ND ND 2 27 F 15 0.06 0.08 III 43.00 58.00 1,27 1,28 L541P/A1038V ND 3 29 F 8 0.17 0.17 II 54.00 20.00 1,38 1,35 5917delG 5917delG 4 42 F 14 0.10 0.10 III 91.00 71.00 1,6 1,59 ND ND 5 22 F 5 0.20 0.33 II 28.00 77.00 1,64 1,68 V2050L ND 6 17 F 2 1.00 0.71 II 156.00 141.00 2,55 2,6 ND ND 7 28 M 13 0.10 0.06 III 71.00 92.00 1,61 1,61 IVS40+5G>A ND 8 37 M 15 0.10 0.10 II 87.00 97.00 1,95 1,95 L541P/A1038V G1961E 9 32 M 7 0.08 0.08 II 51.00 32.00 1,59 1,66 106delT G1961E 10 55 F 17 0.25 0.56 I 160.00 170.00 1,72 1,82 ND ND 11 15 F 3 0.25 0.33 II 67.00 68.00 1,78 1,76 L541P/A1038V G863A 12 15 M 6 0.20 0.20 III 107.00 117.00 1,93 1,92 IVS40+5G>A 5917delG 13 27 M 2 0.38 0.33 I 56.00 86.00 2,01 1,97 ND ND 14 37 F 9 0.12 0.16 II 92.00 46.00 1,55 1,59 G1886E G1961E 15 20 F 5 0.30 0.20 III 49.00 34.00 1,43 1,53 G1961E ND 16 28 M 14 0.32 0.08 II 52.00 60.00 1,46 1,52 ND ND 17 27 M 5 0.10 0.10 III 97.00 92.00 1,76 1,71 IVS40+5G>A 5917delG 18 28 M 12 0.25 0.10 III 49.00 46.00 1,83 1,86 L541P/A1038V D1532N 19 31 F 11 0.10 0.13 II 67.00 72.00 1,55 1,49 ND ND 20 15 F 5 0.10 0.10 II 28.00 34.00 1,63 1,65 L541P L541P/A1038V 21 25 F 2 0.20 0.62 II 94.00 81.00 1,92 1,94 L541P/A1038V G863A 22 18 M 9 0.08 0.10 II 63.00 72.00 1,4 1,43 L541P/A1038V ND 23 34 F 9 0.16 0.16 III 16.00 23.00 1,31 1,56 G1961E ND 24 52 F 14 0.16 0.16 II 122.00 113.00 1,9 1,99 ND ND 25 37 M 22 0.10 0.12 III 40.00 40.00 1,41 1,42 P68L L541P/A1038V 26 18 F 11 0.20 0.25 II 59.00 72.00 1,42 1,47 ND ND 27 24 F 7 0.18 0.18 II 83.00 100.00 1,72 1,77 L541P/A1038V G1961E 28 15 M 7 0.10 0.16 III 38.00 46.00 1,3 1,41 IVS40+5G>A 5917delG 29 31 M 14 0.10 0.10 II 41.00 44.00 1,95 1,96 R1108C R1108C 30 28 M 6 0.33 0.56 II 91.00 129.00 1,98 2,04 G1961E ND 31 28 F 11 0.08 0.10 II 55.00 63.00 1,52 1,59 ND ND 32 32 M 15 0.20 0.20 II 92.00 86.00 1,8 1,75 L541P/A1038V G863A 33 27 F 4 0.25 0.20 II 66.00 75.00 1,72 1,76 ND ND 34 36 F 8 0.12 0.10 II 58.00 69.00 1,59 1,56 ND ND 35 19 F 6 0.10 0.10 III 62.00 53.00 1,67 1,65 IVS40+5G>A IVS40+5G>A II. táblázat F: nő; M: férfi; I,II, III: szemfenéki elváltozások értékelése Fischmann beosztása szerint; FT: foveola vastagság; MV: macula térfogat; ND: genetikai eltérést nem detektáltunk. (Hargitai 2005) A legjobb korrigált látóélesség mind a foveoláris vastagsággal (8. ábra), mind a macula térfogattal (9. ábra) szignifikáns összefüggést (p< 0,05) mutatott a betegcsoportban (többszörös regresszió analízis). Az egyes fenotípus csoportokban a fenti értékek között hasonló összefüggést nem tudtunk kimutatni. 30