BIOMÉRNÖKI MŰVELETEK ÉS FOLYAMATOK I

BIOMÉRNÖKI MŰVELETEK ÉS FOLYAMATOK I Tantárgyfelelős: Dr. Karaffa Levente Oktató: Dr. Karaffa Levente, Dr. Fekete Erzsébet Tanszék: Mikrobiológiai és Biotechnológiai Tanszék Megkövetelt előzmény: Mikrobiológia II; Biokémia II Képzés: Biológus Laboratóriumi operátor Periódus: 2 Óraszám: 2+0+0 Kredit: 3 Számonkérés: Kollokvium A tantárgy részletes tematikája: 1. előadás Bevezetés. Az előadás-sorozat céljainak bemutatása, kapcsolódása a képzés során elsajátított egyéb ismeretekkel. Fermentáció, fermentor, fermentlé, fermentációs technika, fermentációs technológia, bioreaktor kifejezések jelentése, értelmezése. A biomérnöki munkafolyamat alapvető lépéseinek vázlatos áttekintése: termelésre alkalmas előlény vagy sejtalkotó kiválasztása, fenntartása és nemesítése, táptalaj megtervezése és létrehozása, a táptalaj, a reaktor és a reaktor kiegészítő alkatrészeinek csíramentesítése (sterilizálás), oltóanyag (inokulum) előállítása, a növekedés vagy a termékképződés szempontjából optimális fizikaikémiai körülmények beállítása és fenntartása, a gyártási folyamat műszerezése és műszeres ellenőrzése, a termék(ek) kinyerése, a termék(ek) tisztítása, melléktermékek és szennyező anyagok kezelése illetve közömbösítése. Teljes sejtet alkalmazó biomérnöki folyamatok vázlatos áttekintése a keletkezett termék szempontjából: biomassza előállítás, enzimek termelése, primer és szekunder metabolitok előállítása, biokonverziós (biotranszformációs) folyamatok. Az immobilizáció kifejezés vonatkozó jelentése. Magasabbrendű eukarióta sejtek a biomérnöki gyakorlatban. Enzimeket alkalmazó biomérnöki folyamatok és műveletek vázlatos áttekintése. 2. előadás A fermentációs-biomérnöki ipar kronológiai fejlődése: az ókor és a középkor biotechnológiája (sör, bor, ecet, kenyér, aludtej, sajt, túró készítése, tenyészlé-szűrletek alkalmazása sebek kezelésére). A XVIII-XIX. század tudományos eredményeinek kivetülése a fermentációs iparra (hőcserélő, hőmérő, fémtartályok, sörfőzdék). Leeuvenhoek, Pasteur, Hansen, Schwann, Kutzing, Blondeau munkássága. A XX. század első felének biomérnöki eredményei: a sterilitás, az oldott oxigén tenzió és a szénforrás fontosságának felismerése; aerob fermentációk, antibiotikumipar kialakulása. Léptéknövelés, kísérleti üzemek. Weizmann és Fleming munkássága. A XX. század második felének biomérnöki eredményei: táplálék-kiegészítők (aminosavak, nukleotidok, vitaminok) és Single Cell Protein előállítása. Szénhidrogén-alapú fermentációk. Poliszacharidok és lipidek előállítása. A rekombináns DNS-technológia és a molekuláris immunológia kialakulásának következményei a biomérnöki iparra. Magasabbrendű eukarióta sejtek és szövetek alkalmazása a termelésben. A magyar fermentációs és biomérnöki ipar rövid története, legjelesebb személyiségei, jelen helyzete és jövőbeli kilátásai. 3. előadás

Ipari fermentációk tápközegei. Heterotrófia, autotrófia, fotolitotrófia, fotoorganotrófia, kemolitotrófia, kemoorganotrófia fogalmának ismétlése példákon keresztül. A laboratóriumi és a termelői léptékű fermentációk tápközeg-kívánalmainak összehasonlítása. Az ipari tápközeg minőségi követelményei. A tápközeg tervezés legfontosabb szempontjai. A mikroorganizmusok elemi összetételének bemutatása, a mikrovilág ezen szempontból is kimagasló diverzitásának kihangsúlyozásával. Az elemi összetétel tápközeg-függése. A tápközeg összetevőinek tételes áttekintése. A víz. Fizikai és kémiai aspektusok (kémhatás, keménység, ionerősség, aktivitás, tonicitás). A víz körforgása a fermentációs üzemen belül. A vízellátás költségtényezői. A szennyvíz és a hűtővíz jelentősége a biomérnöki gyakorlatban. A mikroorganizmusok növekedéséhez szükséges szénforrások áttekintése. Laboratóriumi illetve termelői léptékű szénforrások. Szénhidrátok. A keményítő eredete, szénforrásként történő felhasználása, savas illetve enzimes hidrolízise. A maláta és felhasználása. Szacharóz és laktóz felhasználása. Növényi olajok szénforrásként történő felhasználása. A kukoricalekvár és felhasználása. Egyéb széntartalmú vegyületek (alkoholok, szerves savak, szénhidrogének) potenciális felhasználása. A mikroorganizmusok növekedéséhez szükséges nitrogénforrások áttekintése. Szervetlen (ammónium, nitrát) és szerves (aminosavak, urea, fehérjék) nitrogénforrások. A mikroorganizmusok növekedéséhez szükséges szervetlen anyagok áttekintése. Nyomelemek, vitaminok. Prekurzorok, anyagcsere-szabályozók (inhibítorok, indúcerek), habzásgátlók. A tápközeg komponenseinek újbóli hasznosítása. Az oldott oxigén jelentősége. A tápközeg összetételének mennyiségi kérdései. A tápközeg reológiai sajátságai; Newtoni és nem-newtoni folyadékok, Bingham-plasztikus, pszeudoplasztikus, dilatáns és Casson-test reológiájú tápközegek. 4. előadás. A növekedés becslése. A biomassza mérésének jelentősége. A mérés elvi típusai: közvetett (indirekt)és közvetlen (direkt) módszerek. A mérés gyakorlati megvalósításának módszerei: tömegmérés, térfogat-vagy hosszmeghatározás, a biomassza egy komponensének tömegmérése, az elfogyasztott szubsztrátum mennyiségi meghatározása, a keletkezett termék mennyiségi meghatározása, fényszórás mérése, sejtszámlálás, festési módszerek. A választást befolyásoló tényezők. A módszerek érzékenységének, reprodukálhatóságának és költségeinek összehasonlítása. A módszerek részletes ismertetése: indirekt módszerek. Mintavétel. Száraztömeg meghatározás. Nedvestömeg meghatározás. Sejt-illetve micélium térfogat meghatározása. Növekedés mérése szilárd felszínen. Sejtalkotók mennyiségi meghatározása: nitrogéntartalom (Kjeldahl-módszer ismertetése, előnyök, hátrányok), fehérjetartalom (specifikus festékeket alkalmazó színreakciók), DNS-tartalom (deoxiribóz meghatározása), RNS-tartalom mérése. A növekedés fényszóráson alapuló meghatározásának elvi alapjai és gyakorlati kivitelezése. Turbidimetria és nefelometria összehasonlítása. Direkt módszerek: sejtszámlálás (mikroszkóp, Coulter-számláló, szélesztéses meghatározás), vitális festékek alkalmazása. Egyedi problémák és megoldásuk a fágok és vírusok, az egysejtű baktériumok, az élesztők, a fonalas baktériumok illetve fonalas gombák növekedésének becslése során. A laboratóriumi valamint a termelői léptékű tenyésztés során a növekedés mérésekor fellépő speciális problémák illetve megoldásuk. 5. előadás. A sejtnövekedés kinetikája I. Az ideális tenyészet tulajdonságai. Batch tenyészet: a növekedés lappangó, gyorsuló, exponeciális, lassuló és stacioner szakaszai, jellemzésük biológiai és biomérnöki szempontból. Másodlagos növekedés. A sejtszám és a biomassza fogalmának értelmezése. A növekedés általános egyenlete, a Gibbs-energia bevezetése a sztöchiometriai számításokba. Az exponenciális növekedés elvének törvényszerűségei, és az ettől való eltérés jelentősége. Szubsztrátum-, biomassza- és termékkoncentráció időbeli változása a batch

tenyésztés során. Fermentációs időprofil jelentése. A limitáló szubsztrátum és a reziduális szubsztrátum koncentráció fogalma. Volumetrikus illetve specifikus szubsztrátum felvételi ráta fogalma és meghatározása. Populációs illetve specifikus növekedési ráta fogalma, levezetése, értelmezése. Generációs idő fogalma és kiszámítása. A növekedési ráta és a generációs idő közötti kapcsolat jellemzése. Növekedésre vonatkozó hozamkonstans fogalma, levezetése és kiszámítása. Specifikus anyagcsere ráta fogalma, levezetése és kiszámítása. A limitáló szubsztrátum koncentrációjának hatása a növekedési rátára. Az exponenciális növekedés törvényszerűségeinek összehasonlítása a Michaelis-Menten-féle enzimkinetikai modellel. Az exponenciális növekedéshez tartozó egyensúlyi szubsztrátum koncentráció értelmezése. 6. előadás A sejtnövekedés kinetikája II. A Monod-törvény. A Monod-törvény grafikus szemléltetése. A Monod-törvény linearizálása, és az egyensúlyi szubsztrátum koncentráció értékének kiszámítása. Az egyensúlyi szubsztrátum koncentráció közvetlen meghatározása analitikai módszerekkel. Az egyensúlyi szubsztrátum koncentráció jellemző értékei szénforrásra, sókra, aminosavakra, vitaminokra és oxigénre, eltérő anyagcserével rendelkező prokariótákban és eukariótákban. Eltérések a Monod-törvénytől: a Tessier-, a Contois- és a Blackmanegyenletek bemutatása és értelmezése példákon keresztül. Fenntartási energia értelmezése és kiszámítása. A lappangó fázis időtartamának kísérletes meghatározása, az eredmény beépítése a tenyészet növekedési egyenletébe (Lodge-Hinshelwood szabály). A maximális biomassza koncentráció értelmezése, az értékek befolyásolásának bemutatása példákon keresztül. A sejtosztódás kinetikai modelljeinek típusai: a sejtszintű és a populációs szintű struktúrálódás értelmezése és összehasonlítása. A struktúrálatlan-szegregálatlan, a struktúrálatlan-szegregált, a struktúrált-szegregálatlan és a struktúrált-szegregált modellek összehasonlítása példákon keresztül. Szilárd fázisú fermentáció. A folyamat alapelvének és jelentőségének bemutatása gyakorlati példákon keresztül. 7. előadás Folytonos tenyészetek. A kemosztát teória alapelvei. Hígítási ráta fogalma és levezetése. A sejtnövekedés mértéke kemosztátban, a hígítási ráta és a specifikus növekedési ráta kapcsolata, az egyensúlyi állapot ( steady-state ) kialakulása. A limitáló szubsztrátum minőségének és koncentrációjának jelentősége. A kritikus hígítási ráta értéke. A maximális növekedési ráta meghatározásának elmélete és gyakorlata. A biomassza produkciós ráta vizsgálata kemosztátban. A batch és kemosztát összehasonlítása a biomassza produkció szempontjából. Egy adott sejt átlagos tartózkodási idejének meghatározása a kemosztátban. Eltérések a kemosztát teóriától. A tökéletlen keverés hatása. A fali növekedés jelensége, hatása a növekedési rátára, és az ellene való védekezés. Az átmeneti állapot jelensége és értelmezése kemosztátban. Az átmeneti állapot időtartamának kiszámítása. A kemosztát gyakorlati alkalmazásai az alapkutatásban, az alkalmazott kutatásban és a termelésben (sörgyártás, Single Cell Protein előállítás). A kemosztát speciális típusai: a turbidosztát és a biomassza visszacsatolásos kemosztát. A turbidosztát felépítése, működése és gyakorlati alkalmazásai. A biomassza visszacsatolásos kemosztát típusai (belső illetve külső visszacsatolásos kemosztát), felépítésük, működésük és gyakorlati alkalmazásuk. Sorba kapcsolt kemosztátok és elvi-gyakorlati jelentőségük. 8. előadás

Rátáplálásos (fed-batch) tenyészetek. Alapelv. A rátáplálásos tenyészet kialakulásához vezető biológiai jelenségek és magyarázatuk. Az átmeneti steady-state állapot fogalma, levezetése és összehasonlítása a kemosztátban elérhető valódi steady-state állapottal. A fenntartási energia kiszámítása rátáplálásos tenyészetben. Az átmeneti állapot és a növekedési ráta összefüggései. Ismételt rátáplálásos tenyészetek. A rátáplálásos tenyészetek gyakorlati alkalmazásai, a rátáplálás technikai kivitelezése és műszeres kontrollja. A rátáplálásos tenyésztés fermentációs iparban betöltött kivételes jelentőségének bemutatása termelési adatok segítségével. A dializáló tenyészet, mint a rátáplálásos tenyésztés egyik speciális módja. Külső illetve belső (osztott terű) dializáló tenyészetek. A külső és belső szubsztrátum koncentrációk meghatározása osztott terű dializáló tenyészetben. A szubsztrátum koncentrációk változásának kinetikája osztott terű dializáló tenyészetben. A növekedési ráta kiszámítása dializáló tenyészetben. Nehézségek a dializáló fermentor működésében: fonalas mikróbák tenyésztése. A dializáló membrán típusai és kiválasztása. A dializáló tenyésztés termelési jellegű alkalmazásai: nagy sejtsűrűségű tenyészetek, zárt rendszerű tenyészetek, lassan, kis hozamkonstans mellett növekvő emlős-és növényi sejt tenyészetek. A diffúziós kapszula elvének, felépítésének és gyakorlati alkalmazásának bemutatása. 9. előadás A termékképződés kinetikája. A fermentációs termékek elvi típusainak áttekintése. A termékképződési ráta fogalma és levezetése. Termékképződésre vonatkozó hozamkonstans fogalma, levezetése és kiszámítása. A specifikus növekedési ráta kapcsolata a termékképződési rátával. Növekedéshez kapcsolt és növekedéshez nem kapcsolt termékképződés, példákon illusztrálva. Lassan illetve egyáltalán nem növekvő tenyészetek termékképződése. Növekedéshez nem kapcsolt termékképződés látszólagos függése a növekedési rátától. A termék bomlásának kinetikája, a termékbomlási ráta. Termékképződés batch tenyészetben. Termékképződés folytonos tenyészetben. A termékképződési ráta levezetése kemosztát tenyészetben. Növekedéshez kapcsolt és növekedéshez nem kapcsolt termékképződési ráta eseteinek vizsgálata kemosztát tenyészetben. A biomassza koncentráció és a termékképződési ráta kapcsolata, termékképződés nagy sejtsűrűségű tenyészetekben. A tenyésztési körülmények hatása a termékképződésre. A szén- és a nitrogénforrás mennyiségének és minőségének hatása a termékképződésre. A tápanyaghiány termékképződésre gyakorolt hatásának bemutatása példákon keresztül. 10. előadás Ipari jelentőségű mikroorganizmusok izolálása. Az izolálás kifejezés mikrobiológiai jelentése, és a folyamat jelentősége. A biomérnöki munka során használatos mikroorganizmusok kiválasztásának kritériumai. A szükséges törzs beszerzésének elvi lehetőségei. Hazai és külföldi törzsgyűjtemények (a legfontosabbak felsorolása, működési elveik, előnyeik és hátrányaik). Az izolálás alapelvei. A kiválasztott tulajdonság szelekciós előnnyé alakítása. Dúsításos technika. A dúsításos technika alapesetei és technikai kivitelezésük. A maximális növekedési ráta jelentősége a dúsításos törzsszelekcióban. A kemosztát, mint a dúsításos törzsszelekció eszköze. A kemosztát technika törzsszelekcióban való alkalmazásának előnyei és hátrányai. A turbidosztát alkalmazása a törzsszelekció során. Kétfázisú kemosztát alkalmazása a törzsszelekció során. A tápközeg minőségi és mennyiségi tulajdonságainak jelentősége a törzsszelekció folyamata során. Szilárd táptalaj használata az izolálás során. A szilárd fázison történő izolálás technikai kivitelezése, a csalétek-módszer. Izolálási technikák abban az esetben, ha a kiválasztott tulajdonság nem alakítható szelekciós előnnyé. A random izolálási technikák alapesetei. Metabolit túltermelő mikróbák izolálása. A túltermelő táptalaj általános minőségi és mennyiségi jellemzői. Antibiotikum-termelő

mikróbák izolálása. Farmakológiailag aktív anyagokat termelő mikróbák izolálása. Poliszacharidokat termelő mikróbák izolálása. 11. előadás Ipari jelentőségű mikroorganizmusok fenntartása. A törzsfenntartás jelentősége és céljai. Az ipari jelentőségű mikroorganizmusok fenntartásának elvi és gyakorlati nehézségei. A törzsfenntartás módjai. Alacsony hőmérsékleten történő tárolás. A tárolás módjának a sejt biológiai állapotától való függése. Spórák tárolása. A dehidratáció alkalmazása a törzsfenntartásban. Talajminták tárolása. A liofilezés elve és gyakorlati kivitelezése. A fenntartott mikroorganizmusok illetve minták minőségének ellenőrzése. Ipari jelentőségű mikroorganizmusok törzsfejlesztése I. A törzsfejlesztés jelentősége és céljai. Prototrófia és auxotrófia fogalma. A mikroorganizmusok (prokarióták és eukarióták) örökítőanyagának rövid jellemzése. A paraszexuális ciklus jelentősége a törzsfejlesztésben. A genetikai állomány megváltozásának illetve megváltoztatásának elvi lehetőségei. A természetes szelekció kihasználása a törzsfejlesztésben. A mutációs ráta fogalma. A mutációs ráta befolyásolásának lehetőségei. Mutagének és mutagenitás. Mutagének osztályozása és jellemzése. A spontán illetve a mutagének hatására kialakuló mutációs ráta minőségi és mennyiségi összehasonlítása. 12. előadás Ipari jelentőségű mikroorganizmusok törzsfejlesztése II. Mikrobiális metabolitok bioszintézisét befolyásoló szabályzó mechanizmusok rövid áttekintése. Feed-back inhibíció, feed-back represszió. Karbon és nitrogén represszió. Multivalens feed-back szabályzás. Izoenzimek. A mutáció megtervezésének jelentősége és lehetőségei. In vivo és in vitro mutagenezis. Példák a mutagenezis révén megnövelt termékhozamra. A sejtmembrán permeábilitás mesterséges megváltoztatásának jelentősége és lehetőségei. Protoplaszt fúzió alkalmazása a törzsfejlesztésben. Feed-back gátlásban mutáns törzsek izolálásának elmélete és gyakorlata, példák bemutatásán keresztül. Auxotróf mutánsok izolálása. A mikrobiális túlélőképletek alkalmazása a törzsfejlesztésben. Izotópok és antimetabolitok alkalmazása a törzsfejlesztésben. Karbon és nitrogén katabolit derepresszált mutánsok izolálása. Hő-, és sótűrő mutánsok izolálása. Inhibitorokra érzéketlen mutánsok izolálása. Kettős és többes mutánsok izolálása. Egy adott génterméket túltermelő (overexpressing) mutánsok izolálása. Konstitutív mutánsok izolálása. Revertált mutánsok izolálása. A rekombináns DNS technológia alkalmazása a törzsfejlesztésben, prokarióta és eukarióta mikroorganizmusok példáján. A termék mennyiségének növelésén túli törzsfejlesztő programok (stabil mutánsok, habzást nem gerjesztő mutánsok, morfológiai tulajdonságokban előnyös mutánsok, oxigénhiányt toleráló mutánsok). Az ipari törzsfejlesztő programok felépítése. A mutáns törzsek piaci értéke és jogi védelme. 13. előadás Sterilizálás. A kifejezés mikrobiológiai jelentése, illetve jelentősége a biomérnöki munkavégzés során. A fertőződés biomérnöki értelmezése, sterilitási kritériumok. A tiszta tenyészet befertőződésének következményei és elkerülésének elvi lehetőségei. A fertőzés ellen védett tenyészetek illetve fermentációk jellemzése, példákon keresztül. A sterilizálás folyamatának kinetikája. A hőhatás és a mikroorganizmusok kölcsönhatása, a specifikus pusztulási ráta fogalma. A mikrorganizmusok rendszertani típusai és a sterilizálás hatékonysága. Ugyanazon faj eltérő élettani állapotából eredő következmények. Gőzzel történő sterilizálás. A tápközeg sterilizálása. A Del-faktor levezetése, kiszámítása és értelmezése. A hőmérséklet vs. időtartam kérdése. Folyamatos és szakaszos sterilezés. A

sterilezés energiaigénye és költségei. A tápközeg sterilizálása során lejátszódó kémiai reakciók és jelentőségük. Sterilezés termelői léptékben. A reaktor és járulékos részeinek sterilizálása és sterilen tartása. A fermentáció során adagolt tápanyagok sterilizálása. A levegő sterilizálása. Levegőszűrők, filterek. Hőhatással, kémai ágensekkel illetve sugárzással történő sterilezés. A sterilezés folyamatának biztonsági követelményei, és ezek megvalósítása. 14. előadás Oltóanyag (inokulum) előállítása. A fogalom értelmezése. Az optimális inokulum kritériumai. Az inokulumtenyészet és a termelői tenyészet minőségi és mennyiségi összehasonlítása. Többfázisú inokulum. Ipari inokulum-fejlesztő program vázlatos ismertetése. A Lincoln-féle inokulum fejlesztés. Élesztő fermentációk inokuluma: sörgyártásban illetve pékélesztő előállításakor használatos technikák. Bakteriális fermentációk inokulumai: aerob és anaerob folyamatok (Bacillus fajok, ecetsav termelők illetve aceton és butanol termelők) oltóanyagának előállítása. Fonalas prokarióták (Streptomyces fajok) fermentációjának inokulumai. Micéliális gombafermentációk inokulumai: spóráztatási technikák (agarral szilárdított, szilárd fázisú és süllyesztett szubsztrátumon), konidium-inokulumok alkalmazása. Konidiumokat nem képző micéliális gombatenyészetek inokulumai. Az inokulumtenyészet és a termelői fermentáció kapcsolata: morfológiai, fiziológiai, biokémiai hatások. A pelletképződés jelensége, előnyei és hátrányai. Az inokulálás (leoltás) technikai kivitelezése a lombik, a laboratóriumi fermentor, a kísérleti üzemi illetve a termelői léptékű fermentor esetében. Kötelező irodalom: Sevella Béla: Biomérnöki műveletek és folyamatok, Műegyetemi kiadó, 1998 Sevella Béla: Biomérnöki műveletek példatár, Műegyetemi kiadó, 2001 Karaffa Levente, Kozma József, Szentirmai Attila: Fermentációs és biomérnöki műveletek. (egyetemi jegyzet; nyomdai kiadás előkészületben) Ajánlott irodalom: Pirt J.S.: Principles of Microbe and Cell Cultivation. Blackwell Scientific Publications, Oxford, UK, 1975 Stanbury P.F., Whitaker A.: Principles of Fermentation Technology, Pergamon Press, Oxford, UK, 1984