1
VESZPRÉMI EGYETEM GEORGIKON MEZŐGAZDASÁGTUDOMÁNYI KAR NÖVÉNYVÉDELMI INTÉZET HIGIÉNE TANSZÉK INTERDISZCIPLINÁRIS DOKTORI ISKOLA Iskolavezető: DR. habil. Várnagy László az MTA doktora Tudományág: Állatorvostudományok Témavezető: DR. habil. Várnagy László az MTA doktora EGYES NEHÉZFÉMEK ÉS NÖVÉNYVÉDŐ SZEREK EGYEDI ÉS EGYÜTTES MÉREGHATÁSÁNAK VIZSGÁLATA MADÁRTERATOLÓGIAI TESZTBEN DOKTORI (PhD) ÉRTEKEZÉS Készítette: FEJES SÁNDOR KESZTHELY 2005 2
EGYES NEHÉZFÉMEK ÉS NÖVÉNYVÉDŐ SZEREK EGYEDI ÉS EGYÜTTES MÉREGHATÁSÁNAK VIZSGÁLATA MADÁRTERATOLÓGIAI TESZTBEN Értekezés doktori (PhD) fokozat elnyerése érdekében Írta: Fejes Sándor Készült a Veszprémi Egyetem Interdiszciplináris Doktori Iskolája keretében Témavezető: DR. habil. Várnagy László Elfogadásra javaslom (igen / nem)... aláírás A jelölt a doktori szigorlaton... %-ot ért el Az értekezést bírálóként elfogadásra javaslom: Bíráló neve:...... igen / nem. aláírás Bíráló neve:...... igen / nem. aláírás A jelölt az értekezés nyilvános vitáján...%-ot ért el Veszprém/Keszthely,.. a Bíráló Bizottság elnöke A doktori (PhD) oklevél minősítése... az EDT elnöke 3
És az a különös csend. Például a madarak hol vannak? Sokan beszélgettek róluk zavartan, tanácstalanul. A kertek hátsó végében felállított madáretetők elhagyottan álltak, s a néhány madár, amelyet itt-ott még látni lehetett, minden ízében reszketett, kínosan vonszolta magát, haldoklott. Hajnalonta, amikor máskor vörösbegy, gerle, szajkó, ökörszem és ezer más madár köszöntötte a napot, most néma csend ülte meg az erdőt, a földeket és a mocsarat. A farmokon hiába kotlottak a tyúkok: a tojásokból nem kelt ki a csirke Ez a város a valóságban nem létezik. Igen könnyen juthat azonban hasonló sorsra ezer meg ezer város Amerikában, vagy bárhol a világon. Nem ismerek olyan helyet, ahol egyszerre történt volna meg mindaz a szörnyűség, amit leírtam. De mind megtörtént már valahol, és sok valódi, létező közösség szenved a csapások közül akár többtől is. A sötét árny szinte észrevétlenül lépett közénk, és ez a fenti, elképzelt tragédia könnyen válhat kegyetlen valósággá, amivel mindannyian szembesülünk. Rachel Carson 4
TARTALOMJEGYZÉK 1. KIVONATOK... 8 1. 1. Magyar nyelvű kivonat... 8 1. 2. Angol nyelvű kivonat... 10 1. 3. Német nyelvű kivonat... 10 2. BEVEZETÉS... 11 3. IRODALMI ÁTTEKINTÉS... 15 3. 1. A madárembrió tesztszervezetként történő felhasználása vegyi anyagok teratológiai tesztelésében... 15 3. 2. A házityúk embrionális fejlődése... 16 3. 3. Szerves foszforsavészter inszekticidek... 19 3. 3. 1. Általános jellemzés... 19 3. 3. 2. Méreghatás és hatásmechanizmus... 20 3. 3. 3. Speciális méreghatás... 21 3. 4. Ditiokarbamát fungicidek... 22 3. 4. 1. Általános jellemzés... 22 3. 4. 2. Méreghatás és hatásmechanizmus... 22 3. 4. 3. Speciális méreghatás... 22 3. 5. Kadmium... 23 3. 5. 1. Általános jellemzés... 23 3. 5. 2. Méreghatás és hatásmechanizmus... 24 3. 5. 3. Speciális méreghatás... 25 3. 6. Réz... 25 3. 6. 1. Általános jellemzés... 25 3. 6. 2. Méreghatás és hatásmechanizmus... 26 3. 6. 3. Speciális méreghatás... 26 3. 7. Interakciós vizsgálatok... 27 4. ANYAG ÉS MÓDSZER... 29 4. 1. Vizsgálati anyagok... 29 4. 1. 1. Növényvédő szerek... 29 4. 1. 2. Nehézfémek... 31 4. 2. Kísérleti állatok... 32 4. 3. Keltetés... 32 5
4. 4. A kezelések időpontja... 32 4. 5. A kezelések módja... 33 4. 6. Feldolgozás... 34 4. 7. Statisztikai értékelés... 37 5. KÍSÉRLETI EREDMÉNYEK... 39 5. 1. Előkísérlet... 39 5. 2. Nulladik napi injektálásos kezelés... 43 5. 2. 1. Korai embrionális fejlődés vizsgálata... 43 5. 2. 2. Kórbonctani feldolgozás eredménye... 49 5. 2. 3. Csontvázfestéssel történt feldolgozás eredménye... 58 5. 2. 4. Szövettani feldolgozás eredménye... 61 5. 3. Tizenkettedik napi injektálásos kezelés... 63 5. 3. 1. Kórbonctani feldolgozás eredménye... 63 5. 3. 2. Csontvázfestéssel történt feldolgozás eredménye... 72 5. 3. 3. Szövettani feldolgozás eredménye... 75 5. 3. 4. Vérplazma paraméterek vizsgálata... 78 6. MEGBESZÉLÉS, KÖVETKEZTETÉSEK ÉS JAVASLATOK... 83 6. 1. Előkísérlet... 83 6. 2. Nulladik napi injektálásos kezelés... 88 6. 2. 1. Korai embrionális fejlődés... 88 6. 2. 2. Kórbonctani feldolgozás... 91 6. 2. 3. Csontvázfestéssel történt feldolgozás... 94 6. 2. 4. Szövettani feldolgozás... 95 6. 3. Tizenkettedik napi injektálásos kezelés... 95 6. 3. 1. Kórbonctani feldolgozás... 95 6. 3. 2. Csontvázfestéssel történt feldolgozás... 99 6. 3. 3. Szövettani feldolgozás... 100 6. 3. 4. Vérplazma paraméterek... 101 6. 4. A két eltérő időpontban elvégzett injektálásos kezelés eredményeinek összevetése... 104 6. 5. Javaslatok... 105 7. ÖSSZEFOGLALÁS... 108 8. SUMMARY... 114 9. ÚJ TUDOMÁNYOS EREDMÉNYEK... 120 6
10. NEW SCIENTIFIC RESULTS... 122 11. IRODALOMJEGYZÉK... 124 MELLÉKLETEK... 140 KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS... 155 7
1. KIVONATOK 1. 1. Magyar nyelvű kivonat A szerző az általa elvégzett vizsgálatsorozat folyamán nehézfémek és növényvédő szerek egyedi és együttes méreghatását tanulmányozta fejlődő madárembrióban, figyelembe véve az egész embrionális fejlődési szakaszt. Mivel az ökotoxikológiai vizsgálati módszerek elsősorban csak egy adott szer méreghatásának vizsgálatára szorítkoznak, ezért a peszticidek interakciós hatásaira vonatkozó adatok különösen fejlődő madár szervezetben a nemzetközi és a hazai szakirodalmak alapján hiánypótlónak tekinthetők. A kísérletekhez felhasznált házityúk tojásokat a szerző a fejlődő madárembriók alkalmazásával végzett toxikológiai vizsgálatok során használt egyik legelterjedtebb kezelési mód révén, a vizsgálni kívánt anyagok légkamrába történő injektálásával kezelte a keltetés megkezdésekor, továbbá az inkubáció tizenkettedik napján. A feldolgozás folyamán az embriókat makroszkópos és fénymikroszkópos technika, továbbá laboratóriumi diagnosztikai módszerek segítségével vizsgálta. A keltetés megkezdésének napján kezelt tojások esetében az embriók egy részéből a csírakorong kimetszésével a korai fejlődési stádium vizsgálata céljából tartós preparátumot készített a keltetés második és harmadik napján, míg a vizsgálatsorozat során kezelt többi tojást a kelés előtt két nappal dolgozta fel. Feljegyezte az embriók testtömegét, az elhalásokat és a makroszkópos elváltozásokat, továbbá hisztológiai feldolgozás céljára mintát vett a májból és a nyakizomból. A makroszkópos vizsgálat részeként a csontvázrendszerben esetlegesen előforduló fejlődési rendellenességek kimutatására a Dawson-féle festési eljárást alkalmazta. A szerző a feldolgozási metodikát vérvétellel egészítette ki, melynek révén közölte a csoportokban kiszámított hematokrit értékeket, továbbá embrionális korból származó új alapadatokat adott közre számos vérplazma paraméter (glükóz, kalcium, magnézium, anorganikus foszfát, AST, ALT, ALP, LDH, összfehérje, albumin, pche) tekintetében. A statisztikai feldolgozás során a testtömeg adatokat és a vérplazma összetevők vizsgálatában nyert hematokrit értékeket varianciaanalízissel, míg a százalékos adatokat (embriomortalitás, fejlődési rendellenességek) RXC Chi 2 teszttel értékelte, majd az együttes, interakciós hatásokat a vizsgálatba vont kémiai anyagok egyedi méreghatásához viszonyította és bírálta el. 8
Az értekezés új adatokat szolgáltat a réz-szulfát, a kadmium-szulfát, a BI 58 EC (38% dimetoát) és a Dithane M-45 (80% mankoceb) embrionális kori egyedi toxicitásáról, továbbá bemutatja a komponensek együttes alkalmazásakor tapasztalt változásokat és eredményeket. Megállapítja, hogy: A réz- és a kadmium-szulfát dózisfüggően növelte embrionális korban az elhalások és a fejlődési rendellenességek arányát. A BI 58 EC inszekticid törpenövekedést, az állatok mozgás-aktivitásának csökkenését, továbbá az életben maradt állatok májának súlyos károsodását idézte elő. A Dithane M-45 fungicid az egyedi kezelések között kiemelkedően magas átlagosan 29,5%-os embriomortalitást okozott, amely elsősorban a keltetés megkezdésének napján elvégzett kezelés eredményeként jelentkezett. A nehézfémek és a peszticidek együttes alkalmazásakor jelentősen fokozódhat a méreghatás a felhasznált komponensek egyedi toxicitásához képest, amely a növényvédő szerek és a kadmium kombinált alkalmazásakor és főként az inkubáció megkezdésének napján tojásba juttatott vegyi anyagok hatásaként volt a legkifejezettebb. Az elhalások aránya a nulladik napi kezelések esetében mind a kadmium-szulfát és a BI 58 EC, mind a kadmium-szulfát és a Dithane M-45 kombinációk kísérletbe állításakor megközelítette a 80%-ot. A keltetés kezdeti szakaszában jelentkező toxikus hatás elsősorban az állatok elhullását eredményezte, ugyanakkor az inkubáció második felében tojásba kerülő nehézfémekre és peszticidekre a kórbonctani feldolgozás eredményei alapján az elhalások alacsonyabb szintje mellett a testtömegek nagyobb arányú csökkenésével és a fejlődési anomáliák arányának emelkedésével reagáltak az állatok. Fénymikroszkópos szövettani technikával kimutatható elváltozások is csak a keltetés második felében kezelt házityúk embriók esetében jelentkeztek. A kísérleti eredmények alapján a szerző megfogalmazta az általa legfontosabbnak ítélt elméleti és gyakorlati javaslatait, amelyek révén a vizsgálatok során alkalmazott vegyi anyagok egyedi és együttes viselkedése az élő szervezetekben jobban megismerhető, és mindezek eredményeként a vadon élő állatok védelme a lehető legmagasabb szinten valósítható meg. 9
1. 2. Angol nyelvű kivonat STUDY OF THE INDIVIDUAL AND COMBINED TOXIC EFFECTS OF CERTAIN HEAVY METALS AND PESTICIDES BY AVIAN TERATOLOGICAL TESTS During his experiments on chicken embryos, the author has examined the individual and combined toxic effects of heavy metals (copper, cadmium), found in large quantities in the environment and regarded as highly dangerous to living organisms, and that of two widely-used pesticides (BI 58 EC, Dithane M-45), taking into consideration the whole embryonic stage of development. It has been pointed out that using heavy metals and pesticides simultaneously may significantly increase the toxic effect in comparison with the individual toxicity of the applied components, which was particularly distinct during the combined application of pesticides and cadmium, especially as the effect of chemicals injected into eggs on the first day of incubation. 1. 3. Német nyelvű kivonat INDIVIDUELLE UND SIMULTANE GIFTWIRKUNG- UNTERSUCHUNGEN DER EINZELNEN SCHWERMETALLE UND PFLANZENSCHUTZMITTEL IN VOGELTERATOLOGISCHEN TESTEN Der Verfasser hat im Laufe seiner Versuche die individuelle und die gleichzeitige Giftwirkung der in der Umgebung in grösserer Menge vorkommenden bzw. auf den Organismus immer gefährlichen Schwermetalle (Kupfer, Kadmium) und zwei in breitem Kreis verwendeten Pestiziden (BI 58 EC, Dithane M-45) an Hühnerembryonen, mit Rücksicht auf die ganze Embryonalphase, untersucht. Es wurde festgestellt, dass die Giftwirkung der gemeinsamen Anwendung von Schwermetallen und Pestiziden im Vergleich mit der individuellen Toxizität der verwendeten Komponente die bei der kombinierten Anwendung von Pflanzenschutzmitteln und Kadmium und besonders am Anfangstag der Inkubation als Wirkung der in Ei gebrachten Chemikalien die bedeutendste war sich steigern kann. 10
2. BEVEZETÉS A II. világháború lezárását követő időszak demográfiai robbanása és ezzel párhuzamosan a fogyasztói társadalom kiépülése merőben új körülményeket teremtett a gazdaság szereplői számára. Ahhoz, hogy ebben a környezetben az ipar és a mezőgazdaság képes legyen betölteni új szerepét, alkalmazkodnia kellett a megváltozott feltételekhez, hiszen csak így adhatott megfelelő választ az újonnan fellépő kihívásokra. Ez a válasz kezdetben meglehetősen egyszerűnek tűnt. Mind az ipar, mind a mezőgazdaság a termelés fokozására koncentrálta erőit anélkül, hogy a környezetvédelem szempontjai meghatározó módon érvényesültek volna. Ennek következtében egyrészt szűkült a vadon élő állatok természetes élettere, másrészt nőtt az embert körülvevő környezetbe kerülő szennyező anyagok köre és mennyisége, mely hosszú távon előrevetíti az élő rendszerek dinamikus egyensúlyának megbomlását és új megvilágításba helyezi a környezetbiztonságot. A gazdasági fejlődés egyik következményeként az emberi tevékenység által okozott katasztrófák hatásaikban mára összevethetőkké váltak a legsúlyosabb természeti eredetű csapásokkal. Számos példa szolgál bizonyítékul mind a peszticidek, mind a nehézfémek esetében arra vonatkozóan, ahogy az emberi tevékenység, illetve az emberi gondatlanság következtében súlyosan károsodott az élővilág. 1986-ban Bázelben egy raktártűz oltása során több száz tonna növényvédő szer részben a disszertációban szereplő szerves foszforsavészter inszekticid mosódott a Rajnába, melynek következtében becslések szerint a folyó két óra alatt több szennyeződést fogadott be, mint ezt megelőzően évek sora alatt (SCHUBERT, 2002). Az élővizek súlyos károsodása sajnos Magyarországon sem ismeretlen. Élénken él még az emléke és egyelőre beláthatatlanok a hosszú távú következményei a 2000. évben a Tiszán és a Szamoson levonult cianid és nehézfém terhelésnek. Elsősorban a halállomány pusztulásában megnyilvánult, de a vízzel együtt viszonylag gyorsan levonuló cianid csóván túl a szakemberek szerint különösen az ad okot aggodalomra, hogy a kiülepedés következtében a mederanyagban kvantitatív módon több olyan toxikus, teratogén és rákkeltő nehézfémet mutattak ki, melyek a táplálkozási láncba kerülve hosszú távon veszélyeztethetik a környék élővilágát (FLEIT, 2001; LAKATOS és mtsai, 2003). A környezetet évszázadok óta súlyosan károsító ipar mellett az agrokemikáliumok felhasználása révén tehát megjelent egy másik nagy szennyezőanyag kibocsátó, a mezőgazdaság. A termesztett növények védelme érdekében 1998-ban a Földön már 750 11
különféle biológiai és kémiai hatóanyagot használtak fel, azonban a peszticidek másodlagos hatása miatt nagy árat fizetünk. A növényvédő szerek a felhasználás területéről elsodródnak (off-target hatás), bemosódnak az élővizekbe (run-off hatás) és nem célszervezeteken (non-target hatás) is kifejtik hatásaikat (DARVAS és POLGÁR, 1998). Ezért vált szükségessé olyan vizsgálati módszerek bevezetése, melyek segítségével a vegyszeres növényvédelmi munkák során nagy mennyiségben kijuttatott vegyi anyagok élő szervezetekre gyakorolt hatása és biológiai rendszerekben való viselkedése megfelelő módon tanulmányozható. Kezdetben a peszticidek mérgezési veszélyességének megítélésében az akut toxikológiai vizsgálatok során nyert adatok játszották a fő szerepet. Ezek a főleg rágcsálókon elvégzett kísérletek elsősorban a letális méregmennyiség vizsgálatára irányultak, amely alapul szolgált a méregerősség, és ehhez kapcsolódóan a veszélyesség megállapításához. Később azonban nyilvánvalóvá vált, hogy léteznek olyan, akár a hatóanyag engedélyezését, illetve forgalomban maradását is kizáró tulajdonságok (karcinogenitás, teratogenitás stb.), amelyek nem csak a szervezetbe került méregmennyiségtől függenek. A klórozott szénhidrogének együttese volt az első olyan hatóanyag csoport, amelynek kedvezőtlen tulajdonságai kumuláció, perzisztencia, biomagnifikáció, karcinogenitás felhívták a figyelmet a kémiai növényvédelem veszélyeire. Kiderült, hogy a klórozott szénhidrogének a természetben csak évtizedek alatt bomlanak el, ugyanakkor a talajba és a vízbe jutva bekerülnek a táplálékláncba, majd a táplálkozási láncon felfelé haladva koncentrálódnak az élő szervezetek zsírszöveteiben (HARRISON és mtsai, 1969, 1970), és mérgező hatásuk egyre inkább érvényesül. Felhasználásuk következtében a mérgezett táplálékot fogyasztó madarak lágyhéjú tojást tojtak, amiből az utódok nem keltek ki. A nagy mennyiségben kiszórt klórozott szénhidrogén hatóanyag-tartalmú növényvédő szerek és egyéb POP (Persistent Organic Pollutants) vegyületek a vízzel és a légáramlatokkal eljutottak a Föld minden részébe köztük a sarki jégtakaróba is, elszennyezve így az egész Földet (COX, 1970; KERÉNYI, 1998). Jelenleg a Föld DDT-vel legszennyezettebbnek tekintett területén, Közép-Ázsiában a talajok 50-80%-a tartalmazza jelentősebb mennyiségben a hatóanyagot! Mindehhez hozzájárul továbbá, hogy óriási az eltérés a fejlődő és a fejlett országok engedélyeztetési rendszere és ennek megfelelően engedélyezett szerválasztéka között. Míg a skandináv országokban a rendkívül szigorú előírások miatt évente öt-tíz hatóanyagot tiltanak be, addig a világ fejlődő felében a DDT még mindig használható. Sőt még néhány, hazánkban forgalomban lévő hatóanyagot is automatikusan kizárnának a skandináv engedélyezési eljárás során. Alapos revízióra volna szükség, ugyanis egy, a Környezetvédelmi 12
Minisztérium megrendelésére 1998-ban készített tanulmány szerint a Magyarországon engedélyezett peszticidek 22%-át ökotoxikológiai szempontok alapján ki kellene vonni a forgalomból és további 9%-kal problémák adódhatnak (1. táblázat, 1. ábra), (DARVAS, 1999 a ). Az EU-ban jelenleg is folyik közel 1000 hatóanyag négy szakaszban történő felülvizsgálata és újraengedélyezése, melynek kitűzött határideje 2005 és 2008 közé esik. 1. táblázat Többféle indokkal Magyarországról kivonásra javasolt növényvédő szer hatóanyagok Kilenc okkal γ-hch * Nyolc okkal diklórfosz, endoszulfán, metil-paration * Hét okkal klórpirifosz, cipermetrin, dimetoát Hat okkal Öt okkal Négy okkal * Visszavonva ** Nélkülözhetetlen használatra engedélyezve *** 2005. 12. 31-ig engedélyezve **** 2006. 10. 01. és 2008. 07. 31. között felülvizsgálatra kötelezve 2,4-D ****, aldikarb *, atrazin **, karbofurán, diuron, linuron ****, malation, metomil, permetrin *, trifluralin karbaril *, cianazin *, diazinon, fenitrotion, fention, maneb *, cineb * alaklór, benomil ***, bifentrin, rézoxiklorid, mankoceb, metiram, foszmet *, pirimikarb, simazin *, tiram ****, triadimefon *, ziram **** kivonásra javasolt 22% problémás 9% kevéssé problémás 26% bizonytalan megítélésű 7% nem problémás 36% 1. ábra A Magyarországon engedélyezett peszticidek toxikológiai minősítése 13
A toxikológiai vizsgálati módszerek fejlesztése tehát ismereteink bővülésével követte a hatóanyag-fejlesztést, amelynek következtében a növényvédő szerek engedélyeztetési eljárása a kor követelményeinek megfelelően fokozatosan átalakult és ebben az új rendszerben az egyéni egészségvédelmen túl már fontos szerepet kap a környezet megóvása is. Ennek szerves részeként hazánkban is évtizedek óta folynak olyan laboratóriumi és modellüzemi vizsgálatok, amelyekben elsősorban kifejlett madár szervezetek alkalmazásával növényvédő szerek toxikus hatásainak részletes feltárása és megismerése a cél. A peszticidek ökotoxikológiai tesztelése során döntő részben az egyes növényvédő szerek külön-külön kerülnek alkalmazásra, ugyanakkor nem hagyhatjuk figyelmen kívül, hogy a vegyi terhelés általában komplex módon jelentkezik, így számolni lehet az egyidejűleg jelen levő vegyi anyagok együttes méreghatásával, interakciójával, amelynek következtében a komponensek egymás méreghatását felerősíthetik, illetve kiolthatják. Az utóbbi néhány évtizedben a kutatók érdeklődése is fokozatosan az interakciós hatások tanulmányozása felé fordult nemcsak a növényvédelmi toxikológia esetében, hanem minden olyan egyéb területen, amely az egészségvédelem és a kémiai biztonság kérdésével foglalkozik (OSKARSSON, 1983; DANIELSSON és mtsai, 1984; SPEIJERS és SPEIJERS, 2004; YOUN-JOO és mtsai, 2004). Az általam elvégzett vizsgálatsorozat célja az volt, hogy két eltérő expozíciós időpontot feltételezve feltárja a környezetünkben nagyobb mennyiségben előforduló, illetve az élő szervezetekre nézve fokozottan veszélyesnek minősülő nehézfémek (réz, kadmium) és két széles körben alkalmazott peszticid (BI 58 EC, Dithane M-45) egyedi és együttes embriókárosító hatását. A vizsgálat alkalmas annak tanulmányozására, hogy a környezeti nehézfém terhelés mellett miként érvényesül az adott inszekticid és fungicid méreghatása a fejlődő madárembrióban, figyelembe véve az egész embrionális fejlődési szakaszt. Mivel az ökotoxikológiai vizsgálati módszerek elsősorban csak egy adott szer méreghatásának vizsgálatára szorítkoznak, ezért a növényvédő szerek interakciós hatásaira vonatkozó adatok különösen fejlődő madár szervezetben hiánypótlónak tekinthetők. Ez a tény pedig különösen azért fontos, mert az élő szervezetek és a környezet közötti kölcsönhatások és összefüggések feltárásának, illetve értékelésének elengedhetetlen és elsődleges feltétele a vizsgálati eredményeket alátámasztó pontos adatok és adatbázisok kialakítása. 14
3. IRODALMI ÁTTEKINTÉS 3. 1. A madárembrió tesztszervezetként történő felhasználása vegyi anyagok teratológiai tesztelésében Dokumentáltan, elsőként Féré vizsgált különféle vegyi anyagokat fejlődő madárembrión a XIX. század végén. Kísérleteiben alkoholt és alkaloidokat (nikotint, kodeint, morfint) juttatott termékeny házityúk tojásba, bizonyítva ezáltal, hogy kémiai úton előidézhető az embrió torzfejlődése (WARKANY, 1977). Az elmúlt évszázadban, különösen a század második felétől kezdődően számos kutató vizsgálta különféle környezetszennyező anyagok többek között az értekezésben szereplő növényvédő szerek és nehézfémek fejlődő madárembrióra gyakorolt hatását (HOFFMAN, 1990; BRUNSTRÖM és mtsai, 1991; VÁRNAGY és mtsai, 1996; KERTÉSZ és FÁNCSI, 2003). Az eddig elvégzett kísérletek bebizonyították, hogy a madárembrió tesztszervezetként történő felhasználása nyilvánvalóan meglevő hátrányai ellenére számos előnnyel jár (2. táblázat), és emiatt széles körben használt a farmakológiai és ökotoxikológiai vizsgálatok területén. 2. táblázat A madárembrió tesztszervezetként történő felhasználásának előnyei és hátrányai a toxikológiai vizsgálatok területén Előnyök (+) gyorsan, olcsón és egyszerűen kivitelezhető, a bejuttatott anyag a tojásban marad és nem választódik ki, lehetővé téve ezáltal a kémiai anyagok embrióra gyakorolt közvetlen hatásának vizsgálatát, a madárembrió érzékenysége a fizikai és kémiai ágensekkel szemben, illetve fejlődésének nagyfokú hasonlósága az emlősök morfológiai fejlődéséhez (KORHONEN és mtsai, 1981, 1982). Hátrányok (-) anya-magzat kapcsolatrendszer hiánya, az embrió nagymértékű érzékenysége miatt kapott sok hibás pozitív eredmény, a vizsgálati rendszerben nyert adatok csak megfontolásokkal extrapolálhatók más fajokra (WILSON, 1978; VÁRNAGY, 2005). 15
Az utóbbi évtizedekben a vegyipar fejlődésének köszönhetően jelentős mennyiségű, újonnan kifejlesztett kémiai anyag került bevezetésre megfelelő toxikológiai vizsgálati háttér nélkül. Becslések szerint az Egyesült Államok Környezetvédelmi Hivatala (Environmental Protection Agency), az EPA is csupán a forgalomba kerülő anyagok 5%- ának felülvizsgálatát tudja ellátni évente. Ennek következtében szükség van olyan egyszerű és gyors teszt-eljárásokra, melyre például az előzetes teratológiai szűrővizsgálatokban a madárembrió nyújt lehetőséget. Így mód nyílik az alacsony kezelési szinteken embriotoxikusnak és teratogénnek bizonyult vegyületeket a későbbiekben emlős vizsgálati rendszerekben tesztelni. A humán szempontból teratogén hatásúnak bizonyult kémiai ágensek (thalidomid, androgén hormonok) szinte minden esetben torzfejlődést indukáltak madárembriókon is (SOMLYAY, 1990). A madarak sajátos anyagcseréjük miatt általában érzékenyebben reagálnak a szennyező és mérgező anyagokra, mint az emlősök. MARLIAC és VERRET (1963) növényvédő szerek (DDT, lindán, paration, metil-paration, karbamát származékok) teratogén hatását vizsgálta és hasonlította össze házityúk és patkány embriókon. Megállapították, hogy a madárembrió egyes esetekben akár háromszázszor érzékenyebben reagál, mint a rágcsáló. Ez a fokozott érzékenység teszi tehát alkalmassá a madarakat arra, hogy az ökotoxikológiai vizsgálatok során az egyes kémiai anyagok veszélyességének megítélésében kiemelt szerepet kapjanak. Magyarországon a 89/2004. (V. 15.) és az 1/2005. (I. 7.) FVM rendelet tartalmazza tételesen a hazai szabályozás szerint a növényvédő szerek engedélyezési eljárása során megkövetelt állatkísérleteket (MAGYAR KÖZLÖNY, 2004; FÖLDMŰVELÉSÜGYI ÉS VIDÉKFEJLESZTÉSI ÉRTESÍTŐ, 2005). 3. 2. A házityúk embrionális fejlődése A vegyi anyagok fejlődő madárembrióra gyakorolt hatásának vizsgálatához nélkülözhetetlen a keltetés alatt végbemenő biológiai folyamatok részletes ismerete. Az átlagosan huszonegy napos inkubáció első kilenc napján az embrió fejlődését minőségi, majd az ezt követő időszakban már elsősorban mennyiségi változások jellemzik. A keltetés első három napjára az intenzív növekedés jellemző. Az első napon (2. ábra) az élet első jeleként az addig gyűrű alakú csírakorong megnyúlik és körte alakot vesz fel, kialakul az őscsík, majd az ectoderma és az entoderma között megjelenik új rétegként a mesoderma. A későbbiek folyamán ebből a három alaprétegből alakulnak ki a 16
különböző szövetek és szervek. A keltetés 21. órájában az őscsík mindkét oldalán megjelennek a szomiták (gerinchúri ősszelvények), amelyekből a későbbiekben fejlődik ki az izomzat és a csontozat. Az első nap végére megjelennek az emésztőszervek, a gerincoszlop, a fej és az idegrendszer kezdeményei. 2. ábra Termékeny házityúk tojás a keltetés megkezdésének napján (Forrás: HUNT és REINHART, audiovizuális prezentáció) A második nap megkezdődik a szív és a véredények, a hajszálerek, a kiválasztó-, halló- és szaglószervek kezdeményeinek fejlődése. Megközelítőleg a keltetés 42. órájában megindul a szívverés és a véráramlás. Az idegrendszer kezdeményei létrehozzák a velőcsövet, amelynek első szakaszából az agy, hátulsó szakaszából pedig a gerincvelő fejlődik ki. A harmadik napon az allantois belenő az extraembrionális testüregbe. Az allantois erei a köldökvénák és a köldök artériák, amelyek biztosítják az embrionális keringést. Megjelennek az orr, a lábak, a farok, majd a szárnyak kezdeményei. A 22. testszelvénypár megjelenését követően az újabbak felismerése egyre nehezebbé válik. A negyedik napra minden testrész megjelenik, a keringési rendszer szemmel jól látható. Az első négy napban az embrió táplálkozása fokozatosan megváltozik, áttérve az egyszerű szénhidrátokról az összetettebb fehérjékre és zsírokra. Az ötödik napon az amnion folyadékkal telik meg, megvédve így az embriót a mechanikai sérülésektől. Differenciálódik az első és a hátsó végtag, az ujjak, a szaporítószervek és az agyvelő. 17
A hatodik és a tizedik nap között az embrió felveszi végleges formáját. A hetedik naptól megindul az allantoislégzés, a nyolcadik naptól már láthatóak a tollkezdemények. Az embrió testén kívül kialakult szív a testüregbe záródik, az embrió a továbbiakban a szik állományával a köldökön keresztül, a vérkeringés útján tart kapcsolatot (BOGENFÜRST, 2004). A tizenegyedik és tizenkettedik nap között a mellizmok és a végtagok izmai erőteljesen növekednek a végtagokkal és a törzzsel egyetemben (3. ábra). A csontosodási folyamathoz szükséges kalcium felvétele a tizenkettedik napra valósul meg. A chorioallantois membrán (CAM) képessé válik a bikarbonát formájában történő kalcium szállítására a tojáshéj és az embrió között, biztosítva ezáltal a megfelelő növekedést (DIECKERT és mtsai, 1992). A tizenharmadik napra az embrióban kifejlődnek a szervek. 3. ábra Házityúk embrió a keltetés tizenkettedik napján (Forrás: HUNT és REINHART, audiovizuális prezentáció) A tizenhatodik naptól a szarukezdemények (csőr, karmok, lábpikkelyek) tisztán felismerhetőek. A tizenhetedik-tizennyolcadik napig az embrionális növekedés dominál. A tizenkilencedik napon (4. ábra) a sziktömlő megkezdi a behúzódást a hasüregbe, majd a huszadik napon befejeződve kezdődik meg a köldökzáródás. A huszonegyedik napra a tojáshéj törékenyebbé válik, mert a mész egy része felszívódott és a csontokban rakódott le (BOGENFÜRST, 2004). 18
4. ábra Házityúk embrió a keltetés tizenkilencedik napján (Forrás: HUNT és REINHART, audiovizuális prezentáció) 3. 3. Szerves foszforsavészter inszekticidek 3. 3. 1. Általános jellemzés Habár a foszfortartalmú szerves vegyületek kutatása már a XIX. század folyamán megkezdődött, a modern szerves foszforsavészter inszekticidek atyjának a német Gerhard Schrader tekinthető, aki az 1930-as években számos organofoszfát típusú vegyületet állított elő. Ilyen volt például a szarin, amelyet ma is a legmérgezőbb vegyületek között tartanak számon (COSTA, 1987). Annak ellenére, hogy sajnálatos módon még az 1980-as évek végén is használtak fel organofoszfátokat hadászati célokra (WEBB, 1993), a II. világháborút követően alapvetően a békés célok kerültek előtérbe és a kutatásokat céltudatosan a szerves foszforvegyületek mezőgazdasági célú felhasználásának irányába terelték (BOGNÁR, 1994). Schrader nevéhez fűződik az első, a növényvédelmi gyakorlatban is felhasznált foszforsavészter alapú rovarölőszerek, többek között a legismertebb inszekticidek közé tartozó paration kidolgozása. Az 1960-as évek végét követően a klórozott szénhidrogéneket azok kedvezőtlen tulajdonságai miatt világszerte kezdték kiszorítani az organikus foszforvegyületek. Alkalmazásuk széles körű. Inszekticid, akaricid tulajdonságuk révén az iparban, a mezőgazdaságban, a háztartásokban, továbbá a köz- és állategészségügy területén egyaránt felhasználhatók. Előnyük az, hogy kémiailag, biokémiailag kevésbé stabilak, mint a klórozott szénhidrogének (TORKOS és ZÁRAY, 1999), ezért sem a kumuláció, sem a 19
biomagnifikáció nem jellemző rájuk, ugyanis észter jellegük miatt általában egy hónapon belül biológiailag inaktív vegyületekre bomlanak (MATSUMURA, 1975). 3. 3. 2. Méreghatás és hatásmechanizmus A szerves foszforsavészterek toxicitása meglehetősen változatos képet fest. A TEPP (tetraetil-pirofoszfát) például közel tízezerszer mérgezőbb, mint az abate (difenfosz) (CLARKE és CLARKE, 1978). Hatásmechanizmusukat tekintve az acetil-kolin-észteráz enzim működését bénítják (HEATH, 1961; O BRIAN, 1967). A melegvérűek vérplazmájában, hasnyálmirigyében és az idegrendszer gliasejtjeiben a máj által termelt úgynevezett pszeudo-kolin-észteráz (pche), míg a vérlemezkékben, a vörös vértestekben, a neuromuscularis junctioban, a ganglionokban, a központi idegrendszerben és az izomszövetben a csontvelő által termelt valódi kolin-észteráz vagy más néven acetil-kolinészteráz (AChE) enzim található (MENDEL és RUDNEY, 1943; AUGUSTINSSON, 1957; LACZAY, 1999). A két enzimet nem egyforma mértékben gátolják az organofoszfátok. A gátlás foka függ a méreg kémiai jellemzőitől, szervezetbe jutott dózisától, illetve az expozíció módjától. A plazma pche általában korábban és jelentősebb mértékben gátlódik, de regenerációja gyorsabb, míg ezzel szemben a vörösvértest AChE gátlása többnyire tartósabb. Az idegrendszer területén mindkét enzim előfordul, bár itt inkább az AChE-nak van jelentősége, ugyanis elősegíti az idegvégződéseknél az ingerület átvitelben fontos szerepet játszó acetil-kolin (ACh) transzmitter hidrolitikus lebomlását. Az ACh csak addig marad bomlatlan állapotban, amíg működésére szükség van, ellenkező esetben az enzim hatására ecetsavra és kolinra bomlik le (VÁRNAGY és BUDAI, 2003). Az enzim aktív centruma két részből áll. Egyrészt az anionos helyből, amely az ACh negatív töltésű nitrogénatomját köti meg, másrészt az úgynevezett észterkötő helyből, amelyhez az acetilgyök kapcsolódik szénatomjával (WILSON és BERGMAN, 1950). Abban az esetben, ha az enzim aktív helyeit más molekula például peszticid vagy gyógyszer foglalja el, akkor a kolinerg idegvégződéseken az ACh biokémiai kumulációja következtében bekövetkezik a mérgezés. A méregmolekula és az enzim kapcsolata kezdetben könnyen megbontható, majd stabillá válik (HOBBIGER, 1955). Amennyiben egy élő szervezet ismételten felveszi az organofoszfátot, illetve jut be az egy biológiai rendszerbe, és az acetil-kolin-észteráz bénítás mértéke meghaladja az újratermelést, enzimhiány alakul ki és ennek következtében már kisebb dózis is mérgezést okozhat. A szerves foszforsavészterek között ismertek olyanok is, amelyeknél tulajdonképpen nem 20