A TERMÉSZETES ÉS ÉPÍTETT KÖRNYEZET VÉDELME 6 6.1 1.6 Petrolkémiai iszappal szennyezett talaj bioremediációja Tárgyszavak: petrolkémia; iszap; talajszennyezés; bioremediáció; baktérium. A kőolajszármazékok termelése és felhasználása során szennyeződik az üzemek körüli talaj. A szennyezett környezet helyreállítására számos technológiát dolgoztak ki. Egyikük a bioremediáció, amelynek célja a szennyezők lebontása és az ártalmatlanítás. Leggyakrabban őshonos mikroorganizmusokkal, helyben végzik ezt az eljárást. Így csökkentik a szénhidrogének koncentrációját, mobilitását és a talaj szennyezését. Korábban a bioremediáció végpontját a talajban maradó mérgező anyagok koncentrációja alapján határozták meg. A kémiai elemzés önmagában nem veszi figyelembe a szennyezők biológiai hozzáférhetőségét. Emellett számos vegyület metabolitokká alakul át, amelyek perzisztenciája és toxicitása ismeretlen. A biológiai vizsgálat ezt számításba veszi. Emiatt előnyös a biológiai vizsgálatokon alapuló monitorozás. Jelenleg nincs egyértelmű útmutatás a bioremediáció végpontjának biológiai meghatározására. A talaj mikroorganizmusai jó indikátorai a mérgező anyagoknak, mert mindenütt jelen vannak, érzékenyek a szennyező anyagra, és részt vesznek a geokémiai ciklusokban. A mikrobák érzékenyek a szennyezésre, és a mikrobiális tevékenység gátlása befolyásolja az általuk szabályozott ökológiai folyamatokat. A bakteriális populáció dinamikájának jobb ismerete a szennyezett talajrendszerben, valamint a baktériumok által szabályozott átalakulási folyamatok tanulmányozása segíti a mikrobadiverzitás fontosságának megértését a talaj ökorendszer folyamatai szempontjából. A biodiverzitási vizsgálatok során a tenyészettől független módszerek különösen nagy figyelmet kapnak, mert általában az a vélemény, hogy a talajbaktériumoknak csak kis hányada képez telepeket az általános laboratóriumi táptalajon. Az a ta-
pasztalat, hogy a könnyen tenyészthető talajmikroba-közösségek a legfontosabbak a biomassza és az aktivitás szempontjából, ezek jelentik az ökológiailag releváns frakciót. Több eljárást dolgoztak ki a vegyi anyagok talajorganizmusokra gyakorolt hatásának értékelésére. Azonban a természetben az ökotoxicitás értékelése mindig gondot okoz, mivel a szennyezés pontos jellege, az időjárás, a természetes lebomlás és a helyreállítatlan talaj tulajdonságai csak részben ismertek. Az alábbi vizsgálatok célja a tenyészthető baktériumpopuláció változásainak és fitotoxicitásának megfigyelése volt laboratóriumi bioremediáció során, valamint a korreláció értékelése a maradék szénhidrogénkoncentráció és a mikrobapopuláció összetétele között, a baktériumok anyagcseréje alapján. Anyagok és módszerek Iszap talaj reaktorok A vizsgálatot olaj víz szeparátorból származó iszapmintával végezték. Az elemzés szerint a 91 g összes szénhidrogén/kg iszap 60%-a policiklikus aromás szénhidrogén (PAH), ezen belül bi-, tri-, tetra- és pentaciklikus összetevő volt. A talaj agyagot (ph = 5,8 5,9), 3,60% szerves szenet, 6,21% szerves anyagot, 0,296% összes nitrogént, 0,00042% foszfort tartalmazott, a gázkromatográfiásan kimutatott összes szénhidrogén mennyisége 0,5 g/kg volt. Háromféle talaj iszap mintát készítettek (2,50; 5,00 és 10,0 g iszap/100g száraz talaj koncentrációval). Kontrollként iszapmentes talajt használtak. 10% iszaptartalmú, 2 %(m/m) HgCl 2 -ot tartalmazó talaj volt az abiotikus kontroll. Az 5 kg-os üvegtartályokba 2 kg iszap talaj keveréket tettek. Utóbbit alapos kézi keverés után rostálták (2 mm lyukméret). Az összes rendszert 20±2 C-on, sötétben, 1 éven át inkubálták. A tartályok tartalmát hetente levegőztették, nedvességtartalmukat meghatározták, és desztillált víz hozzáadásával fenntartották. Kémiai elemzés A talaj szénhidrogén-tartalmát az etil-éterben oldható frakcióból gravimetriásan határozták meg.
Megállapították a gázkromatográfiásan hozzáférhető szénhidrogének és egyes PAH-vegyületek koncentrációját. A talajmintát vízmentes nátrium-szulfáttal keverték, 6 órán át extrahálták n-hexánnal. A gázkromatográfot lángionizációs detektorral látták el. Tenyészthető baktériumpopuláció Időközönként meghatározták az életképes baktériumok és gombák számát. A legnagyobb mennyiségben szereplő baktériumokat kétszer izolálták a bioremediáció alatt. Körülbelül 30 40 telepet izoláltak, és meghatározták morfológiai tulajdonságaikat, kataláz-, oxidáz-, OF glükóz- és szénfelhasználási viselkedésüket. Összehasonlító vizsgálatot végeztek a Gram-negatív baktériumok metabolikus profiljáról a kontroll és az iszap talaj tartályokban. Toxicitásvizsgálat Biológiai módszerrel vizsgálták a magcsírázás gátlását a vizes talajextraktumon, kezdetben és 44, 90, 180, valamint 373 napi kezelés után. A talajra helyezett szűrőpapírokra magokat tettek, majd inkubálás után meghatározták a kicsírázott magvak számát. A csírázást 50%-ban gátló vizes extraktumok hígítását (IC50) lineáris interpolálással számították ki. Eredmények A kezelés első 70 napja során mindegyik rendszerben jelentős mértékben csökkent az összes szénhidrogén-tartalom. Egy év alatt a szénhidrogén-koncentráció a kezdeti szinthez képest 92 95%-kal csökkent a gázkromatográfia szerint, és 42 46%-kal az etil-éterben oldható frakció mérése alapján. A különbséget valószínűleg a nem szénhidrogén jellegű anyagok jelenléte okozta, amelyeket az etil-éter extrahált, de a gázkromatográf nem mutatott ki. Az abiotikus rendszerben a szénhidrogének bomlása 4% volt. Ez arra utal, hogy a mikrobák tevékenysége távolította el azokat. Az elemzési görbék korrelálnak a következő egyenlettel, amely kétlépcsős reakciót ír le: a legkönnyebben lebontható frakció kezdeti gyors csökkenését, majd a stabilabb frakciók lassabb csökkenését:
C t = a e -kt + b ahol C t a talajkoncentráció a t időpontban (mg/kg száraz talaj), a a könnyen bomló frakció kezdeti koncentrációja a talajban (mg/kg száraz talaj), k a könnyen bomló frakció eltávolítási sebességi állandója (1/nap), t az idő (nap) és b a nehezen bomló frakció kiindulási koncentrációja a talajban. A k-érték függött a kezdeti szénhidrogén-koncentrációtól, csökkent a növekvő kiindulási szénhidrogén-koncentrációval. A maradék szénhidrogén-koncentráció (b) arányos volt a kiindulási iszapkoncentrációval. Mivel a szénhidrogén-koncentráció gravimetriás értékelése figyelembe veszi az anyagcseretermékeket és más vegyületeket is, a gázkromatográfiás és etil-éteres elemzés eredményei erősen eltérnek. A gravimetriás mérési görbe meredeksége kezdetben kisebb volt, mint a gázkromatográfiás görbéé, majd a folyamat későbbi szakaszában nagyobb lett annál. Ez részben azzal magyarázható, hogy kezdetben a szénhidrogén gyors eltávolítását az anyagcseretermékek termelése kísérte. Később a szénhidrogén-metabolitok és a szénhidrogének lassan távoztak, csökkenő etil-éteres értékeket adva. A heterotrof, szénhidrogénbontó és fenantrénbontó baktériumok száma jelentősen növekedett az összes iszapkoncentráció mellett a kontrollrendszerhez képest. A gombák száma viszont nagyobb iszapkoncentráció esetén jelentősen csökkent. Az összes iszap talaj rendszerben a heterotrof baktériumok száma egész év folyamán nagyobb maradt, mint a kontrolltalajban. A szénhidrogénbontó baktériumpopuláció az első 21 napban gyorsan szaporodott minden rendszerben, a szénhidrogének gyors bomlása következtében. Ez a gyors kezdeti növekedés indikátorul szolgálhat a bioremediáció megvalósíthatóságának vizsgálatára. A populáció gyorsan csökkent, és a kontrollrendszerhez hasonló koncentrációt ért el. A fenantrénbontó baktériumok lassabb szaporodása 61 nap után érte el maximumát. Egy év múlva a fenantrénbontó baktériumok száma az összes iszaptartalmú tartályban még mindig erősen eltért a kontrollrendszerben levőtől. A kontroll és az iszapos rendszerekből a baktériumokat a kezelés 35. napja után izolálták, a szénhidrogének gyors fogyása idején. Összesen 266 baktériumot különítettek el és jellemeztek. A legnagyobb populáció a kontrollrendszerben 57% Gram-pozitív baktériumot, főleg coryneformokat (43%) tartalmazott. Gram-negatív
baktériumok szintén jelen voltak, köztük Pseudomonas (21%) és Acinetobacter (11%). A Pseudomonas nemzetségbeli baktériumok aránya jelentősen nőtt az iszapkoncentráció növekedésével. Azonban csak az iszap talaj rendszerek 10%-ában volt jelentős változás a Gram-pozitív/Gram-negatív baktériumok arányában a kezelés során. A baktériumizolátumok azt mutatták, hogy a Pseudomonas volt a legfőbb összetevő a szénhidrogénbontó populációban. A legkisebb iszaptartalmú rendszerben a legnagyobb a fajdiverzitás. A szennyezett ökorendszerek mikrobiális közösségeiben azok a szervezetek dominálnak, amelyek fel tudják használni a mérgező anyagokat, vagy ellenállóak a méreggel szemben. Ennek eredményeképpen ezek a közösségek kevésbé sokszínűek, mint a stressz nélküli ökorendszerek. Az ismertetett vizsgálatok szerint az iszap talaj reaktorok szelektíven dúsult környezetek voltak, amelyek kedveztek a tenyészthető Gram-negatív baktériumoknak, ennek eredményeképpen csökkent a diverzitás, főleg az 5% és 10% iszaptartalmúakban. Amikor 104 Gram-negatív tenyészetet elemeztek fenotípusos tulajdonságaik alapján, azt találták, hogy az első két fő összetevő tette ki a teljes variabilitás 46,50%-át. Az első fő komponens (principal component = PC), a PC1 (amely az eredeti variancia 21,23%-a volt), asszimiláció tesztek (glükóz, mannóz, mannit, arabinóz) és a béta-gaklaktozidáz reakció kombinálása révén jött létre. A második fő komponens, a PC2 (amely a teljes variabilitás 15%-át adta), főleg a kaprát asszimiláció és az arginin-dihidroláz reakció kombinálásával alakult ki. Az iszap talaj rendszerek nem tértek el jelentősen a talaj kontrollrendszerektől. Ez az összes esetben maga után vonja az oxidatív metabolizmusú tenyészetek dominanciáját és a rendszer nagy katabolikus kapacitását. A magcsírázás gátlása az inkubálás első 90 napja alatt nőtt. Talaj iszap keverék inkubálása során más szerzők a genotoxicitás növekedéséről számoltak be. Ezt a nagyobb toxicitású metabolitok képződése okozta, tehát a vegyületek átalakulásának jele lehetett. Ebből következik, hogy a szénhidrogén-koncentráció csökkenése nem alkalmas a talaj mérgezőanyag-tartalmának jelzésére. A mutagenicitás növekedése a kezdeti biodegradációs termékek képződésének következménye, mert ezek igen reakcióképesek és genotoxikusak. A magcsírázás gátlásának növekedése a szennyezett rendszerekben egyezik más szakértők véleményével, amely szerint egyes szénhidrogénekből a biológiai lebomlás során fitotoxikus metabolitok, például zsírsavak képződnek.
360 nap múlva jellemezték a domináns tenyészthető baktériumokat. Összesen 243 baktériumizolátumot találtak, ezek az 1. ábrán láthatók. Gram-pozitív coccus-ok Bacillus Actinomycetales Coryneform Flavobacterium Pasteurella Chryseomonas Brevundimonas Com/Palc Moraxella Comamonas Sphingobacterium Alcaligenes Pseudomonas 10% 5% 2,50% kontroll 0 10 20 30 40 50 60 gyakoriság, % 1. ábra Baktériumnemzetségek relatív diverzitása a kontroll- és a szénhidrogéntartalmú rendszerekben 373 napi kezelés után. Az egyes nemzetségeket az összes baktériumhoz viszonyított %-os tartalmukban fejezték ki A 82 Gram-negatív baktérium metabolikus profilját BioMerieux rendszerrel, a köztük levő viszonyt PCA (fő komponens elemzés) módszerrel határozták meg, hogy megállapítsák, van-e kapcsolat a kezdeti iszapkoncentráció és az 1 éves populáció fenotípusai között. A fenotípusos profilok eloszlása azt mutatta, hogy az összes iszap talaj rendszerből származó domináns Gram-negatív tenyészetek egy év után eltértek a kontroll talaj rendszerből származóktól. Nem volt jelentős különbség a különböző iszap talaj rendszerek fenotípusprofiljai között. Egyéves kezelés után az iszap talaj rendszerben levő domináns baktériumpopulációkat a helyreállítatlan talajhoz képest csökkent katabolikus kapacitással lehetett jellemezni. Az egyes PAH-anyagok koncentrációja elfogadható volt az ipari talajokra. Tehát a kémiai elemzési adatok sze-
rint a folyamat befejeződött. A kezelés végén azonban maradék mutagenicitás volt észlelhető, valószínűleg a genotoxikus metabolitok felgyülemlése miatt. Mindkét hatás független volt a kezdeti iszapkoncentrációtól, miközben a maradék szénhidrogén-koncentrációk arányosak voltak a kiindulási iszapkoncentrációval. A mikrobiális közösségben változásokat figyeltek meg, a katabolikus kapacitás vesztesége a tenyészthető bakteriális populációkban részlegesen a szelekciós nyomásnak tulajdonítható, amelyet a genotoxikus metabolitok felgyülemlése okozott. Összegezve: az adatok szerint egyéves bioremediációs kezelés után, függetlenül a kezdeti iszapkoncentrációtól, a szennyezett talaj eredeti tulajdonságai nem állíthatók helyre, akkor sem, ha a bioremediációs indikátorok, például a maradék szénhidrogén-koncentrációk és a fitotoxicitás azt jelzik, hogy a bioremediációs folyamat véget ért. Az adatok szerint a szennyező anyagnak hosszú távú hatása van a talaj bakteriális közösségére. A talajban a tenyészthető baktériumpopulációban fellépő minőségi/mennyiségi változások összefüggésbe hozhatók a szénhidrogén-átalakulási folyamattal. További kutatásokra van szükség ahhoz, hogy megállapítsák e változások hatását a talaj ökorendszerére. Összeállította: Fazekasné Horváth Zsuzsanna Morelli, I. S.; Del Panno, M. T. stb.: Laboratory study on the bioremediation of petrochemical sludge-contaminated soil. = International Biodeterioration & Biodegradation, 55. k. 4. sz. 2005. p. 271 278. Stevenson, F.: Lipids in soil. = Journal of American Oil Chemistry Society, 43. k. 1966. p. 203 210. Mishra, S.; Jyot, J. stb.: Evaluation of inoculum addition to stimulate in situ bioremediation of oily sludge-contaminated soil. = Applied and Environmental Microbiology, 67. k. 2001. p. 1675 1681. Egyéb irodalom Ökotech ötödik sebességben. = Környezetvédelem, 13. k. 2. sz. 2006. márc. ápr. p. 10 11. 30 éve az emberek és a környezet szolgálatában a biztonságos technológiai megoldásokért. = Magyar Elektronika, 22. k. 1 2. sz. 2005. p. 99. Mikkelsen, E.: Új környezetbarát technológiák a felület-előkészítésben és a festékek alkalmazásában, valamint hatásuk a bevonatrendszerek kiválasztására. = Korróziós Figyelő, 45. k. 2. sz. 2005. p. 57 59.