Egy antifungális diszulfid fehérje szerkezeti dinamikája és hideg/meleg kitekeredése (avagy PAF, a hűvös sárkány)

Hasonló dokumentumok
Pályázat címe: Struktur und Funktion des antifungalen proteins PAF aus Penicillium chrysogenum. Beszámoló/Eredmények

Fehérjeszerkezet, fehérjetekeredés


Szimulációk egyszerősített fehérjemodellekkel. Szilágyi András

NMR a peptid- és fehérje-kutatásban

ERD14: egy funkcionálisan rendezetlen dehidrin fehérje szerkezeti és funkcionális jellemzése

DNS, RNS, Fehérjék. makromolekulák biofizikája. Biológiai makromolekulák. A makromolekulák TÖMEG szerinti mennyisége a sejtben NAGY

6. Zárványtestek feldolgozása

A fehérjék térszerkezetének jóslása (Szilágyi András, MTA Enzimológiai Intézete)

A fehérjék harmadlagos vagy térszerkezete. Még a globuláris fehérjék térszerkezete is sokféle lehet.

A fehérjék hierarchikus szerkezete

Biomolekuláris szerkezeti dinamika

Fehérjék nyomás által indukált szerkezetváltozásainak jellemzése infravörös és fluoreszcencia spektroszkópiai módszerekkel

Spontaneitás, entrópia

KÖLCSÖNHATÁS ÉS DINAMIKA. az NMR spektroszkópia, mint a modern szem. Bodor Andrea

PAPP DÓRA. Amiloid szerkezetek stabilitásvizsgálata fehérjékben

ÖNSZERVEZŐDŐ AMFIFILIKUS OLIGOMEREK

Rendezetlen kondenzált fázisok tulajdonságainak vizsgálata számítógépes szimulációs módszerekkel

A fehérjék szerkezete és az azt meghatározó kölcsönhatások

Spontaneitás, entrópia

TERMÉSZETTUDOMÁNY JAVÍTÁSI-ÉRTÉKELÉSI ÚTMUTATÓ

FEHÉRJÉK A MÁGNESEKBEN. Bodor Andrea ELTE, Szerkezeti Kémiai és Biológiai Laboratórium. Alkímia Ma, Budapest,

Felületi feszültség és viszkozitás mérése. I. Felületi feszültség mérése. Felületi feszültség mérés és viszkozimetria 2. Fizikai kémia gyakorlat 1

2. A hőmérő kalibrálása. Előkészítő előadás

Környezetvédelmi mérések fotoakusztikus FTIR műszerrel

K68464 OTKA pályázat szakmai zárójelentés

dr. Molnárné Hamvas Lívia

4. FELADATSOR ( )

Ez mit jelent? Ahány könyv annyi interpretáció, annyi diszciplína kerül bele.

A természetes folyamatok iránya (a folyamatok spontaneitása)

Mai témák. Fehérjék dinamikájának jelentősége. Számítógépes modellezés jelentősége

Makromolekulák. Fehérjetekeredé. rjetekeredés. Biopolimer. Polimerek

KORONKA DÁNIEL. Poli(poli(etilén-glikol)-metil-éter-metakrilát-ko-Nvinilimidazol) kopolimerek előállítása és tulajdonságaik vizsgálata

ozmózis osmosis Egy rendszer termodinamikailag stabilis, ha képződése szabadentalpia csökkenéssel jár, állandó nyomáson és hőmérsékleten.

40-es sorozat - Miniatûr print-/ dugaszolható relék A

Fehérjék nyomás által indukált szerkezetváltozásainak jellemzése infravörös és fluoreszcencia spektroszkópiai módszerekkel

Fizikai alapú közelítő dinamikus modellek

Szerkesztette: Vizkievicz András

kutatás során legfőbb eredményeinket a szerin proteázok aktiválódásának mechanizmusával és az aktiválódás fiziológiai következményeinek

International Solar Technology, Inc. IST vákumcsöves napkollektor rendszerek

A vas-oxidok redukciós folyamatainak termodinamikája

Röntgendiffrakció, tömegspektrometria, infravörös spektrometria.

1. A röntgensugárral nyert interferencia kép esetében milyen esetben beszélünk szórásról és milyen esetben beszélünk diffrakcióról?

SZABÁLYOZHATÓ DC TÁPEGYSÉG DPD SOROZAT

A sejtek élete. 5. Robotoló törpék és óriások Az aminosavak és fehérjék R C NH 2. C COOH 5.1. A fehérjeépítőaminosavak általános

Fizikai kémia és radiokémia labor II, Laboratóriumi gyakorlat: Spektroszkópia mérés

Csökkentse minimálisra fázisvezérelt és TOFD készülékekre költött kiadásait

Bioinformatika előad

Hegesztő és bevonatoló rendszerek Áttekintés

Adalékanyagok kőzetfizikai tulajdonságai

15kA / EN szerint Kioldási jelleggörbék: Védettség: elõlapon (piros/zöld érintkezõnként) Csatlakoztatható vezeték: 1-25mm 2

CSOPORT CSOPORT CSOPORT

A nukleinsavak polimer vegyületek. Mint polimerek, monomerekből épülnek fel, melyeket nukleotidoknak nevezünk.

MŰANYAGFAJTÁK. Új olefin blokk-kopolimerek előállítása posztmetallocén technológiával

7. VIZES OLDATOK VISZKOZITÁSÁNAK MÉRÉSE OSTWALD-FENSKE-FÉLE VISZKOZIMÉTERREL

Gyors, multidimenzionális mérések adaptálása és tesztelése a p53 fehérje rendezetlen TAD régiójának esetében

Biofizika tesztkérdések

2.4 Fizika - Elektromosságtan Elektromos vezetés. Vezetési folyamatok szilárd testekben

ÚJ ELJÁRÁS KATONAI IMPREGNÁLT SZENEK ELŐÁLLÍTÁSÁRA

K=1, tiszta anyagokról van szó. Példa: víz, széndioxid. Jelöljük a komponenst A-val.

3. Sejtalkotó molekulák III.

Termodinamikai rendszerek. Kalorimetria. Extenzív és Intenzív mennyiségek. Hőkapacitás, fajhő Mennyi a felvett hő?

Általános megjegyzések

Lincoln Electric EMEAR Lincoln Electric EMEAR SPEEDTEC 215C. Multifunkciós, egy fázisú, kompakt inverter. BK rev01

Fehérjék rövid bevezetés

A termikus degradáció hmérsékletének hatása a kémiailag stabilizált gumibitumenek tulajdonságaira

Termikus analízis alkalmazhatósága a polimerek anyagvizsgálatában és jellemzésében

A projekt eredetileg kért időtartama: 2002 február december 31. Az időtartam meghosszabbításra került december 31-ig.

Digitális helyzetkijelző. Digitális tolómérő. Gép vízmérce

Fővállalkozó: TELVICE KFT. A projekt címe: Egységesített Jármű- és mobilgépek képzés- és tananyagfejlesztés

Hatékony tumorellenes készítmények előállítása target és drug molekulák kombinációjával (Zárójelentés)

AZT 3/0 AUTONÓM ZÁRLATI TARTALÉKVÉDELEM AZT

Tapasztalatok a fűtés és a hűtés összekapcsolásával az élelmiszeriparban

Biológiai makromolekulák szerkezete

A KAR-2, egy antimitotikus ágens egyedi farmakológiájának atomi és molekuláris alapjai

Peptid- és fehérjék másodlagos-, harmadlagos- és negyedleges szerkezete

Fehérjeszerkezet, és tekeredés. Futó Kinga

A REAKCIÓKINETIKA ALAPJAI

ELEKTROFORÉZIS TECHNIKÁK

Kationos tenzidek membrán affinitásának jellemzése lipid monoréteg modell segítségével





















Átírás:

Egy antifungális diszulfid fehérje szerkezeti dinamikája és hideg/meleg kitekeredése (avagy PAF, a hűvös sárkány) Batta Gyula Debreceni Egyetem Szerkezeti Biológiai és Molekuláris Felismerési Műhely structbiol.unideb.hu (a Magyar Tudomány Ünnepe, 2012. nov. 8)

Program antimikrobiális peptidek a PAF térszerkezete (NMR) diszulfid híd mintázat belső dinamika hőmérsékleti kitekeredés

Az antimikrobiális peptidek (AMP) új, fertőzés-elleni terápiás stratégiát kínálnak Robert E W Hancock & Hans-Georg Sahl NATURE BIOTECHNOLOGY 24 (12) 2006. 1551 Baktérium: töltött membrán célpont

A gazdaszervezetet védő peptidek működése Robert. E W Hancock, Hans-Georg Sahl, NATURE BIOTECHNOLOGY 24 (12) p 1551 2006

Mintegy ezer AMP változat ismert

Az AMP-k pozitívan töltöttek (PAF: Lys=25%) (de sok bennük az apoláros csoport is) a rendezetlen és a globuláris fehérjék határmezsgyéjén várhatók Vladimir N. Uversky : Intern. J. Biochemistry & Cell Biology 43 (2011) 1090 1103

Miért éppen a PAF? Penicillium chrysogenum termeli. Antifungális aktivitás mm koncentrációban. Aspergillosis elleni terápia? Rendkívüli stabilitás (évekig, oldatban). Emlősökre veszélytelen. Mini PET Palicz Zoltán Szentesi Péter Csernoch László (Egészséges kontroll, nincs PAF) Egészséges kontroll, van PAF

A Penicillium chrysogenum antifungális fehérje (PAF, pdb kód: 2kcn) szignál-szekvencia pro-szekvencia MQITTVALFLFAAMGGVATPIESVSNDLDARAEAGVL érett fehérje 1 AKYTGKCTKSKNECKYKNDAGKDTFIKCPKFDNKKCTKDNNKCTVDTYNNAVDCD 55 szekretált protein 5 antiparallel -szál 6 cisztein (3 S-S híd) feltekeredett, rendkívül stabil 13 lizin, pozitív össztöltés Batta et al, FEBS J 276, 2875 (2009)) interakciók a hurkokban

A PAF in-vitro, oldatbeli szerkezete (NMR ) erősen konzervált, lizinben gazdag (13) kationos felület flexibilis hurkok Lys48 Lys46 Lys32 Lys27 Lys35 Lys27 Lys9 Lys11 Lys15 Lys39 Lys9 Lys11 Lys22 Lys6 Lys17 Lys38 Lys6 Lys17

A fehérjékre vonatkozó Chargaff szerű szabály (Mittal, 2010) szerint a diszulfid hidak nélküli (redukált) PAF nem tekeredhet fel

A diszulfid mintázat meghatározása a PAF esetében 1. Az S-S kötések száma könnyen megadható tömegspektrometriával (minden S-S kötés csökkenti (DM=2) a móltömeget). 2. Cys 13 C- NMR kémiai eltolódások jellemzők az oxidált állapotra. 3. A PAF rendkívül stabil, nehezen emészthető, MS kritikus (Kele Z.). 4. A hidrofób magban a hasonló C -C távolságok (NMR, NOE) megengednek konkurrens mintázatokat. 5. Új NMR korlátok ( 13 C adatok, RDC, S 2 ) és a molekula-dinamika kombinációja segíthet (Gáspári Z.). Cys 2 H- jelzés, egzakt NOE? 6. Szeleno-cisztein mutáció (a 77 Se NMR-aktív) rekombináns technológiával vagy szintézissel (Váradi Gy.) nem könnyű.

A PAF szerkezetigazoló kémiai szintézise (Váradi Györgyi és Tóth Gábor) A konkurrens abbacc mintázat megvalósult, de nem azonos a PAF-al.

A lineáris PAF sikeres szintézise után oxidatív feltekeredés > natív PAF piros=szintetikus PAF piros=szintetikus PAF zöld = natív PAF szürke=natív PAF 1 H-NMR spektrumok, amid NHrégió 13 C-HSQC NMR spektrumok, Me régió Váradi, G.; Batta, G.; Kele, Z.; Galgóczi, L.; Tóth G.K. J. Pept. Sci. 18 Suppl: 1 S68 (2012) (módszer: Szabó, I.; Schlosser, G.; Hudecz, F.; Mező, G. Pept. Sci. 2006, 88, 20)

Egyszeres cisztein mutánsok (P. pastoris: C7S, C14S, C54S) A P. pastoris PAF azonos a natív PAF-al azonban a C-mutánsok nincsenek feltekeredve, többnyire dimerek: csak a C54S aktív (~ 50%) monomer-dimer keverék (MS).

Dupla cisztein mutánsok az abcabc minta szerint P. pastoris [ C7S,C36S; C14S,C43S; C28S,C54S ] C7S,C36S C28S,C54S Az egy diszulfid híddal szegényített mutánsok sincsenek feltekeredve: terv: oxidatív feltekeredés kikényszerítése

Az irreverzibilis PAF hőmérsékleti denaturáció (3h, 90 o C) inaktív oligomereket (tetramerig) eredményez (MS, HSQC, DOSY)

Az S 2 (dinamikai) rend paraméterek és az NMR korlátok (NOE, RDC, 13C-shift, J) egyidejű alkalmazása (GROMACS molekula dinamika, Gáspári Z.) Nincs S-S híd, 3 x S-S híd, abbacc, 3 x S-S híd, abcabc, Konkurrens diszulfid híd minták (5x3=15) abcabc abbacc abbcac 7-36 7-36 7-43 14-43 14-28 14-28 28-54 43-54 36-54 MUMO method, Richter et al. J. Biomol. NMR 37, 117, 2007

A PAF NMR dinamikája 15 N (T 1,T 2, NOE) alapján monomer: t c = 3 ns Kísérleti és várt rend parméterek Redukált spektrális sűrűségek Kísérlet: S 2 =0.81 ± 0.05 Számított (RCI) S 2 =0.84 ± 0.06 http://wishart.biology.ualberta.ca/rci/cgi-bin/rci_cgi_1_e.py

A redukált spektrális sűrűségek sem jeleznek cserét (31 o C) J wn = f (J o )

A konformációs (tor)túra lehetséges állomásai: (a natív (aktív?) szerkezet metastabilis!) F Ulrich Hartl & Manajit Hayer-Hartl : Nature Structural & Molecular Biology 16, 574-581 (2009) a fehérje sajátságaihoz az energia tájkép is hozzá tartozik J. Balbach, 2011

Fehérjék hideg (reverzibilis) kitekeredése Gyakorlati jelentőség: biokémikusok, spektroszkópusok élelmiszeripar Tudományos jelentőség: termodinamika, új molekuláris felismerési modellek Privalov PL, Critical Reviews in Biochem. and Mol. Biol. 25, 281-305 (1990) Cordes MH, Lectures, University of Arizona Temussi PA, JACS, 2007/5374 2008/9963 2009/11662 Wand J, Nat. Struct. Mol.Biol. 2004/352

Natív és denaturált állapotok denaturált ensemble kitekeredett ensemble natív állapot feltekeredett állapot sok különböző szerkezet fluktuál; nem nagyon kompaktak; rendezetlenek, de nem is random coil egyetlen szerkezet, vagy nagyon hasonló szerkezetek ensemble-ja kompakt Sok fehérje esetén, (de nem mindegyik), ez a folyamat megfordítható, és populált közbenső állapot nélkül valósul meg -> két-állapotú feltekeredés

A kitekeredés termodinamikája A kitekeredés szabad energiája bonyolult módon függ a hőmérséklettől (T). Az entalpia és az entrópia is hőmérsékletfüggő. A hőmérsékletfüggést a hőkapacitással írjuk le (DC p ). DH u = DH u0 + DC p (T T 0 ) DS u = DS u0 + DC p ln (T/ T 0 ) entalpia és entrópia hőmérséklet függőek DG u = DH u 0 TDS u0 + DC p [T T 0 T ln (T/ T 0 )] beszámít a teljes szabad energiába (Gibbs potenciálba) T 0 önkéntes referencia hőmérséklet, DH u0 és DS u0 az entalpia és entrópia ezen a hőmérsékleten Becktel & Schellman, Biopolymers 26, 1859 (1987).

A kitekeredett fehérje mennyisége f u (T) DG u a T függvényében DG u = DH u,tm (1 T/ T m ) + DC p [T T m T ln (T/ T m )] K u = exp(-dg u /RT) = [U]/[F] K eq a kitekeredési reakcióra f u = K u / (1 + K u ) Kitekeredett frakció A ki-és feltekeredett frakciók cc. aránya Egymásba ágyazott egyenletek

T c --> hideg denaturálódási hőmérséklet, általában fagyáspont alatt 1 10 4 Fehérjék stabilitási görbéi a fehérjék nem túl stabilak: (5-20 kcal/mol szobahőmérsékleten) 5000 általában szobahőm. körül maximális a stabilitásuk 0, cal/mol -5000 G u D -1 10 4-1.5 10 4 a nagyobb hőkapacitású fehérjék parabolája szorosabb és meredekebb (vörös görbe) 260 280 300 320 340 360 380 temperature Hőmérséklet (K) T m --> ezen a hőmérsékleten egyenlő a ki-ill. feltekeredett forma populációja --> DG u = 0 A nagyobb stabilitáshoz alacsonyabbt m. tartozik.

A fehérjék hideg kitekeredésének magyarázata (Privalov) A fehérje apoláros csoportjainak erősen hőmérsékletfüggő kölcsönhatása a vízzel. Ezen csoportok hidratációja termodinamikailag kedvező. A hidratáció Gibbs szabad energiája negatív és a hőmérséklet csökkenéssel növekvő mértékű. Alacsony hőmérsékleten a fehérje a belső apoláros csoportokat a víz oldószer felé mozgatja.

1 H- 15 N NMR HSQC spektrumokban változó az NH jelek térfogata a 265-344 K hőmérséklet tartományban Hogyan adhat NMR sötét anyagot egy sziklaszilárd fehérje?

Néhány görbe, amely a feltekeredett forma populációját mutatja aminosavanként PAF residues 7-55, thermal unfolding 1 0.9 Folded fraction C7 0.8 T8 0.7 0.6 0.5 K9 0.4 D55 0.3 0.2 K11 D19 0.1 S10 D32 C54 0 260 270 280 290 300 310 320 330 340 T [K]

Egyéb kísérleti technikák összhangban a 15 N-NMR-el NMR 13 C-HSQC DSC-kalorimetria

Túlhűtés (supercooling) 1 mm-es kapillárisokban -5-8 o C-ig (puffer) - 15 N-HSQC spektrum kollapszusa nem észlelhető - a feltekeredett, natív forma populációja fokozatosan csökken - rendezetlen szerkezethez vezető totális kitekeredés nincs

Túlhűtés (supercooling) 1 mm-es kapillárisokban - 15 o C-ig (H 2 O) NOESY 1H-NMR a teljes kitekeredést nem engedik a diszulfid hidak

Hogyan magyarázhatók az NMR spektrumok? A fő konformer közepes-lassú cserében lehet az alternatív konformerekkel az NMR kémiai eltolódás különbség időskálán. Néhány, alacsony populációjú, nem natív szerkezet létezhet egyszerre, azonban ezek nem átlagolódnak egyetlen, kitekeredett konformerré - ezért a detektálási küszöb alatt maradnak. A kémiai eltolódások nem változnak ugrásszerűen a hőmérséklet függvényében (kísérleti tény). Nem lehet tiszta kéthelyű csere.

Konformációs csere tankönyvi példa (Hore, P.J.) (hirtelen kémiai eltolódás ugrás várható kéthelyű cserénél)

Három-helyű csere szimuláció: 1-x lassú, 2-3 változó #1 LB=20 Hz #1: 9.5 ppm, X=0.60 #2: 8.0 ppm, X=0.25 #3: 7.0 ppm, X=0.15 Exchange rates 1 2 and 1 3 : 1 Hz #2 #3 2 3 rates are below 1 Hz 100 Hz 200 Hz 500 Hz 1000 Hz 1500 Hz 2000 Hz 11.0 10.5 10.0 9.5 9.0 8.5 8.0 7.5 7.0 6.5 ppm

Három-helyű csere szimulációk: 1- x lassú, 2-3 közepes #1 LB=20 Hz #1: 9.5 ppm, X=0.60 #2: 8.0 ppm, X=0.25 #3: 7.0 ppm, X=0.15 Exchange rates 2 3 : 850 Hz #2, #3 1 2 and 1 3 rates are below 1 Hz 5 Hz 10 Hz 15 Hz 20 Hz 25 Hz 30 Hz 11.0 10.5 10.0 9.5 9.0 8.5 8.0 7.5 7.0 6.5 ppm Bruker, J. Rohonczy

Az 1 H kémiai eltolódások hőmérséklet függésének illesztése 3-állapotú modellel Illesztés (Ser-10): U1/U2 = const.

A 15 N kémiai eltolódások hőmérséklet függésének illesztése 3-állapotú modellel Illesztés (Lys-9) : U1/U2 = const.

Kettő vagy háromállapotú kitekeredés? Kétállapotú modell pl. K2, S10 and K11. Háromállapotú modell pl. C54 Fit of unfolded fraction, residues 2, 10,11 1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 260 265 270 275 280 285 290 295 300 305 310 315 T [ K ] kétállapotú modell, F U háromállapotú modellek: F I U F U1 F U2

Gibbs szabad-energia változás (DG) = f (T) [ kj / M ] Két csoport azonosítható a maximális stabilitású hőmérséklet szerint (kétállapotú modell szerint illesztve)

PAF kitekeredési régiók két-állapotú modellel illeszthető három-állapotú modellel illeszthető nem illeszthető nincs adat

Homológok: PAF és AFP ( hőre érzékeny egységeket piros pötty jelöli a PAF-ban)

Összegzés 1. Sok feltekeredett fehérje oldatfázisban reverzibilis, termikus egyensúlyban van a részlegesen kitekeredett konformerekkel. 2. A PAF esetében a totális hideg kitekeredés a diszulfid hidak miatt nem valósul meg. 3. A PAF korlátozott hideg kitekeredése az egész fehérjében szinkronizált, ellentétben a magas hőmérsékletűvel. 4. A PAF különböző régióinak termikus kitekeredését két és három állapotú modellekkel lehet leírni. 5. A PAF hőmérsékleti sokkra legérzékenyebb régiói nem konzerváltak és inkább a kétállapotú modellel követhetők.

Köszönet Barna Teréz Bodor Andrea (ELTE) Fizil Ádám Galgóczi László (Szeged) Gáspári Zoltán (PPKE) Gyémánt Gyöngyi Kele Zoltán (Szeged) Kövér Katalin Leiter Éva Florentine Marx (Innsbruck) Nyitrai Mónika Pócsi István Tomori Valéria Tóth Gábor (Szeged) Váradi Györgyi (Szeged) OTKA CK 77515 TÁMOP 421 B/09 Osztrák-Magyar Akció Alapítvány OMAA 79u1