A biológiai minták sokfélesége A fehérjevizsgálatok általános és alapvető módszerei a minták előkészítése Betegekből származó Állatkísérletekből nyert Sejtek Szövetek Szervek Egyéb minták (vér/szérum, könny, vizelet, stb.) 1. Sejtek, sejtkultúrák: a klinikai kutatások legfontosabb modelljei kontrolált körülmények 2. Szövetek: Sejtösszetételükben heterogének Pl. máj: hepatocyta, kupffer sejt, endothel sejt, stellate sejt a sejtek szinkronizálása 3. Organellumok: a kinyerési mód meghatározó (1) Magvacska (2) Sejtmag (3) Riboszóma (4) Vezikula (5) Durva felszínű ER (6) Golgi (7) Citoszkeleton (8) Sima felszínű ER (9) Mitokondrium (10) Sejtnedvüreg (11) Citoplazma (12) Lizoszóma (13) Centriólumok 3. Biológiai folyadékok: dinamikusan változó Vér/plasma/szérum Vizelet Nyál Könny 1
A minta előkészítés protokolljai Sejtes minták előkészítése A jó protokol: Egyszerű Jól reprodukálható A fehérjék megtartják eredeti tulajdonságaikat: módosulás/degradáció nem következik be Lépései: Sejtfeltárás Az interferáló anyagok inaktíválása/ eltávolítása A fehérjék Sejtes minták előkészítése: sejtfeltárás Sejtes minták előkészítése: sejtfeltárás Mechanikai Fagyasztás/olvasztás ciklikus ismétlése Ultrahangos feltárás Nagy nyomásos préselés Forgó késes Üveg/teflon dugattyús homogenizátorok Sejtfeltárás Kémiai Detergens kezelés Ozmotikus feltárás Enzimes oldás A módszert a kezelendő minta típusa határozza meg. Pl. baktériumok vagy növényi szövetek feltárása drasztikusabb módszert kíván mint az emlősszövetek. A mechanikai és kémiai módszerek egymással kombinálhatók. A sejtek lízise során interferáló anyagok szabadulnak ki a sejtekből. Interferáló anyagok: proteolitikus enzimek, sók, lipidek, poliszacharidok, nukleinsavak. A proteázok gátlása: Mindig szükséges, hogy megelőzzük a vizsgálni kívánt fehérje degradációját. Kémiai proteázgátlók alkalmazása Forralás SDS tartalmú mintapufferben Proteázok inaktíválása alacsony ph n (TCA s fehérjekicsapás) 2
Sószennyeződések eltávolítása: Azért szükséges, mert a nagy mennyiségben jelenlévő ionok rontják az elektroforetikus és az izoelektromos fókuszálásos elválasztások hatékonyságát. 100 mm os sókoncentráció felett a fehérjék precipitálódnak. Dialízis Ultrafiltrációs kamra Elektroforézis: alacsony feszültség mellett (100 V) kivándoroltatjuk az ionokat a mintákból. Lipidek eltávolítása: Különösen magas lipidtartalmú mintáknál, pl. agyszövet szükséges. Oldószeres extrakció (alkohol, aceton). Probléma: jelentős fehérjevesztés lehet. Ultracentrifugálás: a lipidréteg a minta felszínéről eltávolítható, pl. szérumminták rutin delipidálása air fuge centrifugákkal. Poliszacharidok és nukleinsavak eltávolítása: A poliszacharidok és nukleinsavak kölcsönhatásba lépnek a fehérjékkel, ezáltal összetett makromolekulák jönnek létre, melyek zavarhatják a fehérjevizsgálatokat. TCA kicsapás, hátrány: fehérjevesztés Proteáz mentes RNS áz illetve DNS áz enzimekkel a nukleinsavak eltávolíthatók Ultracentrifugálás Nagy mennyiségben jelenlévő ballaszt fehérjék, avagy tűt a szénakazalban. Zavarják vagy elfedik a kisebb mennyiségben jelen lévő fehérjék vizsgálatát. Pl. albumin: a plazmafehérjék 60% a. Albuminmentesítő kitek. Probléma: nem specifikus, így más fehérjéket is eltávolíthat a mintából. Blue dextrán: megköti az albumint A mintafehérjék híg pufferoldatban szolubilizálhatók Általában enyhén alkalikus közegben A szolubilizáló puffer egyéb komponensei: Detergensek Denzitásnövelő anyagok (glicerin, szacharóz) Komplexképzők: EDTA, EGTA, a Ca és Mg dependes proteázok gátlására Kaotróp anyagok (urea/thiourea) denaturáló szolubilizáló rendszerekben Redukálószerek( dithiotreitol, B merkaptoetanol) Detergensek: Szerepük: a hidrofób kölcsönhatások megszüntetése, az aggregáció és precipitáció megelőzése Fajtáik: Ionos detergensek: SDS (nátrium dodecil szulfát), anionos detergens, különösen hatékony forralva. Extrém hidrofób fehérjékhez alkalmasak az ikerionos detegensek: CHAPS, szulfobetainok. Nem ionos detergensek: NP 40, Triton X 100. 3
Kaotróp anyagok (urea, thiourea): Szerepük: a hidrogénhidak felbontása, a fehérjék kitekeredése, denaturáció. A tiourea hatékonyabb a hidrofób interakciók megszüntetésében, de vízben rosszul oldódik. Extrém hidrofób fehérjék oldása: 5 7 M urea, 2M tiourea. Az ureás oldatban a fehérjék karbamilációja bekövetkezhet. Ezt elkerülendő az oldat hőmérsékletét nem szabad 37 o C fölé emelni. Az urea bomlástermékei elektroforézis során eltávoznak a rendszerből. Redukálószerek ditiotreitol (DTT), ditioeritriol (DTE) Szerepük: az inter és intramolekuláris diszulfid kötések felszakítása valamint újraképződésének megakadályozása. Vízben jól oldódnak, így nagy feleslegben alkalmazhatók. Hátrány: magas cisztein tartalmú fehérjéknél nem elég hatékonyak. Ideális: 5 10 mg/ml A vizsgálandó fehérjék koncentrációja Túl alacsony koncentráció: < 0,1 mg/ml. Problémák: a minta fehérjetartalma hozzátapad a kémcső, pipetta falához. Híg fehérje oldatok koncentrálása: Ultraszűréssel koncentrálhatók, frakcionálhatók, egyúttal sómentesíthetők. Cut off fogalma: azt a molekulaméretet adja meg, amelyet a membrán már nem enged át. Pl cut off 10 kda membrán a 10 000 g/mol tömegű fehérjéknél kisebbeket átengedi, a nagyobbakat fenntartja. 1. Direkt fotometria: 205 illetve 280 nm en történő mérés. 205 nm en a peptidkötés abszorbeál, 280 nm en az aromás aminosavak. Előnye: a minta érintetlen marad. Hátrány: alacsony érzékenység, mennyiségi referencia hiánya. Fehérjekicsapás: Fizikai: hőkezelés Kémiai: szerves oldószerek, akohol, TCA Liofilizálás (fagyasztva szárítás). Előtte célszerű a fehérjeoldat dialízise illékony pufferoldatokkal, pl. ammónium karbonát. 2. Biuret reakció: A Biuret reakcióban Cu (II) ionok képeznek komplexet a peptidkötés N atomjaival lúgos közegben. A lila szín intenzitása, és ebből következően az 546 nm en jelentkező abszorpció a Lambert Beer törvény szerint egyenes arányos a fehérjekoncentrációval, 150 1000 µg/ml fehérjekoncentráció tartományban használható. A Biuret reagens összetétele: réz szulfát, K, Na tartarát, KI, NaOH. 3. BCA fehérje módszer: A biuret reakció érzékenyítése. A BCA reakció kb 100 szor érzékenyebb mint a biuret reakció. A biuret reakcióban keletkező Cu 1+ bicinchonic savval reagáltajuk. A keletkező intenzív lila színű réz komplex 562 nm en fotometriásan detektálható. 4
4. Lowry féle fehérjemeghatározás: A Biuret reakció érzékenyítése. Kis fehérjekoncentrációknál alkalmazható. A reakció két lépésből áll. Az első lépés a klasszikus biuret reakció. Ezt követően adjuk a rendszerhez a Folin fenol reagenst, mely foszfomolibdátot és foszfowolframátot tartalmaz. A biuret reakcióban kialakult réz komplex elektronokat ad a Folin fenol reagensnek, amely intenzív kék színűvé válik. A szín 650 750 nm között detektálható. 4. Bradford módszer: Festék alapú módszer, melyben Coomassie G 250 festék kötődik a fehérjék bázikus és aromás aminosav csoportjaihoz. A fehérje festék addukt 595 nm en fotometrálható. 1 1400 µg/ml fehérjekoncentráció tartományban alkalmazható. Minták előkészítése: tárolás Rövid távú: néhány óra 1 éjszaka: hűtőben 4 o C on Hosszabb idejű tárolás: fagyasztóban 70 o C on száraz jégben 78 o C on folyékony N 2 ben 196 o C on Az ismételt fagyasztást olvasztást kerülni kell. Többszöri felhasználáshoz a mintát célszerű 100 200 µl es adagokban tárolni. 5