Fotoreaktív vegyületek szintézise és tesztelése Zebrahalon, mint modellorganizmuson

Fotoreaktív vegyületek szintézise és tesztelése Zebrahalon, mint modellorganizmuson Diplomamunka biológus mesterszak Molekuláris Immunológiai és Mikrobiológia szakirány készítette: Vörös Gergely István témavezető: Dr. Málnási-Csizmadia András egyetemi docens ELTE Biokémia tanszék EÖTVÖS LORÁND TUDOMÁNYEGYETEM TERMÉSZETTUDOMÁNYI KAR BIOLÓGIAI INTÉZET Budapest, 2014

TARTALOMJEGYZÉK TARTALOMJEGYZÉK...1 BEVEZETÉS ÉS CÉLKITŰZÉS...3 1. RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE...5 2. IRODALMI ÁTTEKINTÉS...6 2.1. A FOTOREAKTÍV VEGYÜLETEK, ÉS FUNKCIÓS CSOPORTOK ÁTTEKINTÉSE...6 2.2. AZ AZIDÁLÁS KÜLÖNBÖZŐ LEHETŐSÉGEI...7 2.3 NA-CSATORNA ÁLTALÁNOS JELLEMZÉSE...8 2.3 A KÜLÖNBÖZŐ MOLEKULÁK FŐBB JELLEMZŐI...9 2.3.3 DIBUKAIN...9 2.3.4 CARBAMAZEPIN...9 2.3.5 RILUZOL... 10 2.4 ZEBRADÁNIO (DANIO REIRO)... 11 2.4.1 ZEBRADÁNIÓ FŐBB JELLEMZŐI... 11 3. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK... 12 3.1 ANYAGOK ÉS ESZKÖZÖK... 12 3.2 MÓDSZEREK... 12 3.2.1 MIKROSZKÓPIA... 12 3.2.2 TÖMEGSPEKTROSZKÓPIA... 13 3.2.3 HPLC... 13 3.2.4 AZIDÁLÁS... 13 3.2.5 HATÓANYAG KONCENTRÁCIÓ MEGHATÁROZÁSA... 14 3.2.6 FÉNYAKTIVÁLHATÓSÁG IN VITRO TESZTELÉSE... 14 3.2.7 HALAK KEZELÉSE... 15 3.2.8 A HATÓANYAGOK IN VIVO TESZTELÉSE... 15 4. KÍSÉRLETI EREDMÉNYEK... 16 4. 1. AZIDÁLT HATÓANYAGOK ELŐÁLLÍTÁSA... 16 4.1.1 AZIDO-DIBUKAIN... 16 4.1.2 AZIDO-KARBAMAZEPIN... 24 4.2 AZIDÁLT HATÓANYAGOK TESZTELÉSE A HALAK SZÍVVERÉSÉRE GYAKOROLT HATÁSA ALAPJÁN... 29 4.2.1 AZIDO-DIBUKAIN... 29 4.2.2 AZIDO-CARBAMAZEPIN... 29

4.2.3 AZIDO-RILUZOL... 37 4.3 AZ EREDMÉNYEK ÖSSZEFOGLALÁSA... 42 5. ÖSSZEFOGLALÁS... 44 6. SUMMARY... 46 7. IRODALOMJEGYZÉK... 48 8. KÖSZÖNETNYÍLVÁNÍTÁS:... 50 NYILATKOZAT... 51

BEVEZETÉS ÉS CÉLKITŰZÉS Ismert tény, hogy a különböző hatóanyagok felhasználásának gátat szabnak a hatásukkor mutatkozó keresztreakciók. Ez különösen olyan esetekben nehezen kezelhető, ha az adott molekulát a target kis affinitással köti, így a mellékhatások elnyomják a kiváltani kívánt reakciót. Ez a jelenség komoly gondot okoz a gyógyászatban is, elég csak ránézni az egy-egy gyógyszerhez tartozó mellékhatások listájára. Ennek kiküszöbölésére számtalan próbálkozás történt, ami új molekulák felfedezéséhez, illetve a génszabályozáson keresztüli vizsgálati módszerek robbanásszerű fejlődéséhez vezetett. Azonban sok esetben ez nem megoldás. Ilyen helyzet lehet, ha a vizsgálni kívánt jelenség még felderítetlen, vagy olyan szabályozási területet érint, aminek kiütése a vizsgált egyedre nézve még a vizsgálni kívánt jelenség kifejlődése előtt letális. Ezért szükségessé vált az új megközelítések bevezetése, és új, eddig ismeretlen vizsgálati módszerek kifejlesztése. Ilyen terület a különböző mikro RNS-ekkel végzett géncsendesítés, ami nagyon specifikus, de ismerni kell hozzá, a csendesíteni kívánt gének pontos szekvenciáját. Másik megközelítés lehet, az eddig is használt molekulák specificitásának növelése, azok biológiai, kémiai módosításával. Az így kapott molekulák tulajdonságai sok esetben megegyeznek a módosítatlan formákéval, azonban olyan új tulajdonságot kapnak, ami a vizsgálni kívánt jelenség felderítésében segítségünkre lehet. Erre példa az aril azidok azon tulajdonsága, hogy UV fény hatására kovalensen kötnek a célpontjukhoz. Ebből adódik a következtetés, hogy a gyűrűs hatóanyagokra integrált azid csoport segítségével nagy affinitású, és specifitású hatóanyagok hozhatók létre, melyek jóval a módosítatlan molekulák effektív koncentrációjánál alacsonyabb koncentráción is hatásosak lehetnek. Ennek oka az, hogy az UV fény hatására a molekulák feldúsulnak a sugárzásnak kitett területen. Új felfedezés továbbá, hogy kétfoton mikroszkópiával ezek a molekulák aktiválhatók, így már akár szubcelluláris pozicionálásuk is kiválthatóvá válik. Ennek sikeres tesztjei után új azidált hatóanyagok létrehozása mindenképp indokoltnak tűnt. Ennek keretében célul tűztük ki már ismert gyógyszerhatóanyagok azidált formájának létrehozását, kihasználva azt, hogy ezek a hatóanyagok hatásukat a feszültség függő Na-csatornák blokkolásán keresztül érik el, vagy a fő hatásterületükön kívül a Na csatornák áteresztőképességét is csökkentik. Az így kapott molekulákat teszteltük in vivo körülmények között. Választ kerestünk arra, hogy az azido-dibukain, az azido-riluzol, és az azidokarbamazepin hatása eltér-e a módosítatlan hatóanyagokétól. Vizsgáltuk továbbá, hogy fény 3

hatására megváltozik-e a módosított molekulák effektivitása. Célunk volt annak vizsgálata, hogy egymást követő több besugárzás erősíti-e a módosított molekulák hatását. 4

1. RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE PAL: Fotoaktív címkézés TTX: tetrasporoxin DMF: Dimetil-Formamid DMADE N - N -Dimetienl-diamin ACN: Acetonitril MS: Tömeg spektrométer HPLC Nagynyomású folyadék kromatográfia DMSO: Dimetil Szulfoxid TFA: Trifluor-acetát ALS: amiotrofiás laterális szklerózis 5

2. IRODALMI ÁTTEKINTÉS 2.1. A FOTOREAKTÍV VEGYÜLETEK, ÉS FUNKCIÓS CSOPORTOK ÁTTEKINTÉSE A fotoreaktív vegyületek fontos eszközei lehetnek az élettudományoknak, mivel pontosan időzített kovalens keresztkötéseket lehet velük létrehozni, a ligand és a célpontja között. ((1) A különböző fotoreaktív csoportokat a 60-as évek eleje óta használják a laborgyakorlatban anyagok és molekulák könnyebb detektálhatóságának érdekében. A laboratóriumi hasznosságukat a tömegspektrometria új értelmezése adja, aminek segítségével vizsgálni lehet a keresztkötéseket a fotoreaktív csoportok, és a biomolekulák között. Az elmúlt 50 évben széles körben felhasználták már a módszert a szerkezeti kémiai és funkcionális vizsgálatokban és a modern technikákkal ötvözve a fotoreaktív csoportok felhasználása, még mindig az egyik legfontosabb területe a biokémiának. Egy fotoreaktív jelölések, több feltételnek is meg kell felelnie a megfelelő felhasználhatósághoz. Fontos, hogy kémiailag inert legyen a fénykezelés kezdetéig, a fotofór aktiválódjon enyhe körülmények között, és az aktiváció ne okozzon sérüléseket a biológiai rendszerben, és annak alkotóiban. Fontos továbbá, hogy a gerjesztett állapot életideje a vizsgálat alatt rövidebb legyen, mint a receptor-ligaid, vagy egyéb vizsgált komplexek életideje, és, hogy képes legyen kovalens kölcsönhatásokat kialakítani a környező molekulákkal, és láncokkal. Szükség van arra is, hogy a jelölés ne befolyásolja a vizsgálni kívánt biológiai rendszert, és a létrehozott kovalens kötések ne okozzanak szignifikáns eltérést annak működésében. Szükség van továbbá arra, hogy a csoport jól detektálható legyen, ha ez nem teljesül, hozzákapcsolhatunk jelerősítő rendszert pl. radioaktív molekulákat építhetünk bele. A laborgyakorlatra létrehozott fotoreaktív molekulák nem felelnek meg minden feltételnek, azonban cél az, hogy minél jobban megközelítsük az ideális PAL-t. Ezen törekvésnek hála a fontosabb PAL-ok a feltételek nagy részének megfelelnek. A kiváltott fotoreakció minden esetben egy elektron-gerjesztési lépésen keresztül történik meg. A reakció során létrejön egy töltetlen rövid életidejű köztitermék, ami egyszeresen, vagy háromszorosan töltött, és ikerionos reakciómechanizmus szerint működik. A módszert sok területen fel lehet használni. Ilyen terület lehet a fotoreaktív hatóanyagok létrehozása is, de felhasználható, nukleotidok, lipidek jelölésére, glikokonjugátumok és membránszerkezet vizsgálatára is. (2) 6

2.2. AZ AZIDÁLÁS KÜLÖNBÖZŐ LEHETŐSÉGEI Az azidálás során egy azid csoportot helyezünk el, valamilyen, a biológiai gyakorlatban használt molekulán, általában organikus vegyületen, például különböző észtereken, vagy gyűrűs vegyületeken. (3) A szerves azidok előállítása fontos köztitermékei aminok és aminosavak új változatainak szintézisében, amik később a funkcionális, és szerkezeti vizsgálatokban felhasználhatók. A szintézis során azonban figyelembe kell venni, hogy az azidok előállítása során mérgező azid vegyületek is keletkezhetnek, így érdemes olyan módszereket választani, ahol ennek kockázata alacsony. (4) Az azidálási reakciók különböző körülmények között játszódhatnak le, ezek közül mutatunk most be néhányat. A reakciók között komoly különbségek lehetnek a katalizátor molekulában és a reakciókörülményekben. Egy viszonylag új módszert jelent az arany katalizálta azidálás. Ezeket az azidált alkének előállítására használták. A módszer előnye abban állt, hogy a korábbi elektrofil módszerekkel ellentétben nem volt szükség veszélyes reagensekre a reakció lejátszódásához. Ez fontos eredmény, mivel a nukleofil azidálószerek nem képesek közvetlenül átadni az azidcsoportot a reaktáns számára. (5) Lehetőség van az azidáció enantioszelektivitásának növelésére is. Ehhez vas katalizálta reakciót használhatunk a ma is használt azidáló szerek segítségével, mint NaN 3. ((6)) Fontos azonban megjegyeznünk, hogy ezek a módszerek főleg köztitermékek előállítására szolgálnak, azonban mi fény aktiválható formát hoztunk létre. Ehhez közvetlenül a gyűrűre kellett építenünk a csoportot. Emiatt egy 2005-ös publikáció alapján kezdtünk neki, amik segítségével aril-azidok előállítására nyílt lehetőség enyhe körülmények között. A detektálásban segített minket, hogy az aril vegyületük maguk is optikailag aktívak, így fotometriás módszerekkel követhető a szubtitució. A módszer során rézjodid és diamin katalizátorok segítségével állítunk elő aril-azidokat magas hozam mellett. A Nátriumaszkorbát pozitívan befolyásolta a konverziós hatékonyságot. Ha a kiindulási anyag ariljodid volt sok esetben a reakció szobahőmérsékleten is lezajlott. A létrehozott aril-azidok, mint pl.: a fenil-azid, sok esetben használhatóak fotoreaktív próbákhoz.(7) 7

1. ábra: A Fenil-azid egy feltételezett reakcióútja UV sugárzás hatására: Látható, hogy egy nitrin intermedieren keresztül halad a reakció, amit gyűrűátrendeződés követ, és egy újabb dehidroazepin köztesállapotot felvéve alakul tovább a kovalens kötésig 2.3 NA-CSATORNA ÁLTALÁNOS JELLEMZÉSE A Na csatornák inaktiválódása feltétlenül szükséges a sejtek helyes működésének. Az inaktiválódás több különböző módon történhet, ide értve a gyors, a lassú és a nagyon lassú inaktiválódást is. (8) Az eukarióta Nátrium és kalcium csatornák négy homológ azonban kismértékben különböző domainből állnak, szemben a bakteriális csatornáktól, amik pszeudotetramerek. Ez azt jelenti, hogy egy fehérje alkotja a csatorna négy egyforma alegységét. (9) A feszültség-függő Na-csatornák központi szerepet játszanak az akciós potenciál terjedésében az aktivált idegsejtek és a többi sejt között, emiatt komoly célpontja a helyi érzéstelenítőknek, az antiaritmiás és antikonkonvulziv készítményeknek. (10) A TTX független feszültség-függő ioncsatornák nem csak az idegrendszer, hanem a szív területén is és a harántcsíkolt izmok felületén is megtalálhatók. (11) A különböző ioncsatornák pontos szerkezetéről csak kevés információval rendelkezünk, mivel a kristályosításuk nagyon bonyolult. A működésükről és általános felépítésükről azonban indirekt módszerek alapján viszonylag átfogó képpel rendelkezünk. A bakteriális Na csatornák felépítése egyszerűbb, a homológia miatt mégis jó modelljei az eukarióta csatornáknak. Ezért volt nagy jelentősége a KvAP 2003-as röntgendiffrakciós meghatározásának. (12) Az ioncsatornák szerkezetéről csak prediktív információink vannak, melyeket a aminosav szekvenciájukból vezettünk le. Ezek alapján az eukarióta nátriumcsatorna 4 egymással homológ domainből épül fel, melyek transzmembrán régiói α-helikális szerkezetetüek. A transzmembrán régiókat feltételezhetően β-redők kötik össze. (13) 8

A NaV 1,5 fehérje, a szív fontos feszültség függő Na-csatornájának egyik alegysége, mely központi szerepet játszik az akciós potenciál terjedésében. Ennek legkisebb hibája is zavarokat okozhat a szív működésében. Mutációja hosszú QT periódust okoz. A működését befolyásoló fehérjéket 3 csoportba lehet sorolni. Adaptor és rögzítő fehérjék, melyek a rögzítésben játszanak szerepet. Enzimek amik a működést befolyásolják és szelektivitást befolyásoló fehérjék.(14) 2.3 A KÜLÖNBÖZŐ MOLEKULÁK FŐBB JELLEMZŐI 2.3.3 DIBUKAIN 2. ábra: Dibukain molekula szerkezeti képlete A Dibukain helyi érzéstelenítőkben használt gyógyszerhatóanyag, ami megfelelő koncentrációban alkalmazva gátolja az akciós potenciálok terjedését. A molekula egyike a legmérgezőbb helyi érzéstelenítőknek, közvetlen felhasználása kizárólag a spinális érzéstelenítésre korlátozódik. Bármilyen idegrostot, vagy idegrendszeri területet blokkolni lehet vele, mivel bénítja a motoros, és szezoros neuronokat az innervált területen. A hatása teljességgel visszafordítható. Mint a legtöbb helyi érzéstelenítő a hatását a feszültség függő, Na csatornák blokkolásával, azok hatásának csökkentésével éri el. (PubChem adatbázis ID: 3025(15)) 2.3.4 CARBAMAZEPIN 9

3. ábra: Karbamazepin szerkezeti képlete. A karbamazepin egy széles körben használt gyógyászati hatóanyag. Hatását feltehetőleg a Na csatornák feszültségfüggő blokkolásán keresztül éri el. Mivel nem kapcsolódik az opiát receptorokhoz nem addiktív, ezért előszeretettel alkalmazzák antiepilepticumként. Szerepet játszik még a bipoláris zavar mániás szakaszának kezelésében, valamint egyéb pszihopátiás tünet együttesek kezelésében is. (Pubchem ID 2554 (14)) (16) 2.3.5 RILUZOL 4. ábra: Riluzol szerkezeti képlete A Riluzol egy antikonvulzív (görcsoldó) Na csatorna blokkoló, és glutamát antagonista gyógyszerhatóanyag, ami felhasználható az amiotrofiás laterális szklerozis kezelésére.(17) Preferenciálisan gátolja a TTX-rezisztív Na-csatornákat. ((18), (19)). Bár elsődlegesen az AlS kezelésére használják, lehetséges, hogy szerepet játszik a gerincvelő regenerációjának előidézésében. Az ezzel kapcsolatos tesztek jelenleg az első klinikai fázisban vannak. (20) 10

2.4 ZEBRADÁNIO (DANIO REIRO) 5. ábra: Dani reiro fényképe 2.4.1 ZEBRADÁNIÓ FŐBB JELLEMZŐI A Zebradánió (Danio reiro Hamilton 1822) egy a legfontosabb gerinces modellorganizmusok közül. Egy kisméretű, robosztus hal, ami olcsón és nagy számban tartható laboratóriumi körülmények között. Ennek oka, hogy a felnőtt nőstények 2-3 naponta ívnak, egy-egy ívás során, néhányszáz petét rakva. A generációs idő gyors, tipikusan 3-4 hónap. Maga a pete viszonylag nagynak számít (0,7 mm átmérőjű, a fertilizáció után) a hasonló méretű halak között. (21); (22); (23)) Származási helye India észak-keleti része. A kifejlett állat 2-6 cm közötti méretet ér el. AZ ivarérett kort 1-1,5 cm testhossznál éri el. Élethossza átlag 42 hónap, az eddig megfigyelt leghosszabb életű egyed 66 hónapig élt. Kedvelt akváriumi fajta. (24) A fejlődésmenete gyors számunkra a pharingula fázis, és a kikelési periódus volt fontos ezek legfontosabb eseményeit összefoglaltuk: Pharingula fázis 24-48 óra A fázis legfontosabb eseménye a viscerális ívek megjelenése és kifejlődése. A periódus elején a hal mozgása még koordinálatlan, az egyes miotómok egymástól függetlenül mozognak. A fázis végére a mozgások összehangolódnak, úszómozgássá szerveződnek. A fázis alatt nagymértékű az idegszövet fejlődése. A periódus végére megjelenik és dobogni kezd a szív, kialakulnak a fontosabb erek. A pigmentsejtek megjelennek. Kikelési periódus: 48-72h 11

A periódus során a koponya átalakul, az úszóbimbók fejlődése felgyorsul, és kialakulnak az úszók. Megjelenik és kifejlődik a kopoltyú és a periódus végére hal kikel a peteburokból. Ezt a periódust a korai lárva stádium követi. (zfin.org, (25)) 3. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK 3.1 ANYAGOK ÉS ESZKÖZÖK Az általunk használt Dibukain-hidroklorid és a DMSO a Fluka cég, a 10-Br-Karbamazepint az Angent Int terméke. Az azido-riluzolt Dr. Málnási-Csizmadia Andrástól kaptuk, aki a Sigma-Aldrich Kft riluzolját használta a szintézis kiindulási anyagaként A HPLC-hez használt acetonitrilt a Fischer khem gyártotta. Az etanol a molar chemical kft-től érkezett. A többi vegyeszert a Sigma-Aldrich Kft készítette. A kísérletekben felhasznált halakat, és az E3 puffert Varga Máté laboratóriuma biztosította számunkra. A zebrahalak az ekkwill vadtípusú törzsbe tartoztak. A kísérletekhez Agilent 1100 sorozatu HPLC-vel választottuk szét. A tömegspektrométer színtén Agilent 1100-as sorozatú HPLC-hez volt kötve. A tömegspektométer a MasLynx aquity waters típusú SQ tömegdetektora volt. Az összekapcsolt gépeket a MassLynx szoftverével vezéreltük. Az analitikai vizsgálatokhoz phenomenex luna 150x2mm-es 5 mikronos oszlopait használtuk. A szemipreperatív elválasztáshoz phenomenex luna c1b 250x10 mm-es 5 mikronos oszlopokat alkalmaztunk. Ha szükséges volt a reakciómixek tisztításához SATRA Xl 100 mikronos reverz fázisú kromatográfiás oszlopait használtuk. A fényerősséget Laserliner LuxTest-Master készülékével mértük. 3.2 MÓDSZEREK 3.2.1 MIKROSZKÓPIA A kísérletekhez zeiss fluoreszcens sztereomikroszkópot használtunk. A fényképek 50xes nagyítással készültek, áteső fényben. A szívverés számoláskor a szív területét 100 x-os nagyítással vizsgáltuk. 12

3.2.2 TÖMEGSPEKTROSZKÓPIA A vizsgálatokat aquity waters HPLC-vel kapcsolt tömegspektroszkóppal végeztük. Oldószernek 50 %os acetonitril és 50 % víz keverékét használtunk. Mindkét anyaghoz 1 százalék TFA-t adtunk. A folyási sebességet 0,2 ml percenkénti sebességre vettük. Az egyes mintákat MS csövekbe töltöttük. Az oszlopra 5 µl mennyiségben vittünk fel mintákat. Ha szükséges volt a felvitt mintákat hígítottuk. A tisztaságellenőrzéseknél a mintákat a HPLC oszlop kikerülésével közvetlenül az MS-be lőttük be. A minták hígítását, ha szükséges volt a futtató puffernek megfelelő arányú acetonitrill-víz keverékével végeztük. A program alapesetben 15 percen keresztül futott, azonban a közvetlen fellövéseket 2 perces futásidővel vizsgáltuk. 3.2.3 HPLC A nagynyomású folyadékkromatogáfiát szemipreperatív módon használtuk a módosított anyagok szétválasztására. Oldószernek Acetonitril és víz 1 %-os TFA-val kevert elegyét használtuk az arányokat az adott kísérlethez optimalizáltuk, alapesetben 50-50%-os arányt vetünk fel. A folyási sebességet alapesetben 5 ml/percnek vettük. Az elválasztani kívánt frakciókat a kromatogrammon megjelenő csúcsuk alapján manuálisan szedtük le és falkon csövekbe gyűjtöttük. 3.2.4 AZIDÁLÁS Az azidált hatóanyagok előállítását halogén csoportkicserélési reakcióval végeztük. Ehhez első lépésben a módosítatlan molekulákat halogénezni kellett. Az eredeti hivatkozás (7) jód csoport hozzáadását javasolta, azonban mivel a jódozás az általunk használt vegyületek esetén nem volt megvalósítható, így bróm csoport beépítését tűztük ki célul. Ennek megvalósítására több lehetséges útvonal is kínálkozott, végül tesztek után a bróm reagenssel végzett közvetlen reakciót választottuk. A reakciót etanolos közegben végeztük. A reakciómix erősen savas kémhatású lett (ph 3-4) ezért az alacsony ph ellen NaOH hozzáadásával védekeztünk. A szintézisben használt NaOH-ból 10 M-os törzsoldatot használtunk. A reakció lejátszódott 13

szobahőmérsékleten is, azonban mikrohullámú reaktorban folyamatos kevertetés mellett gyorsítható volt. Ha szükséges volt a reakcióterméket SATRA XL reverz fázisú kromatográfiás oszloppal tisztítottuk. A kapott terméket szemipreperatív HPLC-vel választottuk szét, majd vákuum bepárlóval kristályosítottuk. A brómozott termék előállítása után került sor az azidálási reakcióra. A csoportkicserélési reakciós során NaN 3 volt az azid csoport forrása. Katalizátornak fémionok és diaminok felhasználásával kezdhettünk neki, végül mi az egy- vagy kétértékű Cu ion mellett döntöttünk. A reakció etanolos közegben történt. A reakcióhoz, ha szükséges volt, aszkorbinsavat és NaOH-t is adtunk. Az aszkorbinsavból 9,9 mg/ml-es koncentrációjú törzsoldatot készítettünk és a reakciókban ezt használtuk fel. Az azidálási reakciókban használt NaOH 50 mm-os koncentrációjú volt. A reakció nem ment végbe diamin jelenléte nélkül, erre a célra DMADE-t használtunk. Amennyire lehetséges volt, a reakciót argon alatt végeztük. A reakciót mikrohullámú reaktorban folyamatos kevertetés mellett játszattuk le a különböző szintézisek függvényében 50-70 C-os hőmérséklet tartományban. A reaktor teljesítménye 8-15 W volt. A szintetizált anyagokat szemipreperatív HPLC-vel választottuk el, majd vákuum bepárlóval kristályosítottuk. Ha a kristály újraoldása után szükséges volt, a további töményítést liofilizátorral végeztük. A reakciók részletes leírását a kísérleti eredmények fejezetben tárgyaljuk, mivel úgy gondoljuk, maga az előállítás útja is fontos eredményt jelent. 3.2.5 HATÓANYAG KONCENTRÁCIÓ MEGHATÁROZÁSA A hatóanyagok koncentrációjának meghatározásához ismert koncentrációjú oldatokból 5 lépcsős oldási sort készítettünk, majd mértük az abszorbanciájukat. Az ismeretlen minta koncentrációját a kapott értékek alapján számítottuk úgy, hogy az oldási sor értékeire egyenest illesztettünk és az egyenes egyenlete alapján határoztuk meg azt. 3.2.6 FÉNYAKTIVÁLHATÓSÁG IN VITRO TESZTELÉSE Az előállított azidokról el kellett döntenünk, hogy UV fény hatására elbomlanak-e. A bomlásból a fényaktiválhatóságra következtettünk. Ehhez UV lámpával 302 nm-en sugároztunk belőlük vett mintát. A törzsoldatokhoz képest 100-szoros hígítást alkalmaztunk. A sugárzás alatt az anyagból percenként mintát vettünk, és MS-el vizsgáltuk, hogy történt-e bomlás. A kísérletek 10 percig, vagy az azidált hatóanyag teljes elbomlásáig tartottak. Az 14

összes előállított hatóanyag fényaktiválhatónak bizonyult, azonban mivel a kísérleteket nem a munka szerzője végezte, így az eredmények között nincsenek feltüntetve. 3.2.7 HALAK KEZELÉSE A kísérletekhez használt embriókat Varga Máté laborjától kaptuk. A halak Ekkwill vadtípusú törzsbe tartoztak. A pigment sejtek blokkolását és a peteburok eltávolítását a Varga laboratórium végezte. A felhasználásig E3 pufferben tartottuk őket 40 ml-es falconcsőben. a halak áthelyezéséhez üvegpipettát használtunk, mivel a műanyag eszközökre a halak könnyen kitapadtak, és az eltávolításuk a sérülésükhöz vezetett volna. Az előre meghatározott térfogatot utólag állítottuk be. Ügyelni kellett arra, hogy az embriók kis mérete és törékenysége miatt ne szívjuk őket be az automata pipettákkal, így az oldatok eltávolítására a legmegfelelőbb a 200 µl-es automata pipetta volt. A halak sugárzására transzilluminátort használtunk. A kísérletek végén az embriókat jégen altattuk el. 3.2.8 A HATÓANYAGOK IN VIVO TESZTELÉSE Azidált hatóanyagok tesztelését 2 és 3 napos zebrahal embriókon végeztük. A kísérletekben a pigment sejtek kifejeződését PTU-val gátoltuk. A peteburkot eltávolítottuk. Az embriókat E3 pufferben tároltuk, 96 lyukú lemezen vizsgáltuk, egy lyukba 5 halat helyeztünk. Az üregekbe 200 µl-es térfogatot pipettáztunk a hatóanyagok az adott kísérlethez használt koncentrációjú oldatából. Az embriók áthelyezéséhez üvegpipettát használtunk, mivel a műanyag eszközökhöz hajlamosak voltak kitapadni. Vizsgáltuk, hogy a hatóanyagok módosítatlan és azidált formájának hatásspektruma változik-e. Ehhez különböző koncentrációkon vizsgáltuk a hatóanyagok halak szívverésére gyakorolt hatását. Vizsgáltuk továbbá, hogy az azidált hatóanyagok fény hatására effektívebbekké válnak-e. A kísérletben a halakat 1 percen keresztül 302 nm-es hullámhosszon sugároztuk transzilluminátor asztalon. Az asztal 6700 Lux fényintenzitású volt. A kontroll és a sugárzott halakat külön lemezen tároltuk. A szívverésüket 20 s-en keresztül számoltuk közvetlenül a besugárzás előtt, majd lecseréltük a puffert E3 hal pufferre és ez után közvetlenül, majd 10 és húsz perccel a besugárzást követően is számoltuk azt. A kísérlethez 1 mm-os koncentrációt választottunk, mivel az előzetes tesztek során ez a koncentráció már jól látható változásokat okozott az embriók 15

szívverésében, azonban a hatás esetleges erősödése vagy az UV sugárzás okozta szívveréscsökkenés következtében se kellett arra számítanunk, hogy mind a kontroll, mind a vizsgált csoport elpusztul. A kapott eredményeket a kontrollcsoport szívverésének százalékára normáltuk. A szórást ábrázoltuk. Vizsgáltuk még, hogy többször megismételve a kezelést növelhető-e az azidált forma hatása. Egy ciklusnak vettük az 1 perces besugárzástól az új hatóanyag hozzáadása közötti időszakot. Minden ciklus után hatóanyagot cseréltünk és az egyes minták esetén mindig 10 perccel a besugárzás után számoltuk a szívverést. A besugárzás után minden esetben E3 pufferbe helyeztük az embriókat, és az új hatóanyagot a szívverés számlálása után pipettáztuk a pufferbe. A kísérleteket 150 µm-os és 1mM-os koncentráción végeztük. Az ábrázolásnál a semmilyen kezelést nem kapó kontroll halak szívverésére normáltunk. 4. KÍSÉRLETI EREDMÉNYEK 4. 1. AZIDÁLT HATÓANYAGOK ELŐÁLLÍTÁSA 4.1.1 AZIDO-DIBUKAIN Az azido-dibukain előállításánál a kiindulási anyagunk dibukain-hidroklorid (továbbiakban dibukain) volt. Mivel az irodalmi adatok alapján (7)az aril-azidok legoptimálisabb kiindulási molekulái az aril-halogének, szükség volt a dibukain halogénezésére. A legjobb konverziós értékeket a fent említett cikkben aril-jodidokból kiindulva sikerült elérni, azonban a dibukain jódozott formáját nem tudtuk előállítani, ezért alternatív megoldásként bróm beépítését tűztük ki célul. A bróm csoport beépítésére, több lehetséges reagens is felmerült. Ezeket teszteltük. Először FeBr és FeCl keverékét használtuk Dimetil-Formamidban feloldva. A reakció pontos összetételét az 1. táblázat tartalmazza. A reakciótermékeket HPLC-vel kapcsolt tömegspektrométerrel elemeztük. A spektrogrammok tömegszámai alapján következtettünk a csoport beépülésére. Ezek alapján a reakció sikeres volt, azonban a csoportbeépülés nagyon alacsony hatékonyságon működött. A hatékonyságot a kromatogrammon megjelenő csúcs integráljának mérete alapján ellenőriztük, melyet a készülék kezelőszoftverével számíttattuk ki. 16

FeBr (mg) FeCl (mg) Dimetilformamid Dibukain (mg) a br- (ml) dibukainhoz tartozó csúcs integrálja 16,36 16,57 100 10 3584 12,01 24,57 100 10 3753 11,82 45,2 100 10 1588 24,21 12,24 100 10 3633 36,1 12,2 100 10 0 1. táblázat: Brómozási reakció FeBr és FeCl segítségével: A reakció során különböző arányokban adagoltuk a vas-bromidot és a vas-kloridot. A legjobban sikerült reakciót kiemeltük. A csúcsintegrál értéke 3753 volt. Következő lépésben a bróm reagenssel végzett közvetlen reakciót próbáltuk ki etanolos közegben. A reakcióhoz 96%-os etanolt használtunk. A direkt reakció hozama magasabb volt, így a későbbiekben ezt az útvonalat használtuk, azonban a reakció további optimalizálást igényelt. Először a reakcióhoz használt összetevők arányain és a reakciókörülményeken próbáltunk változtatni. A pontos összetételeket, és a reakciókörülményeket a 2. táblázat tartalmazza. A reakció során két bróm-dibukain izomer keletkezett, ezeket a továbbiakban A és B formának neveztük. Ahol feltűntettük, a két csúcs integrálösszegét jeleztük. Dibukain Etanol (µl) Bróm Hőmérséklet Reakcióidő A kapott (mg) reagens (µl) ( C) (min) csúcsok integrálja 10 100 7 szoba 120 7673 10 100 7 szoba O/N 12811 10 100 7 50 O/N 12765 10 100 7 70 20 13600 2. táblázat: Brómozási reakció Br reagens segítségével: A kísérlet korai optimalizációja során 13600-as integrálcsúcsot értünk el. Ez mintegy 5-szöröse a DMF-ben elért eredményekhez képest. Vastaggal emeltük ki a legmagasabb hozamot. Ezekkel a körülményekkel ez volt a legnagyobb hozam, amit sikerült elérnünk. A későbbiekben során azonban nem ezzel, hanem az O/N reakcióval dolgoztunk tovább. Ennek oka annak viszonylagos egyszerűsége volt. 17

A kapott integrálokból látható, hogy a reakció körülbelül 13000es integrálérték körül minden esetben megálltak, így arra a következtetésre jutottunk, hogy az elegyben olyan változás történik, ami meggátolja a szintézis lejátszódását. Először a savasodást jelöltük meg, mint lehetséges okot és ennek kivédésére NaOH-al és NaPO 4 -al próbáltuk a közeget lúgosan tartani. Kipróbáltuk, hogy a fent említett lúgok 50mM-os koncentrációja okoz-e változást a szintézis hatékonyságában. Ehhez NaOH és NaPO 4 10 M-os törzsoldatát higítottunk desztillált vízzel 1M-osra és ebből adtunk a reakcióelegyhez olyan mennyiségben, hogy a kívánt koncentrációjú oldatot kapjuk. Jelen esetben 100 µl-es végtérfogatot terveztünk a bróm reagens hozzáadása előtt, amihez 5 µl lúgot és 95 µl etanolt használtunk. Ez a változtatás már az első kipróbált reakció összetétel esetén is nagy hatásfok növekedést okozott szobahőmérsékleten O/N végezve a kísérletet. NaPO 4 hozzáadása esetén oldhatatlan csapadék is keletkezett, és ez a későbbi tisztítási folyamatot nehezítette volna, így a NaOH-al dolgoztunk tovább. A pontos reakciókörülményeket a 3. táblázat tartalmazza. Dibukain mennyiség Etano l (µl) Bróm reagen Hozzáado tt anyagok Hozzáadott anyag Hőmérsékl et Reakci ó ideje A keletkezet e (mg) s (µl) koncentrációj t Brdibukain a csúcs integrálja 10 95 7 semmi 0 szoba O/N 7805 10 95 7 NaOH 50mM szoba O/N 10671 10 95 7 NaPO 4 50mM szoba O/N 13400 3. táblázat: Lúg hozzáadásának hatása a reakció konverzióra: Látható hogy a lúgok hozzáadása megnöveli a konverziós hatékonyságot. Vastaggal emeltük ki azt, amivel tovább dolgoztunk, mivel a NaPO 4 hozzáadása nagy mennyiségű oldhatatlan csapadékot eredményezett, így bár magasabb hatékonyságot értünk el, mégis reméltük, hogy a NaOH koncentrációját növelve javítható a konverziós hatékonyságot. Reméltük, hogy a NaOH koncentrációjának változtatásával tovább növelhetjük a konverziós hatékonyságot, így a 4. táblázat szerint változtattuk a körülményeket. Az összes reakciót O/N szobahőmérsékleten végeztük. A reakciók eredményét HPLC-vel kapcsolt MS-sel ellenőriztük. A kromatogrammokat elemezve észrevettük, hogy a NaOH koncentráció emelése növelte a bróm-dibukain mennyiségét is, azonban a reakciók során megjelent, egy a 18

kromatogrammok alapján a keresett anyagunkhoz közel elhelyezkedő mellékreakció terméke is, ami a tisztítás során nehézséget okozhatott volna, mivel a szemipreperatív célra használt oszlop töltete szintén 5 mikronos pórusméretű volt. Így azt az ideális állapotot kerestük, ahol a két csúcs aránya a legkisebb. A NaOH koncentrációjának 200 mm feletti növelése csökkentette a dibukain konverziós hatékonyságát is. A NaOH koncentráció további növelése csapadékképződéssel járt. Ennek kivédésére a reakció lejátszódása után megkíséreltük a csapadék újra oldatba vitelét víz, majd DMSO hozzáadásával, azonban a próbálkozásaink nem vezettek eredményre, így a legmagasabb konverziós hatékonysággal járó reakciót választottuk a további szintézishez. Ez 200 mm-os NaOH koncentrációt tartalmazott a Br reagens hozzáadása előtt. A NaOH törzsoldatunk továbbra is 10 M-os volt, amit ha szükséges volt 1 M-osra higítottunk a könnyebb adagolhatóság kedvéért. A szintézis eredményét a 6. számú ábra mutatja Dibukain mennyisége (mg) EtOH (µl) Bróm reagens (µl) NaOH 10M-os törzsolda tból (µl) Hozzá adott anyag ok Hozzáado tt anyag koncentrá ciója A keletkezett Brdibukain csúcsok integrálja A mellékreakció csúcsának integrálja 10 100 7 0 semmi 0 16825 12596 10 99,5 7 0,5 NaOH 50 mm 21912 14656 10 99 7 1 NaOH 100 mm 24883 16395 10 98,5 7 1,5 NaOH 150 mm 25748 21272 10 98 7 2 NaOH 200 mm 39977 16966 10 97 7 3 NaOH 300 mm 22629 15394 10 96 7 4 NaOH 400 mm 13990 15394 10 95 7 5 NaOH 500 mm 17058 11488 4. táblázat: NaOH hatása a konverziós hatékonyságra: A legjobb konverziós hatékonyságot 200mM-os NaOH koncentrációnál értük el (lásd kiemelés) Ezek alapján ezzel dolgoztunk tovább. A ph növelve csak egy ideig növelte a hatékonyságot, 200 mm felett az átalakulás hatékonysága csökkent, 400 mm felett oldhatatlan csapadék keletkezett 19

6. ábra: Br-Dibukain kromato- és spektogrammja: A számunkra fontos csúcs 6,08 percnél jött le, a hozzá tartozó spektogramm az ábrára van illesztve. 4,8 percnél jól látható a megjelenő mellékreakció csúcsa. Látható, hogy a reakcióban szinte egyszerre jött le a két csúcs, azonban a B forma mennyisége többszöröse volt az A -énak. 20

A kapott anyagokat SATRA XL reverz fázisú kromatográfiás oszlopon tisztítottuk meg, a nem gyűrűs összetevőktől vákuumszivattyúval gyorsítva az átfolyást. A reakciómixet vizes közegben vittük fel. Az oszlopról a felkötött anyagokat acetonitrilel mostuk. 1 ml térfogatnyi oldószer volt felvihető egyszerre az oszlopra, és a 3. ml-től szedtük a frakciót. Az így kapott oldatot vákuumbepárlóval kristályosítottuk, majd a kristályokat DMSO-ban vettük fel. A keveréket szemipreperatív HPLC-vel bontottuk összetevőire, a Br-dibukain frakciót tartottuk meg. A két formát külön gyűjtöttük. Az elválasztáshoz használt program az 5. táblázat tartalmazza. Időtartam (min) Acetonitril (%) Víz (%) átfolyási sebesség (ml/min) 0-6,3 50 50 5 6,3-6,4 95 5 5 6,4-7,1 95 5 5 7,1-7,2 50 50 5 7,2-15 50 50 5 5. táblázat: A Br-Dibukain szétválasztására használt program: Az Acetonitril arányának növelése gyorsította az anyag oszlopon való áthaladását, míg a víz arányának növelése lassította azt. Az anyagot az oszlopra 0,1 ml-es mennyiségben vittük fel, és ahhoz készült a program. Fontos azonban megjegyezni, hogy minden szintézis után ellenőrizni kell, hogy az ott kapott reakcióelegynek is megfelelő-e ez a program. Az általunk keresett anyag a kromatogramm csúcsa volt. A számunkra fontos frakciók 6,4-6,7 és 6,7 és 7,5 perc között jöttek le az oszlopról. Az így szétválasztott oldatok tisztaságát MS-HPLC-vel vizsgáltuk, majd vákuumbepárló kristályosítottuk. A kristályokat végül etanolban oldottuk vissza. A kapott végtermék koncentrációját ismert koncentrációjú dibukain oldat adszorpciós spektruma alapján határoztuk meg, és liofilizátorral töményítettük. A szintézisek során kb. 20 mg anyagot állítottunk elő az egyes formákból külön-külön. Ehhez a kiindulási anyag mennyisége 100 mg Dibukain volt így a tisztítás után kb. 40 %-os hatásfokot értünk el. A reakciókat eppendorf csövekben a fent bemutatott összetétellel O/N végeztük. Az azidáláshoz felhasznált törzsoldat koncentrációja 100 mg/ml-es volt. A Br-dibukaint kiindulási anyagnak véve kezdtünk bele a kapott anyagok azidálásába. A folyamathoz Jacob Andersen és mts 2005-ös cikkét használtuk fel forrásként.(7) Először az A forma azidálásával próbálkoztunk. A reakcióhoz NaN 3- t használtunk reagensként, 21

katalizátornak CuI-ot használva. A protokoll előírt diamint is, ami a csoport kicserélődést segítette. Erre a célra DMADE-t használtunk. A DMADE törzsoldatot 10-szeresére hígítottuk desztillált vízzel, és a kísérletekben így használtuk fel. A jobb hozam eléréséhez aszkorbinsavat használtunk 9,9 mg/ml-es koncentrációban. A savasodás ellen NaOH-t adtunk a reakcióelegyhez. A NaOH 50 mm-os törzsoldatát használtuk a reakciók során. A pontos reakciókörülményeket az 6. táblázat tartalmazza. A Br-dibukain törzsoldatból minden esetben 30 µl-t vittünk fel. NaN 3 (mg) NaOH (µl) Ascorbin sav DMADE (µl) CuI (mg) Csúcsintegrál (µl) 15 8 100 3 5,2 34445 15 8 100 3 6,9 32121 12 8 100 3 4,7 34450 12,3 8 100 3 9,3 21100 30 8 100 3 11,7 32123 34 8 100 3 15,6 30089 6. táblázat: A Dibukain A formájának azidálásához felhasznált reakciókeverékek. Vastaggal kiemelve a legjobban sikerült reakció. A reakció azért volt folytatásra érdemes, mert nagyon tiszta reakcióelegyet adott. A későbbiek folyamán azzal dolgoztunk tovább. A konverziós hatékonyság 80 % körül alakult. 22

7. ábra: Az azido-dibukain "A" formájának kromatogrammja, és spektrogramja: A számunkra fontos csúcs 5,28 percnél jött le, az 5,28 perces csúcshoz kapcsolódó spektogramm az ábrára van illesztve. Az ábrán megjelenítettük a csúcshoz kapcsolt integrál értéket. A kromatogramm a tisztított anyag 100-szoros hígításával készült. 23

A kapott reakciómixet szemipreperatív HPLC-vel választottuk szét, a szétválasztást Ozorócziné Szász Ilona végezte. Az azido-dibukain frakcióját gyűjtöttük majd vákuumbepárlóval kristályosítottuk. Az egyes frakciókat MS-HPLC-vel ellenőriztük. A kapott kristályt DMSO-ban vettük fel. A termék kromatogrammját a 7 számú ábra tartalmazza. A további vizsgálatokhoz 3 mg anyagot tisztítottunk meg, a maradék kristályosításával annak nagy időigénye miatt vártuk az első tesztek eredményét. Mivel a tesztek alapján az azidált forma megváltoztatta élettani hatásait végül nem folytattuk a szintézist. A B forma azidálásával is próbálkoztunk, azonban az minden erőfeszítésünk ellenére sikertelen maradt. A Br- dibukain törzsoldatból ebben az esetben is 30 µl-t vittünk reakcióba, A kipróbált reakciókörülményeket a 7. táblázat tartalmazza. NaN 3 NaOH Ascorbin sav DMADE CuI csúcsintegrál 24 8 100 3 12,5 0 34,3 8 100 3 17,3 121 10 8 100 3 5,2 126 12 8 100 3 6 0 12 8 100 3 12 0 21 8 100 3 7 0 7. táblázat: A Br-Dibukain B formájának azidálásához használt reakcióelegyek: Bármely általunk kipróbált reakció összetételt vizsgálunk is, látható, hogy nem, vagy csak minimális mértékben történt átalakulás. Azonban az átalakulás kis mennyiségéből arra következtettünk, hogy csak A forma alakult át, ami szennyezőként maradt az anyagunkban. 4.1.2 AZIDO-KARBAMAZEPIN Kiindulási anyagnak a 10-Brómkarbamazepint választottuk, hogy elkerüljük a halogénezést és az azt követő tisztítási és átoldási lépést. A reakciók egyszerűbbé tétele érdekében a brkarbamazepint tömény metanolban oldottuk, és 100 mg/ml-es törzsoldatot készítettünk belőle. A továbbiakban az ebből a törzsoldatból bemért mennyiségeket tűntettük fel a táblázatokban. A felhasznált DMADE a 99%-os tisztaságú törzsoldat 10-szeres hígításával készült. A reakciókhoz 9,9 mg/ml koncentrációjú ascorbinsavat használtunk. Először a már a dibukainnál bevált módszerrel próbálkoztunk, kezdetben kis mennyiségekkel, hogy 24

minimalizáljuk az optimalizálás során fellépő veszteségeket. A tesztreakciók pontos összetételét a 8. táblázat tartalmazza. Br- NaN 3 (mg) EtOH (µl) DMADE (µl) CuI (mg) Karbamazepin (µl) 30 10 400 3 5 30 12,5 400 3 6,2 30 10 400 3 3,3 8. táblázat: Azido-Karbamazepin tesztreakciók pontos összetétele: A reakcióban a réz-jodid, és a Nátrium-Azid legmegfelelőbb arányát kerestük. Ezt végül a 3:1-hez 4:1-hez arány között találtuk meg. A kiemelt reakció eleggyel dolgoztunk tovább Hamar kiderült, hogy az azido-karbamazepin csak köztiterméke egy reakciónak, és továbbalakul, a molekulatömeg alapján feltehetőleg nitro-karbamazepin irányába. Ahhoz hogy stabilizáljuk a kapott azidált formát, először a katalizátoron változtattunk. Kipróbáltuk, hogy van-e különbség ha CuI katalizátor helyett CuSO 4 vagy ZnCl 2 -ot használunk. A kapott eredményeket a 9. táblázat tartalmazza. Bróm- Etanol NaN 3 DMADE Katalizátor Katalizátor Csúcsintegrál Karbamazepin (µl) (µl) (mg) (µl) mennyisége (mg) 30 400 11,5 3 CuI 5,2 2437 30 400 12 3 CuSO 4 5,7 2698 30 400 11,2 3 ZnCl 2 5,5 0 9. táblázat: A különböző katalizátorok hatása a reakcióra: Látható, hogy a ZnCl 2 nem katalizálta a reakciót, míg a másik két katalizátor között csak kis eltérés mutatkozott. Azonban mivel a CuSO 4 hatásfoka valamivel magasabb volt, és tisztább, kevésbé csapadékos oldatot kaptunk így azzal dolgoztunk tovább. A ZnCl 2 használata nem hozott eredményt. CuSO 4 -t használatával a termelés hatásfok kismértékben jobb volt, mint CuI-t használva és tisztább, kevesebb csapadékot tartalmazó terméket kaptunk. Ezért a későbbiekben azt használtuk a reakcióhoz fém katalizátornak. Azonban a továbbalakulást nem tudtuk meggátolni, így a reakciókörülményeken további változtatásokat próbáltunk ki. Először a NaOH, később az aszkorbinsav elhagyásával 25

próbáltuk javítani a konverzió hatékonyságát. Végül mindkét anyag elhagyása mellett döntöttünk. A próbálkozásokat a 10. táblázat tartalmazza. Bróm- Karbamazepin NaN 3 (µl) NaOH (mg) CuSO 4 (mg) Ascorbinsav (µl) Etanol (µl) DMADE (µl) (µl) 30 11,2 8 4,1 100 400 3 30 11,1 8 3,3 0 400 3 30 10,8 0 3,9 100 400 3 30 11 0 4,2 0 400 3 10. táblázat: Az Aszkorbin-sav és NaOH elhagyásának következményei a konverzióra: A két csoportvédőként használt szer elhagyása csak minimálisan növelte a konverziós hatékonyságot, azonban az azidált forma továbbalakulását lassította, így ezzel dolgoztunk tovább. A kapott eredmények azt mutatták, hogy a továbbalakulást nem tudtuk megszűntetni, így próbáltuk a legoptimálisabb arányt elérni a kettő között. A kipróbált körülményeket a 11. táblázat tartalmazza. Bróm- Karbamazepin CuSO 4 (mg) DMADE (µl) EtOH (µl) NaN 3 (mg) Idő (min) Hőmérséklet ( C) (µl) 30 5 3 400 11 90 60 30 5 3 400 11 60 70 30 5 3 400 11 20 55 30 5 3 400 11 20 45 30 5 3 400 11 20 50 11. táblázat: A szintézis optimalizálására használt reakciók. A kapott eredmények alapján a reakció 60 C alatt nem játszódott le, míg 70 C esetén túl gyors volt a nem kívánt termék növekedése. A számunkra legoptimálisabb összetételt kiemeltük, és a továbbiakban ezzel dolgoztunk tovább. Az így kapott eredmények alapján fogtunk bele az azido-karbamazepin nagy színtézisébe. Az első próbálkozásokkor látszott, hogy a nagyobb mennyiségek szintézis további optimalizációt igényel. A kipróbált összetételeket 12. táblázat tartalmazza. A HPLC-vel történt tisztítás utáni állapot kromatogrammját a 8 ábra mutatja. 26

8. ábra: Végső szintézis eredménye: Az ábrán látható 4,05 percnél a számunkra fontos Azido- Karbamazepin csúcs. A képre illesztettük a hozzá tartozó spektogrammot. A vizsgálni kívánt anyagot a törzsoldat 100-szoros hígításával nyertük. 27

Br- CuSO 4 (mg) NaN 3 (mg) EtOH (µl) DMADE Csúcsintegrál Karbamazepin (µl) (ml) 200 26 70 1200 9 59702 200 20 60 1200 9 62300 200 45 45 1200 9 46400 200 15 30 1200 9 75607 100 16,1 35 1200 9 31200 100 17,2 32,6 1200 9 24321 12. táblázat: A nagyszintézis optimalizálására használt reakció összetételek. Vastaggal kiemelve a legjobban sikerült reakció. A reakciók 60 C játszódtak 80percen keresztül. A reakció mikrohullámú reaktorban folyamatos kevertetés mellett zajlott. A színtézis alatt 20 percenkénti mintavétellel követtük a reakciót. A színtézist továbbiakban a vastagon kiemelt összetétellel végeztük. A kapott végterméket szemipreperatív HPLC-vel választottuk szét, 50%-50% Acetonitril-víz aránnyal 5 ml percenkénti folyássebességgel. Az azido-karbamazepint külön gyűjtöttük. A levett anyag tisztaságát MS-HPLC-vel ellenőriztük. Ezt követően vákuumbepárlóval átkristályosítottuk, és DMSO-ban oldottuk. A koncentrációt ismert koncentrációjú Karbamazepin oldási sor alapján határoztuk meg. A tesztekhez felhasznált Azidokarbamazepin koncentrációja 45 mg/ml volt. Az első tesztekhez 4,5 mg anyagot szintetizáltunk. A tisztítási, és átkristályosítási lépések után szintézis hatékonyságát 20 % körülinek találtuk. 28

4.2 AZIDÁLT HATÓANYAGOK TESZTELÉSE A HALAK SZÍVVERÉSÉRE GYAKOROLT HATÁSA ALAPJÁN 4.2.1 AZIDO-DIBUKAIN Az Azido-Dibukain hatás spektrumának vizsgálatakor kiderült, hogy az A forma hatásának az élő szervezetekre gyakorolt hatása jelentősen eltér a módosítatlan dibukainétól. Percekkel a kezelés megkezdése után a halak sejtjei szétestek, nekrotizálni kezdtek, miközben a szívverés a várt lassulás helyett duplájára emelkedett. Így a további vizsgálatokhoz nem használtuk. A B formának azidálása minden próbálkozásunk ellenére sikertelen maradt így ezzel az anyaggal a későbbiekben nem foglalkoztunk. 9. ábra: Azido-dibukainnal kezelt és kontroll hal 5 perccel a kezelés után: A bal oldali képen a kezelt, a jobbon a kontroll hal látható. Az áteső fényben készült képen jól látható az azido-dibukainnal kezelt hal elfeketedése, ami a sejtek elhalásának, nekrotizációjának jele. A halak szívverése jelentősen megemelkedett, azonban fél órával a kezelés után az összes elpusztult. A képek fluoreszcens sztereo mikroszkóppal 50X-es nagyítás mellett készültek. 4.2.2 AZIDO-CARBAMAZEPIN Vizsgáltuk, hogy a különböző funkciós csoportok (azido, és bromo) eltérést okoznak-e a hatóanyagok spektrumában. A kapott eredményeket a 10 ábra mutatja. Látható, hogy a módosítatlan karbamazepinéhez képest a Br, és az Azido csoport is 5-5 nm-rel tolja el az elnyelési maximumot. A módosítások eltérő irányba mozgatták az adszorpciós csúcsot. A görbék karakterisztikája nem változott, így a későbbi tesztek során nem okozott problémát a 29

gerjesztési hullámhossz eltérése. A finomabb, kétfoton mikroszkóppal végzett teszteknél, azonban figyelembe kell majd venni a csúcsok eltolódását. 10. ábra: A hatóanyagok spektrális analízise: Feketével az Azido-Karbamazepin kékkel a karbamazepin, míg pirossal a Bróm-Karbamazepin van jelölve. Az anyagokat DMSO-ban oldottuk. A spektrális analízist még a pontos koncentráció meghatározás előtt végeztük, így az Azid- Karbamazepin töményebb oldatban került lemérésre. A vizsgálatot 2 µl-es mennyiségben nanodroppal végeztük. Vizsgáltuk továbbá, hogy a módosítások megváltoztatták-e a drogok hatását a zebrahal embriók szívverésére. A kapott eredményeket a 11 12 13 14 számú ábrák tartalmazzák. A zebrahal embriókat 96 lyukú szövettenyésztő edénybe helyeztük. Az egyes koncentrációkhoz tartozó elemszám 5 volt. 30

11. ábra: Karbamazepin hatása Zebrahalak szívverésére a koncentráció függésében: a felső ábra a szívverésszámokat tartalmazza, míg az alsó ábrán látható a kezeletlen halak szívverésének százalékában kapott érték. Az ábrán látható, hogy a koncentráció növelésével a szívverésszám csökken. 2 mm-os koncentrációnál a halak szívverése a kezeletlenek szívverésének csak 2,6%. Az elemszám minden koncentrációhoz 5. 31

12. ábra: Br-Karbamazepin hatása Zebrahalak szívverésére a koncentráció függésében: a felső ábra a szívverésszámokat tartalmazza, míg az alsó ábrán látható a kezeletlen halak szívverésének százalékában kapott érték. Az ábrán látható, hogy a koncentráció növelésével a szívverésszám csökken. 2 mm-os koncentrációnál a halak szívverése a kezeletlenek szívverésének 4,31 % Az elemszám minden koncentrációhoz 5. 32

13. ábra: Karbamazepin hatása Zebrahalak szívverésére a koncentráció függésében: a felső ábra a szívverésszámokat tartalmazza, míg az alsó ábrán látható a kezeletlen halak szívverésének százalékában kapott érték. Az ábrán látható, hogy a koncentráció növelésével a szívverésszám csökken. 2 mm-os koncentrációnál a halak szívverése a kezeletlenek szívverésének csak 8,5%. Az elemszám minden koncentrációhoz 5. 33

14. ábra: Az anyagok hatása a halak szívverésére a koncentráció függvényében: Látható, hogy a három drog hatásának lefutása egymáshoz nagyon hasonló, az azidált forma hatása 500 és1000 µm között kisebb mértékben változik. Az egyes koncentrációkhoz használt minta száma 5 Az ábrázolás a kezeletlen kontroll halak szívverés átlagának százalékában történt. Ezt követően vizsgáltuk, hogy a fényaktiváció megváltoztatja-e a hatóanyagok élettani hatását. Ehhez a halakat 2 percen keresztül sugároztuk be áteső 302 nm-es hullámhosszú UV fénnyel. A kísérlethez 1 mm-os koncentrációt választottunk, mivel az előzetes tesztek során ez a koncentráció már jól látható változásokat okozott az embriók szívverésében, azonban a hatás esetleges erősödése vagy az UV sugárzás okozta szívveréscsökkenés következtében se kellett arra számítanunk, hogy mind a kontroll, mind a vizsgált csoport elpusztul. A kezelés után lecseréltük a puffert tiszta E3 hal pufferre. A szívverés változását 20 percen keresztül követtük. A kapott eredményeket a kezeletlen kontroll százalékában számoltuk. Az elemszám minden esetben 5 volt. Az eredményeket a 15. sz. ábra mutatja. 34

15. ábra: Azido és Br-Karbamazepin hatása 2 perc sugárzás után a halak szívverésére 1 mm-os koncentrációban. A mintaszám minden vizsgálat esetén 5 db volt. A tengelyfeliratok a besugárzáshoz viszonyított időszakot jelölik. Ahogy a hatásspektrum alapján vártuk, a besugárzás előtt a Br-omozott forma volt az effektívebb, azonban besugárzás hatására ez megfordult. A kimosódás karakterisztikájára a vizsgált időtartamban a kezelésnek nem volt hatása. Az adatokat a kezeletlen kontroll halak szívverésének százalékában adtuk meg. Vizsgáltuk, hogy ha a sugárzást több cikluson keresztül ismételjük erősödik-e az azidált forma hatása. Az adatokat a 16-os és 17-es sz. ábra mutatja. A mintaszám 5 volt, az ábrán a kezeletlen kontroll szívverésének százalékában tűntettük fel az adatokat. A vizsgálatot 150 µm-os és 1 mm-os hatóanyag koncentrációnál végeztük. A koncentrációk megválasztásánál figyelembe vettük a korábbi tesztek eredményét. A besugárzás nélküli tesztek azt mutatták, hogy a 150 µm-os hatóanyag koncentráció még nem változtatja meg számottevően az embriók szívverésének a számát, így bármely változás könnyen észrevehetővé vált. Az 1 mmos koncentrációt azért választottuk, mert a besugárzási tesztek alapján tudtuk, hogy az azidált forma effektivitása megnő UV hatására. A 16-es ábrán látható, hogy 150 µm os hatóanyag koncentrációnál az azidált forma hatása a modosítatlan drogokhoz képest 10 %-al erősödik és azt a tiszta puffer hozzáadása után 10 perccel is megtartja. Azonban a többszörös ciklus nem 35

szívverés (%) erősíti a hatását, a szívverés gyengülése a kontrolléhoz, és a modosítatlan drogokéhoz hasonlóan változik. 120 110 kontrol 150 um Karbamazepin 150 um Br-Karbamazepin 150 um Azido-Karbamazepin 100 90 80 70 60 előtte 1 ciklus 2 ciklus 4 ciklus 16. ábra: Karbamazepin Br- és Azidokarbamazepin hatása a halak szívverésében, a besugárzási ciklusszám függvényében, a besugárzás után 10 perccel: Az egyes minták darabszáma 5. Látható, hogy az eltérés kicsi a legkisebb érték se megy 77% alá. Látható, hogy a nem fényaktiválható formákkal ellentétben az azidált hatóanyagnál, nem látható kimosódás, és a többi csoportnál nagyobb mértékű a ciklusszám növeléséből adódó szívveréslassulás. 1mM-os koncentráció esetén, szintén megfigyelhetjük az azidált forma hatásának erősödését a besugárzás hatására. A szívverés további csökkenése azonban nem tér el szignifikánsan a kontrollhalak, és a modosítatlan drogokat kapott halak szívverésének csökkenésétől. Az így kapott eredmények azonban megerősítenek bennünket abban, hogy az azidált forma UV fény hatására növeli hatékonyságát. Annak eldöntése azonban, hogy a többszöri besugárzás a drogok feldúsulásával jár-e további vizsgálatokat igényel. Ezen vizsgálatok alapján azonban kénytelenek vagyunk feltételezni, hogy nem. A kapott eredményeket a 17. ábra mutatja. A kapott eredményeket a kezeletlen kontrollhalak szívverésének számára normáltuk. 36

szívverés (%) 115 105 95 kontrol 1 mm Karbamazepin 1 mm Br-Karbamazepin 1 mm Azido-Karbamazepin 85 75 65 55 45 35 25 előtte 1 ciklus 2 ciklus 4 ciklus 17. ábra: 1 mm-os koncentrációjú Karbamazepin Br- és Azido-Karbamazepin hatása a halak szívverésére, a besugárzási ciklusszám függvényében, a kezelés után 10 perccel: Az egyes minták darabszáma 5. Az ábrán látható, hogy az azidált forma sugárzás hatására effektívebbé válik, azonban a további erősödés nem látszik az eredményekből. A besugárzások után a halakat E3 pufferbe helyeztük, és csak a sugárzás megkezdése előtt adtunk hozzá új hatóanyagot. 4.2.3 AZIDO-RILUZOL Vizsgáltuk, a modosítatlan és az azidált forma különböző koncentrációinak hatását zebrahalak szívverésére. A kapott eredményeket 18. 19. és 20. sz. ábra mutatja. Láthatjuk, hogy a két hatóanyag egyes koncentrációkon gyakorolt hatásában csak kismértékű eltérések vannak. Az egyes koncentrációkat vizsgálva láthatjuk, hogy 40 150 és 1000µM-os hatóanyag koncentrációnál az azido-riluzol míg 70 250 és 500 µm-os koncentrációnál a riluzol hatása volt az erősebb. Fontos megjegyeznünk azonban, hogy az riluzol 70µM-os riluzol koncentrációnál kapott érték feltehetőleg a viszonylag alacsony mintaszám miatt erősen lefelé lóg ki, és nem illeszkedik az általános trendbe. 2mM-os koncentrációnál a modosítatlan és az azidált forma hatása gyakorlatilag megegyezik. Ezek alapján a drogokat felhasználhatónak ítéltük a további vizsgálatokhoz. 37