Hatékony PGP (növényi növekedést serkentő) baktériumok izolálása és fitohormon termelésük vizsgálata

Átírás

1 Budapesti Műszaki és Gazdaságtudományi Egyetem Vegyészmérnöki és Biomérnöki Kar Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudományi Tanszék Hatékony PGP (növényi növekedést serkentő) baktériumok izolálása és fitohormon termelésük vizsgálata TDK DOLGOZAT 2014 Szerző: Molnár Zsófia Klára (Biomérnök BSc hallgató) Témavezető: Dr. Tardy Gábor Márk egyetemi adjunktus BME Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudományi Tanszék 1

2 Rövidítés jegyzék: ABA: CAMAG: EPS: GIB: IAA: PCR: PGPB: Rf: TRP: VRK (TLC): abszcizinsav, növényi hormon Vékonyréteg kromatográfiás rendszerre kidolgozott gépcsalád és software család exopoliszacharid gibberellin, növényi hormon indolecetsav, növényi hormon polimeráz láncreakció plant growth promoting bacteria, növényi növekedést serkentő baktérium retardation faktor, visszatartási tényező, vékonyréteg kromatográfiában használatos jelölés triptofán, vékonyréteg kromatográfia Z: zeatin, növényi hormon ZR: zeatin-ribozid, növényi hormon 2

3 Tartalom 1. Bevezetés Irodalmi áttekintés A nitrogén-körforgása és a mikroorganizmusok jelentősége Nitrogénkötő mikroorganizmusok Önálló nitrogénkötő mikroorganizmusok Önálló nitrogénkötő mikroorganizmusok izolálása talajból Nitrogénkötők identifikálása Nitrogénkötés mechanizmusa Növényi hormonok Hormontermelés vizsgálata Baktériumtrágyák jelentősége A kutatás jelentősége és célja Piackutatás Magyarországon kapható N-kötő baktériumokat tartalmazó termékekre Témaválasztás és célkitűzés Anyagok és módszerek Felhasznált tápoldatok és táptalajok Eszközök és berendezések Alkalmazott módszerek Talajminták gyűjtése Minták dúsítása, tisztítása Biokémiai tesztek Nitrogénfixálók azonosítása hagyományos módszerekkel Kiválasztott törzsek genetikai azonosítása Nitrogénkötés hatékonyságának mérése Növényi hormontermelés vizsgálata Exopoliszacharid termelés vizsgálata Baktériumtörzsek csírázó növényekre gyakorolt hatásának vizsgálata Kísérletek és eredményeik kiértékelése Talajgyűjtemény és mikroorganizmus gyűjtemény létrehozása Az izolátumok hagyományos mikrobiológiai identifikálása Izolátumaim genetikai azonosítása Fermentáció és a termelt növényi hormonok vizsgálata Exopoliszacharid (EPS) termelés

4 5.6. Az izolátumok hatása az angolperje (Lolium perenne) növekedésére Összefoglalás Irodalomjegyzék Függelék Izolált törzsek azonosítása hagyományos mikrobiológiai módszerekkel (1. Táblázat) Genetikailag azonosított törzsek 16SrRNS szekvenciája Növényi növekedési teszt eredményei (2. Táblázat)

5 1. Bevezetés A talaj természetes életerejét nagyban az határozza meg, hogy milyen, a növények számára is hasznosítható tápanyagokat tartalmaz. A XIX. században fogalmazták meg először, hogy a talajgazdagodást elsődlegesen a talaj nitrogéntartalma okozza, de már az ókorban is felfigyeltek arra, hogy ahol korábban borsó, bab, vagy lucerna állt, ott később jobb termést arathattak. A jelenség okának magyarázatára, vagyis a nitrogénkötő és talajegyensúlyt kialakító mikroorganizmusok felfedezésére, még évtizedeket kellett várni. [1] Napjainkban az ugrásszerű népességnövekedés és a következtében fellépő nagyobb táplálékigény, földterületre jutó nagyobb termelékenységet igényel, ezzel átformálta a korábban alkalmazott önfenntartó mezőgazdaság lehetőségét. Talajaink természetes ereje kezd kimerülni a túlfeszített mezőgazdasági termelés miatt, amit nagymennyiségű műtrágyával (állattartó országokban szerves trágyával is) igyekeznek pótolni. A mesterségesen bejuttatott és kimosódó nitrogén- és foszfáttartalom a természetes vizekben eutrofizációt okoz, így környezetvédelmi és gazdasági szempontból is fontos erre a problémára hosszú távon is alkalmazható megoldást találni. Az utóbbi évtizedben egyre nagyobb szerephez jutnak az úgynevezett baktériumtrágyák, melyek a talajból izolált, természetes és hasznos mikroorganizmusok talajba történő visszajuttatásával, visszaoltásával javítják a talajéletet és talajminőséget. Az ilyen készítménnyel kezelt termőföldön több termés várható, a növények között kisebb arányú a megbetegedések száma, és a korábbi vetésből származó szármaradványok bontásával a talaj tápanyagtartalma és szerkezete is ideálisabb lesz, mind a növények, mind a talajművelést végző munkagépek számára. TDK munkám során PGPB (plant growth promoting bacteria növény növekedést serkentő baktériumok), nitrogént fixáló mikroorganizmusokat izoláltam magyarországi talajokból, melyek fitohormont és exopoliszacharidot termeltek, ezáltal serkentve a talaj egészséges mikrobiális életét és javítva a növények számára hozzáférhető tápanyagok mennyiségét, összetételét. A fitohormon termelés felelős az egészséges és gyors növényfejlődésért, a talajgazdagodást pedig a megkötött, növény számára hozzáférhető nitrogén biztosítja. A TDK munkám során hosszú távú célom volt, hogy olyan baktériumtartalmú készítményt állítsak elő, mely olcsó és alkalmas kiskertek vagy otthoni veteményesek gondozására. 5

6 2. Irodalmi áttekintés 2.1. A nitrogén-körforgása és a mikroorganizmusok jelentősége A nitrogén egyike a biogén elemeknek, így minden élő szervezetnek szüksége van rá az alapvető életfolyamataihoz. [2] A Földön a nitrogén alapvetően elemi állapotban, nitrogén gázként fordul elő. A legtöbb élőlény nem rendelkezik olyan komplex enzimrendszerrel, ami képes felbontani ezt az igen stabil szerkezetet. Mindössze néhány baktériumfaj képes erre (pl. Clostridium, Azotobacter, Rhizobium, cianobaktériumok), amivel nélkülözhetetlen szerepet vállalnak a földi Élet fenntartásában. Természetes közegben jellemzően a nitrogén mennyisége a limitáló tényező, így a nitrogénfixáló baktériumok mennyisége és produktivitása határozza meg, hogy mennyi nitrogént képesek megkötni, és ezáltal mennyi nitrogén válik elérhetővé a környező mikroorganizmusok és növények számára. [3] A talajnak a felső, szerves anyagban gazdag rétegében, vagy vizek felszínén találhatóak meg azok a mikroorganizmusok is, melyek a nitrogén természetes körforgásának fenntartásáért felelősek. A nitrogénkötők két nagyobb csoportra oszthatók: a szabadon (pl. Azotobacter és Azospirillum nemzetségek), valamint a szimbiózisban élő mikroorganizmusok (pl. Rhizobium nemzetség). [4] A folyamat igen sok energiát igényel, ezért is van szükségük szerves anyag forrásra is. Az így keletkező ammónia egy részét a növények hasznosítják közvetlenül, valamint további, mikroorganizmusok általi átalakítás során a nitrifikáló baktériumok oxidálják nitritté, majd nitráttá az ammóniát (pl. Nitrosomonas, Nitrococcus, Nitrobacter). Ez egy aerob folyamat, a baktériumok az oxidációs reakció során az oxigént használják elektronakceptornak. [3] A növények ezeket saját aminosavaikba, nukleotidjaikba, fehérjéikbe építik be, a táplálékláncon keresztül pedig az állatok ezt fogyasztják el. [4] A körforgásba kétféleképpen tud visszakerülni a szerves nitrogén. Egyrészt a növényi és állati maradványokból, rohasztó baktériumok segítségével a makromolekulák lebomlanak, és ammónia kerül a földbe. A másik út a denitrifikáló baktériumokon keresztül vezet. Ez a folyamat szigorúan anaerob körülmények között megy végbe, ekkor a nitrát-ion funkcionál elektron akceptorként, és végül nitrogén gáz kerül a légkörbe. [5] A fentiek alapján megállapítható, hogy a nitrogén körforgásában résztvevő mikroorganizmusok nélkül a földi Élet nem lenne fenntartható. 6

7 1. ábra: A nitrogén körforgása a természetben [6] 2.2. Nitrogénkötő mikroorganizmusok Bár még a mikroorganizmusok közül is csak néhány faj képes a légköri nitrogén megkötésére, ennek a csoportnak a képviselői több tulajdonságban is eltérnek egymástól. Az már tisztázott, hogy mindegyik faj azonos biokémiai folyamat során redukálja a levegő nitrogénjét, de a részfolyamatokban az egyes mikroszervezetek között különbség lehet. [4] Az is egységesen igaz mindegyik fajra, hogy a nitrogenáz enzimrendszert az oldott oxigén inhibeálja, tehát valahogy védekezni kell ettől a káros hatástól, annak ellenére, hogy a nitrogénfixálók nagy részben aerob mikróbák. [7] A védekezési mechanizmusban azonban már lehetnek különbségek. A nitrogénkötőket két nagy családra szokták osztani, a szabadon élőkre, és a szimbiózisban működőkre. [4] A szimbiózisban élő fajok közül a legismertebb a Rhizobium [4], a faj képviselői elsősorban pillangósvirágúak gyökerein élnek, többé-kevésbé fajspecifikusan. A talajban élő szabad baktérium, és a növény gyökérszövete sem képes nitrogénkötésre. A nitrogénfixálás a szimbiózis eredménye, a gazdaszervezet szénforrásokkal látja el a baktériumot, cserébe a baktérium a megkötött nitrogén jelentős részét átadja a magasabb 7

8 rendű élőlénynek. Ezek a fajok a legtöbb esetben növényspecifikusak (pl. bab, szója, lóhere). [7] A továbbiakban az önálló nitrogénkötő mikroorganizmusok ismertetésére térek ki részletesebben, ugyanis a kutatómunkám során elsősorban ilyen PGP baktériumok izolálásával és vizsgálatával foglalkoztam Önálló nitrogénkötő mikroorganizmusok Ehhez a csoporthoz tartoznak az Azotobacter és Azospirillum fajok, valamint néhány Klebsiella és Clostridium törzs is rendelkezik a szükséges nitrogenáz enzimmel. Ezek a fajok a gyökerek rizoszférájában alkotnak laza asszociációt, szénforrásuk a növény gyökere által kiválasztott exudátum. [7] Még ezen a csoporton belül is vannak különbségek az oxigén elleni védekezésben, ugyanis egyes fajok (pl. Azotobacter) képesek úgynevezett leghemoglobint termelni, ami az oxigénhez kapcsolódva nem engedi, hogy csökkentse a nitrogenáz enzim aktivitását. Más fajok (pl. Azospirillum) a növények gyökeréhez közel helyezkednek el, számukra a növények által kiválasztott metabolitok biztosítják a redukáló környezetet Azotobacter nemzetség Az Azotobacterek a Gram-negatív, aerob pálcák és kokkuszok családjába tartoznak a Bergey s Manual alapján. [8] Nagy, átlagosan 1,5-2,0 μm átmérőjű tojásdad sejtjeik pleomorfok, pálcától a kokkuszig vehetik fel alakjukat a környezeti tényezőktől és a sejt korától függően. Egyesével, kettesével, szabálytalanul összetapadva illetve változó hosszúságú láncokban is előfordulhatnak. Endospóraképzésre nem képesek, romló körülmények között azonban cisztásodásra hajlamosak. Nem mindegyik törzs rendelkezik ostorral, azonban melyek igen, azok peritrich ostorzatot növesztenek. Aerob mikroorganizmusok, de csökkentett oxigéntenzió mellett is képesek a növekedésre. Vízoldható és vízoldhatatlan pigmentek előállítása is jellemző a faj képviselőire, továbbá kemoorganotrófként cukrok, alkoholok és szerves savak bontásával jutnak energiához. Egy gramm szénforrás elégetésekor 10 mg N2 szabadon történő fixálásához elegendő energiát nyer a sejt. A nitrogén fixálás folyamáthoz kofaktorként molibdénre van szüksége, mely esetenként vanádiummal helyettesíthető. Vizekben és talajokban is fellelhető mezofil faj, hőmérsékleti optimuma 20 és 30 C között található. [9],[10] A Bergey s Manualban fellelhető Azotobacter fajok tulajdonságait az 1. Táblázat tartalmazza. Az évben 8

9 kiadott 9. Bergey szerint az Azotobacter nemzetségben 7 (azóta 8 az A. tropicalis felfedezésével) fajt tartanak számon, ezek a A. chroococcum, A. vinelandii, A. beijerinckii, A. paspali, A. armeniacus, A. nigricans és az A. salinestris. [11] Az Azotobacter genus tagjait fontos nitrogén kötőként tartjuk számon, de a nitrogén fixáláson túl jelentős a növényi hormonok és exopoliszaharidok (elsődlegesen alginát) termelésük [12], valamint sziderofór hatásukról is beszámoltak már [13]. Mikroflórában való jelenlétük, az általuk termelt elsődleges és másodlagos anyagcseretermékek a növények számára is kedvező hatással bírnak: növelik a terméshozamot, segítenek a gyökérgyarapodásban, ezáltal biztosítva a növényi tápanyagok felvételét, megvédhetik a növényeket egyes gyökér betegségektől és nem utolsó sorban részt vesznek a növényi biomassza-termelésben is. Irodalmi leírás szerint a genus tagjai a foszformobilizálás folyamatában is részt tudnak venni [14], ezzel növelve a talajban a növények számára hozzáférhető foszfort, amivel ismételten csak elősegítik az egészséges és dús növénytakaró kialakulását. Ezen tulajdonságaik miatt érthető, hogy az Azotobactereket előszeretettel alkalmazzák baktériumtrágyákba is. (ld Baktériumtrágyák jelentősége c. fejezet) 9

10 Tulajdonság A. ameniacus A. beijerinckii A. chroococcum A. nigricans A. paspali A. vinelandii Vízoldható pigment Mozgékonyság Sárgás-zöld, fluorenszcens Zöld d Barna-fekete d - - Vöröses-barna Vörös d Szénforrások hasznosulása Ramnóz Kaproát Kaprilát mezo-inozitol d d mannitol + d malonát - + d Táblázat: Azotobacter törzsek jellegzetességei a Bergey s Manual alapján [8] *Megjegyzés: +:pozitív teszt; -: negatív teszt; d:esetenként előfordulhat Azospirillum nemzetség Az Azospirillumok a mozgásra képes, aerob vagy mikroaerofil csavarodott Gramnegatív baktériumok csoportjába tartoznak, telt sejtjeik hajlott vagy egyenes 0,9-1,2 μm átmérőjű pálcák. [8] Gram-festésük negatív, esetenként variábilis, sejtjeikben intracelluláris poli-β-hidroxibutirát szemcsék találhatóak. Mozgékony sejtjeik poláris flagellumok segítségével haladnak. Burgonyaagaron egyes törzseik világos vagy sötét rózsaszín pigmentet választanak ki, növekedési hőmérsékleti optimumuk C-on található. Nitrogénfixálásra mikroaerofil körülmények között képesek, de kötött nitrogén jelenlétében (pl. ammónium-sók) atmoszférikus körülmények között is növekedést mutatnak. Oxidáz pozitív, kemoorganotróf prokarióták, bár néhány fajuk fakultatív hidrogén autotróf. Szerves 10

11 savak sóit (malát, szukcinát, piruvát, laktát) előszeretettel fogyasztják. A természetben a talajban fordulnak elő szabadon, illetve növények (pl. gabonák, füvek) gyökérzetével asszociálódva, azonban gümőképzés nem indukálnak, a Rhizobiumokkal ellentétben. Az nemzetség alá a Bergey 9. kötete alapján 6 faj tartozik: A. amazonense, A.brasilense, a. halopraeferense, A. irakenese, A. lipoferum és A. seropedices. Tulajdonságaik összehasonlítása a 2. Táblázatban látható. Tulajdonságok A. amazonense A. brasilense A. halopraeferense A. irakenese A. lipoferum A. seropedices Biotint igényel Növekedés burgonyaagaron Nitrát disszimilációja nitritté +/- + + d + + Nitrit disszimilációja N2O-dá - +/ /- +/- Komplex táptalajon képes nitrát-függő anaerob növekedésre Szénforrások N- mentes tápközegben Glükóz Szacharóz α-ketoglutarát Citrát Táblázat: Azospirillum törzsek jellegzetességei a Bergey s Manual alapján [8] *Megjegyzés: +:pozitív teszt; -: negatív teszt; d:esetenként; +/-:poz. és neg. is elfogadható 11

12 Önálló nitrogénkötő mikroorganizmusok izolálása talajból Nitrogénkötő baktériumok izolálásánál azt a képességüket használjuk ki, hogy megfelelő szénforrás jelenlétében asszimilálható nitrogénformák hiányában elemi nitrogénből is elő tudják állítani saját szaporodásukhoz szükséges aminosavakat, fehérjéket. Bár a nitrogénfixálók anyagcseretermékeit felhasználva más baktériumok is elszaporodhatnak, megfelelő szélesztés után könnyedén kaphatunk színtenyészetet. [15] Erre alapozva már több különböző technikát is kifejlesztettek nitrogénkötők izolálására. Egyrészt megfelelő összetételű szilárd táptalajra (pl. Brown médium) szélesztenek a minta szuszpenziójából, majd a fejlődő telepeket tisztítják a további célok szerint. [15] Másik módszer szerint az izolálni kívánt nitrogénfixálókat napig erre a célra kifejlesztett tápoldatban (pl. Winogradsky [15] vagy Ashby [16]) termosztálják, úgymond dúsítják a nitrogént kötni képes mikroorganizmusokat. Az inkubálási idő letelte után az előző módszerhez hasonlóan szilárd, nitrogén mentes tápközegre oltanak a szuszpenzióból, és a továbbiakban az agaron fejlődő különválasztott telepeket vizsgálják. A fenti oldatok nem tartalmaznak semmilyen nitrogénforrást, szénforrásként szacharidokat foglalnak magukba (glükóz, szacharóz, mannit), továbbá elengedhetetlen nyomelemek a vas és a molibdén, melyek a nitrogenáz enzim kofaktorai. Ezek a körülmények az Azotobacterek elszaporodásának kedveznek, így ezek a tápoldatok ideálisak izolálás szempontjából. A harmadik módszer az úgynevezett in situ dúsítás, ekkor steril vízből, valamilyen nitrogénfixálók által hasznosítható C-forrásból (pl. mannit, keményítő) és az adott talajból egy pasztát, műföldet képeznek, amelyet steril spatulával simítunk egyenletes rétegben a petricsészébe nap termosztálás után a műföld felszínén pigmentálódott telepek formájában jelennek meg az elszaporodó nitrogénfixáló mikroorganizmusok, melyeket az előző módszerekhez hasonlóan nitrogénmentes szilárd táptalajra oltunk tovább. [15] [16] Nitrogénkötők identifikálása A baktériumok pontos rendszertani besorolása, komoly feladat, mely már régóta foglalkoztatja a mikrobiológiai rendszertannal foglalkozó kutatókat, így nagy mennyiségű irodalom áll rendelkezésünkre. A hagyományos módszerek [17] szerint a baktériumokat morfológiai tulajdonságaik (pl. telepek alakja, színe, felszíne, pigmenttermelés, endospóraképzés, cisztaképzés, ostor elhelyezkedése) és anyagcserefolyamataik, enzimeik működése (pl. oxidáz, kataláz, nitrát-redukció, ureáz próba) szerint osztályozzák. Újabban 12

13 már más megközelítéseket is alkalmaznak, például antigénszerkezetet elemző szerológiai, vagy genetikai teszteket. [16] Amennyiben hagyományos biokémiai tesztekkel szándékozunk egy adott fajon belül osztályozni a baktériumokat (esetemben Azotobacter és Azospirillum), sok szempontra van szükség a pontos azonosításhoz. Thompson és Skerman [18] több száz szempont alapján rendszerezték az Azotobacteraea család tagjait, elsősorban morfológiai bélyegeket vizsgáltak, valamint biokémiai folyamatokat igen széles körben (pl. szénhidrátok, szerves savak, alkoholok, makromolekulák bontása, gázképzés, antibiotikum-rezisztancia). Pontos útmutatót is publikáltak az Azotobacter fajok identifikálásához, de ezeken felül további, szelektív, differenciáló táptalajokkal működő módszerek is léteznek (pl. szelektív tápközeg Azotobacter paspali-ra, egyéb indikátortartalmú táptalajok stb.). [19] Napjainkban a géntechnológia robbanásszerű fejlődésével már a genetikai módszerrel történő azonosítás már bevett szokás. Bár már olyan berendezések is léteznek, melyekkel egy élőlény teljes genomját néhány nap alatt fel lehet térképezni, mikroorganizmusok filogenetikai azonosítására más technikákat alkalmaznak. Leggyakrabban csak egy bizonyos szakasz, az úgynevezett filogenetikai markerek szekvenciáját hasonlítják össze más, adatbázisban található szekvenciákkal. [20] Fontos, hogy az alkalmazott filogenetikai marker minden vizsgált fajban előforduljon, funkciója konstans legyen, megfelelő mennyiségű információt szolgáltasson és legyen róla adatbázis. Általában a 16S rrns, a 23S rrns, DNS függő RNS polimeráz vagy elongációs faktorok szekvenciáját vizsgálják. A vizsgált mikroorganizmus genetikai állománya alapján adatbázisok segítségével primereket terveznek. A szekvenáláshoz előzőleg PCR (polimeráz láncreakció) segítségével fel kell szaporítani a vizsált génszakaszt. [21] Ekkor a DNS-izolátumot, a megfelelően tervezett primer párt, dezoxi-nukleotid-trifoszfátokat, puffert és a polimeráz enzimet tartalmazó elegyet PCR-készülékbe helyezzük. (tulajdonképpen egy hőmérsékletet gyorsan változtató, nagyon pontos termosztát) Először magas hőmérsékleten (95 C) megtörténik a DNS-szálak kettéválása, hűtés után (45 C-65 C) a primerpárok a megfelelő komplementer génszakaszhoz illeszkednek, majd az enzim működési optimumán (72 C körül) lezajlik a polimerizáció. [22] A fenti ciklus többszöri ismétlése után a reakcióelegyben feldúsul az általunk szekvenálni kívánt génszakasz. A szekvenálás eredményét az adatbázisban tároltakkal összehasonlítva megállapíthatjuk, hogy milyen mértékben egyeznek a baktériumok. Bár általában csak egy rövid ( bázispár hosszúságú) szakaszt 13

14 vizsgálunk ezzel a módszerrel, mivel ezek igen konzervatív gének, nagy valószínűséggel helyes következtetéseket tudunk levonni a sejt teljes génállományára vonatkozóan Nitrogénkötés mechanizmusa Habár az Élet egyik alapköve az élő szervezetekben vegyületek formájában megtalálható nitrogén, amely nélkül az enzimes reakciók elképzelhetetlenek lennének, az elemi nitrogén igen stabil szerkezettel rendelkezik, normál légköri nyomáson és hőmérsékleten gyakorlatilag inert. A reakcióba viteléhez egy speciális enzimre, a nitrogenázra van szükség, az enzim által katalizált reakció eredményként pedig egy nitrogénmolekulából két molekula ammónia keletkezik. Az enzim két fehérjekomplexből áll, a kisebb alegység kénhez kötött vasat (Fe-S-protein), a nagyobb pedig a vas mellett molibdént is tartalmaz (Fe-Mo-S-protein). [2] A szintetizálásához szükséges genetikai információt a baktériumok cirkuláris DNS-e hordozza. Az enzimen és egy erős redukáló reaktánson kívül a folyamat még nagy mennyiségű ATP-t is igényel [23]. A sejtek a felhasznált energia jelentős százalékát fektetik be a nitrogénfixálás folyamatába (pl. Azotobacterek esetén10 mg N/1 g szerves szénforrás [8]). Bár a nitrogén fixálás pontos mechanizmusa még ma sem ismert, sok részletet tisztáztak már. A folyamatban átadott elektrononként két ATP hidrolizálódik, ez nitrogén molekulánként 16 ATP-t jelent (8H + + 8e - + N2 H2 + 2 NH3). Nitrogént helyettesítő alternatív, mesterséges szubsztrátok esetén (melyek szintén hármaskötést tartalmaznak), mint például az acetilén [24], szintén elektrononként két ATP-t igényel a folyamat. [25] Korábbi kutatások már bebizonyították, hogy a nitrogenáz kisebb alegysége két azonos részből áll (egyenként Da), tartalmaz egy 4Fe-4S csoportosulást, valamint képes egy alacsonyabb potenciálú donortól elektront átvenni (sejten belül általában ferredoxin vagy flavodoxin), és emellett 2 ATP megkötésére is alkalmas. Azonban MoFe-protein nélkül nem tud ATP-t hidrolizálni. A MoFe-protein két hasonló méretű részből áll (egyenként és Da tömegűek). A frissebb kutatások már azt is bebizonyították, hogy a Fe-protein két ATP-t megkötve komplexálódik a MoFe-proteinnel, majd megtörténik az elektronátadás és az ATP-k hidrolízise, a komplex disszociációja, és ez a művelet addig ismétlődik, amíg elég elektron gyűlik össze a szubsztrát redukciójához. ATP hidrolízis csak komplexált állapotban lehetséges, és a szubsztrát csak akkor köt a MoFe-proteinhez, ha az már a Feprotein segítségével redukált állapotba került. [26] 14

15 Sok enzim expressziójával ellentétben a nitrogenáz enzim bioszintézisének génszintű szabályzásában a katalizált reakció terméke, azaz az ammónia nem játszik szerepet, a MoFe-protein de novo szintézise ammónia jelenlétében is végbemegy. Sőt, egyes mérések azt mutatták, hogy az ammónia mennyiségének növelésével nő az expresszió mértéke is, feltehetően azért, mert nő a felhasználható nitrogén mennyisége, és így több aminosav és fehérje szintézise válik lehetővé. [27] A sejtből eltávolított enzim nagyon érzékeny oxigén jelenlétére, tehát a sejteknek rendelkeznie kell valamilyen védőmechanizmussal ezzel szemben (pl. leghemoglobin termelés, vagy növényekkel kialakított szimbiózis [7]). A citoszólban jelenlévő oldott oxigén növeli a citoplazma potenciálját, ami feltehetően ellehetetleníti a nitrogenáz működését. A nitrogén fixálás csupán asszimilálható nitrogén formák hiányában esszenciális, ennek megfelelően csak olyan tenyészetek reagálnak érzékenyen az oxigén mennyiségének növelésére, melyek nem kaptak elég szervetlen nitrogént a tápoldatból, tehát nitrogénfixálásra lettek kényszerítve. [28] 2.4. Növényi hormonok Habár a nitrogénkötő baktériumok elsősorban a nitrogén fixálásával formálják környezetüket, további hasznos tulajdonságokkal is rendelkeznek, amelyek miatt kedvelik őket a mezőgazdasággal foglalkozók. Ilyen jellegzetesség például a növényi hormonok szintetizálása. Fitohormonoknak tekintjük azokat a növényi szervezetben képződő, endogén szerves vegyületeket, melyek kis mennyiségben képesek a magasabb rendű növényi szervezetekben a környezeti hatások közvetítésére, a fejlődés szabályozására. [29] Ezek a kémiai közvetítők a termelődés helyéről minden esetben másik szervbe, szövetbe szállítódnak, és ott fejtik ki hatásukat. [7] A növényi szervezetben a hormonszintézis helye, a transzlokáció útja, és a hatása sem specifikus egy adott vegyületre nézve. Ugyanaz az anyag a növény különböző szöveteiben más folyamatokat indíthat el, és több szövetben is szintetizálódhat. A szabályozás a hormonok együttes hatásának eredménye, serkentés és gátlás eredője, a specifikus reakciókért a szövetspecifikus receptorok felelősek. Az egyik fontos hormoncsoportot alkotják az auxinok (pl. indol-ecetsav, indolpropionsav, fenil-ecetsav, 2. Ábra), ide azok a vegyületek tartoznak, melyek a növény megnyúlási zónájából izolált szárdarabok megnyúlását okozzák. A növekedéssel együtt nő 15

16 a légzés intenzitása, felgyorsul a nukleinsav- és fehérjeszintézis, nagyobb lesz a membránpotenciál. Az auxinoknak emellett a sejtosztódás szabályozásában is szerepük van. A növények auxintartalma a magfejlődés kezdeti szakaszában a legnagyobb. [7] 2. Ábra: Auxinok a) indol-ecetsav (IAA) b) 4-kloro-indol-ecetsav c) indol-butánsav 1 Auxinok szintetizálására több mikroorganizmus is képes, például növényi patogének, mint az Agrobacterium spp. vagy a Pseudomonas savastanoi pv. savastanoi, melyek tumorokat képeznek a növények szöveteiben. [30] Azonban PGP baktériumok (pl. Azospirillum) is nagy mennyiségben termelik ezeket a vegyületeket, ezzel elősegítve a növények fejlődését. Habár az indolecetsavat elsősorban növényi hormonként tartják számon, friss kutatások szerint mikroorgaizmusok fejlődésében is regulátor szerepet tölthet be. [30]Az auxinszintézis prekurzora a triptofán, ezt nélkülőző tápoldatban a baktériumok szaporodása is lassabban megy végbe, azonban már 1 μg/ml-es koncentráció is elegendő ahhoz, hogy a sejtek szaporodás felgyorsuljon, és meginduljon az indolecetsavtermelés. [31] A gibberellinek szintén fontos szerepet játszanak a növényi szervezet szabályozásában. Valamennyi gibberellin a négy gyűrűből álló gibbánvázból áll, és a vázon található különböző módosulások alapján csoportosíthatjuk őket tovább. [7] Ezek a vegyületek a növényekben kötött formában is előfordulhatnak, ekkor egy glükóz molekula kapcsolódik a gibbánváz 7. szénatomján található karboxil-csoporthoz észterkötéssel, vagy valamelyik hidroxil-csoporthoz glükozid-kötéssel (3. Ábra). Az ilyen kötött gibberellinek inaktívnak tekinthetők, és a glükozidok fiziológiai aktivitása is kisebb a szabad gibberellinekénél. 1 A képletek megrajzolásához a ChemDraw programot használtam. 16

17 3. Ábra: a) Gibberellin-1-sav b) Kötött gibberellin A magvak érése során a szabad gibberellinek kötötté alakulnak át a raktározószövetekben, csírázáskor pedig az ellentétes folyamat megy végbe, ezzel ellátva a csírázó növényt gibberellinnel. Szintézisük első szakasza megegyezik az egyéb terpenoid vegyületekével (pl. szteroidok), a gyűrűzáródások után faj- és környezetspecifikus átalakítások következnek, majd létrejönnek az adott körülmények által igényelt gibberellinek. [7] Sokféle hatást válthatnak ki, merisztémákban sejtosztódást, már nem osztódó, de még nem is differenciálódott sejtekben sejtnagyobbodást indukálnak, idősebb, differenciálódott szövetekre nincsen hatásuk. [31] A megnyúlásos növekedésben feltehetően az auxinnal kiváltott közös hatásuk érvényesül. [32] A gibberellinek másik, nem helyettesíthető hatása, hogy indukálja a gabonafélék szemtermésének aleuronrétegében a hidrolitikus enzimek de novo szintézisét, ezzel elősegítve a raktározott makromolekulák hidrolízisét, a csírázó mag számára nélkülözhetetlen, vízben oldható szerves molekulák képződését. Citokininnek tekintjük azokat a vegyületeket, melyek optimális auxinkoncentráció esetén sejtosztódást indukálnak, a ma ismert citokininek valamennyien N 6 -szubsztituált adeninszármazékok. [7] Szubsztituenseik alapján két csoportra oszthatóak, ez lehet izoprenoid-lánc, illetve hidroxi-benzil-gyök (4. Ábra). 17

18 4. Ábra: Citokininek a) zeatin b) zeatin-ribozid c) zeatin-nukleotid A növényekben a citokininek nukleozidjai és nukleotidjai is előfordulnak, természetes citokininek például a zeatin és az izopentenil-adenozin, bioszintézisük a merisztémákban történik, azon belül is elsősorban a gyökérszövet látja el a hajtást citokininnel, bár a többi szervben is mutattak ki termelést. Ezzel szemben egyesek szerint a növények citokinintartalmának jelentős részét a PGP baktériumok biztosítják. [33] A citokininek pontos hatásmechanizmusa még nem ismert, többféle módon befolyásolják a növények fejlődését [34]: stimulálják a sejtosztódást (auxin jelenlétében), serkentik a fehérje- és nukleinsavszintézist, befolyásolják a gének expresszióját (egyeseket represszálnak, másokat fokoznak) és szerepük van a szervek fiatal állapotának fenntartásában, öregedési folyamatok gátlásában. A korábbi hormonvegyületekkel ellentétben az abszcizinsav nem serkentő, hanem gátló hatásokkal bír, ez a legjelentősebb és legtöbb növényi szervben előforduló természetes inhibitor, endogén hormon-antagonista (5. Ábra). [29] A növekedés gátlásán túl szabályozza a lombhullást, a rügyek és magvak nyugalmi állapotát, a gyümölcsérést, és a sztómák hidroaktív csukódását. [7] 5. Ábra: Abszcizinsav [35] Plasztiszokban szintetizálódik, a többi izoprenoid vegyülethez hasonlóan. Hatásmechanizmusa még nem tisztázott, de feltehetően a membránokhoz kapcsolt folyamatokon keresztül szabályoz, például ioncsatornák megnyitásával. Az abszcizinsav 18

19 fontos szerepet játszik az áttelelő endogén növényi szervek nyugalmának kialakításában. Megfigyelték, hogy a rövidülő őszi nappalok, vagy a romló körülmények (pl. vízhiány, csökkenő hőmérséklet, túlzott sótartalom) hatására több abszcizinsav termelődik, és ez mérsékli a növény növekedését. [36] Feltehetően a téli fagyokkal szembeni védelemben is szerepe van, ezért fordulhat elő az, hogy a vegyület fogyásával, tél végén, tavasz elején következnek be fagykárok. A fentiek alapján belátható, hogy a fitohormonok egy összetett bioregulációs rendszer útján fejtik ki hatásukat. Bár ismereteink a szignalizációról és a hatásmechanizmusokról a mai napig hiányosak, megfelelően kiválasztott PGP baktériumokkal be tudunk avatkozni ezekbe a folyamatokba, hogy a mezőgazdaságban, vagy akár otthon termelt növényeink egészségesebbek, életerősebbek és termelékenyebbek legyenek Hormontermelés vizsgálata A növényi hormonok igen összetett vegyületek, mennyiségi és minőségi meghatározásukhoz az utóbbi időkben különböző módszereket dolgoztak ki, melyeknek részletei nagy részben függnek attól, hogy a növények szöveteiben képződött anyagokat kívánják mérni, vagy a PGP baktériumok által fermentlébe kiválasztott fitohormonokat. Az analitikai vizsgálatok előtt mind két esetben körültekintően kell megtisztítani a mintát, hiszen növényi szövetek és PGP baktériumok esetén is számos szerves molekula zavarhatja a meghatározást. [29] A kinyerés módja is különbözik a két esetben amennyiben a növény által termelt hormon mennyiségét kívánjuk mérni, sokkal kisebb mennyiségekkel dolgozunk, melyek ráadásul érzékenyek is a külső hatásokra, így ilyen esetekben a növény frissen eltávolított levelét (vagy egyéb részét) folyékony nitrogénben fagyasztják le, és később abból extrahálják a hormonokat. [36] [29] PGP baktériumok esetében növényi hormonok fermentációját végzik rázatott lombikban, majd a fermentlé centrifugálásával és a felülúszó extrahálásával nyerik ki a kívánt vegyületeket. [31] [32] Nagy teljesítményű folyadékkromatográfiával (HPLC) pontos mennyiségi és minőségi meghatározást lehet végezni egyszerre, azonban ez megfelelő kolonnát és berendezést igényel, ami igen nagy költségeket jelent. A futtatás előtt a mintákon elválasztó és tisztító műveletek sorozatát kell végrehajtani (folyadék-folyadék extrakció [37], szilárd fázisú extrakció [38], illetve immunaffinitás kromatográfia [39]), ellenkező esetben a túl sok szennyeződés nehezíti a pontos detektálást. [29] Különböző vitaminok (niacin, biotin, 19

20 tiamin, riboflavin) elválasztására már 1991-ben is dolgoztak ki módszert. [40] Bár ekkor még hormonokat nem mértek, a vitaminok igen hasonló felépítésű vegyületek, tulajdonságaikban sok hasonlóság van. A módszer további fejlesztéssel már hormonokra is alkalmazhatóvá vált. [14] A detektálás UV-VIS spektrofotométerrel történik, 260 nm-en abszcizinsavat, és 280 nm-en indolecetsavat. [29] Az immunoassay egy szintén nagyon pontos módszer, kimutatási határa (0,01-10 pm/50 μl) igen alacsony. [33] [39] Ez a specifikus antigén-antitest kölcsönhatásoknak köszönhető, azonban ezért a mérés kivitelezéséhez szükséges anyagok előállítása miatt szintén költséges. Szabad indolecetsav, abszcizinsav és citokinin mérésére nyulakkal előállított antitestet használtak. [41] Mindazonáltal az immunometriás mérés előtt különösen ügyelni kell a minta megfelelő tisztítására, ugyanis a szennyeződések könnyen okozhatnak keresztreakciót a kevésbé specifikus antigénekkel, ezzel meghamisítva az eredményt. [29] A hormonok kvantitatív meghatározásának egy egyszerű és közkedvelt módja az indolecetsav Salkowski-reagenssel történő fotometriás mérése. A mintához Salkowskireagenst (2% 0,5 M FeCl3, 98% 35% HClO4) kell adni, majd 30 perc szobahőmérsékleten történő inkubálás után 530 nm-en mérik az abszorbanciát. A mérés kiértékeléséhez indolecetsavból készített standard kalibráló sorozat is szükséges. [42] A fenti módszerekkel ellentétben kevésbé elterjedt, de olcsón és hatékonyan alkalmazható eljárás a vékonyréteg-kromatográfia (VRK), mely akár pontos mennyiségi meghatározásra is alkalmas. A mintaelőkészítés és mérés kivitelezés egyszerűsége, kisebb működési költségei miatt, kiválthatja vagy megelőzheti a HPLC- vagy az immunospecifikus méréseket. [34] Megfelelő futtatóelegyet és előhívási körülményeket használva legalább olyan informatív lehet, mint egy HPLC-s mérés. Akár citokininek egymástól történő elválasztása és azonosítása is végrehajtható vele, annak ellenére, hogy igencsak hasonló vegyületekről van szó (zeatin-nukleotid, zeatin-glükozid, zeatin, zeatin-ribozid, izopenteniladenozin). [33] Mivel a növényi hormonok általi szabályozás egy igen összetett rendszer alapján történik, a hatásuk megismeréséhez a pontos analitikai módszerek használatán felül növekedési tesztek végrehajtása is sok segítséget nyújthat. Ekkor általában a földet és a vizsgálandó növényfaj magjait is sterilizálják, hogy az idegen mikroorganizmusok hatását kizárják, majd a vizsgálni kívánt PGP baktérium inokulumjával beoltják a talajt. A növényfajt a kutatás céljának megfelelően választják ki (pl. Nigella sativa [14], Triticum 20

21 durum [33], paradicsom, repce és napraforgó [43]), és a kísérlet időtartamát is ehhez igazítják (napok, hetek, hónapok). Kiértékelésnél a növény különböző tulajdonságait viszonyítják a kezeletlen kontroll értékeihez. A vizsgált jellemző lehet a levelek klorofilltartalma [33], a gyökerek hossza és szerkezete (elágazások és gyökérszőrök mennyiségének összevetése) [31], a kifejlődött növény szárának, leveleinek vagy virágzatának mérete [43], a termés minősége, hatóanyagtartalma [14], vagy akár a levelek által kiválasztott viasz összetevői [36] Baktériumtrágyák jelentősége Amióta az emberiség rájött, hogy a termés mennyiségét befolyásolja a talaj tápértéke, azon belül is leginkább a nitrogén- és foszfortartalma, a földműveléssel foglalkozók igyekeznek ezt állandó szinten tartani, de legalábbis megfelelően pótolni minden aratás után, hogy folyamatosan biztosítani lehessen a termelékenységet. Eleinte, nagyobb állatállománnyal rendelkező területeken csak szerves trágyával igyekeztek ezt elérni (komposzt, állati ürülék), azonban a kemikáliák fejlődésével a műtrágyák kaptak teret. [44] Ma már műtrágyákra feltétlenül szükség van ahhoz, hogy a népességet el tudjuk látni elegendő élelemmel, azonban használatuk során előnyös tulajdonságaik mellett tudnunk kell, hogy használatuknak több hátulütője is van. Elsősorban környezetvédelmi szempontok miatt kell átgondolni, hogy mennyi műtrágyát használunk és milyen formában. Az esővíz által a patakokba, majd később tavakba mosódik a szervetlen nitrogén és foszfor, melyek kedveznek a vízi mikrobák, többek között az algák elszaporodásának, ami eutrofizációhoz vezet. [45] Emellett szembesülnünk kell hosszú távú problémákkal is, mint például a földből bányászható foszfor mennyisége véges, és jelenleg nem tudjuk máshonnan pótolni a műtrágyában termőföldbe, majd onnan tavakba, tengerekbe kerülő foszfort. Napjainkban egyre több problémára keresünk megoldást a biotechnológia területén. A baktériumtrágyák segítik visszaállítani a talaj természetes életerejét, és az életerős növények kifejlődését különböző módokon támogatják. A legtöbb baktériumtrágyában találkozhatunk nitrogénfixálókkal (Azotobacter, Azospirillum, Rhizobium), mivel a talaj nitrogéntartalma határozza meg elsősorban, hogy a növény milyen mértékben képes növekedni, továbbá a többi mikroba számára is ők állítják elő a felhasználható, oldható formában lévő nitrogént. 21

22 A legtöbb készítmény a különböző mezőgazdasági igényekhez igazodva tartalmazza a célnak leginkább megfelelő fajokat. A foszformobilizálás céljából általában Bacillus megaterium-ot alkalmaznak, ami emellett a cellulózbontók élénkülését is segíti. Cellulózbontókat olyan földeken szükséges alkalmazni leginkább, ahol a szármaradványok nehezítik a vetést, betakarítást, valamint a megfelelő talajszerkezet kialakítását is hátráltatják (pl. kukoricaföldek). Továbbá még rengeteg előnyös hatással rendelkező baktériumot találhatunk a különböző termékekben: növényi hormontermelés, patogének elleni védekezés, talajszerkezet lazítása, stb. [46] A baktériumtrágyák különösen jótékony hatás fejtenek ki, hiszen a talajt természetes módon gazdagítják. Ennek ellenére még nem válthatják ki teljes mértékben a nagyüzemi műtrágyahasználatot, de használatukkal jelentős mértékben lehet csökkenteni a műtrágyaszükségletet. [47] 22

23 3. A kutatás jelentősége és célja 3.1. Piackutatás Magyarországon kapható N-kötő baktériumokat tartalmazó termékekre Ahogy egyre inkább teret kapott hazánkban is a baktériumtrágyák használata, egyre több, különböző igényeket kiszolgáló készítményt szabadalmaztattak. Néhány, hazánkban előállított és forgalmazott készítmény mikrobiológiai összetevőit tartalmazza a 3. Táblázat. Termék Nitrogénkötő baktérium Egyéb mikroorganizmusok Azorhiz [48] Azotobacter chroococcum, Azospirillum brasilense, Bacillus megaterium fajspecifikus Rhizobium Azoter F [48] Azotobacter chroococcum, Azospirillum brasilense Bacillus megaterium Azoter SC [48] Azotobacter chroococcum, Azospirillum brasilense Bacillus megaterium BactoFil A10 [49] Biofil Lúgos [50] Biofil Normál [50] Biofil Savas [50] Azospirillum brasilense, Azotobacter vinelandii Azospirillum brasilense, Azospirillum largimobile Azospirillum brasilense, Azospirillum largimobile Azospirillum brasilense, Azospirillium largimobile, Azospirillum irakense Biorex-1 [51] - Biorex-2 [51] Phylazonit [52] Azotobacter chroococcum, Azospirillum lipoferum Azotobacter chroococcum Bacillus megaterium, Bacillus polymyxa, Pseudomonas fluorescens, Streptomyces albus Pseudomonas jessenii, Arthrobacter crystallopoietes, Kocuria rosea Pseudomonas jessenii, Arthrobacter crystallopoietes, Kocuria rosea Pseudomonas jessenii, Arthrobacter crystallopoietes, Pseudomonas chlororaphis, Exiguobacterium acetylicum Bacillus subtilis, B. thüringiensis, B. megaterium Pseudomonas putida Bacillus megaterium, Pseudomonas putida 3. táblázat: Hazai baktériumtrágyák mikrobiológiai összetevői Mint az a táblázatból is látható, a legtöbb forgalmazott készítmény nitrogénfixálókon kívül más fajokat is tartalmaz, hiszen a mezőgazdasági igények 23

24 kielégítéséhez nem elegendő a talaj nitrogéntartalmát növelni, további pozitív hatásokkal is kell rendelkeznie a baktériumtrágyának (pl. foszformobilizálás, hormontermelés, növényi patogének visszaszorítása). Ez természetesen a termék árát jelentősen növeli, de a mezőgazdaságban erre van szükség, hogy a folyamatosan növekedő népesség élelmiszerigényét kielégítsék, és versenyképes minőségű termést kapjanak. Véleményem szerint a természetes talajélet fellendülését és egyensúlyának visszaállását szolgálja kiskerti veteményesünkben már az is, ha a nitrogénkötők visszajuttatásával pozitív hatásokat érünk el. Az ökológiai, biológiai körfolyamatok kihatással vannak egymásra: a természetesen jelenlevő- komposztálóban dúsuló cellulózbontók, kálium, foszfor immobilizálók a komposzt visszajuttatásával és nitrogénkötő mikroorganizmusok jelenlétével egészségesebb talajélet-egyensúlyt és termékenyebb, egészségesebb növényeket eredményeznek. Mivel a többi baktériumnak is a talaj nitrogéntartalma határozza meg a szaporodás mértékét, kis léptékben elegendő, ha a nitrogénfixálók mennyiségét növeljük, ennek következményeként a többi baktérium szaporodása is fel fog gyorsulni, és érvényesülni fog a pozitív hatásuk a növénytermesztés szempontjából. A nitrogénfixálók is rendelkeznek a további pozitív hatásokkal, például növényi hormonok termelésével és kisebb mértékű foszfor mobilizással is hozzájárulnak a talaj tápértékének növeléséhez. Hazánkban jelenleg legjobb tudomásom szerint nincsen olyan termék forgalomban, ami csak nitrogénkötőket tartalmaz. Indiában lehet olyan készítményeket kapni (pl. Synbion N néven [53]), melyek csak nitrogénkötő baktériumfajokat tartalmaznak [54] [55], azonban ez a hazai piac számára nem elérhető. Véleményem szerint a hazai piacon is létjogosultsága lenne egy olyan, árban versenyképes terméknek, mely különböző működésű nitrogénfixálókat tartalmazna Témaválasztás és célkitűzés TDK munkám megkezdése előtt piackutatást végeztem a Magyarországon forgalomban levő bakteriális talajjavító készítményekről. Úgy találtam, hogy néhány kivételtől eltekintve ezek a készítmények elsősorban a nagygazdaságok számára, több hektáros területeken, elsősorban agráriumi felhasználásra lettek optimalizálva, így a kiskerti, háztáji felhasználás számára drága készítmények, vagyis ezen piaci szegmensben nem versenyképesek. Például az Azoter által forgalmazott baktériumtrágyának litere

25 Ft+ÁFA, egy hektárra 10 l készítmény kipermetezését írják elő (felhígítva), és csak 25 és 50 literes kannákban forgalmazzák [48]. Elképzelésem szerint kevesebb mikroorganizmust tartalmazó, kisebb kiszerelésű, ennek megfelelően olcsóbb baktériumkészítménnyel ez a piaci rés is betölthető lenne. A jelenleg kapható készítmények többnyire komplex baktériumkészítmények (3-10 db baktérium/készítmény), melyek általában egy nitrogénkötő törzset tartalmaznak, valamint számos olyat, melyek más feladatokért: pl.: a cellulózbontásért, foszfátmobilizálásért, és a talajszerkezet kialakításáért felelősek. Otthoni, kiskerti környezetben ezen funkciók egy része veszít fontosságából, hiszen a komposzt visszajuttatásával, a veteményes vetésforgójával, elővetemény alkalmazásával mind a talajszerkezet javítását, mind a cellulóztartalom elbontását megoldjuk. TDK munkám célkitűzése, hogy PGPB (plant growth promoting bacteria = növényi növekedést serkentő baktériumok) nitrogént fixáló mikroorganizmusokat izoláljak magyarországi talajokból, melyek fitohormont és exopoliszacharidot termeltek, ezáltal serkentve a talaj egészséges mikrobiális életét és javítva a növények számára hozzáférhető tápanyagok mennyiségét, összetételét. Alapgondolatnak a XIX. század elején megfogalmazott és azóta is helytállónak tekintett kijelentést vettem: A talajgazdagodás a nitrogéntartalom megnövekedésének eredménye. [1] Ezek alapján úgy gondolom, hogy kevesebb törzset, de hatékonyabb nitrogénkötést biztosító készítmény kiskerti körülmények között jól működhetne, valamint olcsóbb előállítása miatt versenyképessé is válhatna a jelenleg elérhető készítményekhez képest. Ezen természetes készítmény további előnyének érzem, hogy műtrágyázást kiválthatja, így akár biokertekben is felhasználható, ezáltal is kímélve közvetlen környezetünket, egészségesebb világban élhessünk. Hosszú távú célom, hogy háztáji és kiskerti veteményesekben, díszkertekben felhasználható baktériumkészítményt hozzak létre, mely gazdaságos, környezetbarát lehetőséget jelenthet a magyarországi bio-, öko- és hobbikertészek számára. 25

26 4. Anyagok és módszerek 4.1. Felhasznált tápoldatok és táptalajok A kutatásom során többnyire szakirodalomból ismert eljárásokat és táptalajokat használtam, de a törzsek identifikálása során saját fejlesztésű tápagarokkal is dolgoztam. Az általam alkalmazott tápközegek az irodalomból jól ismertek Ashby: Azotobacter szelektív táptalaj [16]; AcACO3: Azotobacter chroccocum izoláló tápagar [18]; Asp: Azospirillum izoláló tápleves [56]; Ap: Azotobacter paspali differenciáló tápközeg [19], RC: Azospirillum szelektív tápagar [56]. A szakirodalomban [19] olvashatjuk, hogy a mikroorganizmusok fajtól függő mértékben képesek akkumulálni bizonyos indikátoranyagokat, ezáltal a tápagar felületén megjelenő pigmentek eltérő színűek, illetve az akkumuláció mértékétől függően eltérő nagyságú feltisztulási zónákat hozhatnak létre. Ezen elgondolás alapján továbbgondoltam az irodalmi tápagarokat és saját fejlesztésű Ashby + indikátor (Ashby táptalaj +0,03g/l neutrálvörös; 0,001g/l kristályviola) AcACO3+ indikátor (táptalaj +0,03g/l neutrálvörös; 0,001g/l kristályviola) táptalajokat is alkalmaztam differenciáló táptalajként. A táptalaj színének változásából azt is megállapíthatjuk, hogy a mikroorganizmus milyen mértékben savanyítja el a környezetét, ez újabb információval bír a fajbesorolás során. Az Ashby és AcACO3 tápközegeket szilárd táptalaj formában használtam az izolálási szakasz folyamán, egyrészt szelektálási módszerként, ugyanis nitrogénmentes összetételüknek köszönhetően csak a nitrogénkötésre képes törzsek tudtak elszaporodni rajtuk. Másrészről differenciáló közegként is remekül alkalmazhatóak, ugyanis a különböző Azotobacter törzsek jellegzetes, könnyen felismerhető pigmentált, illetve nyálkás telepeket képeznek rajta. Azotobacterek törzsfenntartása során is ezt a két médiumot használtam, ugyanis a szelektivitásának köszönhetően a tenyészetek befertőződését is könnyebb megelőzni. A szintén nitrogénmentes Asp és RC tápközegeket a fentiekhez hasonlóképpen alkalmaztam Azospirillumok izolálására, melyek szintén jellegzetes, letapadó telepeket képeztek a szilárd RC táptalajon, valamint akkumulálták belőle a kongóvörös indikátort is. Az Asp oldatban a mikroorganizmusok dúsítása történt. 26

27 A2 tápoldatban végeztem a növényi hormon fermentációt, a korábbiakhoz hasonlóan ez is nitrogénmentes, fermentációs tápoldat. A fenti tápközegek összetétele igen eltérő, azonban az mindegyikre vonatkozik, hogy vasat és molibdént tartalmaz nyomelem mennyiségben, ugyanis ezek nélkülözhetetlenek a nitrogenáz enzim megfelelő működéséhez Eszközök és berendezések A tápoldatokat és a steril eszközöket autoklávban sterileztem 121 C-on. Tápoldatok esetén 15 perc, eszközök esetén 30 perc volt a sterilizáció hőntartási ideje 1 atm túlnyomáson. A beoltott oldatokat és petricsészéket termosztátban inkubáltam szobahőmérsékleten amíg az izolálási szakasz tartott, a tiszta tenyészeteket 28 C-on inkubáltam termosztátban. Amennyiben rázatott lombikos fermentációt végeztem, a rázatást rázógépen végeztem, szintén 28 C-on termosztált rázószobában Alkalmazott módszerek Talajminták gyűjtése Magyarországi területekről gyűjtöttem össze talajmintáimat 2014 májusában, ekkor az időjárási körülmények miatt igen aktív mikrobiális életre számíthattam a talajban. Minden esetben olyan területeket választottam ki, ahol a növényzet, a fű jó minőségű élénk, üde zöld és egészséges volt. Egy helyről 3-4 grammnyi földet gyűjtöttem össze vízzel, majd alkohollal fertőtlenített fém kanállal, 1-2 centiméterrel a földfelszín alatti rétegből. A sorszámozott és kategorizált mintákat hűtőben tárolom légmentesen zárható műanyag zacskókban Minták dúsítása, tisztítása Az összegyűjtött talajmintákból elsősorban két nitrogénkötő nemzetség, az Azotobacterek és az Azospirillumok tagjait izoláltam. Mindkét esetben olyan tápoldatot használtam dúsítás céljára, ami nélkülözte a szervetlen nitrogént, így csak azok a mikroorganizmusok szaporodtak el, melyek képesek a légköri nitrogén fixálására. Az Azotobacter fajok izolálására kétféle módszert is alkalmaztam, egyrészt Ashby módszerét [16] használtam, mely során steril Ashby-tápoldat 20 ml-es adagjaiba tettem a 27

28 talajminták 1-1 grammját. Mivel ezek a baktériumok aerob élőlények, a folyadékfelszín közelében fognak elszaporodni, és hártyát képezni. 10 nap szobahőmérsékleten való termosztálás után ebből a hártyából vettem le steril, leégetett kaccsal, és szilárd nitrogénmentes Ashby tápagarra szélesztettem. 5-7 nap múlva különálló, pigmentálódó telepek jelentek meg, melyeket külön-külön tovább szélesztettem Ashby ill. AcACO3 tápagarokra és 28 C-on termosztáltam 1 hétig. A szelektív és differenciáló tulajdonságú tápagarok segítettek abban, hogy minél nagyobb számban csak Azotobactereket sikerüljön befognom. Az Aquilanti és munkatársai által kidolgozott másik módszerben [15] a talajminták 2-2 grammját kőliszttel, keményítővel, mannittal és steril vízzel kevertem össze petricsészékben. A keletkező masszákat 2-3 hétig termosztáltam, ez idő alatt a felszínen elkülöníthető telepeket képeztek a nitrogénkötésre képes mikrobák. Ez is továbboltásra került szilárd Ashby tápagarra, majd a fent említett módon tovább tisztítottam, míg tiszta, homogén izolátumokat nem kaptam. Az Azospirillumokat Asp tápoldatot tartalmazó kémcsövekből izoláltam. [56] A kémcsövekbe szintén 1-1 gramm talajmintát tettem, és egy hét 37 C-os termosztálás után a képződő hártyából vettem le steril kaccsal, és RC táptalajra oltottam tovább. 5-7 naponként a különálló telepeket továbboltottam RC tápagarra, míg homogén izolátumokat nem sikerült kapnom Biokémiai tesztek Az izolátumokat a további vizsgálatok előtt oxidáz és kataláz próbával vizsgáltam, valamint Japán-tesztet is végeztem rajtuk. Mivel az Azotobacterok Gram-negatívok (illetve esetenként variábilisak), és legtöbb esetben oxidáz és kataláz pozitívak, azokat az izolátumokat kizártuk, melyek nem adták egyértelműen ezt az eredményt. A Gram-teszt egy alapvető differenciáló festési eljárás, ahol a baktériumok sejtfalszerkezetéről nyerünk információt. Trifenil-metán típusú színezékkel festett preparátumot jód oldattal kezelik, majd a képződött jódpararozanilin komplexet alkoholos mosással kísérlik meg kivonni a sejtekből. A Gram-negatív sejtek elszíntelenednek, a Gram-pozitív sejtek színesek maradnak, kontrasztfestéssel (pl. szafranin) egyértelműsíthető az eredmény (6. Ábra). [17] 28

29 6. Ábra: Gram-negatív (rózsaszínes-vörös) és pozitív baktériumok (ibolyakék)[57] A String-teszt szintén a baktériumok Gram-rendszer szerinti besorolását végzi el, de ez a módszer jelentősen rövidebb a többlépéses festési eljárással szemben. Egy tárgylemezre felvitt telepre 3%-os KOH oldatot cseppentünk, majd egy steril fogpiszkáló segítségével megpróbálunk szálat húzni belőle. Amennyiben ez egyértelműen sikerült a baktériumot Gram-negatívnak tekintettük (7. Ábra). A jelenség azzal magyarázható, hogy a KOH oldat a Gram-negatív baktériumok sejtfalát lebontja, ellentétben a Grampozitívakéval. A megbontott sejtfal komponensei képes újraasszociálódásra, így tapasztalhatunk szálképződést. Ez a módszer gyors tesztnek tekinthető, de nem minden esetben helyettesíti a Gram festést. [58] 7. Ábra: String-teszt [59] A kataláz-próba hátterében az aerob ill. fakultatív anaerobok baktériumokban végbemenő terminális oxidáció mechanizmusa áll. A folyamat során ugyanis hidrogénperoxid keletkezik, mely egy sejtméreg, így ezek a baktériumok kataláz enzimet termelnek a semlegesítésére. A teszt során tárgylemezre felvitt tenyészetre csöppentünk 3%-os hidrogén-peroxid oldatot, amennyiben pezsgést tapasztalunk, a tenyészet kataláz pozitív. [17] 29

30 8. Ábra: Negatív és pozitív kataláz-próba [60] Az oxidáz-próba alatt az oxidatív anyagcserét folytató baktériumok terminális oxidációjában szerepet játszó citokróm-oxidáz enzim kimutatását értjük. A kimutatás során a tiszta tenyészetből egy telepet szűrőpapírcsíkra viszünk fel, majd 1%-os színtelen tetrafenilén-diamin-oldatot cseppentünk rá. Amennyiben a mikroba termel oxidáz-enzimet, a szűrőpapíron sötétkék elszíneződést tapasztalhatunk. [17] 9. Ábra: Pozitív ill. negatív oxidáz-próba [61] Nitrogénfixálók azonosítása hagyományos módszerekkel A pontos beazonosítás érdekében a 4.1. fejezetben leírt különböző szilárd, differenciáló táptalajon vizsgáltam az izolátumokat. Ezen differenciáló tápközegek az irodalomból jól ismertek. Ashby: Azotobacter szelektív táptalaj [16]; AcACO3: Azotobacter chroccocum izoláló tápagar [18]; Ap: Azotobacter paspali differenciáló tápközeg [19], valamint saját fejlesztésként Ashby és AcACO3 táptalaj indikátorral kiegészítve (+0,03g/l neutrálvörös; 0,001g/l kristályviola). A szilárd táptalajokon megfigyelhető pigment termelés (vízoldható, vízoldhatatlan, UV fény alatti fluoreszcencia), színanyag akkumuláció, környezetsavanyítás és egyéb 30

31 metabolizmusra vonatkozó jellemzők összesítésével és elemzésével, valamint a telepmorfológiai tulajdonságokkal történő összevetéssel lehetővé válik az izolátumok identifikálása. Minden tápagar felületén megjelent tenyészetet mikroszkóppal is megvizsgáltunk Kiválasztott törzsek genetikai azonosítása Habár a hagyományos mikrobiológiai tesztek megbízható eredményt adnak, bizonyos izolátumok esetén elvégeztük a 16S rrns gén szekvenálását is genetikai azonosítás céljából. Ehhez az izolátumokból kacsnyi mennyiséggel 10 ml A2 tápoldat tartalmazó kémcsővet oltottunk, majd óráig 28 C-on termosztáltunk. A fermentlé, 1 ml-ét Eppendorf-centrifugacsövekbe pipettáztuk, majd lecentrifugáltunk (14000 rpm-en, 1 perc, 4 C). A felülúszót leöntöttük és az összegyűjtött sejtmasszát felhasználásig mélyhűtőben tároltuk. A genomiális DNS izolálás során a sejtmasszát először 2 alkalommal 1,5 ml steril vízzel (Milli-Q) mostam át, rpm-en centrifugáltam 2 percig. A felülúszó leöntése után a sejtpellethez 300 mg üveggyöngyöt, 200 μl lízis puffert illetve 200 μl fenol-kloroform elegyet (24:1 arány) adtam. Egy perc vortexelés után 200 μl TE puffert adtam a mintákhoz. Ezt követően rpm-en centrifugáltam a mintákat 10 percig. A felülúszókat tiszta Eppendorf-csövekbe pipettáztam át, majd 1,0 ml 96%-os jéghideg etanolt adtam hozzájuk. Újbóli centrifugálás után a DNS-csapadékról leöntöttem a felülúszót, majd a DNS-t 400 μl TE pufferben oldottam fel, és 3 μl RNázt adtam hozzá. 5 percen keresztül 37 C-on inkubáltam a mintákat, majd a DNS kicsapás érdekében 40 μl 3 M Na-acetátot (ph=5,2) és 1,0 ml 96%-os etanolt adtam hozzájuk. Ezt 10 perces rpm-en történő centrifugálás követte. A felülúszó eltávolítása után a csövek alján maradó DNS-t légszáraz állapotig szárítottam, majd 50 μl TE pufferben oldottam vissza, használatig -20 C-on tároltam. A DNS izolálás eredményességét agaróz gélelektroforézis végrehajtásával ellenőriztem. A futtatáshoz 1%-os agaróz gélt használtam, a zsebekbe 6-6 μl DNS markerrel ellátott minta került (1 μl marker, 5 μl minta), valamint a gél szélén futtattam 6 μl DNS Laddert is. A futtatást 100 V-on végeztem 60 percen keresztül, majd az etídium-bromidos előhívás után 260 nm-es UV fény alatt vizsgáltam a kapott gélképet. A kinyert DNS 16S rrns szakaszait kívántam összevetni már korábban meghatározott szekvenciákkal, ehhez univerzális primerpárok felhasználásával, PCR készülék alkalmazásával szaporítottam fel a kívánt kódoló régiót. A PCR készülék 30-szor 31

32 ismételte a beállított ciklust (4./a Táblázat). A PCR-csövekbe 25 μl reakcióelegy került, melynek tartalma a 4./b Táblázatban látható. Beállítás Hőmérséklet [ C] Idő [perc] Komponens neve Mennyiség [μl] Felfűtés 95 5 MQ víz 18,25 Denaturáció 95 0,5 dntp 2,5 Anneláció 55 0,5 Dream Taq puffer 2,5 Extenzió 72 1 Dream Taq polimeráz 0,25 Befejezés 72 5 Primer 0,5 DNS-izolátum 0,5 4. Táblázat: a) Polimeráz láncreakció paraméterei b) PCR reakcióelegy összetétele A szekvenálást megelőzően PCR Clean-Up Kit segítségével tisztítottam a termékeket, majd a Macrogen Europe-tól (Hollandia, Amszterdam) kapott szekvenálási eredményeket összevetettem a GenBank NCBI adatbázisának BLAST algoritmusának felhasználásával a már adatbankba felvett szekvenciákkal Nitrogénkötés hatékonyságának mérése Nitrogénfixáló baktériumok legfontosabb tulajdonságának, a nitrogénkötés hatékonyságának mérésére leggyakrabban az acetilén-redukciós módszert alkalmazzák, ugyanis az enzim nem csak az elemi nitrogént, hanem más, hármaskötést tartalmazó szubsztrátokat is képes redukálni. [62] Kutatásom során nem állt rendelkezésemre olyan berendezés, mellyel ezt a mérést kivitelezhettem volna, azonban jövőbeli terveim közt szerepel, hogy az izolátumokat ebből a szempontból is megvizsgáljam Növényi hormontermelés vizsgálata Habár a nitrogénkötés hatékonyságát nem tudtam mérni, a baktériumok által termelt hasznos hormonok vizsgálatával is közelebb kerültem ahhoz, hogy melyik izolátum rendelkezik a legjobb képességekkel. Rázatott lombikos fermentáció során vizsgáltam, hogy a különböző izolált fajok milyen növényi hormonként is funkcionáló vegyületek 32

33 szintetizálására képesek. 33 kiválasztott tenyészetet növesztettem módosított A2 tápoldaton (1 g/l triptofán hozzáadva) 3 héten keresztül 28 C-on 100ml/500ml-es lombikokban. Mikroszkópos vizsgálat alapján megállapítottam, hogy a lombikok nem fertőződtek be, csak ezután dolgoztam fel a fermentleveket. A fermentlevek 50 ml-ét lecentrifugáltam rpm-en, 20 C-on, 15 percig. A sejtmasszából egy kacsnyit tettem el Eppendorf-csövekben mélyhűtőbe a későbbi genetikai azonosításhoz. A továbbiakban a feldolgozás és a VRK-s meghatározás során is a Tien, Gaskins és Hubbell által leírt módszereket és paramétereket alkalmaztam. [31] A felülúszóból választótölcsérrel extraháltam a vegyületeket. Először ph állítást végeztem 1 M-os sósavval, aminek hatására az exopoliszacharidok sok esetben gélesedtek és kiváltak, ezzel később nehezítve az elválasztást. Először 2 15 ml etil-acetáttal extraháltam, majd a szerves fázist vízmentes MgSO4-tal szárítottam, redős szűrőn átszűrtem gömblombikba, és vákuumdesztillálón lepároltam az oldószert, a gömblombikban maradó magas forráspontú vegyületeket 1 ml metanollal mostam ki. A mintákat Eppendorfcsövekben tároltam mélyhűtőben a VRK-s futtatásig. A vizes fázist újra feldolgoztam, 2 15 ml n-butanollal extraháltam, a szerves fázist ismételten szárítottam, szűrtem, majd lepároltam vákuumdesztillálón az elválasztani kívánt vegyületekről, melyeket metanolos mosás után Eppendorf-csövekben mélyhűtőben tároltam. Az metanolban tárolt mintákat CAMAG automata VRK felvivő készülékkel készítettem elő, standardként triptofán, indolecetsav, gibberelin és abszcizinsav oldatokat használtam. A vizsgálat során cm-es 5554, F254-es lemezeket használtam, a futtatószer kloroform:etil-acetát:hangyasav elegye volt (55:40:10 arányban), előhívószerként kénsav:etanol:víz elegyet alkalmaztam (1:9:10). Az előhívás szárítószekrényben történt 105 C-on, a detektálást szabad szemmel és UV fény alatt végeztem el. A kiértékelésnél a standardek elhelyezkedése mellett az irodalomban megadott Rf értékeket is figyelembe vettem, melyeket a 5. Táblázat tartalmaz. Vegyület IAA GIBB Z és ZR ABA Irodalmi Rf 0,8 0,5-0,6 0,6 0,72 5. Táblázat: Keresett hormonok irodalmi Rf értéke 33

34 Exopoliszacharid termelés vizsgálata Izolátumaimat A2 tápoldaton (1 g/l triptofán hozzáadva) 100ml/500ml-es lombikokban 28 C-on, 335rpm-en rázószobában 3 héten keresztül növesztettem. A fermentlevekből 50 ml-ét lecentrifugáltam rpm-en, 20 C-on, 15 percig. Az élesre szűrt felülúszó 5 ml-hez 10 ml 2-propanolt öntöttem, majd hűtőszekrényben 24 órán át állni hagytam. Ezt követen az EPS kicsapódott, kaccsal kiemelhetővé vált Baktériumtörzsek csírázó növényekre gyakorolt hatásának vizsgálata A növényi hormonok analitikai módszerekkel meghatározott mennyiségi és minőségi értékeiből csak következtetni tudunk a növényekre kifejtett tényleges hatásukra. Ezért kutatásomban egy növekedési kísérlet kereti közt kívántam megvizsgálni, hogy az izolált törzsek közül melyek hatnak a legpozitívabban a növények fejlődésére. Tesztnövénynek, gyorsan növő növényfajok közül választottam, így a publikációkban már tanulmányozott angol perje (Lolium perenne) mellett döntöttem [63], mivel a hazai fűmagkeverékekben is ez a leggyakoribb faj. A kísérlet során körülbelül 40 izolátum hatását vizsgáltam két párhuzamos rendszerben egyesével, valamint növényi hormon és exopoliszacharid termelésük alapján egymással párosítva. (egy A. vinelandii és egy A. chroococcum) A kísérlet során sterilezett üveg petricsészékbe tettem földet, amibe csészénként 10 fűmagot helyeztem. Ezután kezeltük őket a baktériumtartalmú szuszpenzióval. A virágföldet nem sterilizáltuk a művelet előtt abból az elgondolásból kiindulva, hogy a nitrogén-fixálók a növény növekedését nem csak közvetlenül, hanem közvetve, a talaj élőflórájának gazdagodásával is segíthetik. A fűszálak 16 napon keresztül nőttek szobahőmérsékleten, napi öntözés mellett. Minden nap nedvesítettük a talajt és folyamatosan dokumentáltuk a fejlődést. A kísérlet végén a 16. napon sor került a fűszálak szálhosszúságának és gyökérhosszúságának lemérésére, valamint egyéb szempontok alapján is összehasonlítottuk a kifejlődött növényeket. 34

35 5. Kísérletek és eredményeik kiértékelése 5.1. Talajgyűjtemény és mikroorganizmus gyűjtemény létrehozása A kutatási céljaim megvalósításához először saját talajgyűjteményt (összesen 15 db talajmintával), majd saját törzsgyűjteményt (összesen 48 db Azotobacter faj, 2 db Azospirillum faj) hoztam létre. A talajmintákat magyarországi, dús fűtakaróval borított területekről gyűjtöttem össze Alapelgondolásom, hogy azokon a területeken, ahol rendszeres ápolás nélkül is életerős növényzet fejlődik ki, feltehetően gazdagabb a jótékony hatású baktérium populáció jelenléte, így jobb esélyekkel lehet izolálni a PGPB baktériumokat is. A kutatási időszakom legnagyobb részét kitevő izolálási időszakban elsősorban két nitrogénkötő nemzetség, az Azotobacterek és az Azospirillumok tagjait izoláltam. Mindkét esetben olyan tápoldatot használtam dúsítás céljára, ami nélkülözte a szervetlen nitrogént, így csak azok a mikroorganizmusok szaporodtak el, melyek képesek a légköri nitrogén fixálására. A szakcikkekben olvasott számos eljárás közül az Azotobacterek esetében az kétféle, in vitro, és in situ módszerrel történő dúsítását alkalmaztam. A talajmintákban levő, nitrogént kötni képes mikroorganizmusok dúsultak az alkalmazott műföld, illetve tápleves felületén, majd többszörös, Azotobacterekre szelektív tápagarok alkalmazásával tisztíthatóvá váltak. [15] Az Azospirillumokat az irodalomban [56] leírt minimál sóoldatot tartalmazó nitrogénmentes tápoldat felületén képződött hártyáról izoláltam. Izolátumaim tisztításához szelektív és differenciáló tápagarokat használtam. Mind irodalmi, mind saját fejlesztésű tápagarokkal dolgoztam. (ld. 3.1 fejezet) A tiszta és homogén tenyészetekből nitrogénmentes ferdeagaron fenntartott törzsgyűjteményt hoztam létre a további vizsgálatokig. 35

36 10. ábra: a) in vitro: Ashby tápoldatban képződő hártya b) in situ: Műföld elkülöníthető telepekkel c) Asp tápoldatban képződő hártya 5.2. Az izolátumok hagyományos mikrobiológiai identifikálása A nagyszámú izolátum szűkítését egyrészt a 4.1. fejezetben leírt szelektív tápagarok, majd differenciáló tápagarok segítségével tehettem meg, valamint a telepek és telepnövekedés során tapasztalható külső morfológiai bélyegek, és mikroszkópos vizsgálat alapján végeztem el. Sok törzs tisztítása a nagymértékű exopoliszacharid termelés miatt tartott sokáig, ugyanis ebben könnyen megtapadnak az apróbb sejtméretű mikrobák, melyek így tartósan fertőzik a tenyészetet. Ezektől többlépéses szélesztés során sikerült mentesíteni az izolátumokat. A célkitűzéseink alapján bíztatónak mutatkozó Azotobacter és Azospirillumszerű izolátumainkkal további biokémiai teszteket végeztünk. (Úgy, mint mikroszkópos vizsgálat, Gram-teszt, String-próba, kataláz-teszt, oxidáz-teszt). Miután a külső, morfológiai bélyegek, a biokémiai tesztek és a mikroszkópos vizsgálatok alapján is kijelenthettem, hogy Azotobacter vagy Azospirillum-szerű színtenyészeteket kaptam, a következő lépésben a 4.1. fejezetben leírtak szerint több típusú, differenciáló táptalajra oltottam minden tenyészetből. Gazdaságossági megfontolásból, több 36

37 tenyészet egyidejű tesztjét kívántam megoldani, ezért egy petricsészére egyszerre 15 izolátumot vizsgáltam. A szúrt tenyészeteket 4-5 napig inkubáltam 28 C-on. Sajnos ezzel a módszerrel nem a várt eredményt kaptam, ugyanis túl sok olyan törzset izoláltam, melyek nagy mennyiségű exopoliszacharidot termeltek ilyen körülmények között. Ezek a telepek néhány nap alatt elérték a szomszédos szúrt tenyészeteket, és összefolytak velük. A többi törzs azonban ennyi idő alatt nem mutatott eredményt, ami miatt a teszt értékelhetetlen volt. 11. ábra: Összefolyó telepek a differenciáló tápközegen A teszteket új módon kellett elvégeznem, ezért microplate/microtiter lemezen vizsgáltam az izolátumok pigment, exopoliszaharid és a szénforrás hasznosításukat. Ezzel az új módszerrel a tesztek már kiértékelhetővé váltak, morfológiai bélyegekkel kiegészítve elegendő információ állt a rendelkezésünkre a törzsek beazonosításához. 12. Ábra: Biokémiai tesztek microplate-lemezen A hagyományos mikrobiológiai beazonosítás alapján megállapítottam, hogy az összesen 48 darab Azotobacter izolátum közül 23 törzs bizonyult Azotobacter 37

38 vinelandii-nak, 23 törzs bizonyult Azotobacter chroococcum-nak, 2 db Azotobacter salinestris-nek az eredményeket a Függelék 1. Táblázata tartalmazza. Izolátumaimnak saját, ferdeagaron tárolt törzsgyűjteményt hoztam létre Izolátumaim genetikai azonosítása A morfológiai szempontok és biokémiai tesztek alapján történt identifikáláson túl, néhány izolátum esetében genetikai módszerekkel is megtörtént a beazonosítás. A színtenyészetek közül öt olyat választottam ki, melyek érdekes morfológiai bélyegekkel (pl. fokozott pigmenttermelés, extrém mennyiségű exopoliszacharid termelése) vagy mikroszkópos képpel (pl. csillós sejtek) rendelkeztek. Az azonosítás alapját a 16SrRNS szekvencia képezte, ehhez egy kacsnyi telepet óráig 28 C-on termosztáltunk A2 tápoldaton, majd 1-1 ml fermentlevet lecentrifugáltunk, a sejtmasszákból pedig DNS izolálásra került sor. Genetikai vizsgálatra csak és kizárólag fertőzésmentes tenyészetek alkalmazhatóak, így a fermentleveket a centrifugálás előtt mikroszkóp alatt is megvizsgáltam. Az fejezetben leírtak szerint hajtottam végre a DNS izolálást, a polimeráz láncreakciót, valamint a PCR termékek tisztítását. A DNS izolálás és a PCR reakció után is agaróz alapú gélelektroforézissel ellenőriztem a művelet sikerességét, szintén az Anyagok és módszerek c. fejezetben leírtak szerint (13. Ábra). A baloldali gélképen látható, hogy a minta jelentősen kevesebbet haladt, mint a Ladder komponensei, amiből arra következtethetünk, hogy a DNS nem töredezett fel, és az izolálás sikeresnek tekinthető. A jobboldali gélkép a polimeráz láncreakció után készült, a másikkal ellentétben a minták tovább futottak, ami PCR sikerességét bizonyítja, 1000 bázispár nagyságú szakaszok szaporodtak fel az elegyben. 38

39 13. Ábra: Gélelektroforézis eredménye a) DNS izolálás után b) polimeráz láncreakció után A megtisztított PCR termékeket a primerekkel együtt küldtem szekvenálásra, a bázissorrendet a Macrogen Europe (Hollandia, Amszterdam) határozta meg számomra. A Serial Cloner 2.6 molekuláris biológiai szoftver alkalmazásával a mintánként kapott antiparalell lefutású DNS termék két nukleotidszála között homológiát kerestünk, majd a kivágott szakaszt a GenBank NCBI adatbázisának BLAST algoritmusa felhasználásával összevetettük az ismert 16S rrns nukleotidszekvenciával rendelkező Azotobacterek adataival. A vizsgált törzsek közül az Iz36, az Iz45, az Iz 52 és az Iz54 Azotobacter chrocoococcum-nak, az Iz56 pedig Azotobacter vinelandii-nak bizonyult, ami megegyezik a hagyományos mikrobiológiai módszerekkel kapott eredményekkel. A szekvenálási eredményeket a Függelék tartalmazza. 39