Eötvös Loránd Tudományegyetem Természettudományi Kar Környezettudományi Doktori Iskola Humán kórokozó vírusok előfordulása magyarországi felszíni- és fürdővizekben Kern nita Témavezető: Dr. Vargha Márta, Országos Környezetegészségügyi Intézet Belső konzulens: Dr. Márialigeti Károly, ELTE TTK Mikrobiológiai Tanszék
vírusok Obligát, intracelluláris paraziták DS vagy RS Egyszálú vagy kétszálú Külső kapszid fehérje alegységekből Szimmetria agyon kis méret: 25-100nm Élő gazdasejten kívül IERT 2010. június 9. KDI beszámoló 2
Vírusok a természetes vizekben Enterálisan ürülő vírusok nagy mennyiségben ürülnek Több, mint 100-féle 10 9 partikulum/1g széklet Fertőzöttek és tünetmentes hordozók Szennyvízkezelésnek ellenálló vírusok Szennyvízzel kontaminálódhatnak Természetes vizek (tavak, folyók) Rekreációs célra használt vizek Ivóvíz Öntözésre használt vizek talajvíz, növények 2010. június 9. KDI beszámoló 3
vírusok átviteli lehetőségei (Hurst és mtsai., 2002 nyomán) 2010. június 9. KDI beszámoló 4
vizsgált vírusokról denoviridae (HdV) dsds vírus Humán d 6 csoport: -F Vízben leginkább F: d40, d41 Hányás, hasmenés Továbbá C: d2, d5 Főként légúti megbetegedések incs szezonalitása, de csak gyermekeknél, időseknél és immunszuppresszáltaknál vált ki megbetegedést Caliciviridae +ssrs vírus 2 humán genus: orovirus, Sapovirus em bakteriális gastroenteritis járványok 70-90%-át okozhatják (kortól függetlenül) winter vomiting disease Változatos terjedési út: kontaktus, széklet, aerosol, szennyezett víz, élelmiszer Picornaviridae +ssrs vírus http://www.worsleyschool.net Enterovirus (EV) Legtöbb fertőzés enyhe vagy tünetmentes lefolyású, de olykor fatális kimenetelű is lehet Megbetegedések széles spektruma http://www.defendingfoodsafety.com 2010. június 9. KDI beszámoló 5
Rutin víruskimutatás vízből? Klinikai minták Vízminta Koncentrálás Rutin vízvizsgálat Víruskimutatás vízből Méretkorlát és tenyészthetőség Mikrobiológiai indikátorok (Escherichia coli, intesztinális enterococcusok, fágok) Humán patogén (enterális) vírusok Szerkezeti felépítés rezisztencia Molekuláris Klasszikus víruskimutatás Kivitelezhetőség, költség, kórokozóképesség 2010. június 9. KDI beszámoló 6
Célkitűzések dszorpciós/elúciós víruskoncentrálási módszerek adaptálása magyarországi felszíni vizekre ( Virobathe protokoll alapján), illetve vírus nukleinsav kivonás a kapott koncentrátumból továbbá az azt követő víruskimutatás vírus specifikus polimeráz láncreakcióval (PCR) és szekvencia elemzéssel két koncentrálási módszer hatékonyságának összevetése Emberi kórokozó vírusok kimutatása magyarországi felszíni- és fürdővízmintákból víruskimutatást befolyásoló tényezők vizsgálata Eredményeink összehasonlítása a vízmikrobiológiai indikátorvizsgálatok eredményeivel 2010. június 9. KDI beszámoló 7
Mesterséges fürdővíz: = 7 Mintavételi helyek ETEROVÍRUS POZITÍV YGOK JÚLIUSB ÉS UGUSZTUSB Enterovírus Serologically verified tick-borne Budapest, Dráva utca & Petőfi híd & Csepel Rózsa utca Jászberény, 2db forgatott vizű Jászapáti, töltő-ürítő Természetes fürdővíz: = 5 Felszíni víz: = 9 Kőtelek, forgatott vizű agykörű, Tisza Győr, Mosoni- Duna Koloska és Kékipatak Rákóczifalva, Tisza Rákócziújfalu, Tisza Túrkeve, töltő-ürítő Tiszaliget, töltőürítő Szeghalom, Berettyó Tiszakécske, Tisza Csongrád, Tisza Tiszaföldvár, töltő-ürítő Gyoma, Hármas- Körös Körösladány, Sebes-Körös 2010. június 9. KDI beszámoló 8
nyag és módszerek - koncentrálás Kiindulás: 10 L vízminta ph állítása 3,5-re dszorpció: Membránfilter Üveggyapot Elúció: ph 9,5 húskivonat Flokkulálás: 1 HCl Ülepítés: Centrifugálás 7000xg Víruskoncentrátum: Üledék feloldása 10mL foszfát pufferben 2010. június 9. KDI beszámoló 9
nyag és módszerek - detektálás ukleinsav kivonás: Mágneses szilikagyöngy technika PCR: denovírus spec Enterovírus spec orovírus spec Detektálás: Gélelektroforézis Pontos meghatározás: Szekvenáló reakció, szekvencia elemzés és adatbázisba illesztés 2010. június 9. KDI beszámoló 10
denovírus eredmények egatív; 11; 31% Pozitív; 6; 50% egatív; 6; 50% Pozitív; 24; 69% Természetes fürdővíz; 12 = 61 Medencés fürdővíz; 14 Egyéb felszíni víz; 35 Pozitív; 9; 64% egatív; 5; 36% 2010. június 9. KDI beszámoló 11
orovírus eredmények egatív; 11; 92% egatív; 19; 54% Pozitív; 16; 46% Pozitív; 1; 8% Természetes fürdővíz; 12 = 61 Egyéb felszíni víz; 35 Pozitív; 7; 50% Medencés fürdővíz; 14 egatív; 7; 50% 2010. június 9. KDI beszámoló 12
Vízminta típusok Vírusok aránya a különböző víztípusokban Medencés fürdővíz 35,71% 50,00% 64,29% 78,57% Természetes fürdővíz 8,33% 8,33% 50,00% 50,00% Egyéb felszíni víz 45,71% 45,71% 68,57% 68,57% 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% Pozitív minták % denovírus pozitív Legalább az egyik vírusra pozitív orovírus pozitív Mindkét vírusra pozitív 2010. június 9. KDI beszámoló 13
Koncentrálási módszerek összevetése Üveggyapot Membránfilter denovírus kimutatás denovírus pozitív; 62,50% denovírus pozitív; 59,38% denovírus negatív; 37,50% denovírus negatív; 40,62% 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% orovírus kimutatás = 32 Üveggyapot orovírus pozitív ; 43,75% orovírus negatív ; 56,25% Membránfilter orovírus pozitív ; 37,50% orovírus negatív ; 62,50% 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% 2010. június 9. KDI beszámoló 14
Enterovírus eredmények Minden mintasorozat mellett ECHO11 vírusizolátummal elegyített csapvíz koncentrálása (pozitív kontroll) Vírusdetektálás specifikus RT-PCR-rel (Puig et al., 1994) három nukleinsav hígításban Minden esetben visszanyerhető volt a vírus Valós mintákon (szennyvízvizsgálattal) is bizonyított az új módszer hatékonysága 2010. június 9. KDI beszámoló 15
Szekvenciaelemzés pozitív PCR termékek nukleotid sorrendjének vizsgálata kimutatta, hogy a minták humán adenovírusokat (d2, 5, 12, 40, 41) és humán calicivírusokat (norovírus GGII) tartalmaztak kromatogramok sokszor kevert szekvenciákra utaltak genus specifikus PCR Klónozással lehetne elválasztani és külön vizsgálni 2010. június 9. KDI beszámoló 16
PCR optimalizálási kísérlet Redukálószerek alkalmazása DTT Diszulfid-hidak bontása DMSO DS másodlagos szerkezetének kialakulását gátolja em javították egyik vizsgált vírus kimutathatóságát sem denovírus eredmények Enterovírus eredmények DMSO DTT+DMSO 2010. június 9. KDI beszámoló 17
Víruskimutatást befolyásoló tényezők Inhibítorok Koncentrálás szintjén ukleinsav kivonás szintjén PCR során Sokszor olyankor is lehetett a 10 és a 100 hígítású nukleinsav koncentrátumból detektálni a vírust, amikor a töményből nem Ez utal a vírusmennyiségre is Huminsav 2010. június 9. KDI beszámoló 18
Mintaszám Mennyiségi meghatározás 14 12 10 8 6 4 2 0 2 2 1 2 1 2 2 2 2 1 2 2 2 1 1 3 1 1 1 1 10 100 Σ pozitív Σ vizsgált Jászberény2 Jászapáti Túrkeve Kőtelek Rákóczifalva Csongrád ukleinsav hígítása 2010. június 9. KDI beszámoló 19
Csongrád Tiszakécske Gyomaendrőd Körösladány Szeghalom Győr, Mosoni-Duna Koloska Kéki-patak Dráva utca ősz Petőfi híd ősz Csepel ősz Dráva utca tél Petőfi híd tél Csepel tél Dráva utca tavasz Petőfi híd tavasz Csepel tavasz Dráva utca nyár Petőfi híd nyár Csepel nyár agykörű Rákócziújfalu Rákóczifalva Tiszaliget Tiszaföldvár Kőtelek Túrkeve Jászberény 1 Jászberény 2 Jászapáti CFU/100mL Vízmikrobiológiai indikátorok és a vírusok 100000 10000 1000 100 10 1 : norovírus pozitív : adenovírus pozitív = 30 Vízminták E. coli Enterococcus sp. szomatikus colifág 2010. június 9. KDI beszámoló 20
Összefoglalás I. vizsgált minták 64%-a adenovírus, 39%-a norovírus pozitivitást mutatott denovírusok rendkívül ellenállóak és egész évben ürülnek medencés fürdővízminták ~80%-a, a természetes fürdővízminták fele és az egyéb felszíni vízminták ~70%- a tartalmazott legalább egyféle humán patogén vírust két alkalmazott koncentrálási módszer közül számos szempontból (visszanyerés eredményessége, gyorsaság, költség) hatékonyabb az üveggyapot tölteten történő koncentrálás Enterovírus kimutatás hatékonysága bizonyított a koncentrálási pozitív kontroll- és szennyvízvizsgálattal z új módszer adaptálása folyamatban van valós (fürdővíz)mintákra 2010. június 9. KDI beszámoló 21
Összefoglalás II. z eddigi szekvenciaelemzések alapján minták humán adenovírusokat és calicivírusokat tartalmaztak Szennyvízminták esetében a redukálószerek hozzáadása nem segítette elő a kimutatást víruskimutatást gátló anyagokra utal, hogy többször csak a hígított nukleinsav koncentrátumból lehetett kimutatni a vírus-nukleinsavat Következtetések tehetőek kvalitatív PCR alapján vírusmennyiségre, a kvantitatív PCR beállítása folyamatban van vírusjelenlétet sokszor nem jelzik sem az indikátor baktériumok, sem a szomatikus colifágok megbízhatóan 2010. június 9. KDI beszámoló 22
Kitekintés Új víruskoncentrálási módszer adaptálása (tanulmányutakon szerzett tapasztalatok alapján) víruskoncentrálást és kimutatást gátló anyagok mennyiségének csökkentése lkalmazott PCR-k további optimalizálása Enterovírus, hepatitis vírus és rotavírus kimutatás Kvantifikálás Visszanyerés hatékonyságának meghatározása Klasszikus víruskimutatási technikák alkalmazása Infektivitás nyomon követése Mintaspektrum kiszélesítése Állóvizek Magyarország számos részéről 2010. június 9. KDI beszámoló 23
témában megjelent közlemények Tudományos előadások Kern nita, Bánfi Renáta, Kádár Mihály, Vargha Márta: Közegészségügyi szempontból jelent s vírusok a magyarországi felszíni vizekben, Magyar Higiénikusok Társaságának Vándorgyűlése, Balatonvilágos, 2009. 10. 6-8. Vargha Márta, Christopher u-yeung, Barna Zsófia, Bánfi Renáta, Kern nita, Kádár Mihály: Európa-fürdés - Epibathe: a felmérés hazai eredményei; Magyar Higiénikusok Társaságának Vándorgyűlése, Balatonvilágos, 2009. 10. 6-8. nita Kern, Renáta Bánfi, Mihály Kádár, Márta Vargha : Prevalence and seasonality of human viruses in Hungarian rivers; Second Central European Forum for Microbiology, Keszthely, 2009.10.07-09. Külföldi tanulmányutak 2010. március 7-18. Short Therm Scientific Mission: University of Barcelona Department of Microbiology, Prof. Rosina Girones 2010. május 10-14. Training course in food and environmental virology: University of Patras, Prof. postolos Vantarakis 2010. június 9. KDI beszámoló 24