Gliális sejttípusok az idegrendszerben

humán asztrocita 2-3X nagyobb, 10X több nyúlványa van plazmás asztrocita territóriumában rágcsáló: 20,000 120,000 szinapszis ember: 2 millió szinapszis Scale : 20 um Verkhratsky, Parpura, Rodríguez 2011 Oberheim, Nedergaard 2012

Sejttípusok az idegrendszerben neuroektodermális eredet (kivéve mikroglia) mezodermális eredet idegsejtek (neuronok) neuroglia erek falát és agyhártyákat alkotó sejtek általában: minden, ami nem neuron... asztroglia oligodendroglia mikroglia ependyma

Gliális sejttípusok az idegrendszerben neuroektodermális eredet (kivéve mikroglia) mezodermális eredet neuronok neuroglia erek falát és agyhártyákat alkotó sejtek asztroglia oligodendroglia mikroglia ependyma * asztrociták * II. típusú asztrociták * radiális glia * Bergmann glia * Müller glia * Pituicita (hipofízis) * tanycita * corpus pineale * glia limitans sejtjei sejtjei GLIA: gyűjtőfogalom!!! gliák * oligodendrociták * szatellitasejtek * NG2 sejtek * olfactory nerve ensheating cells (ONEC) * Schwann sejtek * adenohipofízis csillagsejtjei * rezidens mikroglia *bevándorolt makrofágok * enterális gliasejtek *ependymociták *ependymaszervek sejtjei *choroid plexus hámsejtjei perivaszkuláris periszinaptikus pericelluláris perinodális asztrociták

Asztroglia Ia pial tanycyte Ib vascular tanycyte II radial astrocyte (Bergmann glial cell) III marginal astrocyte IV protoplasmic astrocyte V velate astrocyte VI fibrous astrocyte VII perivascular astrocyte VIII interlaminar astrocyte IX immature astrocyte X ependymocyte XI choroid plexus cell Kettenmann and Ransom 2005 in Verkhratsky, Butt 2007

Four major classes of GFAP + cells coreside within the human neocortex. Layer 1 is composed of the cell bodies of interlaminar astrocytes, whose processes extend over millimetre lengths through layers 2 4 and are characterized by their tortuous morphology. Protoplasmic astrocytes, the most common, reside in layers 2 6. Polarized astrocytes are found only in humans and are seen sparsely in layers 5 6. They extend millimetre-long processes that are characterized by varicosities. Fibrous astrocytes are found in the white matter and contain numerous overlapping processes.yellow lines indicate areas in which the different classes of astrocytes reside. Scale = 150 μm. GFAP Heterogeneity of astrocytic form and function. Oberheim, Goldmann, Nedergaard 2012

Hominid-specific astrocytic phenotypes pervade the human brain. (a) Varicose projection astrocytes reside in layers 5 6 and extend long processes characterized by evenly spaced varicosities. GFAP,white, MAP2,red, DAPI,blue.Yellow arrowheads indicate numerous long processes. (b) Pial surface and layers 1 2 of human cortex. GFAP,white, DAPI,blue.Yellow line indicates border between layers I and II. (c) Process from a varicose projection astrocyte. GFAP,white. (d) Interlaminar astrocyte processes characterized by their tortuousity. GFAP,white. Scale: (a,b) 100 μm; (c,d) = 10 μm. Reproduced from (8). Oberheim, Goldmann, Nedergaard 2012

Csillag alakúak A legnagyobb glia populáció a CNS-ben Fő markere mindmáig : GFAP (gliális fibrilláris savas fehérje) DE a GFAP expresszió nagyon varábilis (4 kép: GFAP immunfestések tenyésztett asztrocitákban) Minden Bergmann-glia GFAP+, de a cortexben és HC-ban az asztrocitáknak csak ~15-20 % - a GFAP+ (felnőttben)!!!

rostos asztrociták fehérállományban Hosszú nyúlványok (akár 300 um) Kevésbé elágazó, mit plazmás asztro Perivaszkuláris, szubpiális végtalpakat képeznek Perinodális kontaktusokat képeznek neuronokkal Sűrűségük 200 000 cell per mm3. (Dr Szigeti Cs., SZTE ÁOK-TTIK Sejtbiológia és Molekuláris Medicina Tanszék - Golgi-impregnáció, rostos, protoplazmás asztrocita)

plazmás asztrociták szürkeállományban Sok, rövidebb nyúlvány (kb. 50 um) Nagyon elágazó nyúlványrendszer Perivaszkuláris, szubpiális végtalpakat képeznek Neuronokkal sok kapcsolatuk van Sűrűségük cortexben 10 000 30 000 cell per mm3.

GFAP festés: az asztrocita térfogatának csak kb. 15%-át adja ki GFAP: gliális fibrilláris savas fehérje Hoechst: sejtmag

GFAP Hoechst - sejtmag hgfap-gfp

GFAP/GFP in vivo GFAP/ezrin in vitro plazamembrán aktin citoszkeleton Reichenbach 2010, Frotscher 2001

hgfap-gfp

Brainbow Jeff Lichtman (Harvard University)

In vitro In vivo GFAP/Hoechst

www_biology_uiowa_edu_daileylab

GFAP: gliális fibrilláris savas fehérje (IF) Hoechst vér/agy gát (asztroglia-endotél) liquor/agy gát (asztroglia-ependima) glia limitans (asztroglia-pia mater)

Markerek Huang 2006 GFAP glial fibrillary acidic protein GLT-1(EAAT2) glutamate transporter GLAST(EAAT1) glutamate transporter GS glutamin synth(et)ase glutamát uptake AQP4 aquaporin4 Glutamate + ATP + NH 3 Glutamine + ADP + phosphate Glutamin synthase/gfap Aquaporin 4 (asztro végtalp) Thrane 2010 GFAP/AQP4-GFP mouse cortex GS/GFAP/DAPI asztrociták in vitro

S100b - Astrocyte Marker in Mouse HC Kipp, Abcam S100B-KO egér: agyi anatómia OK, DE LTP, tanulás, memória romlik: HC neuronális plaszticitás érintett! S100b - Asztrocitában (nem mindben) Schwann sejtben, radiális gliában - Ca ++ kötő fehérje - több fehérje foszforilációját gátolja - GFAP összeszerelődést is szabályozza - MT összeszerelődést gátolja - Asztrociták szekretálják is - patológiás esetekben keringésbe is kijut: esetleg diagnosztikában használható (screening) for determination of CNS injury at the molecular level before gross changes develop The concept of brain specific proteins was first proposed in 1965 (Moore, 1965). These workers separated proteins from the brain and liver of cattle, rabbits, rats and monkeys. Three low molecular weight acidic proteins were found consistently in high concentrations in the brain fractions one of them was named S100 because it was soluble in 100% ammonium sulphate. S100 family: at least 21 S100 proteins Sen, Belli 2007 McDougal 2011 S100B readily labels the soma and the larger processes, whereas GFAP labeling is predominantly seen in the processes

FABP7 (BLBP) Fatty acid binding protein 7 Brain lipid binding protein hosszú szénláncú zsírsavak és egyéb hidrofób ligandok kötése Érett asztro szubpopulációkban ill. radiális gliában is Érdekes: FABP7 köti a legerősebben a FABP család tagjai közül a DHA-t Docosahexaenoic acid omega-3 zsírsav az agyi PUFA (polyunsaturated fatty acid) 40%-a neuronális plazmamembrán fontos építőeleme DHA hiányában: cognitive decline Felnőtt cortex FABP7+ sejtek 21%-a GFAP+ asztrocita, 62%-a NG2+ (oligo progenitor) Mori, Götz 2005 Sharifi 2011 Kipp 2011 Reaktív asztrociták 3 nappal agyi lézió után, kéregben De asztro FABP7 agyi demielináció során is nő (MS!)

McDougal 2011 asztrociták az agytörzsben (Texas Red is a sulfonyl chloride derivative of SR101) Sulforhodamine 101 In vivo two-photon imaging of cortical astrocytes at a 250 mm depth (P21 rat) 30 minutes after SRB (20 mg/kg) iv injection.

Glycogen granules Sárga ill. piros nyilak: glikogén szemcsék asztrocitákban: kicsi, kerek, sötét szemcsék glikogén glükóz http://synapses.clm.utexas.edu/anatomy/astrocyte/glycogen.stm http://captain-nitrogen.tumblr.com/post/13552129455/just-some-casual-energy-storage Marker: brain glycogen phosphorylase

DCX-immunolabeled neuron (NN) with a labeled apical process (large arrow) and an adjacent glial cell (GC) with a watery cytoplasm. Shapiro 2005 Sejtmag sima maghártya vastagnak tűnik Baille 2005 Kromatin maghártyához tapad Nucleolus gyakran maghártyához közeli, excentrikus ELMI, normál HC asztro. (ezek jó elkülönítő jegyei asztronak ELMI szinten) *: gliális filamentum a Citoplazma üres (watery), organellum-szegény citoplazmában Jellegzetes filamentumkötegek (IF) Glikogénszemcsék Néhol kristályos testek: glioszómák = Glial subcellular particles, izolálható, mint a szinaptoszóma

Szinapszisok közelében Bundles of intermediate filaments (arrows) are often found in in the cytoplasm of astrocytes (arrows). http://neurolex.org/wiki/category:astrocyte http://synapses.clm.utexas.edu/anatomy/astrocyte/filaments.stm

Freeze fracture végtalpak perivaszkuláris végtalpai rendezett 4-6 nm-es intramembrán partikulum (IMP) sorokat tartalmaznak. Ezek egyedi aquaporin4 tetramereknek felelnek meg. Square arrays or ortogonal array of particles, OAP. Neuronális membránban ilyen nincs. A, B : P-face C: E-face Furman CS 2003 P-face: protoplasmic leaflets E-face: extraplasmic leaflets

Nagy JI 1998 Connexin43 asztrocita rés-kapcsolatokban immunogold jelöléssel. (A, B) gap junction a neuropilben (nyilak). (C, D) Connexin43 asztrocita rés-kapcsolatokban a szürke (C) és fehérállományban (D).

Current immunohistochemical markers for mature astrocytes include, but are not limited to, the following: A2B5, Aldh1L1, aldolase 3, apolipoprotein E, aquaporin 4, brain glycogen phosphorylase, connexin 30, cystatin C, fibroblast growth factor receptor 3, gapjunction channel protein 1-α, GFAP, GLAST, glutamine synthetase, Niemann Pick type C1, phospholipase A2 Group VII, S100β, and vascular cell adhesion molecule 1 (Holash, Harik et al. 1993; Patel, Suresh et al. 1999; Eng, Ghirnikar et al. 2000; Pringle, Yu et al. 2003; Bachoo, Kim et al. 2004; Mori, Tanaka et al. 2006; Slezak, Goritz et al. 2007).

Aldh1L1-EGFP Aldh1L1 Aldh1L1 is a specific pan-astrocyte marker aldehyde dehydrogenase 1 family, member L1 gene, also known as 10-formyltetrahydrofolate dehydrogenase (FDH) 10-CHO-THF is important in purine biosynthesis Affymetrix A, Aldh1L1 labels both cell bodies and processes of astrocytes in cortex B, GFAP does not label the finer processes C, GFAP labels a subset of astrocytes whereas Aldh1L1 labels many astrocytes not labeled by GFAP D F, Aldh1L1 does not label neurons, OLs, or OPCs G I, Aldh1L1-EGFP transgenic mouse cortex 2008, Ben Barres

ALDH1L1-eGFP riporter törzs felhasználása 2008 óta: 14 cikk (2014) 17cikk (2015) ALDH1L1 egfp X EAAT2-tdTomato keresztezés nagyon jó átfedés regulation of mammalian astrocyte precursor proliferation during development

hgfap-mrga1:gfp mice These mice express a Gq-protein coupled receptor (called Mas-related gene A1, MrgA1) fused to GFP selectively in GFAP-expressing cells using the inducible tet-off system. MrgA1, is normally expressed in dorsal root ganglion nociceptive sensory terminals in the spinal cord where it is activated by RF amide neuropeptides resulting in Ca2+ release from internal stores. Mice expressing the tetracycline transactivator (tta) under the hgfap promoter (hgfap-tta mice) were crossed to mice in which the MrgA1 receptor was transcribed off the tet (teto) minimal promoter (teto- MrgA1). In the absence of doxycycline, astrocytes express MrgA1:GFP. Transzgenikus egerek Fiacco 2007 Lacar, Bordey 2010 Asztro-specifikus reporterek Inducible Cre-strains are coming Romano

mass spectrometry based cell surface capturing (CSC) technology to generate a snapshot of the astrocyte cell surface glycoproteome (using primary astro cultures) 482 astrocyte cell surface exposed glycoproteins 1. chemical labeling of oxidized cell surface polysaccharides using the bi-functional linker molecule biocytin hydrazide 2. cell homogenization and protein digestion 3. affinity enrichment of biocytin hydrazide labeled peptides 4. enzymatic peptide release 5. peptide analysis by tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) 6. peptide or protein identification The functions of the identified cell surface glycoproteins were analyzed using the PANTHER database

http://www.med.unc.edu/ embryo_images Neuroepitél E9 sejtek Radiális glia * E8 pseudostratified epithelium * * E8-9 egér velőcső

Golgi, Kölliker, His and many others observed radial fibers in the embyronic spinal cord 1888, Giuseppe Magini was the first to describe radial glia in the cerebral cortex of fetuses, using Golgi impregnation Cortex of calf fetus, Magini, 1888 Developing cortex of a calf fetus (4th month of gestation) drawn by Magini on the basis of Golgi impregnation counterstained with hematoxylin. In the original figure legend, the labels are indicated as follows: B, superficial zone of the white matter with very few filaments and rare spherical, fusiform, triangular cells; C, cortical matter rich of radial filaments and spherical cells; C sketched nerve cell; Cg, twin nerve cells (cellula nervosa gemella), whose division is not yet complete; M, medullary [myelinated] matter with radial filaments and scarce varicosities (spherical cells); V, varicosities (spherical cells) inserted in the filaments continuous with the epithelial cells. Note that the neurons indicated as Cg resemble the Cajal-Retzius cells (their proximity one to the other suggested to Magini that they could be dividing cells). Reproduced from G. Magini. Ulteriori ricerche istologiche sul cervello fetale. Rendiconti della R. Accademia dei Lincei 4:763; 1888. Radiális glia (1851-1916), Italian histologist and pathologyst

Radiális glia Cajal indítványozta elsőként, hogy a radiális rostok módosult asztrocitanyúlványok melyek a kéreg hisztogenezisét támogatják. Cajal elismerte Magini munkáját, de kritizálta azokat a megfigyeléseit, melyek szerint a radiális rostok mentén neuronok vannak. Magini 1888 Cajal, 1911 Rakic, 1972 Az elektronmikroszkópia felfedezésével a radiális glia nyúlványok és a mellettük migráló neuronok létezése bebizonyosodott: az 1970-es években, Pasko Rakic munkássága nyomán. (A) Magini s drawing (1888) of a detail of the radial filaments as seen with Golgi impregnation counterstained with hematoxylin; the original Magini s legend phrases: S: Three spherical cells of the cortical matter, with a large nucleus surrounded by a rim of protoplasm, inserted on a filament. (B) Cajal s drawing (1911) of radial glia; epithelial and neuroglial cells of the cerebral cortex; rabbit of a few days of age, Golgi method; A, bodies of epithelial cells; B, peripheral arborizations of these cells; b, bundles of white matter; c, perpendicular or radial fibers; e, displaced epithelial cells.. (C) Drawing of a Golgi-impregnated coronal section through the brain of a 97-day monkey fetusby Rakic (1972). Bentivoglio and Mazzarello 1999

Radiális glia Golgi impregnált telencephalon, 97 napos majom fetus MC: migrating cell; RF: radial fiber; LV: lateral ventricle; CP: cortical plate Radiális rostokra merőlegesen vágott metszetek, 80 napos fetus Radiális glia Rakic P. 1972, J. Comp. Neur. 145: 61-84

Radiális glia Elongált morfológia megmarad: madarak, emlős kisagy (Bergman glia) Guerrier 2007 radiális rost migráló neuron Rakic P. 1972, J. Comp. Neur. 145: 61-84 Noctor, Kriegstein et al 2001 Interkinetikus magvándorlás!

Radiális glia Rakic 1972-ben még nem ismerte fel, hogy az idegsejtek a radiális gliasejtekből származnak. Önálló neuronális ill. gliális progenitorok létét feltételezte. A radiális glia őssejt jellegét később írták le. asztrocita radiális glia Újszülött NP! perinatális periódus (~E18-P10)

Radiális glia piális felszín Interkinetikus magvándorlás Radiális glia osztódásai: VZ-ben vertikális, szimmetrikus vertikális, asszimmetrikus (önmegújító) Intermedier progenitorok osztódásai: SVZ-ben ventrikuláris felszín horizontális, szimmetrikus Radiális glia = multipotens őssejt!!

Neuroepiteliális sejt Radiális glia Neuron Asztroglia Őssejt Radiális gliává való átalakulás: a legtöbb agyterületen: E10-E12 körül Elongált morfológia megmarad: - madarak, - emlős kisagy (Bergman glia) Bizonyos epitél-sajátságok downregulálódnak, pl.: - tight junction kapcsoltság, - egyes membránfehérjék apikális/bazális transzportja De egyes epitél-sajátságok megmaradnak, pl.: - nestin IF expresszió (RC2); - apikális felszínek, - centroszómák apikális lokalizációja, - prominin-i expresszió, - adherens junction-ok az apikális felszínhez közel /itt PAR3, PAR6, apkc (PAR-komplex) expresszió/ - kapcsolat a bazális membránnal - interkinetikus magvándorlás /de már nem a teljes sejt hosszán/ - Pax6 Basal lamina Asztroglia-sajátságok megjelennek, pl.: - glikogén-szemcsék - GLAST, S100b, vimentin, FABP7(BLBP), - GFAP+ (főemlősök), - GFAP- (rágcsálók GFAP+ P0-tól) Götz, Huttner 2005

Radiális glia már jobban elkötelezett ( more fate-restricted ), mint a neuroepiteliális sejtek. Ritka! Radiális glia - az apikális (kamrai!!) plazmamembrán csak 1-2%-a a teljes membránnak - a és c síkú osztódás tehát szimmetrikusan illetve asszimmetrikusan osztja a sejtet - komplex szabályozás, pl: Emx2 transzkripciós faktor a vertikális, szimmetrikus osztódást támogatja Götz, Huttner 2005 Pax6 transzkripciós faktor inkább az asszimmetrikus, neurogén osztódást támogatja Tis21 (BTG2) gén/fehérje expresszió (from off to on ) a neurogénné váló sejtekben transcriptional cofactor

Radiális glia - apikális membrán érintkezik a velőcső üregével, ahonnan az instruktív szignálok érkezhetnek - két transzmembrán fehérje Megalin - LDL-receptor related protein - mikrovillusok közti rések membránjában - megalin-hiányos embrióban neuroepitél prolif. károsul hiányos koleszterin uptake-hez társulva Prominin-I (CD133) - membrán protrúziókon - koleszterol-alapú mikrodoménben - részt vehet az apikális membrán asszimmetriájának kialakításában (?) apikális (kamra felé) megalin PAR3, PAR6, apkc.. (PAR-komplex) epitél polaritás szabályozás!! - adherens junction közelében, apikálisan - proliferatív osztódásnál szimm. öröklődik - neurogén osztódásnál asszimm.öröklődik Götz, Huttner 2005, Costa, Götz 2008, Shackelford, Shaw 2009

FABP7 (BLBP) Fatty acid binding protein 7 Brain lipid binding protein Radiális glia (DHA: Docosahexaenoic acid enriched in the brain) - hosszú láncú PUFA-kat köt (polyunsaturated fatty acids) radiális glia alakjának fenntartásában és neuronális migrációban van szerepe - támogatja a neurális őssejt/progenitor pool proliferációját - FABP7 -/- egerekben drámaian csökken a neurogenezis mértéke BLBP-GFP vektor elektroporálva, majd 24h in vitro fenntartva Liu, Godbout et al. 2010 Schmid 2006 E14 E18

Hachem 2007 Radiális glia GFAP vimentin nestin (RC2 antigen) Nestin/BLBP Intermeder filamentumok E14 rat spinal cord Tenascin-C ECM http://www.anatsoc.org.uk/t.clive.lee S100b Cerebellum, E17.5. A: parasagittal section of the cerebellar vermis. In addition to neural cells, the EGFP reporter is strongly expressed in the mesenchyme underlying the CP.