BUDAPESTI MŰSZAKI ÉS GAZDASÁGTUDOMÁNYI EGYETEM VEGYÉSZMÉRNÖKI ÉS BIOMÉRNÖKI KAR OLÁH GYÖRGY DOKTORI ISKOLA A sikéralkotó fehérjék bioszintézise és a sikérkomplex reológiai sajátságai c. PhD értekezés tézisei Szerző: Abonyi Tibor Okleveles biomérnök Témavezető: Lásztity Radomir Professor emeritus Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszer-tudományi Tanszék Budapest 2010 1
1. ELŐZMÉNYEK, CÉLKITŰZÉSEK A XIX. és XX. század fordulóját követő intenzív kutatásoknak köszönhetően részletes képet nyertünk a búza kémiai összetételéről, az egyes összetevők különösen az endoszperm tartalékfehérjéinek szerepéről a minőség kialakításában. Főleg a glutenin alegységek és a minőség közötti összefüggések felderítése nyomán úgy tűnt, hogy a minőség előrejelzés és a minőség fejlesztését célzó nemesítő munka hatékony útjai tisztázódtak. Általánosan elterjedt a nagy molekulatömegű glutenin alegység spektrum alapján történő minőség előrejelzés (Glu-1 Score rendszer). A modern feldolgozási technológiák, a minőséggel szembeni növekvő követelmények nyomán azonban újabb kérdések merültek fel, amelyek válaszra várnak. Nevezetesen: az egyes fajták minősége évjáratonként jelentősen ingadozhat, míg a modern feldolgozási technológia egyenletes minőséget követel. Ez azt jelenti, hogy tisztázni kell, mi okozza a minőség ingadozást és ez hogyan kerülhető el. Kézenfekvő volt a feltételezés, hogy a választ a növény (a gabonaszem) fejlődése során lezajló folyamatok megismerése adhatja meg. Az első ilyen irányú kutatások több mint negyven éve indultak meg és napjainkra világszerte intenzívvé váltak. Ennek eredményeként ma már részletes betekintést nyertünk a búzafehérjék bioszintézisébe. Az endoplazmatikus retikulum (ER) felszínéhez kapcsolódó riboszómákon szintetizálódó polipeptidek az N-terminális szignál-peptid hasításával a membrán lumen felőli (belső) oldalára kerülnek. A kezdeti szakaszban a sikért alkotó polipeptidek különálló fehérjetestecskéket alkotnak. A fejlődés további szakaszában a különálló testecskék eltűnnek, és a keményítő szemcsét körülölelő összefüggő mátrix képződik. A széleskörű kutatások bizonyították, hogy a termesztésben alkalmazott agrotechnika (különösen a műtrágyázás) és az időjárási viszonyok (csapadék, napsütéses napok száma) jelentősen befolyásolják a fehérje bioszintézis dinamikáját, a makro frakciók arányát 1,2,3. Kevesebb figyelem fordult eddig az egyes polipeptidek szintézisének alakulására és méginkább a polipeptidek esetleges kölcsönhatásaira. Ezzel kapcsolatban különösen a glutenin alegységek kapcsolódására lehet gondolni. Már 1 Carceller, J. L. and T. Aussenac (2001). Australian Journal of Plant Physiology 28(3): 193-201. 2 Dupont, F. M. and S. B. Altenbach (2003). Journal of Cereal Science(38): 133-146. 3 Naeem, H. A. and F. MacRitchie (2005). Journal of Cereal Science 41(1): 7-12. 2
Magyar nyelvű előadás 11. Abonyi T.: A sikéralkotó glutenin alegységek vizsgálata. BME, 4. Doktoráns Konferencia (2007). Nemzetközi konferencia kiadványban megjelent idegen nyelvű publikáció 12. Lásztity R., Király I., Baticz O., Guóth A., Abonyi T., Tömösközi S., Gergely Sz.: Biosynthesis and in vivo and in vitro polymerization of glutenin subunits and its effect on quality of wheat. In Flour - Bread 05 (Proceedings of 3rd International Congress Opatija, Croatia), Ed by Hardi Z.U., p. 49-56 (2005). 13. Lásztity R., Abonyi T., Tömösközi S.: How to improve the quality prediction of wheat? In Flour - Bread 07 (Proceedings of 4th International Congress Opatija, Croatia), Ed by Hardi Z.U., p. 1-6 (2007). 14. Lásztity R., Abonyi T., Budai M, Tömösközi S.: Determination of hydrodynamic properties an useful tool in study of gluten quality. In Flour - Bread 09 (Proceedings of 5th International Congress, Opatija, Croatia), Ed by Hardi Z.U., p. 1-8, (2009). Nemzetközi konferencia kiadványban megjelent idegen nyelvű összefoglaló 15. Király I., Baticz O., Larroque O., Juhász A., Tömösközi S., Békés F., Guóth A., Abonyi T., Bedő Z.: Relationship between functional properties of wheat dough and the relative proportion of the polymeric fraction. In The Gluten Proteins (Proceedings of the 8th Gluten Workshop, 2003 in Viterbo, Italy), Ed by Lafiandra D., Masci S. and D Ovido R., Published by RCS, p. 323-326 (2004). 16. Baticz O., Király I., Abonyi T., Guóth A., Gergely Sz., Tömösközi S., Salgó A., Lásztity R.: Study of the in vivo and in vitro polymerisation of polypeptides of gluten complex: Changes in gliadin components during ripening of wheat. In Using cereal science and technology for the benefit of consumers (Proceedings of the 12th International ICC Cereal and Bread Congress, 23-26th May 2004, Harrogate, UK), Ed by Cauvain S.P., Salmon S.S., Young L.S., Woodhead Publishing, ISBN 1 85573 961 5, p. 527 (2005). korábbi tanszéki kutatások mutattak rá arra 4, hogy ugyanazon összetételű polipeptid keverékekből teljesen eltérő reológiai tulajdonságú sikérek állíthatók elő az oxidáció (diszulfid kötések kialakítása) körülményeinek (koncentráció, ph, karbamid jelenléte stb.) változtatásával. Előzőeket figyelembe véve alakultak ki az ezen értekezésben tárgyalásra kerülő kutatás céljai a következők szerint: - a tartalékfehérje monomerek (gliadinok, glutenin alegyégek) bioszintézisének dinamikája - a glutenin alegységek in vivo polimerizációja és a sikérkialakulás dinamikája - sikérfehérjék reológiája és kölcsönhatása más fehérjékkel 4 Lásztity, R. (1969). Periodica Polytechnica. Chem.Eng(13): 239-248. 2. KÍSÉRLETI MÓDSZEREK A monomer tartalékfehérjék bioszintézisének vizsgálatához két évjáratból (2005 és 2006) származó búzamagmintákat használtam a virágzás utáni 12. naptól kezdve az aratás napjáig (12-53 days post anthesis, DPA). A szemtömeg, nedvességtartalom és száraztömeg meghatározása a mintavétel napján történt. A búzamagok homogenizálását követően, 250 m lyukátmérőjű mikroszita segítségével különválasztottam a korparészt a lisztfrakciótól. A lisztfrakció nyersfehérjetartalmának meghatározása után a tartalékfehérje alegységek elválasztását RP-HLCval végeztem. A sikérpolimer in vivo kialakulását az Ukrainka búzafajta (HMW-GS összetétel 1, 7+8, 5+10) 2006. évi mintáin követtem az érés során (19-52 DPA). A búzamagokat átlagos szemtömegük ismeretében légszárítás után laboratóriumi malom segítségével őröltem. A 250 m alatti lisztfrakció sikérmennyiségének meghatározásához a hagyományos kézi mosásos módszert alkalmaztam. A polimerikus sikérfehérjék méret szerinti eloszlását SE-HPLC-val, a tartalékfehérje alegységek mennyiségi változását RP-HPLC-val követtem. Végül a sikérfehérjék vizes oldatának hidrodinamikai tulajdonságait módosított Ostwald (Cannon-Fenske) kapilláris vizskoziméterrel mértem. A sikérfehérjék és a pszeudocereáliák kölcsönhatásával kapcsolatos kutatások amarant és quinoa fehérjeizolátumok felhasználásával történtek. A különböző kísérleti tészták reológiai tulajdonságainak vizsgálatát mikro-valorigráffal végeztem. 10 3
3. EREDMÉNYEK 3.1. A tartalékfehérje monomerek bioszintézise A búzaszem érése során követtük a teljes fehérjemennyiség és az egyes tartalékfehérje alegységek relatív mennyiségének változását. Megállapítottuk, hogy a különböző fajták érése során a magban szintetizálódó fehérjék mennyiségi változása hasonló dinamikát mutat. A felhalmozódás sebessége, és a virágzástól eltelt idő közötti összefüggés leginkább szigmoid görbével jellemezhető. A korábbi, csak a gliadinok összmennyiségére koncentráló kutatásokkal szemben sikerült az egyes gliadin típusok ( -gliadinok) szintézisdinamikáját is követni. Az RP-HPLC technikával már jól mérhető gliadin mennyiség a virágzás utáni 15-16. nap után jelent meg. Az intenzív érési periódus az érési folyamat 20-26. napján kezdődött el és egészen a 40-43. napig tartott. A teljes érés szakaszában stagnálás, sőt kisebb csökkenés fordulhat elő a száradás és az ebből eredő kölcsönhatásváltozások eredményeként. Az egyes gliadin komponensek szintézise szinkronban folyik. 4 Gliadin alfrakciók koncentrációja (csúcsterület) 25 20 15 10 5 I. II. 0 10 15 20 25 30 35 40 45 50 DPA 1. ábra: A gliadin tartalékfehérjék bioszintézise A glutenin frakció szintézisének vizsgálatán túl megoldottuk az egyes glutenin alegységek bioszintézisének követését is. A HMW és LMW gluteinin alegységek már az érés korai szakaszában kimutathatók és szintézisük az eddigi tendenciákhoz hasonlóan ezután következik be és a teljes érés előtt befejeződik (kisebb eltérést csak a 6. AZ ÉRTEKEZÉS TÉMAKÖRÉBEN MEGJELENT KÖZLEMÉNYEK Folyóiratcikk angol nyelvű hatásfaktorral rendelkező folyóiratban 1. Abonyi T., Király I., Tömösközi S., Baticz O., Guóth A., Gergely Sz., Scholz É., Lásztity D., Lásztity R.: Synthesis of gluten-forming polypeptides. 1. Biosynthesis of gliadins and glutenin subunits. Journal of Agricultural Food Chemistry. 55(9), 3655 3660 (2007). IF: 2,322 (2006) 2. Tömösközi S., Gyenge L., Pelczéder A., Varga J., Abonyi T., Lásztity R.: Functional properties of of protein preparations from amaranth seeds in model systems. Eur.Food Res. Technol. 226(6), 1343-1348, (2008) (IF: 1.18) 3. Lásztity R., Abonyi T.: Predicton of wheat quality - A new strategy is needed. International Food Reviews 25(2), 126 141 (2009). IF: 1,500 (2007) 4. Abonyi T., Tömösközi S., Budai M., Gergely Sz., Scholz É., Lásztity D., Lásztity R.: Gluten formation from flour of kernels is developing wheat grains. Cereal Research Communication 38(1), pp. 90 100 (2010). IF: 1,190 (2007) 5. Tömösközi S., Lilla Gy., Pelcéder Á., Abonyi T., Lásztity R.: The effect of flour and protein praparations from amaranth and quinoa seeds on the rheological properties of wheat flour dough and bread crumbs. Czech Journal of Food Sciences, (In Press). IF: 0.602 (2009) Folyóiratcikk magyar vagy egyéb nem angol nyelvű folyóiratban 6. Lásztity R., Abonyi T., Tömösközi S., Gergely Sz., Scholz É.: Stabilan kvalitet brasna glavna zelja a stabilan i dobar kvalitet proizvoda glavni cilj pekara. Mlinpek Almanach (Jugoszláv Molnárok, Pékek Szaklapja) 12(127), 27 30 (2006). 7. Király I., Tömösközi S., Baticz O., Abonyi T., Guóth A., Gergely Sz., Lásztity R.: A sikérkomplex in vivo kialakulásának vizsgálata. 1. A gliadinok bioszintézise a szemfejlődés során. Növénytermelés 56(3), 131 138 (2007). 8. Abonyi T., Guóth A., Király I., Tömösközi S., Baticz O., Gergely Sz., Lásztity R.: A sikérkomplex in vivo kialakulásának vizsgálata. 2. A gluteninalegységek szintézise és polimerizációja a szemfejlődés során. Növénytermelés 56(3), 139 145 (2007). 9. Abonyi T.: A tartalékfehérjék kémiai összetétele és a búza minőségének előrejelzése. Élelmezési Ipar 62(4) 120-126 (2008). 10. Abonyi T., Budai M., Lásztity R.: Sikérfehérjék hidrodinamikai vizsgálata. Mit árulhatnak el a sikérről? Élelmezési Ipar 62(1) 22-24 (2008). 9
5. ALKALMAZÁSI LEHETŐSÉG A PhD dolgozat egy új viszkozimetriás módszer lehetőségét teremti meg a tartalékfehérje vizsgálatok területén, alapozva az RP- és SE-HPLC technikákkal elért eredményekre, valamint a polimerekre vonatkozó Staudinger szám alakulására. Hogy a bioszintézis során tapasztalható viszkozitás növekedés, valamint az eredeti és a redukált glutenin viszkozitása közötti különbség mérése alkalmas lehet-e következtetések levonására sütőipari minőség vonatkozásában, azt további részletes kutatásoknak kell eldönteni esetleg újabb hidrodinamikai (pl.: Flow-field fractionation, FFF) módszerekkel történő vizsgálatok alapján. kimagaslóan jó sütőipari minőséggel rendelkező Bánkúti 1201 fajta LMW alegységeinek szintézise során tapasztaltunk). A HMW alegységek (Dy, By, Dx, Bx, Ax) egyidejűleg szintetizálódnak, mennyiségi szempontból a B és a D kromoszómán kódolt alegységek szintézise a domináns. Glutenin fehérjék koncentrációja (csúcsterület) 5 4 3 2 1 I. II. 0 10 15 20 25 30 35 40 45 50 DPA HMW LMW 2. ábra: A HMW- és LMW glutenin fehérjék bioszintézise 3.2. A glutenin alegységek polimerizációjának vizsgálata és a sikérkialakulás dinamikája a búzamag érése során A lisztből kimosható sikérpolimer kialakulásának dinamikáját követve megállapítottuk, hogy a virágzás utáni 24. napig nem alakult ki összetapadó nedves sikér annak ellenére, hogy a tartalékfehérjék szintézise már a 12. nap környékén megkezdődik. Feltételezzük, hogy a kis mennyiségben szintetizálódott glutenin alegységek nem érik el a hálózat kialakulásához szükséges kritikus koncentrációt és polimerizáltsági fokot. A kritikus 12-24. napokon a HMW és LMW alegységek egy szemre jutó mennyisége 0,3-0,5 mg között mozog. A kritikus polimerizáltsági fok megállapításához további kutatások szükségesek. A kapott RP-HPLC kromatogramok alapján a 12. DPA környékén megjelenő nagy és kis molekulatömegű glutenin alegységek (HMW és LMW alegységek) a 29. DPA érik el végleges alegység összetételüket. A 29. napig növekvő HMW/LMW arány ezután állandósul, valamint változás történik a sikérfehérjék SE-HPLC-val tapasztalt UPP mennyiségében is. Az UPP arány a 29. DPA után nem növekszik jelentősen. Mindez 8 5
arra utal, hogy a glutenin alegységek közötti kovalens kötések kezdeti kialakulása után az alegységek szintézisének hiányában a molekulatömeg-növekedés leáll. A HMW és LMW glutenin alegységeket összekötő diszulfid kötések kémiai bontását jól lehet követni az oldat viszkozitásának csökkenésével. Ebből a megfigyelésből kiindulva vizsgáltuk a búzaszem fejlődése közben vett mintákból nyerhető sikérek oldatainak viszkozitását. A mérések azt igazolták, hogy a kimosható sikér fehérjetartalmának egyre lassuló növekedése mellett az azonos fehérje koncentrációra beállított sikéroldatok viszkozitás növekedése következett be a nem extrahálható polimerikus fehérje frakció (UPP) alakulásával szoros összefüggésben (r 2 =0.87). Bizonyítottuk, hogy a viszkozitás Ostwald kapillárissal történő mérésével a szemfejlődés során követhető a glutenin alegységek polimerizációja és a glutenin bioszintézise (3. ábra). 4. TÉZISEK 1) A gliadinok és az egyes gliadin típusok ( -gliadinok) szintézisdinamikája leginkább szigmoid görbével jellemezhető a búzamag érése során. A teljes érés szakaszában stagnálás, esetleg kisebb csökkenés fordulhat elő a száradás és az ebből eredő kölcsönhatásváltozások eredményeként. Az egyes gliadin komponensek szintézise szinkronban folyik (1.). 2) A HMW és LMW glutenin alegységek már az érés korai szakaszában kimutathatók. Szintézisük az eddigi tendenciákhoz hasonlóan ezután következik be és a teljes érés előtt befejeződik. A HMW alegységek (Dy, By, Dx, Bx, Ax) egyidejűleg szintetizálódnak és mennyiségi szempontból a B és a D kromoszómán kódolt alegységek szintézise a domináns (8.). Relatív viszkozitás 1,5 1,4 1,3 1,2 1,1 1 0,9 10 20 30 40 50 60 Virágzás utáni napok száma (DPA) 3. ábra: Sikéroldat relatív viszkozitásának változása az érés során 3) A virágzás utáni 24. napig nem alakult ki összetapadó nedves sikér annak ellenére, hogy a tartalékfehérjék szintézise már a 12. nap környékén megkezdődik. A kis mennyiségben szintetizálódott glutenin alegységek nem érik el a hálózat kialakulásához szükséges kritikus koncentrációt és polimerizáltsági fokot (4.). 4) A HMW és LMW alegységek a virágzás utáni 29. nap érik el végleges mennyiségüket. Ezután jelentős növekedés nem figyelhető meg az egymáshoz viszonyított arányukban (HMW/LMW), valamint állandósul a nem extrahálható polimerikus fehérjék aránya (UPP) is. Mindez arra utal, hogy a glutenin alegységek közötti kovalens kötések kezdeti kialakulása után, a polimerizáció az érés későbbi szakaszában lassul (4). 3.3. A sikér- és amarant illetve quinoa fehérjék kölcsönhatása Az amarant és quinoa fehérje izolátumok adagolása a tészta reológiai sajátságainak javulását eredményezi, ami annak a jele, hogy a fehérjék között nem áll fenn a szerkezeti inkompatibilitás jelensége. 6 5) A búzaszem fejlődése közben vett lisztmintákból nyerhető sikérek oldatainak relatív viszkozitás növekedése következett be a sikér fehérje UPP tartalom változásával csaknem párhuzamosan. Bizonyítottuk, hogy a viszkozitás mérésével követhető a glutenin alegységek polimerizációja, és a glutenin bioszintézise a szemfejlődés során (4). 6) Az amarant és quinoa fehérje izolátumok adagolása a sikértészta reológiai sajátságainak javulását eredményezi, ami annak a jele, hogy ezen pszeudocereáliák és a sikérfehérjék között nem lép fel a szerkezeti inkompatibilitás jelensége (5). 7