Ph. D. ÉRTEKEZÉS TÉZISEI BILÓGIAI IDÁCIÓK BIMIMETIKUS MDELLEZÉSE Balogh György Tibor Témavezető: Dr. ógrádi Mihály a kémiai tud. doktora Konzulens: Dr. Keserű György Miklós az MTA doktora Készült a BME Szerves Kémia Tanszékén, a CHII RT. övényvédőszer Üzletág, Kémiai Kutatólaboratóriumában és a RICHTER GEDE RT. Technológiai Fejlesztés Laboratórium II. osztályán BUDAPEST, 2003
BEVEZETÉS Ph. D. doktori értekezésemben egyetemi éveim alatt a Szerves kémia Tanszéken elkezdett, majd a Chinoin Rt.- nál folytatott kutatómunkámat, valamint a Richter Gedeon Rt.-nál végzett tudományos tevékenységemet foglaltam össze. Munkám első lépésében, szintetikusan előállított metalloporfirinek (1. ábra) segítségével, a növényvédőszer kutatásban még nem alkalmazott és a növényvédőszerekkel szembeni rezisztencia kialakulásában fontos szerepet játszó citokróm P450 által katalizált folyamatokat modelleztem. A modellrendszer beállításához a karbamát inszekticidek családját vizsgáltam. FeTPPCl 8 ; = Cl, = H FeTPPF 20 ; = F, = F Fe 1.ábra Alkalmazott szintetikus metalloporfirinek Vizsgálataim segítségével a következő kérdésekre kerestem választ: (i) képes-e a kémiai modell reprodukálni a karbamát inszekticideknek citokróm P450 katalizált oxidatív metabolizmusát; (ii) lehetőség van-e a modell segítségével meghatározni a molekulák metabolikusan érzékeny csoportjait; (iii) képes-e modellrendszer 2
reprodukálni az in vivo kísérletek által szolgáltatott metabolitprofilt? Ezt követően a kémiai modellrendszer felhasználásával a CHII övényvédőszer Üzletág kutatói által kifejlesztett rovarszelektív citokróm P450 inhibitorokat vizsgáltam. Célom az inhibitorok és a citokróm P450 között kialakuló kölcsönhatás és az esetleges biomimetikus átalakulások mechanizmusának megismerése volt. A következőkben a szintén hem fehérje, a S által katalizált szintézist vizsgáltam arginin, -hidroxiarginin és ezek szerkezeti analógjainak segítségével. Vizsgálataim célja, a szintézis mechanizmusának pontosabb megértése, illetve olyan modellrendszer kifejlesztése, ami képes lehet előre jelezni egy hatóanyag donor sajátságát. Munkám második felében a Richter Gedeon Rt. originális hatóanyaga, a cink-hyaluronát, valamint a hyaluronsav (2. ábra) egyéb fémkationokkal (a +, Co 2+, Cu 2+, Mn 2+ ) képzett asszociátumai és a patológiás szempontból legfontosabb reaktív oxigént tartalmazó metabolitok (RM: hidroxilgyök ( H), szuperoxidanion ( 2 - ), alkilperoxidgyök (R 2 ), peroxinitrit ( - )) közötti kölcsönhatást vizsgáltam. 2.ábra A hyaluronan diszacharid egysége 3
Vizsgálataim a következő problémakörök megválaszolására irányultak: (i) a hyaluronan (HA) önálló antioxidáns hatásának bemutatása; (ii) az RM-ok HA-ra gyakorolt degradációs és a HA önálló antioxidáns hatása közötti összefüggés feltárása; (iii) a fémkation szerepének bemutatása a HA asszociátum antioxidáns hatásában és lehetséges védő hatásának bemutatása RM-okkal szembeni degradációs folyamatokban. Vizsgálataim célja a kiválasztott biológiai oxidációs folyamatok megismerésén, illetve mechanizmusának magyarázatán túl, olyan modellrendszerek felállítása volt, amelyek viszonylag könnyen változtatható paramétereik és hozzáférhetőségük miatt alkalmassá tehetők hatóanyagjelöltek gyors, hatékony tesztelésére is. TUDMÁS TÉZISEK 1. A karbamát inszekticidek (karbofurán, karbaril, pirimikarb (3. ábra)) vizsgálatai során az általunk kifejlesztett FeTPPF 20 / m-klór-perbenzoesav (m-cpba), H 2 2 biomimetikus modellrendszer alkalmasnak bizonyult a citokróm P450 katalizált folyamatok modellezésére. H H H 3 C H 3 C CH3 H Karbofurán Karbaril Pirimikarb 3. ábra Vizsgált karbamát inszekticidek 4
Sikerült rámutatnunk mindhárom karbamát inszekticid metabolikusan érzékeny pontjaira, a kapott metabolitprofilok jó egyezést mutattak a házi legyen végzett vizsgálatok in vivo adataival. Vizsgálatainkban a karbaril és pirimikarb oxidatív mechanizmusának egyes termékeit is sikerült pontosítanunk. 2. A kifejlesztett modellrendszer a két CHII-ban előállított rovarszelektív CP450 inhibitor, a verbutin és a perbutin (4. ábra) vizsgálata esetén is hasznosnak bizonyult. Verbutin C H 2 C H2 Perbutin 4. ábra Verbutin és Perbutin szerkezeti képlete A biomimetikus rendszer alkalmazása révén sikerült megmutatni a két inhibitor citokróm P450 katalizált folyamatokra érzékeny pontjait. A két módszerből származó eredmények jó egyezést mutattak. Megmutattuk továbbá, hogy az inhibitorok a kémiai modellreakciókban olyan alternatív átalakulásokat is elszenvedtek, amelyek csak a peroxidázok (LiP, MnP) által katalizált folyamatokkal magyarázható. Ez alapján sikerült rámutatni a két inhibitor alkalmazásának lehetséges környezetvédelmi előnyeire is. 3. A FeTPPF 20 /H 2 2 biomimetikus rendszert a S katalizált szintézis modellezésére is sikerrel alkalmaztuk. Eredményeink jó egyezést adtak az is H 2 2 jelenlétében végbemenő folyamatával. Az eredmények 5
alapján megállapítható, hogy modellrendszerünk alkalmas lehet guanidin származékok biomimetikus oxidációjára, valamint potenciális -donorok azonosítására. 4. A HA asszociátumok antioxidáns hatását vizsgáló kísérleteinkben megmutattuk, hogy a HA (a HA) önálló antioxidáns hatást csak a H-kel és a - -tel szemben mutat. E sajátsága feltehetően a szerkezetében végbemenő degradációval hozható kapcsolatba ( önfeláldozó antioxidáns sajátság ). A kapott antioxidáns hatást leíró görbe mind a két esetben jól korrelált az egyes RM által indukált HA degradáció mértékét bemutató görbe lefutásával. A HA asszociátumok antioxidáns, illetve RM indukált degradációval szemben mutatott a a HA-nál fokozottabb hatásának okát két pontban látjuk: (i) a hatás következhet a változó oxidációs állapotú fémionok (Co 2+, Cu 2+ és Mn 2+ ) redox tulajdonságából. Ennek a hatásnak az érvényesülése figyelhető meg a Cu, Mn HA és Cu 2+, Mn 2+ 2 - -nal szemben, a Co, Mn HA és Co 2+, Mn 2+ AAPH-val szemben, valamint a Co, Cu HA és Co 2+, Cu 2+ - -el szemben mutatott hatásánál. Látható, hogy ezekben az esetekben nemcsak az antioxidáns hatás fokozódásáról van szó, hanem a Co 2+, Cu 2+ és Mn 2+ megvédték a HA-at az RM-ok indukált degradációtól is; (ii) a hatás másik lehetséges oka, a HA és a fémionok között kialakuló komplex kötődésnek tudható be. Ezt támasztja alá számos, a fémionok és a HA között kialakuló igen szoros kölcsönhatást bemutató vizsgálat. Figyelembe véve az egyes fémionok önálló farmakológiai hatását, a HA asszociátumoknak jelentős szerepe lehet olyan fokozott RM-ok megjelenésével járó betegségek (reumatoid artritisz, krónikus sebek stb.) 6
kezelésében, ahol fontos a HA reológiai tulajdonságának megtartása és a keletkező RM-ok eliminálása is. IRDALM Az értekezésben felhasznált közlemények 1. Gy. M. Keserű,Gy. T. Balogh,I. Czudor,T. Karancsi, A. Fehér, B. Bertók: Chemical Models of Cytochrome P450 Catalysed Insecticide Metabolism. Application to the xidative Metabolism of Carbamate Insecticides. (1999) J. Agric. Food. Chem. 47(1-2), 762-769. 2. Gy. M. Keserű, Gy. T. Balogh, S. Bokotey, G. Árvai, B. Bertók: Metalloporphyrin Catalyzed Biomimetic xidation of Aryl Benzyl Ethers. Implications of Lignin Peroxidase, Catalyzis. (1999) Tetrahedron 55, 4457-4466. 3. Gy. M. Keserű, Gy. T. Balogh, T. Karancsi: Metalloporphyrin Catalyzed xidation of - Hydroxyguanidines: A Biomimetic Model for the H 2 2 -Dependent Activity of itric xide Synthase. (2000) Bioorg. Med. Chem. Lett. 10, 1775-1777. 4. Gy. T. Balogh, J. Illés, Zs. Székely, E. Forrai, A. Gere: Effect of different metal ions on the oxidative damage and antioxidant capacity of hyaluronic acid (2003) Arch. Biochem. Biophys. 410(1), 76-82. 7
Az értekezésben fel nem használt közlemény Gy. M. Keserű, B. Volk, Gy. T. Balogh: Cytochrome P450 Catalysed itric xide Synthesis. (2000) J. Biomol. Struct. Dynam. 17(4), 759-767. Az értekezéshez kapcsolódó előadások, poszterek 1. Balogh Gy. T., Czudor I., Fehér A., Bertók B., Keserű Gy. M.: Kémiai modellek alkalmazhatósága enzimkatalizált folyamatok vizsgálatában. MKE Vegyészkonferencia, Siófok, szeptember 1-3., 1997. (poszter) 2. Balogh Gy. T., Czudor I., Fehér A., Bertók B., Keserű Gy. M.: Kémiai modellek alkalmazhatósága Citokróm P450 katalizált folyamatok vizsgálatában.. Kémiai Előadói apok, Szeged, október 13-15., 1997. (előadás) 3. Balogh Gy. T., Czudor I., Fehér A., Bertók B., Keserű Gy. M.: Elméleti és preparatív kémiai modellek alkalmazhatósága a CP 450 katalizált folyamatok vizsgálatában. A Gyógynövénykutatás Aktuális Kérdései: övénykémiai. Kemotaxonómia. Flavonoidkémia. Szeged, október 16-17., 1997. (előadás) 4. Balogh Gy. T.: Kémiai modellek alkalmazhatósága Citokróm P450 katalizált folyamatok vizsgálatában. Tudományos Diákköri Konferencia. BME, 1998. (előadás) 8
5. Balogh Gy. T.: Kémiai modellek alkalmazhatósága Citokróm P450 katalizált folyamatok vizsgálatában. TDK, Veszprém, 1998. (előadás) 6. B. Volk, Gy. T. Balogh, Gy. M. Keserű: Cytochrome P450 Catayzed itric xide Synthesis. Hungarian- German-Italian- Polish Joint Meeting on Medicinal Chemistry, Budapest Szeptember 2-6, 2001. (poszter) 7. Gy. T. Balogh, J. Illés, E. Forrai, Zs. Székely: Counter-ion effect on oxidative damage and free radical scavenger capacity of hyaluronic acid. Hungarian-German-Italian- Polish Joint Meeting on Medicinal Chemistry, Budapest Szeptember 2-6, 2001. (poszter) 8. Balogh Gy. T., Keserű Gy. M.: Lehetőségek metalloporfirinek jelenlétében végzett biomimetikus oxidáció alkalmazására. Gyógyszerkémiai és Gyógyszertechnológiai Szimpózium 2002, Visegrád, szeptember 30- október 1. 2002. (előadás) 9