A diffúzió csak rövid méretsálán gyors Az élő sejt fizikai Biológiája: Diffúzió, polimerizáció, reptáció Kellermayer Miklós Négyzetes összefüggés: meredekség=2 A DIFFÚZIÓ ÉS BOLYONGÓ MOZGÁS KAPCSOLATA A polimérek alakja a bolyongó mozgásra emlékeztet Brown-mozgás - random walk r1 R rn Négyzetgyök törvény : R 2 = Nl 2 = Ll R = elmozdulás N = elemi lépések száma l = r i = átlagos szabad úthossz r i = elemi lépés Nl = L = teljes út Bolyongó (Brown-féle) mozgás ( random walk ) r1 Négyzetgyök törvény : R 2 R rn = Nl 2 = Ll R = vég-vég távolság; r i = elemi vektor; N = elemi vektorok száma; l = r i = korrelációs hossz ( perzisztenciahossz, hajlítómerevség mértéke); Nl = L = kontúrhossz Az elemi vektorok orientációs rendezetlenségre törekvése rugalmasságot eredményez Entropikus rugalmasság: Termikus gerjesztésre a polimerlánc random, ide-oda hajló fluktuációkat végez. Nő a lánc konformációs entrópiája (elemi vektorok orientációs rendezetlensége). Az entrópiamaximumra törekvés miatt a polimerlánc rövidül. Átlagos részecske sebesség: v = l τ Teljes bolyongási idő: t = Nτ R = Nl 2 = t τ l 2 = tvl = 3Dt Diffúziós együttható: D = 1 3 vl Bolyongó (diffúzióvezérelt) mozgás esetén R=elmozdulás, N= elemi lépések száma, L=teljes megtett út, és l=átlagos szabad úthossz. Makroszkópikus folyamat esetén: <Δx 2 >=2Dτ. <Δx 2 > = átlagos négyzetes elmozdulás, D = diffúziós állandó, τ = diffúziós idő (megfigyelés időtartama)
Polimerlánc egyensúlyi alakja Az a makroállapot, amely a legtöbb mikroállapottal valósítható meg (legvalószínűbb állapot) Féregszerű polimermodell (Wormlike chain) WLC (wormlike chain): ha s elég nagy, cosθ () s s függvényében lecseng: cosθ () s = exp s l p =perzisztencia hossz l p ha s<<l p, akkor cosθ () s ~1, és a θ(s) szög körül fluktuál. Ha s>>l p, akkor cosθ () s ~, azaz θ(s) és 36 közötti értékeket ugyanolyan valószínűséggel vehet fel. A perzisztencia hossz értelme: az a hossz, amelyen belül a lánc megtartja irányát (emlékszik rá). A perzisztencia hosszon túl a lánc elfelejti irányítottságát. s θ(s) DNS molekulák atomerő mikroszkópos felvétele 5 nm EI = hajlítómerevség (E = Young modulus - anyagfüggő, I = keresztmetszet másodrendű nyomatéka - alakfüggő); kbt = termikus energia Értelme: minél merevebb egy lánc, annál nagyobb távolságon (lp) lesznek csak észlelhetők a termikusan gerjesztett fluktuációk. A globális alak és rugalmasság között összefüggés van l = perzisztencia hossz (hajlítómerevséget jellemzi) L = kontúrhossz Entropikus rugalmasság vizualizálása Csomókötés egyetlen DNS láncra Merev lánc l>>l Mikrotubulus mikrogyöngy mozgatható lézercsipeszben Fáziskontraszt kép Fluoreszcencia kép Szemiflexibilis lánc l~l Aktin filamentum Flexibilis lánc l<<l DNS molekula mikrogyöngy stacionárius lézercsipeszben Kinosita Group
A humán genom fizikai mérete A tanteremnyi modell-sejtre adaptálva: Idealizált sejt: 2 µm oldalfalú kocka Analógia - Tanterem: 2 m oldalfalú kocka filamentum a reptációs alagútban A DIFFÚZIÓ SPECIÁLIS ESETE: REPTÁCIÓ Reptáció: polimér hálóban történő kígyószerű diffúzió. (Reptilia: hüllők) DNS vastagsága 2 nm 2 mm DNA teljes hossza 2 m 2 km Perzisztenciahossz (LP) 5 nm 5 cm Átlagos vég-vég hossz 32 µm 32 m polimér mátrix: entanglement (összegabalyodás) Actin filamentumok metilcellulóz mátrixban. Egyenirányított diffúzió Girációs sugár (RG) 13 µm 13 m Tehát: az egyensúlyi alakú DNS nem férne el a sejtben. Teljesen kompakt DNS (elméletileg legkisebb) térfogata (2 mm alapterületű, 2 km hosszú henger térfogata): 8 m 3 (2 m élhosszúságú kocka) A DNS-t a sejtben csomagolni szükséges! Egyedi nukleoszóma partikulum: hiszton fehérjekomplex (oktamer) + ~1.6-ször köré tekeredett DNS 2 L N τ r = μ k T τ r = Reptációs idő, egy kontúrhossznyi távolság megtételéhez szükséges idő; L = kontúrhossz; N= elemi szegmensek száma; μ = lánc mozgékonyság; kt = termikus energia D r = ( a N ) τ r 2 D r = Reptációs diffúziós állandó; N= elemi szegmensek száma; a = elemi szegmens hossz (~perzisztenciahossz); τ r = reptációs idő. N.B.: számláló az átlagos négyzetes elmozdulással analóg. Polimerizáció Alegységek összeállásának folyamata Polimerizációs egyensúlyok 1. valódi equilibrium Polimer mennyiség A polimerizáció fázisai: 1. Lag fázis: nukleáció 2. Növekedés fázisa 3. Equilibrium (egyensúly) fázisa Equilibrium 2. dinamikus instabilitás: folyamatos, lassú növekedést követő katasztrofikus depolimerizáció Növekedés Lag Idő 3. Treadmilling: taposómalom
Dinamikus instabilitás Mikrotubulusok In vivo treadmilling Gary Borisy Aktin GFP-aktin Speckle microscope Clare Waterman-Storer Microtubulusok Gary Borisy Motilitás aktin polimerizációval Intracelluláris patogének mozgása Motilitás aktin polimerizációval In vitro körülmények Listeria monocytogenes F-aktin jelölés phalloidinnel Shigella flexneri Listeria Xenopus extraktumban ActA-val aszimmetrikusan bevont mikrogyöngy Xenopus extraktumban ActA-val szimmetrikusan bevont mikrogyöngy Xenopus extraktumban ActA: A protein expressed by the bacterium Listeria monocytogenes that is responsible for the "rocketing" motility of the bacterium throughout the eukaryotic host cell. In addition to other host proteins, ActA binds actin directly.
A diffúzió speciális esete: Brown-féle kilincskerék Kilincs Kilincskerék potenciál A polimerizációs erő megmérhető Brown-féle mozgás k be δ k ki Diffúzió F Listeria monocytogenes intracelluláris mozgása aktin polimerizációval K(F) = erő jelenlétében fennálló disszociációs állandó - az a monomer koncentráció, amelynél a nettó filamentum növekedés. Kc = kritikus koncentráció ( erőnél); F = erő; δ = diszkrét növekedés egyetlen monomer beépülésekor. kbt = termikus energia. N.B.: F lehet + vagy -. A folyamat lehet reakcióvezérelt (a kbe-hez képest túl gyors diffúzió) vagy diffúzióvezérelt (a kbe-hez képest lassú diffúzió). MT-depolimerizációvezérelt erőkifejtés MCAK: MT-depolimerizáló kinezin MCAK: Kinezin-13 A MT + végéhez kötődik Diffúziós mechanizmussal keresi meg a + véget ATP-t hidrolizál MT depolimerizációt szabályoz ( katasztrófa-faktor ) MCAK-indukált MT depolimerizáció Vezikulum transzport MT depolimerizációval Kromoszóma (kinetochore) mozgatás MT depolimerizációval Diffúziós keresés a MT mentén (GFP-MCAK)
Motorfehérjék Az élő sejt fizikai Biológiája: motorfehérjék 1. Specifikus citoszkeletális filamentumhoz kapcsolódnak (DE ) 2. Elmozdulást és erőt generálnak 3. Kémiai energiát használnak fel 4. Kémiai energiát közvetlenül alakítják mechanikai munkává (nincs közbülső hővagy elektromos energia) Motorfehérjék alaptípusai In vitro aktomiozin motilitás 1. Aktin alapú Miozinok: Konvencionális (miozin II) és nem-konvencionális Miozin szupercsalád (I-XXIV osztályok). Plusz vég irányába mozognak. Miozin Aktin 2. Mikrotubulus alapú a. Dineinek: Ciliáris (flagelláris) és citoplazmáris dineinek. A mikrotubulus mentén a minusz vég irányába mozognak. b. Kinezinek: Kinezin szupercsalád: konvencionális és nem-konvencionális. A mikrotubulus mentén a plusz vég irányába mozognak. c. Dinaminok: MT-függő GTPáz aktivitás Biológiai szerep: vakuoláris fehérjeválogatás (pinchase enzimek)? Mikroszkóp fedőlemez HMM 1 mm ATP 3 mm MgCl2 3. DNS alapú mechanoenzimek DNS és RNS polimerázok, vírus kapszid csomagoló motor, kondenzinek A DNS fonal mentén haladnak és fejtenek ki erőt 4. Rotációs motorok F1F-ATP szintetáz Bakteriális flagelláris motor Vastag filamentum Gyakoriság Immobilis frakció Mobilis frakció (1.3 μm/s) 5. Mechanoenzim komplexek Riboszóma Aktin filamentum Sebesség (μm/s)
processzív A miozin szupercsalád 5% homológia a tagok között A miozin II 2 db alfa-hélixből coiled-coil könnyűláncok nyaki v. pánt régió "konvencionális" 2-fejű Regulatórikus könnyű lánc (RLC) ATP-kötő zseb csupasz zóna miozin fejek Minusz vég irányába mozog miozin fejek miozin farok Nyak (erőkar) Esszenciális könnyű lánc (ELC) Konverter domén Aktin-kötő hely A miozin fej (Subfragment-1) Típusok: axonemális és citoplazmáris. Sok alegységes fehérjék (Mr~5 kda) A minusz vég irányába mozognak. Koordinált működésük meghajlítja a ciliumot. Dineinek A motor domén mutációi hipertrofiás kardiomiopátiához vezetnek!
minusz vég irányába mozog Processzív motorok. Plusz vég irányába mozognak. Vesicular transport Vakuoláris fehérjeválogatás GTPázok Dinaminok Switch domén: hasonlít a miozinhoz és G-fehérjékhez. pinchase funkció DNS motorok Processzív motorok Vírus portális motor Különleges DNS motor T7 DNS Polimeráz φ29 bacteriofág portális motor RNS Polimeráz RNS Polimeráz, Wang et al. 1998.
DNS mechanoenzimek Kondenzinek SMC fehérjecsalád SMC = "structural maintenance of chromosomes" MukBEF nanomechanika és kondenzációs model ROTÁCIÓS MOTOROK I: F1F-ATP SZINTETÁZ ROTÁCIÓS MOTOROK II: Bakteriális flagellum motor 2 nm ATP 2 nm ATP Diszkrét 12 rotációs lépések Kinosita Fordulatszám: > 2 rpm Fogyasztás: 1-16 W Hatásfok: > 8% Energiaforrás: protonok
Mechanoenzim komplex Riboszóma Az élő sejt fizikai Biológiája: Egyensúlytól távoli folyamatok Wen et al. Nature 28 2.7 nm-es lépések (egy triplett).78 s transzlokációs idő Transzlokációval csatolt helikáz aktivitás Titin: rugalmas molekuláris gyöngyfüzér Izomköteg Titinmolekula nanomechanikája lézercsipesszel Izomrost Erőválasz Erővezérelt szerkezetváltozások: Nemlineáris rugalmasságra szuperponált domén kitekeredés Összehúzódás Z Vékony filamentum Titin I-szakaszbeli szegmens M Szarkomer Vastag filamentum Miofibrillum Z 1 8 6 4 2 6 55 5 45 4 A ~28 nm 1.75 1.8 1.85 Nemlineáris rugalmasság Domén kitekeredés C.5 1 1.5 2 2.5 Megnyúlás (µm) B F E D Nemlineáris rugalmasság A-B C D E F Ig-domén (7-szálú ß-hordó) tandem Ig-régió PEVKdomén tandem Ig-régió A domének egymás után, a mechanikai stabilitásuk növekvő sorrendjében tekerednek ki.
Erővezérelt fehérje-kitekeredés Titin I55-62 rekombináns fragmentum kitekerése G k off Fx ß Tranzíciós állapot Titin I55-62: viszkoelasztikus molekulaszakasz Az I55-62 fragmentum kitekeredési görbéje 2 Gyakoriság 3 2 1 ΔL Natív állapot x ß F unf = k BT x β ln Kitekert állapot Reakció koordináta rx β k B T k unf 3 2 1 ΔL 15 1 5 1 2 3 Kitekeredési erő (pn) 4 2 pn Kitekerési erő 5 nm ΔL = 29,8 ± 3,5 nm 2 pn 5 nm ΔL = 29,8 ± 3,5 nm Mechanikai stabilitás alapja: Az Ig domén első és utolsó ß-láncait összetartó, párhuzamosan csatolt H-hidak A mechanikai stabilitás biológiai logikája Szerkezetet összetartó H-hidak párhuzamos csatolása Nagy kitereredési erő Titin nanomanipulálás erővisszacsatolt lézercsipesszel Referencia jel (erő) Csapdázott gyöngy Mozgatott gyöngy T12 anti-titin ellenanyaggal bevont gyöngy Mért jel (+/-) (erő) Σ Szerkezetet összetartó H-hidak soros csatolása Alacsony kitereredési erő sulfo-sanpah keresztkötővel bevont latex gyöngy titin Feedback vezérlés mozgatható mikropipetta Vezérelt kimenet (+/-) (piezo mogás)
Konstans-erő kísérlet egyetlen titinmolekulán Titin kitekeredés konstans erőnél 3 Lépcsőméret eloszlás 28.2 ± 14.6 SD Megnyúlás (nm) 12 8 4 3 25 2 15 1 Kvázi erőrámpa..2.4.6.8 1. x1 6 Idő (1 3 s) ~2-perces adatsor High-force clamp Low-force clamp Kiteredési görbe Visszatekeredési görbe Megnyúlás (nm) 1 4 38 36 34 32 3 28 26 Monoexponenciális Singleexponential görbeillesztés fit Megnyúlás (nm) 182 1696 159 1484 ~28 nm lépcsők 15 2 25 3 x1 3 5 1 15 2 25 x1 3 A várttól eltérések mutatkoznak a lépcsőméret eloszlásban, a monoexponenciális idő-megnyúlás görbe lefutásában és az erőfüggő sebességi állandó összefüggésben. Freqency Rate constant (s -1 ) 25 2 15 1 5 1.1 Megnyúláslépcsők többsége: egyedi doménkitekeredési esemény 1 2 3 4 5 6 Step size (nm) Erőfüggő sebességi állandók 94 97 1 13 Feedback force (pn) Megnyúlás (µm) Doménkitekeredés hirtelen ugrásokban Kitekeredési ugrások Doméncsoportok korrelált szerkezeti elrendeződést mutatnak fej farok 1.6 Topografikus magasság (nm) 1.2.8.4 Autokorreláció függvény 4-4 2 4 6 8 Axiális távolság (nm) Kellermayer et al. BBA Bioenergetics 23 5-1 doménből álló csoportok kooperatíven tekeredhetnek ki. Megnyúlás (µm) Szerkezeti átmenetek alacsony erőnél Nagy lépcső (>1 nm) Elsimult átmenet Az elsimult és nagy, lépcsőszerű átmeneteket a PEVK doménben kialakuló rövid- és hosszútávú elektrosztatikus kölcsönhatások okozhatják, amelyek a mechanikai fáradás alapjául szolgálnak. 8 pn 7 pn 6 pn 5 pn 4 pn 3 pn 2 pn 1 pn 5 pn Molekuláris fáradás Domén kitekered és Sima Nagy lépcső T12 9D1 (PEVK) Megnyúlás (μm) Z Trombitás et al. J. Struct. Biol. 1998. Titin T12 és 9D1 ellenanyagokkal megragadva Megnyúlás (μm)
Megnyúlás (nm) Titin gombolyodás konstans erőnél 1 2 15 1 5 Kitekert állapot Gyors kontrakció (entrópikus kollapszus) Szerkezeti fluktuációk (A fázis időtartama rövidül az erő csökkenésével) Végső kontrakció (ritkán tapasztalható) Teljesen feltekert állapot 3 4 5 6 7 8 9 x1 3 Az erőt ~3 pn alá kell csökkenteni jelentős domén visszatekeredéshez. A fluktuáció diffuzív keresés a konformációs térben. Részleges viszatekeredés: doméncsoportok kooperatívan tekeredhetnek. Kitekeredés Megnyúlás (μm) Megnyúlás (μm) Fluktuációk Domén unfolding ~7 nm 4 pn Fluktuációk Részleges refolding Megnyúlás (nm) 1 15 1 5 A visszatekeredési útvonal változatos még egyetlen molekula esetén is 6 8 1 12 14 16 18 x1 3 Erővezérelt ki- és visszatekeredés Titinben: -Kooperatív kitekeredés -Mechanikai fáradás -Diffuzív keresés a konformációs térben -Kooperatív visszatekeredés -Mechanikai erő és random fehérjeszakaszok modulálhatják a gombolyodás folyamatát