A LightCycler 2.0 készülékhez való használatra ( és nagyobb sorozatszámok)

Átírás

1 LightCycler SeptiFast Test MG AZ ALÁBBIAKKAL VALÓ HASZNÁLATRA: A LightCycler 2.0 készülékhez való használatra ( és nagyobb sorozatszámok) In vitro diagnosztikai célra. LightCycler SeptiFast Kit MG 54 Tests REF : SeptiFast Lys Kit MG 100 Tests REF : SeptiFast Prep Kit MG 10 Tests REF : SeptiFast Software Set REF : FELHASZNÁLÁS CÉLJA A LightCycler SeptiFast Test MG egy in vitro nukleinsav-amplifikációs vizsgálat a SeptiFast Master List (SML) listán megadott mikroorganizmusokból származó bakteriális, illetve gomba DNS kimutatására és azonosítására humán K-EDTA-s vérben LightCycler 2.0 készülék segítségével. A vizsgálat a klinikai megjelenéssel, elfogadott mikrobiológiai vizsgálatokkal és/vagy egyéb laboratóriumi markerekkel együtt olyan betegek gondozásában nyújthat segítséget, akiknél szepszis vagy más bakteriális/gomba véráram-fertőzés gyanúja merült fel. A VIZSGÁLAT ÖSSZEGZÉSE ÉS MAGYARÁZATA A leginkább bacteriaemia és/vagy fungaemia okozta szepszis a kórházi mortalitás és morbiditás fő okainak egyike. A szepszissel kapcsolatos morbiditás és mortalitás csökkentésében a megfelelő antibiotikus terápia és a kezelés minél előbbi megkezdése kritikus tényezők. Az intenzív terápiás osztályokon a kezdettől inadekvát antibiotikus terápiával kezelt betegek hányada jelentős, 11 46% (1,2,3). A kórházakban rendszerint legalább 48 órát vesz igénybe a bakteriális/gomba kórokozó(k) azonosítása és gyógyszerérzékenységük meghatározása haemokultúrákból (1). Molekuláris diagnosztikai eszközökkel végzett gyors kórokozó-kimutatás elősegítheti a bacteriaemia/fungaemia gyors diagnózisát, és a megfelelő antibiotikum-terápia korai adását, ugyancsak csökkentve a széles spektrumú antibiotikumok túlzott használatát (4,5). A LightCycler SeptiFast Test MG olyan mikroorganizmusok kimutatására szolgál, amelyek az összes véráram-fertőzések mintegy 90%-át okozzák (1,6). Míg a mikrobiológiai módszerek élő mikroorganizmusokat mutatnak ki, ez a vizsgálat élő és élettelen mikroorganizmusokat, valamint szabad mikrobiális DNS-t egyaránt kimutat. A target fajokat a SeptiFast Master List (SML) sorolja fel az 1. táblázatban. Ezeket a fajokat a LightCycler SeptiFast Test MG segítségével belső vizsgálatok és/vagy klinikai kísérletek során pozitívként detektálták. Ezen fajok némelyike a leggyakrabban inadekvát módon kezelt fajok közé tartozik: Enterococcus spp.; E. coli; Candida spp.; Klebsiella spp (6). Továbbá az SML target fajok némelyikének korai azonosítása azért is fontos, mert ezek a legnehezebben kezelhető fertőzéseket okozzák: Acinetobacter spp., Stenotrophomonas spp., Enterococcus spp., Candida spp., Pseudomonas spp. (6). Egy mintán belül egynél több faj is kimutatható. Tehát a valós idejű PCR egy kiegészítő eszköz a korai klinikai döntéshozás elősegítésére. 1. táblázat: SeptiFast Master List (SML) Gram (-) Gram (+) Gombák Escherichia coli Staphylococcus aureus Candida albicans Klebsiella (pneumoniae/oxytoca) CoNS 1 Candida tropicalis Serratia marcescens Streptococcus pneumoniae Candida parapsilosis Enterobacter (cloacae/aerogenes) Streptococcus spp. 2 Candida glabrata Proteus mirabilis Enterococcus faecium Candida krusei Pseudomonas aeruginosa Enterococcus faecalis Aspergillus fumigatus Acinetobacter baumannii 3 Stenotrophomonas maltophilia 1 Koaguláz negatív Staphylococcusok (a CoNS csoportba tartozó fajok a 9. táblázatban vannak felsorolva). 2 A Streptococcus spp. csoportba tartozó fajok a 9. táblázatban vannak felsorolva. 3 Gyakran A. calcoaceticus-a. baumannii (Acb komplex) elnevezésű fajokat nem mutatja ki (8). 1

2 AZ ELJÁRÁS ALAPELVEI A LightCycler SeptiFast Test MG 3 fő lépésből épül fel: Minta-előkészítés a mechanikai feltárással és DNS-tisztítással együtt A target DNS valós idejű PCR-amplifikálása 3 párhuzamos reakcióban (Gram-pozitív baktériumok, Gram-negatív baktériumok, gombák), majd a specifikus hibridizációs próbákkal történő kimutatás A minták és kontrollok automatikus azonosítása Minta előkészítése A minták mechanikus feltárása a SeptiFast Lys Kit MG és a MagNA Lyser készülék segítségével történik. A SeptiFast Prep Kit MG segítségével a mintákat magas hőmérsékleten való inkubálás során roncsolják egy proteáz és egy olyan chaotrop feltáró puffer segítségével, amely szabaddá teszi a nukleinsavakat, és megvédi a szabaddá vált DNS-t a vérben lévő DNázoktól. Belső kontroll (IC) meghatározott térfogata kerül a feltáróreagenssel együtt hozzáadásra valamennyi mintához. Az IC a targetszekvenciák kötő régióival identikus primer kötő régiókkal bíró szintetikus kettős szálú DNS-molekulákat tartalmaz. Az IC egyedi H próba kötő régiókat tartalmaz, amelyek lehetővé teszik az amplifikált IC megkülönböztetését a target-specifikus amplikontól. A kötő puffer hozzáadását követően a keverék egy üvegszálas szűrőbetéttel ellátott centrifugaoszlopba kerül. A humán genom és a bakteriális/gomba DNS az üvegszál felületéhez kötődik. A nem kötődött anyagok, mint sók, fehérjék és egyéb sejtfragmensek két mosási lépés során kerülnek eltávolításra. A mosási lépések befejezését követően az adszorbeált nukleinsavakat magas hőmérsékleten eluálják. Az elutátumokon PCR-analízist végeznek. Valós idejű PCR-amplifikáció és kimutatás A targetszekvencia kiválasztása A baktérium- és gombafajok differenciálására target régióként az internal transcribed spacer (ITS) régiót jelölték ki. Ez az egyetlen kópiájú géneknél nagyobb fokú analitikai érzékenységet nyújt, mivel a baktériumok és gombák genomjában számos operon található. Továbbá az ITS fajspecifikusabb, mint a riboszomális RNS-ek, és ezért a legalkalmasabb fajok közti differenciálásra. Valamennyi Gram-negatív és Gram-pozitív baktérium esetén a 16S és 23S riboszomális DNS-szekvenciák között, valamennyi gomba esetén pedig a 18S és 5,8S riboszomális DNS-szekvenciák között helyezkedik el. Amplifikáció A PCR-amplifikálás előtt az amplikonszennyezés kockázatát AmpErase (uracil-n-glikoziláz) enzim használatával csökkentik. Az enzim felismeri és katalizálja az olyan DNS-szálak megsemmisítését, amelyek dezoxiuridint tartalmaznak, a dezoxitimidint tartalmazókét viszont nem. A mintákat LightCycler kapillárisokban (100 µl) MG lévő hot-start Taq polimerázt tartalmazó amplifikáló elegyhez adják, ahol a PCR-amplifikálás megtörténik. Az adott faj minden egyes targetja amplifikálódik vagy általános vagy specifikus primerek segítségével. Egy targetkeverék párhuzamosan amplifikálódik a reagens kontrollokban (RC). A PCR-termékek valós idejű kimutatása H próbák segítségével Az amplikon két specifikus H próba segítségével fluoreszcens technikával mutatható ki. Ezek a fluoreszcens festékkel jelölt H próbák az amplifikált fragmens belső szekvenciájához hibridizálnak az amplifikálási ciklus annealing fázisában. A kibocsátott fluoreszcenciát a LightCycler 2.0 készülék a négy különböző detektáló csatorna egyikén méri. Az amplifikálás befejeztével az olvadási görbe elemzése történik. Az olvadási hőmérséklet T M függ a hosszúságtól, a szekvenciától, valamint a próba és a target DNS közti homológia mértékétől. A próbák az egy csatornán belül kimutatott fajok differenciálására szolgálnak azok T M értékei révén. A minták és kontrollok automatikus azonosítása A minták és kontrollok olvadási hőmérsékleteinek (T M ) elemzését a mellékelt azonosító szoftver (SeptiFast Identification Software) végzi el, és egy eredménylap kerül kinyomtatásra. A munkafolyamat során történő szennyeződés tartományába eső alacsony koncentrációjú Staphylococcus (CoNS) és Streptococcus fajok nem jelennek meg eredményként. Ha Staphylococcus aureus pozitív eredményt kap, azt követően meca rezisztencia vizsgálat megfontolandó. A részleteket illetően tanulmányozza a LightCycler SeptiFast meca Kit MG mellékelt használati utasítását (P/N: ). REAGENSEK SeptiFast Lys Kit MG P/N: teszt LM (feltáró mátrix) 100 x üveg/kerámia gyöngyök SeptiFast Prep Kit MG P/N: teszt [1] LB (feltáró puffer) < 50% guanidin-tiocianát 20% Triton X-100 Ártalmas 20 x 1500 µl [2] PK (proteináz K) 2% proteináz K glicerin [3] BB (kötő puffer) < 50% guanidin-tiocianát 20% Triton X-100 [4] IRB (gátlás eltávolító puffer) < 50% guanidin HCl < 40% etanol Ártalmas Ártalmas Ártalmas 2 x 850 µl 10 x 1000 µl 10 x 1800 µl 2

3 SeptiFast Prep Kit MG P/N: teszt [5] WB (mosópuffer) < 0,2% nátrium-klorid < 80% etanol Tűzveszélyes 10 x 1600 µl [6] EB (eluáló puffer) 10 x 400 µl BET (vérextraháló csövek) 1 x 50 FC (szűrőoszlopok) 2 x 5 LightCycler SeptiFast Kit MG P/N: teszt [1a] RM 1a (reakciókeverék 1a) 3 U/µl FastStart Taq polimeráz < 0,1% AmpErase (uracil-n-glikoziláz) enzim 3 x 27 µl [1a] RM 1b (reakciókeverék 1b) < 1% Brij < 0,1% magnéziumoldat < 0,1% dntp [2] DM G+ (kimutatási keverék Gram-pozitív) < 0,001% primer, próbák G+ < 1% Brij [3] DM G- (kimutatási keverék Gram-negatív) < 0,001% primer, próbák G- < 1% Brij [4] DM F (kimutatási keverék gomba) < 0,001% primer, próbák F < 1% Brij [5] RC G+ (reagens kontroll Gram pozitív) < 0,001% DNS kontroll templát G+ EDTA [6] RC G- (reagens kontroll Gram-negatív) < 0,001% DNS kontroll templát G- EDTA [7] RC F (reagens kontroll gomba) < 0,001% DNS kontroll templát F EDTA [8] IC (belső kontroll) < 0,001% DNS in process kontroll templát G+, G-, F EDTA [9] NC (negatív kontroll) < 35% polietilén-glikol x 620 µl 3 x 126 µl 3 x 126 µl 3 x 126 µl 1 x 330 µl 1 x 330 µl 1 x 330 µl 5 x 100 µl 10 x 1600 µl SeptiFast Software Set 1.0 vagy újabb P/N: x SeptiFast Identification Software SeptiFast Macro SeptiFast meca Macro SeptiFast MCC Macro SeptiFast biztonsági fájlok 3

4 FIGYELMEZTETÉSEK ÉS ÓVINTÉZKEDÉSEK Általános figyelmeztetések és óvintézkedések In vitro diagnosztikai célra. Csak humán K-EDTA-s vérmintákhoz. A heparinról kimutatták, hogy gátolja a PCR-t, ezért tilos a használata. Amennyiben a vizsgálatot olyan beteg esetében alkalmazzák, aki heparin adásban részesül (pl. terápiásan vagy hemodialízis során), akkor a mintát a heparin adását megelőzően kell levenni. Ne pipettázzon szájjal. Ne egyen, igyon vagy dohányozzon a laboratórium területén. Viseljen púdermentes, egyszer használatos védőkesztyűt, védőruhát és szemvédőt a minták és a készlet reagensei kezelése közben. A minták és a tesztreagensek kezelését követően gondosan mosson kezet. Ne öntse össze a különböző gyártási tételekből származó reagenseket. Ne keverje a különböző készletekből származó reagenseket, a master mixhez szükségeseket kivéve. A fel nem használt reagensek, hulladék és minták kezelésének összhangban kell lennie a megfelelő országos, szövetségi, állami és helyi szabályozásokkal. Ne használja a készletet a lejárati idő után. Az anyagok biztonsági adatlapjai (MSDS) igény esetén hozzáférhetők a Roche helyi képviselőjétől. A mintákat fertőzőként kell kezelni a Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (8) és a CLSI Document M29-A (9) előírásoknak megfelelő biztonságos laboratóriumi eljárásokat alkalmazva. Minden munkafelületet és kesztyűt alaposan tisztítson meg és fertőtlenítsen DNS-dekontamináló reagenssel (pl. LTK-008 ). Győződjön meg arról, hogy a kesztyűk ellenállóak a DNS-dekontamináló reagenssel szemben. Viseljen szemvédőt, védőruhát és egyszer használatos védőkesztyűt bármely reagens kezelése közben. Ezen reagensek bőrrel, szemmel és nyálkahártyákkal való érintkezése kerülendő. Ha mégis előfordul érintkezés, azonnal mossa le nagy mennyiségű vízzel. Ellenkező esetben égő érzés előfordulhat. Ezen reagensek kiömlése esetén szárazra törlés előtt vízzel hígítsa. A feltáró puffer (LB) és kötő puffer (BB) bőrrel, szemmel és nyálkahártyákkal való érintkezése kerülendő. Ha mégis előfordul érintkezés, azonnal mossa le nagy mennyiségű vízzel, ellenkező esetben égés történhet. A kiömlött reagenseket feltörlés előtt hígítsa fel vízzel. Az LB és BB pufferek ne kerüljenek kapcsolatba hipoklorit (fehérítő) oldattal. Az ilyen keverékből erősen mérgező gáz fejlődhet. A laboratóriumi munkafolyamatnak egyirányú módon kell zajlania, kezdve a preamplifikálási területtől a posztamplifikálási (amplifikálási/kimutatási) területig haladva. A preamplifikálási műveletek a reagens-előkészítés és a minta-előkészítés. Valamennyi preamplifikálási művelethez tartozó felszerelést és eszközt jelölni kell, és tilos használni más művelethez vagy más munkaterületre átvinni. Valamennyi munkaterületen kesztyűt kell viselni, és a terület elhagyása előtt le kell venni. A reagens és kontroll kezeléséhez használt felszerelést és eszközöket tilos használni minta-előkészítési műveletekhez, amplifikált DNS vagy más target DNS-forrás pipettázásához vagy feldolgozásához. A posztamplifikálási műveletekhez tartozó felszerelést és eszközöket mindenkor a posztamplifikálási munkaterületen kell tartani. A master mixben jelen lévő AmpErase enzim csökkenti az amplikonszennyezés kockázatát. Ugyanakkor a pozitív kontrollokból és pozitív klinikai mintákból származó szennyeződés csak helyes laboratóriumi gyakorlattal és ezen Használati utasításban meghatározott eljárások gondos betartásával kerülhető el. Specifikus figyelmeztetések és óvintézkedések a LightCycler SeptiFast Test MG használatához A LightCycler SeptiFast Test MG target organizmusaiból származó DNS jelen van a környezetben. Az ilyen, környezeti DNS kimutatásából származó álpozitív eredmények (DNS-szennyezés) elkerülése érdekében szükséges DNS-szennyezéstől mentes munkafolyamat biztosítása. Különösen a kezelő személy lehet DNS-szennyezés forrása, mivel az emberi bőrt és felső légutakat olyan különböző mikroorganizmusok népesítik be, amelyek a LightCycler SeptiFast Test MG target organizmusai is [pl. Streptococcusok és koaguláz negatív Staphylococcusok (CoNS)]. Az alábbi szabályok ajánlások a DNS-szennyezés elkerülésére. LightCycler SeptiFast Test MG reagensek és egyszer használatos eszközök A LightCycler SeptiFast Test MG reagensek és egyszer használatos eszközök MG minőségűek. Az MG termékeket bakteriális és gombákból származó nukleinsavak nagyon érzékeny kimutatására tervezték. Szabadalmazott gyártási eljárásokat fejlesztettek ki annak érdekében, hogy kizárják az ilyen jellegű vizsgálatokat zavaró DNS-szennyezést. Kerülje a reagensfiolák szükségtelen kinyitását és lezárását. Ruházat és kesztyű Viseljen púdermentes kesztyűt a teljes munkafolyamat alatt. Ne hagyjon fedetlen bőrfelületet, viselje a kesztyűt a labor köpeny ujjára húzva. Szennyeződés esetén azonnal cseréljen kesztyűt, vagy kezelje DNS-dekontamináló reagenssel (pl. LTK-008 ; a kesztyűnek ellenállónak kell lennie a DNS-dekontamináló reagenssel szemben). Felvételkor ne érjen a kesztyűk tenyér részéhez és az ujjakhoz. A lamináris áramlású fülke gondozása A munkaállomás felületeinek tisztítását lamináris áramlás mögött végezze DNS-dekontamináló reagenssel minden egyes minta-előkészítést követően. MEGJEGYZÉS: Győződjön meg arról, hogy a felszerelés ellenálló a DNS-dekontamináló reagenssel szemben. Rendszeres időközönként takarítson le minden felületet a lamináris áramlású fülkén belül (oldalfalak, alsó tálca alatti terek, padlótálca). Ha több felhasználó használja a lamináris áramlású fülkét, biztosítsa annak DNS-mentességét. Kapcsolja be az UV-fényt és a levegőáramot legalább 30 percre a munka előtt. Kapcsolja ki az UV-fényt amíg dolgozik. A PCR-munkaállomás gondozása A PCR-munkaállomás munkafelületeinek tisztítását DNS-dekontamináló reagenssel végezze el minden egyes PCR-üzembeállítást követően. Rendszeres időközönként takarítsa le a PCR-munkaállomás valamennyi felületét. Kapcsolja be az UV-fényt legalább 30 percre a munka előtt. Kapcsolja ki az UV-fényt, amíg dolgozik. MEGJEGYZÉS: A lamináris áramlású fülke és PCR-munkaállomás UV-lámpájának cseréjét a gyártó utasításai szerint végezze. Munkaeszközök és fogyóeszközök kezelése A LightCycler SeptiFast Test MG vizsgálathoz használt specifikus fogyóeszközöket és munkaeszközöket hagyja a lamináris áramlású fülkében, ha lehetséges. A munka megkezdése előtt sugározzon be minden darabot UV-fénnyel legalább 30 percig. Csak DNS-mentes egyszer használatos anyagokat használjon (pl. MG minőség. Lásd a Szükséges, de nem biztosított anyagok c. fejezetet.) Csak egyszer használja azokat. 4

5 A kapillárisok lezárásához használjon kupakozó eszközt (a kezelési utasításokat illetően tanulmányozza a LightCycler 2.0 készülék Felhasználói kézikönyvét). Kapilláris törése esetén kérjük, tanulmányozza a LightCycler 2.0 készülék Felhasználói kézikönyvét ( Karbantartás fejezet). Óvintézkedések pipettázáskor Csak a lamináris áramlású levegőszűrő alatt nyissa ki a reagensfiolákat, pipettahegyes dobozokat és kapillárisdobozokat. A lamináris áramláson kívül ne használja ugyanazokat a pipettahegyeket és kapillárisokat. Ne érjen nyitott fiola pereméhez vagy csavarmenetéhez. Pipettázáskor a fiolát a pereme alatt érintse. Ne érjen nyitott kapilláris pereméhez. Rendezze a műveletek során használt valamennyi eszközt logikai sorrendbe a lamináris áramlás alatt (kerülje az összevissza történő pipettázást). Ha kifröccsenés fordul elő, fejezze be az aktuális munkalépést, és utána azonnal takarítsa le munkaterületet DNS-dekontamináló reagenssel (pl. LTK-008 ). TÁROLÁSI ÉS KEZELÉSI KÖVETELMÉNYEK SeptiFast Lys Kit MG C között tárolandó. Csak egyszer nyissa ki a fiolákat. Tilos újra felhasználni őket. A lejárati idő után ne használja fel azokat. SeptiFast Prep Kit MG C között tárolandó (tilos lefagyasztani vagy hűtőben tárolni). A PK-t legfeljebb 3-szor nyissa ki. A többi fiolát csak egyszer nyissa ki, és a fel nem használt reagenseket dobja ki. Ne használjon különböző gyártási tételekből származó reagenseket egy extrakciós futtatáson belül. A lejárati idő után ne használja fel azokat. LightCycler SeptiFast Kit MG -15 és -25 C között tárolandó. Fénytől védve tartandó. A master mixeket ([1a], [1b] és [2] vagy [3] vagy [4] keverékét) legfeljebb 3 napig 2 8 C között tárolja. A RC-t használat után legfeljebb 10 napig 2 8 C között tárolja, vagy minden egyes használat után fagyassza le azonnal -15 és -25 C közé. A RC-t legfeljebb 6-szor nyissa ki. A többi fiolát csak egyszer nyissa ki, és a fel nem használt reagenseket dobja ki. Ne használjon különböző gyártási tételekből származó reagenseket egy PCR-futtatáson belül. A lejárati idő után ne használja fel azokat. A KÉSZLET TARTALMA SeptiFast Lys Kit MG P/N: teszt SeptiFast Prep Kit MG P/N: teszt LightCycler SeptiFast Kit MG P/N: teszt SeptiFast Software Set 1.0 vagy újabb (egy alkalommal biztosítva) P/N: SZÜKSÉGES, DE NEM BIZTOSÍTOTT ANYAGOK Megvásárolhatók a Roche-tól LightCycler 2.0 készülék és a Software vagy újabb LightCycler kapillárisok MG (100 µl) LC mintatárcsa-centrifuga MagNA Lyser készülék (230 V) LightCycler Multicolor Compensation Set SeptiFast hűtőblokk Megvásárolhatók más gyártóktól Kilendülő fejes centrifuga 15 ml-es csövekhez min g ülepítőerejű (pl. Eppendorf) 1x centrifuga x illesztőelem (1 pár) 15 ml-es csövekhez kúpos fenékkel 1x kilendülő fejes rotor min g Centrifuga (pl. Eppendorf) 1x MiniSpin 2 termo keverő (pl. Eppendorf) 2x Thermomixer Comfort benne 1x termoblokk 24 x 2,0 ml-es fiolákhoz és 1x termoblokk 8 x 15 ml-es fiolákhoz Cső/palack átforduló keverő (pl. Stuart Scientific) 1x átforduló keverő 1x vortex VWR International VWR International VWR International VWR International

6 DNS-mentes fiolák és hegyek (pl. MG egyszer használatos anyagok, greiner bio-one) 5 ml-es szűrőhegyek MG 1 ml-es szűrőhegyek MG 100 µl-es szűrőhegyek MG 20 µl-es szűrőhegyek MG 1 ml-es szérumpipetta MG 1,5 ml-es csövek MG DNS-dekontamináló reagens (pl. biodelta GmbH) LTK-008 set Pipetta 1 5 ml-es (pl. Thermo Life Sciences) 1x Finnpette 1 5 ml-es Pipetta µl-es (pl. Eppendorf) 2x referencia µl 2x referencia µl 1x referencia 2 20 µl (csak meca vizsgálathoz) Lamináris áramlású fülke (pl. Cleanair) BioSafety Cabinet EF 4E PCR-munkaállomás (pl. Safety Cabinet Solutions Ltd.) Biocap Passive DNA PCR Cabinet Pozitív kontrollanyag Más gyártó által biztosítva vagy a felhasználó laboratóriumában előállítva (lásd az Ajánlás a pozitív kontrollanyagok készítésére c. szakaszt). greiner bio-one MG MG MG MG MG MG biodelta GmbH VWR International VWR International VWR International VWR International A MINTA LEVÉTELE, TRANSZPORTJA ÉS TÁROLÁSA MEGJEGYZÉS: Valamennyi mintát és kontrollt fertőzések átvitelére alkalmasként kell kezelni. A minta levétele A LightCycler SeptiFast Test MG kizárólag K-EDTA-s vérmintákhoz való használatra alkalmas. A vért K-EDTA alvadásgátlót tartalmazó steril csövekbe kell levenni. A minta transzportja és tárolása A teljes vér transzportja meg kell feleljen a kóroki ágensek transzportjára vonatkozó országos, szövetségi, állami és helyi szabályozásoknak (10). A teljes vér -15 C és -25 C vagy 2 8 C között legfeljebb 3 napig, C között pedig legfeljebb 4 óra hosszat transzportálható/tárolható. Az eluátumok stabilitása A feldolgozott mintát közvetlenül a DNS-tisztítás után használja fel. Ha szükséges, tároljon egy a meca vizsgálat céljára előkészítendő kis részletet (további részleteket illetően kérjük, tanulmányozza a LightCycler SeptiFast meca Kit MG készletet). Az eluátumok -15 és -25 C vagy 2 8 C között legfeljebb 3 napig, C között pedig legfeljebb 4 óra hosszat tárolhatók. HASZNÁLATI UTASÍTÁS Mielőtt a minta és kontroll előkészítését megkezdené A LightCycler 2.0 készülék és PCR-munkaállomás előkészítése Színkompenzáció: Használja a LightCycler Multicolor Compensation Set-et (P/N: ). Ha a színkompenzáció-fájl lejárt, akkor készítsen egy új fájlt. A részleteket illetően kérjük, tanulmányozza a LightCycler Multicolor Compensation Set mellékelt használati utasítását. A SeptiFast Identification Software (SIS) telepítése: A frissítések telepítése során ellenőrizze, hogy van-e újabb információ adva a termékhez. 1. Jelentkezzen be a LightCycler adatállomásra rendszergazdaként. 2. Helyezze be a SeptiFast Software Set CD-t a LightCycler adatállomás CD-meghajtójába. 3. Első alkalommal történő telepítéskor: Abban az esetben, ha a Microsoft.NET 1.1 keretrendszer nincs telepítve, a SIS beállításának megkezdésekor emlékeztetve lesz annak telepítésére. A Microsoft.NET 1.1 keretrendszer telepítése kötelező, különben a SIS nem fog megfelelően működni. 4. A SIS telepítéséhez nyomja meg az <OK> gombot, kövesse a telepítő varázslót. 5. Ha csak egy felhasználó fog dolgozni a LightCycler adatállomáson, válassza, hogy <just me>, ha egynél több felhasználó fog dolgozni a LightCycler adatállomáson, válassza, hogy <everyone>. 6. Erősítse meg a <Setup succeeded> üzenetet az <OK> megnyomásával (a SIS mostantól az asztalon lévő ikonjával indítható). 7. Az *.ixo fájlok adatmappája: <C:\Export to SIS> automatikusan létrejön. A SIS helyes telepítésének ellenőrzése (a LightCycler SeptiFast Test MG és a LightCycler SeptiFast meca Kit MG vizsgálatokkal): 1. Valamennyi biztonsági fájlt a SeptiFast Software Set CD-ről a program automatikusan a <C:\Export to SIS> mappába másolja. 2. Kattintson duplán a SIS ikonra az asztalon, nyomja meg a <Start> gombot. 3. Jelölje ki a biztonsági fájlt a <C:\Export to SIS> mappából (SeptiFast Proof 1.0.ixo vagy SeptiFast meca Proof 1.0, rendre). 4. Jelölje meg a NO választ arra, hogy a LightCycler eredménylap tartalmazza-e a <User Developed or Modified Test Method> jelzést. 5. A program automatikusan elemzi a fájlt, és megjeleníti az adatokat. 6. Nyomtassa ki a jelentést. 7. Nyissa meg és nyomtassa ki a vonatkozó pdf fájlokat (SeptiFast Proof 1.0.pdf vagy SeptiFast meca Proof 1.0.pdf, rendre). 8. A kinyomtatott jelentésnek és a kinyomtatott proof.pdf fájlnak meg kell felelnie egymásnak. Ha nem, akkor lépjen kapcsolatba a Roche helyi képviselőjével. 9. Végezze el a 3 8. lépéseket a második biztonsági fájllal. 6

7 A SIS eltávolítása: 1. Jelentkezzen be a LightCycler adatállomásra mint rendszergazda. 2. Kattintson a <Start> gombra a LightCycler adatállomás tálcáján. 3. Válassza ki a <Settings - Control Panel - Add/Remove Programs> pontot. 4. Megjelenik az aktuálisan telepített programok listája, kattintson a <SIS>-re. 5. Válassza, hogy <Remove>, és erősítse meg, hogy <Yes>. A SeptiFast makrók telepítése: 1. Telepítse a makrókat a SeptiFast Software Set CD-ről. 2. Egy makró telepítéséhez kérjük, tanulmányozza a LightCycler 2.0 készülék Felhasználói kézikönyvét ( in vitro diagnosztikai célra ). A lamináris áramlású fülke és PCR-munkaállomás előkészítése 1. Gondosan takarítsa ki és dekontaminálja a lamináris áramlású fülkét és a PCR-munkaállomást (pl. LTK-008 segítségével). 2. Legalább 30 percre kapcsolja be: a lamináris áramlású fülke UV-lámpáját és levegőáramát, a PCR-munkaállomás UV-lámpáját. 3. Kapcsolja ki az UV-fényt amíg dolgozik. 4. Nyissa ki a LightCycler SeptiFast Kit MG-t és vegyen elő: 1 fiola IC és 2 fiola NC kontrollt, és hagyja őket felolvadni 2 8 C hőmérsékleten egy, a minta-előkészítéshez használt állványban (nem tartozék). 1 fiola RM 1a, RM 1b, DM G+, DM G-, DM F, RC G+, RC G-, RC F reagenseket, és hagyja őket felolvadni SeptiFast hűtőblokkban a minta előkészítés során 2 8 C között. 5. Kapcsolja be: Termo keverő 1 (15 ml-es csövekhez) és állítsa be 56 C-ra, termo keverő 2 (1,5 ml-es csövekhez) és állítsa be 70 C-ra. 6. Helyezzen megfelelő mennyiségű EB fiolát (1 fiola per minta/nc) a termo keverő 2-be (70 C). 7. Tegye a vérvételi csöveket vagy minta fiolákat átforduló keverőbe, és keverje 30 percig. Dolgozza fel őket azonnal. Minta és kontroll előkészítése MEGJEGYZÉS: Valamennyi műveleti lépést a lamináris áramlású fülkében végezzen el. Ajánlás a pozitív kontrollanyagok készítésére A pozitív kontrollanyagokat más gyártóktól is meg lehet vásárolni. Amennyiben a felhasználó laboratóriumában készülnek, jellemző klinikai izolátumokat kell kiválasztani a helyi előfordulás és a klinikai jelentőség szerint. Ezen izolált telepeket fel kell oldani, és körülbelül 300 CFU/ml koncentrációnak megfelelően be kell oltani negatív vérbe. Pozitív kontrollnak, ATCC anyag 33592, egy methicillin-rezisztens S. aureus használható, amely megteremti annak a lehetőségét, hogy az eluátumot pozitív kontrollként lehessen használni a LightCycler SeptiFast Test MG és a LightCycler SeptiFast meca Kit MG vizsgálatokhoz (P/N: ) is. A törzset óra hosszat C között tenyésztették véres agaron (5% birkavér), és reszuszpendálták 0,5 McFarland-nak megfelelően (~1,5x10 8 CFU/ml). Ezt a szuszpenziót kell beoltani negatív vérbe 300 CFU/ml végső koncentrációnak megfelelően. Előfeltárás SeptiFast Lys Kit MG segítségével MEGJEGYZÉS: Olvassa el gondosan a MagNA Lyser készülék Felhasználói kézikönyvét. 1. Használjon 2 megfelelően felcímkézett LM fiolát minden egyes mintához, illetve NC-hez. 2. Egy alkalommal 2 fiolát felnyitva vigyen át 1500 µl vérmintát, illetve NC-t az egyes fiolákba. 3. Zárja le szorosan a 2 csövet. MEGJEGYZÉS: Ne a kupak tetején jelölje meg a csöveket. 4. Végezzen elő feltárást a mintákon a MagNA Lyser készülékben 70 másodpercig 7000 rpm fordulatszámon. 5. Hagyja a fiolákat a készüléken kívül állni 10 percig. Centrifugálni tilos! Minta-előkészítés SeptiFast Prep Kit MG segítségével. MEGJEGYZÉS: Valamennyi reagensnek tiszta oldatnak kell lennie. Ha csapadék képződött, melegítse fel az oldatot (max. 37 C-ra). Rázza finoman, amíg a csapadék feloldódik. 1. Mérjen 150 µl PK-t a BET 1-be. 2. Mérjen 2x1 ml előfeltárt mintát vagy NC-t a BET 1-be. Kerülje el a szilárd feltáró mátrix vagy hab pipettázását. 3. Tegye fel a kupakot, és röviden vortexelje. 4. Adjon hozzá 10 µl IC-t. Használjon új pipettahegyet minden egyes mintához, illetve NC-hez. 5. Adja hozzá 2 fiola LB tartalmát, tegye rá a kupakot és azonnal vortexelje alaposan. 6. Inkubálja 15 percig 56 C-on óvatos keverés közben (pl. 500 rpm Eppendorf termokeverővel). MEGJEGYZÉS: A BET 1-ben lévő valamennyi folyadékot le kell fedni az inkubáló eszközzel. 7. Adja hozzá 1 fiola BB tartalmát, tegye rá a kupakot és vortexelje. 8. Tegyen FC-t a BET 2-re. Ne érjen az FC belső oldalához vagy kivezető nyílásához. 9. Pipettázza a minta-előkészítő keverék felét a BET 1-ből az FC szűrőjére (kb. 3,2 ml). 10. Tegye rá a kupakot és centrifugálja le a BET 2-FC szerelvényt 1900 x g-n 1 percig. 11. Pipettázza a minta előkészítő keverék maradékát a BET 1-ből az FC szűrőjére (kb. 3,2 ml). Használjon új pipettahegyet minden egyes mintához, illetve NC-hez. 12. Tegye rá a kupakot és centrifugálja le a BET 2-FC szerelvényt 1900 x g-n 3 percig. 13. Tegyen FC-t a BET 3-ra. Dobja ki a BET 2-t átáramoltatással. 14. Mérje egy fiola IRB tartalmát a BET 3-ban lévő FC szűrőjére. 15. Tegye rá a kupakot és centrifugálja le a BET 3-FC szerelvényt 4200 x g-n 2 percig. 16. Mérje egy fiola WB tartalmát a BET 3-ban lévő FC szűrőjére. 17. Tegye rá a kupakot és centrifugálja le a BET 3-FC szerelvényt 4200 x g-n 10 percig. 18. Tegyen FC-t a BET 4-re. Dobja ki a BET 3-at átáramoltatással. 19. Centrifugázza a BET 4-et 4200 x g-n 1 percig. 20. Tegyen FC-t a BET 5-re. Dobja ki a BET 4-et. 21. Pipettázzon 300 µl előmelegített EB-t (70 C) az FC közepére. 22. Tegye rá a kupakot, és inkubálja 5 percig szobahőmérsékleten. 23. Centrifugázza 4200 x g-n 2 percig. 24. Dobja ki az FC-t. Vigye át az eluátumot 1,5 ml-es fiolákba (pl. greiner bio-one szérumpipettákkal). Kerülje a cső falával való érintkezést. 7

8 Reagens-előkészítés LightCycler SeptiFast Kit MG segítségével MEGJEGYZÉS: Javasoljuk, hogy valamennyi műveleti lépést a minta-előkészítési helytől elkülönített PCR-munkaállomáson végezzen el. 1. Vegye ki a SeptiFast hűtőblokkot a reagens fiolákkal a hűtőszekrényből, szennyezésmentesítse DNS-dekontamináló reagenssel (pl. LTK-008 ), és vigye át a PCR-munkaállomásra. 2. Röviden vortexelje a felolvadt reagenseket (kivéve RM 1a), és centrifugálja le őket (ha csapadék képződött, melegítse fel az oldatot 37 C-ra 5 percig, és keverje óvatosan, amíg a csapadék fel nem oldódik). 3. Helyezze a felolvadt reagenses és az eluátumos fiolákat a SeptiFast hűtőblokk kijelölt pozícióiba. 4. Nyissa ki az RM 1b, RM 1a, DM G+, DM G- és DM F fiolákat. 5. Pipettázzon 600 µl RM 1b-t az RM 1a-ba, keverje meg óvatosan fel-le pipettázással. 6. Master mix MM G(+), MM G(-) és MM F létrehozásához pipettázzon 200 µl reakciókeveréket 1a-ból mindegyik DM G+, DM G- és DM F fiolába; keverje meg óvatosan fel-le pipettázással. A PCR-reakciók előkészítése 1. Helyezze a szükséges számú kapillárist a SeptiFast hűtőblokkba, 3 kapillárist az RC-k számára (1, 2, 3 pozíciók), 3 kapillárist az NC eluátum számára (4, 5, 6 pozíciók), 3 kapillárist minden egyes mintaeluátum számára (7 és afeletti pozíciók). 2. Pipettázzon 50 µl MM G(+)-t a felső sor minden egyes kapillárisába. 3. Pipettázzon 50 µl MM G(-)-t a középső sor minden egyes kapillárisába. 4. Pipettázzon 50 µl MM F-t az alsó sor minden egyes kapillárisába. 5. Nyissa ki az első minta eluátum fiolát. Kezdje a SeptiFast hűtőblokk jobb oldalán lévő fiolával. 6. Pipettázzon 50 µl mintaeluátumot az MM G(+), MM G(-) és MM F oldatokat tartalmazó három kapilláris mindegyikébe. MEGJEGYZÉS: Minden pipettázási lépés után cserélje le a hegyet. 7. Kupakozó eszköz segítségével zárja le a három kapillárist (a LightCycler 2.0 készülék tartozéka; a használatot illetően kérjük, tanulmányozza a LightCycler 2.0 készülék Felhasználói kézikönyvét). 8. Folytassa a maradék mintaeluátumokkal az 5 7. lépésekben leírtak szerint. Pipettázza az NC-eluátumot utoljára a 4, 5 és 6 pozíciókban elhelyezkedő kapillárisokba. 9. Nyissa ki az RC G+-t. 10. Pipettázzon 50 µl-t az 1 pozíciójú kapillárisba. 11. Zárja le a kapillárist, majd zárja le az RC G+-t. 12. Pipettázzon RC G- és RC F kontrollokat rendre a 2 és 3 pozíciójú kapillárisokba a lépésben leírtak szerint. 13. Vigye át valamennyi kapillárist a sorszámaik szerint a LightCycler mintatárcsába. 14. Centrifugálja le a LightCycler mintatárcsát LC mintatárcsa-centrifuga 2.0 segítségével. 15. Helyezze a LightCycler mintatárcsát a LightCycler 2.0 készülékbe. A maradék reagensek és eluátumok tárolása 1. Címkézze fel a fel nem használt MM G(+), MM G(-) és MM F oldatokat a fennmaradó reakciószámokkal és dátummal. Helyezze a fiolákat a SeptiFast hűtőblokk megfelelő pozícióiba. 2. A master mix MM 2 8 C között legfeljebb 3 napig tárolható. A következő futtatáshoz szükséges munkaoldat-térfogat biztosításához a tárolt master mix (MM) friss MM oldattal feltölthető Ez az oldat azonnal felhasználandó. 3. Az RC fiolákat tárolja a SeptiFast hűtőblokk megfelelő pozícióiban 2 8 C között. 4. Címkézze fel a mintaeluátumokat és NC-t a futtatási sorszámmal és dátummal. 5. Dobja ki valamennyi üres reagensfiolát. LightCycler 2.0 készülék betöltése és működtetése MEGJEGYZÉS: A LightCycler 2.0 készülék működtetése egy, a DNS-tisztítástól és a munkaoldatok elhelyezésétől elkülönített helyiségben javasolt. 1. Indítsa el a SeptiFast_1.0_ vagy újabb SeptiFast makrót (kérjük, tanulmányozza a LightCycler 2.0 készülék Felhasználói kézikönyvének Roche-makró végrehajtása c. fejezetét. MEGJEGYZÉS: Ha a felhasználó kijelentkezett, ne folytassa a futtatást. Kezdjen el egy új futtatást egy új névvel. MEGJEGYZÉS: Ne használja az <assay lot number> mezőt. Ha szeretné a vizsgálat tételszámát hozzáadni a futtatáshoz, szúrja be ezt az adatot a mintaszerkesztő megfelelő mezőjébe. 2. Olyan néven mentse a futtatást, amely lehetővé teszi az egyértelmű azonosítást (pl. felhasználó neve és dátum). 3. Csökkentse a minták számát az alapértelmezett betöltési listából, ha 7-nél kevesebb mintára van szükség. Törölje egy minta mind a 3 kapillárisát a listában, nem csupán 1-et vagy 2-t a 3 párhuzamos vizsgálatból. Ha véletlenül túl sok kapillárist törölt, ne adja hozzá azokat, hanem kezdje az eljárást az elejétől. 4. Lehetséges, hogy a betegspecifikus adatokat <zárójelben> adja meg az alapértelmezett beállítás helyett [pl. G(+) <Név_01> ahelyett, hogy G(+) <minta 1>]. A SIS helyes mintafelismerésének biztosítására egy mintalista 3 párhuzamos vizsgálatán belül a szövegnek azonosnak kell lenni. Vagy hagyja meg az alapértelmezett beállítást, és ha szükséges, akkor az adatbevitelhez használja a <Run Note> pontot. 5. Ha egyszer valamennyi mintaspecifikus információt megadta, folytassa a készletvarázslóval, és indítsa el a LightCycler 2.0 készülék futtatását. MEGJEGYZÉS: Ne módosítsa a G(+), G(-), F előtagokat. Ne módosítsa a reagenskontrollok [pl. G(+) #RC#] és a negatív kontrollok [pl. G(+) #NC#] elnevezését. 6. A futtatás befejezése után ellenőrizze a folyadék szintet a kapillárisokban (egy adott kapillárisra nézve az eredmények érvénytelenek, ha a térfogat a kapillárisban változik. 8

9 Csúcsészlelés és automatikus mintaazonosítás Az analízismodulok általános magyarázata MEGJEGYZÉS: Ne kezdje meg az adatelemzést a LightCycler 2.0 készülék futása közben. A manuális T M hívás 12 T M -hívás modult (3 vizsgálat, 4 csatorna) igényel. Az abszolút mennyiségi meghatározás modulok nem igényelnek kézi vezérlést. Manuális T M -hívás a T M sávok segítségével legfeljebb 6 csúcs esetén végezhető. Mindegyik analízismodul T M sávja a SeptiFast makróban van megszabva. Az olvadási csúcs ablakban a kiválasztott grafikonok valamennyi görbéje megjelenik. Lehetőség van a T M sávok kijelölésére, illetve a kijelölés törlésére jelző nélkül. Mindegyik analízismód alapvonala a SeptiFast makróban van meghatározva. Ne módosítsa az alapvonalakat, és ne törölje a kijelölésüket. Ha véletlenül módosította, írja be a helyes értéket a 3. táblázat alapján: Alapvonalértékek. Ha egynél több kapilláris van aktiválva, akkor az ellenőrző ablakban az első kapilláris beállításai vannak feltüntetve. A sávok közti váltás valamennyi aktivált kapillárist érinti. MEGJEGYZÉS: Ne módosítsa az alábbi beállításokat: <Channel>, <Color Compensation>, <Program>, <Method>, <Show Shoulders>, <Peak Area> vagy <Peak Width>. A <Display Peak Height> beállítás kiválasztható. A csúcsok, mint az alapvonal feletti maximumok vannak definiálva. A vállak nem csúcsok. Kivétel az RC G-, csatorna 610 (lásd 1. ábra, 2. grafikon). Az 1. grafikonon a két bal oldali csúcs maximum, és indexvonallal kijelölendő. A 2. grafikonon a csúcsok egyike (pl. a második) vállként jelenik meg, de ugyanúgy kijelölendő. A 3. és 4. grafikonon az egyik csúcs hiányzik. Három indexvonal helyett csak kettőt kell aktiválni. 1. ábra: RC G-, CH grafikon 2. grafikon 3. grafikon 4. grafikon A T M indexvonalakkal a kijelölést az érvényes T M tartományokon belül kell elvégezni (lásd 2. táblázat). 2. táblázat: Érvényes csúcsok T M tartományai CH 610 CH 640 CH 670 CH 705 Alacsony T M [ C] Magas T M [ C] Alacsony T M [ C] Magas T M [ C] Alacsony T M [ C] Magas T M [ C] Alacsony T M [ C] Magas T M [ C] G(+) G(-) F Az alapvonal értékek az alábbi táblázat szerint vannak meghatározva, és tilos azokat módosítani. (Ha véletlenül mégis módosítaná, írja vissza a táblázat szerinti eredeti értéket, különben a futtatás jelzőt kap.) 3. táblázat: Alapvonalértékek CH 610 CH 640 CH 670 CH 705 G(+) 0,159 0,027 0,061 0,027 G(-) 0,234 0,001 0,236 0,065 F 0,196 0,033 0,111 0,059 A T M sávok beállítása 1. A futtatás befejezése után a vizsgálati varázsló kiírja, hogy <Analyses have been created>. 2. Tegye alulra az ablakot (ne nyomja meg a <Finish> gombot). 3. Ügyeljen arra, hogy a T M és alapvonalértékek láthatóak legyenek. 4. Kattintson az analízismodulra [pl. T M -hívás G(+) 610]. 5. Áttekintés nyeréséhez aktiválja a vizsgálat valamennyi pozícióját [pl. G(+)]. 6. Kattintson csak a G(+) #RC# pozícióra. 7. Állítsa be a T M sávokat az alapvonal feletti csúcsmaximumokra, ne felejtsen el koncentrálni csak az érvényes T M tartományra (lásd 2. táblázat: Érvényes csúcsok T M tartományai). Ha nincs csúcs az alapvonal felett, a T M sávot törölni kell (megszüntetni az aktiválást a megfelelő kis négyzetben). Egy adott kapilláris T M -hívásának végére csak csúcs maximumok maradhatnak T M sávokkal. Néhány esetben az E. faecium (G+, CH 705, T M 51,8 55,9) és a C. albicans (F, CH 640, T M 53,4 57,5) alacsony koncentrációi megjelenhetnek mint a megfelelő IC csúcsok vállai (G+, CH 705, T M 45,5 49,6; F, CH 640, T M 44,8 48,0). Ezeket a vállakat ugyanúgy jelölje ki egy T M sáv segítségével. 9

10 8. Áttekintés nyeréséhez aktiválja a következő pozíciót [pl. G(+) #NC#] a G(+) #RC#-vel együtt. (Az automata skálázás a legmagasabb csúcsra fog beállni). 9. Aktiválja csak a kiválasztott pozíciót [pl. G(+) #NC#]. (Az automata skálázás a negatív kontroll háttércsúcsaira fog beállni. Az alapvonal adott esetben többé már nem látható.) 10. Folytassa a csúcsdetektálást az 5 7. lépésekben leírtaknak megfelelően. 11. Az egyik vizsgálat [pl. T M -hívás G(+) 610] analízisének befejezését követően folytassa a következővel a lépésekben leírtaknak megfelelően. A T M -hívás befejezése 1. Váltsa a vizsgálati varázslót a monitor közepére, és nyomja meg a <Finish> gombot. 2. A jelentést a program automatikusan létrehozza és kinyomtatja. 3. A futtatást a program automatikusan elmenti. 4. Exportálja az *.ixo fájlt a <C:\Export to SIS> mappába. 5. Ellenőrizze az eredménylapon az esetleges jelzőket, és hogy a <run state: complete> üzenet megjelent-e. 6. Jelző előfordulása vagy a futtatás állapotára vonatkozó más üzenet megjelenése esetén a futtatás érvénytelen, és valamennyi mintát újra kell vizsgálni. Automatikus csúcsazonosítás a SeptiFast Identification Software (SIS) segítségével 1. Kattintson duplán a SIS ikonra az asztalon, nyomja meg a <Start> gombot. 2. Válassza ki a futtatást a <C:\Export to SIS> mappából, és töltse be a *.ixo fájlt. 3. Válassza ki a Yes vagy No választ attól függően, hogy a LightCycler eredménylap tartalmazza-e a <User Developed or Modified Test Method> jelzőt. 4. A *.ixo fájlt a program automatikusan feldolgozza, és az adatokat egy eredménylapon megjeleníti. 5. Nyomtassa ki a SIS eredménylapot. EREDMÉNYEK Az eredmények értékelése A SeptiFast Identification Software (SIS) JELZŐKET és MEGJEGYZÉSEKET hozhat létre a SPECIMEN ablakban úgymint: RUN FLAGS, ASSAY FLAGS és FLAGS (lásd alább). A kezelő személynek meg kell néznie, hogy a kinyomtatott jelentés(ek)en van-e bármelyik ablakban FLAGS vagy COMMENTS. 2. ábra: Specimen ablak Specimen Assay Data Result Flags Comment G(+) <CH..., TM..., PH..., CP...> <species> SeptiFast sample 1 G(-) F További információ szerezhető a RUN FLAGs és az ASSAY FLAGs COMMENT mezőiből. Minta eredménye A <faj> nevek a RESULT mezőben azt jelzik, hogy a minta pozitívnak bizonyult az adott mikroorganizmusra. A megfelelő csúcsok nyers adatai a DATA mezőben vannak feltüntetve: csatorna (CH), olvadáspont (T M ), csúcsmagasság (P H ) és metszéspont (CP 1 ). A RESULT mezőben lévő szimbólum azt jelenti, hogy a faj meghatározott feltételeinek megfelelően nem volt kimutatható analit. 1 A CP csak a G(+) csatorna 610, 640 számára van feltüntetve. meca vizsgálat Ha Staphylococcus aureus pozitív eredményt kap, azt követően meca rezisztencia vizsgálat megfontolandó. A részleteket illetően kérjük, tanulmányozza a LightCycler SeptiFast meca Kit MG mellékelt használati utasítását (P/N: ). Futtatás validálása A futtatás validálást a SeptiFast Identification Software (SIS) végzi. Az érvénytelen futtatásokat automatikusan kiírja és jellel megjelöli. A teljes futtatást meg kell ismételni. A jelzőkhöz tartozó megjegyzések és a vonatkozó magyarázatok az alábbiakban vannak felsorolva. 4. táblázat: Futtatásvalidáláshoz tartozó jelzők Megjegyzések 1 Magyarázat ASSAY FLAG NC: IC not detected Az NC-ben sem target, sem IC nem kimutatható ASSAY FLAG NC: < CH, TM, PH, CP 2 >,< species > Az NC-ben faj mutatható ki ASSAY FLAG NC: more amplicons detected Ráadás jelző, ha több, mint 3 amplikon mutatható ki az NC-ben ASSAY FLAG RC: No amplicon: <species> Az RC egy vagy több amplikonja nem mutatható ki ASSAY FLAG RC: more amplicons not detected Ráadás jelző, ha az RC több, mint 3 amplikonja nem mutatható ki SPECIMEN FLAG IC not detected Sem target, sem IC nem mutatható ki. 1 A rendszerhibák a Hibaelhárítás szakaszban vannak felsorolva. 2 A CP csak a G(+) csatorna 610, 640 számára van feltüntetve. 10

11 MINŐSÉG-ELLENŐRZÉS Egy negatív kontrollt (NC) és egyet-egyet a 3 reagenskontrollból (RC) minden futtatás során a 3 párhuzamos vizsgálat [G(+), G(-), F] mindegyikének tartalmaznia kell. Az NC és RC kontrollokat meghatározott pozíciókba kell elhelyezni, ahogy az A PCR-reakciók előkészítése c. szakaszban le van írva. Pozitív kontrollként egy házon belüli pozitív anyag futtatása javasolt a teljes munkafolyamaton keresztül (lásd a Nem biztosított anyagok c. szakaszt). A SIS meghatározza az IC, NC és RC eredményeket. Amennyiben a kontrollok nem felelnek meg az adott specifikációknak, valamennyi mintaeredmény jelzőt kap a SPECIMEN ablakban. Ellenőrizze a kinyomtatott eredménylapon a SPECIMEN ablakban a jelzőket és megjegyzéseket, hogy meggyőződjön arról, hogy a futtatás érvényes. Negatív kontroll (NC) Az NC negatív kell legyen, ugyanakkor annak belső kontrollja pozitív. Amennyiben az NC nem felel meg ezen feltételeknek, a vizsgálat valamennyi mintaeredménye jelzőt kap. A teljes futtatást meg kell ismételni. Reagenskontrollok (RC) Minden RC pozitív kell legyen az adott RC target amplikonjára. Amennyiben az RC nem felel meg ezen feltételnek, a vizsgálat valamennyi mintaeredménye jelzőt kap. A teljes futtatást meg kell ismételni. Pozitív kontroll A pozitív kontroll pozitív kell legyen. Ha a házon belüli pozitív anyagok vagy külső pozitív kontrollok nem felelnek meg ennek a feltételnek, a teljes futtatás érvénytelen. A SIS nem tüntet fel jelzőt. Belső kontroll (IC) A belső kontroll pozitív kell legyen valamennyi negatív mintában, így a negatív kontrollban is. Amennyiben az IC nem felel meg ezen feltételnek, a minta eredménye jelzőt kap. Érvénytelen kontrollok esetén ismételje meg a teljes eljárást (minta- és kontroll-előkészítés, amplifikálás és kimutatás mind a 3 vizsgálat esetén). Ha a kontrollok következetesen érvénytelenek, vegye fel a kapcsolatot a Roche helyi szervizével. HIBAELHÁRÍTÁS 5. táblázat: A RUN FLAGS COMMENTS mezőjében, illetve a SIS nyomtatott lapon megjelenő rendszerhibák. Rendszerüzenet (a SIS nyomtatott lap jelző részében látható) Lehetséges ok Javító intézkedés User Developed or Modified Test Method CCC File Name: Multiple CCC used! Color Compensation has expired on DD-Month-YY A futtatás érvénytelen; a lehetséges okok a LightCycler 2.0 készülék Felhasználói kézikönyvében vannak ismertetve. Lehetséges, hogy a makró alapértelmezett beállításait (pl. alapvonalak, futtatási protokoll stb.) módosították. Két vagy több színkompenzáció-fájl aktív egy vagy több analízismodulban. A színkompenzáció-objektum hat hónaposnál régebbi. Amennyiben egy vagy több minta hiányzik a SIS eredménylapon, ellenőrizze: 1) nincs-e egy minta három vizsgálati kapillárisának bármelyike tévesen elnevezve, azaz a vizsgálatspecifikus előtagok (G+, G-, F) detektálása téves, vagy 2) nincs-e egy vagy több mintakapilláris tévesen elnevezve, vagy nincsenek-e hiányzó kapillárisok. A javításhoz nyissa meg az eredeti *.ixo fájlt a LightCycler szoftverben, és ellenőrizze a minta elnevezések megfelelő begépelését a mintaszerkesztőben. Módosítson az alapértelmezett nevekre, mentse és exportálja újra a fájlt. 11 Nyissa meg az eredeti *.ixo fájlt a LightCycler szoftverben, és ellenőrizze az alapvonal értékeket a 3. táblázat szerint. Mentse és exportálja újra a fájlt. Válassza ki a megfelelő színkompenzációt és számolja újra. Hozzon létre egy új színkompenzáció-objektumot. Invalid Macro Nem megfelelő makró lett alkalmazva Keresse meg a megfelelő makrót a LightCycler szoftverben és/vagy a SeptiFast Software Setben. Invalid Baseline Lehetséges, hogy az alapvonalértékeket véletlenül módosították Nyissa meg az eredeti *.ixo fájlt a LightCycler szoftverben, és ellenőrizze az alapvonal értékeket a 3. táblázat szerint. Mentse és exportálja újra a fájlt. Invalid Control Tube Egy vagy több tévesen elnevezett kontroll Nyissa meg az eredeti *.ixo fájlt a LightCycler szoftverben, és ellenőrizze a kontroll elnevezések megfelelő begépelését a mintaszerkesztőben. Módosítson az alapértelmezett nevekre, mentse és exportálja újra a fájlt. Missing Sample Tube Invalid LightCycler SW Version No Manual T M Calling Egy vagy több tévesen elnevezett mintakapilláris vagy hiányzó mintakapillárisok Nem megfelelő LightCycler szoftververziót alkalmaztak az eljáráshoz Nem volt manuális T M -hívás elvégezve (nincs minta és nincs analízis modulban). A makró befejezte analízis nélkül Nyissa meg az eredeti *.ixo fájlt a LightCycler szoftverben, és ellenőrizze a minta elnevezések megfelelő begépelését a mintaszerkesztőben. Módosítson az alapértelmezett nevekre, mentse és exportálja újra a fájlt. Nyissa meg a LightCycler szoftvert és ellenőrizze, hogy megfelelő-e a verziószám. Nyissa meg az eredeti *.ixo fájlt a LightCycler szoftverben, és végezzen manuális T M -hívást. Mentse és exportálja újra a fájlt. + additional run flags 5-nél több futtatási jelző került észlelésre Kísérelje meg az egyes ismertetett jelzők megoldását, végezze el újra a SIS analízist. Invalid CCC File Name Két vagy több színkompenzáció-fájl aktív egy vagy több analízismodulban. Válassza ki a megfelelő színkompenzáció-fájlt, és számolja újra.

12 ELJÁRÁSSAL KAPCSOLATOS KORLÁTOZÁSOK A vizsgálatot csak K-EDTA alvadásgátlóval gyűjtött humán vér használatára validálták. Más típusú minták vizsgálata téves, álnegatív vagy álpozitív eredménnyel járhat. A megbízható eredmény a megfelelő mintalevételen, -transzporton, -tároláson és -feldolgozáson múlik. A terméket csak a LightCycler SeptiFast Test MG vizsgálat munkafolyamatára speciálisan kiképzett személy használhatja. A LightCycler SeptiFast Test MG vizsgálat WBC/µl tartalmú vérmintán végezhető el. A mikroorganizmusok jelenlegi nevezéktana főleg fenotípusos osztályozáson alapul (biokémiai és fiziológiai tulajdonságok), és lehetséges, hogy nem mutat azonosságot a genetikai meghatározással. Ritka esetekben a nagy mennyiségű Streptococcus spp. target DNS-t tartalmazó minták álnegatív eredményt adhatnak. KLINIKAI ÉRTÉKELÉS Klinikai vizsgálati feltételek és módszerek Négy európai vizsgálóhelyet magába foglaló multicentrikus klinikai vizsgálat történt. A vizsgálat célja a LightCycler SeptiFast Test MG (SeptiFast Lys Kit MG, SeptiFast Prep Kit MG, LightCycler SeptiFast Kit MG) teljesítményének értékelése volt a haemokultúrával (BC) és más mikrobiológiai vizsgálati eredményekkel szemben. Az SML fajok target DNS-ének azonosítása céljából humán EDTA-s teljes vér minták kerültek levételre (SML: SeptiFast Master List, lásd 1. táblázat). Összesen 778 minta került levételre 279 olyan betegtől, akinél szisztémás bakteriális vagy gombafertőzés gyanúja merült fel, függetlenül a betegek esetleges antibiotikum kezelésétől és a szisztémás fertőzés klinikai tüneteinek jelenlététől (szepszis, súlyos szepszis és szeptikus sokk). Lehetőség szerint intenzív terápiás osztályok betegei vettek részt a vizsgálatban. Párhuzamosan rutin diagnosztikai célra haemokultúrák lettek levéve. Klinikai vizsgálati eredmények A diagnosztikus érzékenység és specificitás nem került meghatározásra, tekintettel arra, hogy nem áll rendelkezésre megfelelő referenciamódszer. Összességében 279 beteg 778 mintáját elemezték BC vagy PCR segítségével. Az SML-be nem tartozó fajt tartalmazó mintákat nem vették figyelembe. 6. táblázat: A klinikai vizsgálat során EDTA-s vérben talált fajok száma Csak BC Csak PCR Mindkét módszer Staphylococcus aureus CoNS Streptococcus pneumoniae 2 4 Streptococcus spp Enterococcus faecalis Enterococcus faecium Acinetobacter baumannii Enterobacter aerogenes / cloacae Escherichia coli Klebsiella pneumoniae / oxytoca Proteus mirabilis 1 1 Pseudomonas aeruginosa 8 3 Serratia marcescens Stenotrophomonas maltophilia Aspergillus fumigatus 28 Candida albicans Candida glabrata 2 Candida krusei 1 Candida parapsilosis Candida tropicalis Valamennyi mikroorganizmus minta volt BC-negatív, de PCR-pozitív. A beteg kórházi tartózkodása során ezeket az eredményeket tovább elemezték. Az eltérő eredmények megerősítésére egyéb mikrobiológiai eredményeket (amelyek egy második, eltérő időpontban levett haemokultúrából, testfolyadékokból, illetve szövetekből származtak, esetleg drénből, sebzésből, biopsziából stb.) vagy egy második, külön levett vérminta PCR-eredményét használták. 12