DOKTORI ÉRTEKEZÉS. Gondor Orsolya Kinga

Átírás

1 DOKTORI ÉRTEKEZÉS Gondor Orsolya Kinga 2016

2 Az exogén szalicilsav hatása az endogén szalicilsavszintre és rokon vegyületeire búzában és kukoricában stresszkörülmények között PhD értekezlés Készítette: Gondor Orsolya Kinga ELTE Biológia Doktori Iskola (Prof. Dr. Erdei Anna) Kísérletes Növénybiológia Doktori Program (Prof. Dr. Szigeti Zoltán) Témavezető: Dr. Szalai Gabriella tudományos tanácsadó MTA ATK Mezőgazdasági intézet 2016

3 Tartalomjegyzék 1. Bevezetés Irodalmi áttekintés Növényi stressz Oxidatív stressz Antioxidáns rendszerek Kataláz Gvajakol-peroxidáz Glutation-S-transzferáz Aszkorbát-glutation ciklus Aszkorbát-peroxidáz Glutation-reduktáz Kadmiumstressz Szalicil sav szalicilsav bioszintézise Az szalicilsav és az abiotikus stressz Flavonoidok ábra. Flavonoidok főbb csoportjai (Heim és mtsai, 2002) A flavonoidok bioszintézise Flavonoidok biofunkciója Kutatási célok Anyagok és módszerek A növényi anyagok Búza növények magáztatásos és tápoldatban kezeléses kísérletének leírása Kukorica növények nevelése és a különböző SA formák tanulmányozása Életképesség mérése Ionkiáramlás mérése Gyökér életképesség vizsgálata 2,3,5-trifenil-tetrazolium-kloriddal... 30

4 Gyökér életképesség vizsgálata nitroblue-tetrazolium-kloriddal Lipidperoxidáció meghatározása Klorofilltartalom mérése Antioxidáns enzimek kivonása és aktivitásuk mérése Antioxidáns enzimek izolálása és fehérje tartalmának meghatározása Aszkorbát peroxidáz (EC ) Gvajakol-peroxidáz (EC ) Kataláz (EC ) Glutation-reduktáz enzim aktivitásának mérése (EC ) Glutation-S-transzferáz (EC ) Fotoszintetikus paraméterek mérése A klorofill-a fluoreszencia mérés Fitokelatin-szintézis γ-glutamil-cisztein-szintáz enzim aktivitásának mérése Glutation-szintetáz enzim aktivitásának mérése Cisztein, γ-glutamil-cisztein és glutation meghatározása Fitokelatinok és fitokelatin-szintáz aktivitásának mérése Szalicilsav szintézisben jelen levő vegyületek és flavonoidok extrahálása és mennyiségi meghatározása Kadmiumtartalom meghatározása Aszkorbinsav meghatározása Az 1-aminociklopropán-1-karboxilsav meghatározása Statisztikai analízis Eredmények A különböző exogén szalicilsav kezelések hatása a búza metabolizmusára A különböző exogén szalicilsav kezelések hatása a növények életképességére A különböző exogén szalicilsav kezelések hatása az antioxidáns enzimek aktivitására A különböző exogén szalicilsav kezelés hatása az endogén szalicilsav szintjére A különböző exogén szalicilsav kezelés hatása az endogén orto-hidroxi-fahéjsav szintjére A különböző exogén szalicilsav kezelés hatása az endogén benzoesav szintjére... 51

5 A különböző exogén szalicilsav kezelés hatása az endogén fahéjsav szintjére A különböző exogén szalicilsav kezelés hatása az endogén kaempferol szintjére A különböző exogén szalicilsav kezelés hatása az endogén kvercetin szintjére A különböző exogén szalicilsav kezelés hatása az endogén miricetin szintjére A különböző exogén szalicilsav kezelés hatása az endogén rutin szintjére A különböző exogén szalicilsav kezelés hatása az 1-aminociklopropán-1-karboxilsav mennyiségére A különböző szalicilsav formák hatása a kukorica növényekre stresszkörülmények között A különböző szalicilsav formák hatása a kadmium felvételre A különböző szalicilsav formák hatása az életképességi paraméterekre A különböző szalicilsav formák hatása a fitokelatin tartalomra és a fitokelatin-szintáz aktivitására A különböző szalicilsav formák hatása a redukált és oxidált cisztein, - glutamil-cisztein és glutation mennyiségére és - glutamil-cisztein-szintáz és glutation-szintetáz enzimek aktivitására A különböző szalicilsav formák hatása az antioxidáns enzimekre A különböző szalicilsav formák hatása az aszkorbáttartalomra Eredmények megvitatása A különböző exogén szalicilsav kezelések hatása a búza metabolizmusára A különböző szalicilsav formák hatása a kukorica növényekre stresszkörülmények között Összefoglalás Summary Felhasznált irodalom Köszönetnyilvánítás

6 Rövidítések jegyzéke F/Fm : ACC: ACN: APX: Asc: BA: BSA: CA: KAT: CDNB: CHES: Cys: DTNB: DTPA: EDTA: EtOH: effektív quantumhatásfokot 1-amino-1-karboxil-propán acetonitril aszkorbát peroxidáz aszkorbát benzoesav borjú szérum albumin fahéjsav kataláz 1-kloro-2,4-dinitrobenzént 2-(ciklohexilamino)etánszulfonsavat cisztein 5,5 -ditio-bis-(2-nitro-benzoesav) dietiléntriamin-pentaecesav etilén-diamin-tetraecetsav etanol F0: minimális fluoreszcencia értéke Fm: Fv/Fm: G(POD): GR: GSHS: GSH: GSSG: maximális fluoreszcencia optimális kvantum hatásfokát gvajakol-peroxidáz glutation-reduktáz enzim glutation-szintetáz redukált glutation oxidált glutation

7 GST: glutation-s-transzferáz HEPES: K: kaempferol M: miricetin MACC: MDA: MeOH: NADPH: NaSA: NBT: oani: ohca: PC: PCS: phba: PS I: PS II: 1-malonil-amino-1-karboxil-ciklopropán malon-dialdehid metanol 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinetánszulfonsav -nikotinsavamid-adenin-dinukleotidfoszfát nátrium-szalicilát nitroblue-tetrazólium klorid orto-anizinsav orto-hidroxi-fahéjsav fitokelatin fitokelatin szintáz para-hidroxi-benzoesav első fotokémiai rendszer második fotokémiai rendszer Q: kvercetin R: rutin ROS: SA: TBA: TCA: TFA: Tris: reaktív oxigénformák (reactive oxygen species) szalicilsav tiobarbitursav triklór-ecetsav trifluor-ecetsav tris-(hidroximethil)-aminometáne

8 TTC: γec, γ-glu-cys: γecs: 2,3,5-trifenil-tetrazólium klorid γ-glutamil-cisztein γ-glutamil-cisztein-szintetáz

9 1. Bevezetés A stressz az élő szervezet válasza bármilyen természetű megterhelésre. Mindössze két alapvető reakciótípus létezik: aktív válasz, azaz küzdelem, vagy pedig passzív válasz, azaz menekülés vagy eltűrés. Selye János így fogalmazta meg a Stressz distressz nélkül című írásában. Azóta a stressz növényekre elfogadott definícióját Larcher 1987-ben Selye János általános adaptációs elméletére alapozva úgy fogalmazta meg, hogy a stressz olyan terheléses állapot, amelyben a növénnyel szembeni fokozott igénybevétel a funkciók kezdeti destabilizációját követően egy normalizálódáson át az ellenállóság fokozódásához vezet, majd a tűréshatár túllépésekor tartós károsodást, vagy akár pusztulást is okoz. A stressz tényező lehet természetes és antropogén is. Természetes tényező például a szélsőséges időjárás, túl sok eső vagy szárazság, melyre hazánkban számos példa felsorolható. Az antropogén tényező lehet herbicid vagy légszennyező gázok is. Sajnos antropogén stresszfaktornak tekinthetjük a 2010 októberében történt vörösiszap katasztrófát is, hiszen ott is az ember által létrehozott timföldgyártás mellékterméke okozott károkat, mely elöntötte Devecsert, Kolontárt és Somlóvásárhely mélyebben fekvő területeit. A vörösiszap nagyon lúgos (ph=13) volt és több féle fémoxidot is tartalmazott, vas-oxidot, aluminium-oxiod, titándioxidot, szilicium-dioxidot, nátrium-oxidot és kálcium-oxidot is. Bár felhasználni talajjavításra is lehet, mert lúgosítja a talajt és a cukorrépa nátriumtartalmát is növeli, szörnyű pusztítást okozott élő- és élettelen környezetben is. A fémek közül a nehézfémek is antropogén módon kerülnek szennyezőként a környezetbe. Ezek közül a kadmium az egyik legveszélyesebb, hiszen kis mennyiségben is karcinogén hatású. A növényekben felhalmozódik, így mi magunk is bevisszük a szervezetünkbe, hiába gondoljuk azt, hogy egészségesen táplálkozunk. Fontos megismerni az akkumuláció mechanizmusát és hogy mivel lehet a növények ellenállóságát fokozni a kadmiummal szemben. A fűzfakéreg már évezredek óta ismert fájdalomcsillapító, köszönhetően a benne található nagy mennyiségű szalicilsavnak (SA). A növény hatóanyaga a fűzfa latin nevéből, a Salix-ból származik. A SA egy mono-hidroxi-orto-benzoesav. Manapság a SA-t hatékonyabb formában gyógyszerként használjuk nap mint nap, amióta március 6-án bejegyezték a szabadalmi hivatalban az acetil-szalicil savat, vagyis az aszpirint. A SA egy fitohormon, mely minden növényben megtalálható, bár sokkal kisebb mennyiségben, mint a fűzfában. A SA- 2

10 nak mint fitohormonnak a növényekben nagyon sokrétű feladata van, hiszen amellett, hogy szignálmolekula, képes a növény stressztűrését is fokozni. Először a SA ellenállásnövelő hatását biotikus stressz során mutatták ki. A hatásmechanizmusa alapján a kataláz enzimhez kötődik, gátolva annak aktivitását, így feldúsulhat a hidrogén-peroxid a növényben, ami mint jelátvivő molekula közvetíti a SA hatását. Így beindítja az akklimációs folyamatokat, ami a nagyobb stressztűrést eredményezi. Az újabb kutatások azt mutatják, hogy a SA-nak az abiotikus stressztűrésben is fontos szerepe van. A növények számára a stressztűrés növelése fontos, hiszen helyhez kötve nem tudnak a környezeti tényezők változása elől elmenekülni, így az egyetlen védekező mechanizmusként mindössze a stressztűrés fokozását tehetik. A munkánk első felében a különböző módokon adagolt exogén SA hatását vizsgáltuk az endogén SA bioszintézisére és rokonvegyületeire, valamint a flavonoidok mennyiségének változására. A munkánk másik részében a különböző SA formák hatását vizsgáltuk a kadmium stressz elleni védekezés kialakulásában. 3

11 2. Irodalmi áttekintés 2.1. Növényi stressz Sokan sokféle stressz definíciót dolgoztak ki, de a legelfogadottabb Sellye János által megfogalmazott, A stressz az élő szervezet válasza, bármilyen természetű megterhelésre. Mindössze két alapvető reakciótípus létezik: aktív válasz, azaz küzdelem, vagy pedig passzív válasz, azaz menekülés vagy eltűrés. (Selye János: Stressz distressz nélkül). A stressz lehet eustressz vagyis pozitív hatású és lehet distressz, vagyis negatív hatású. A növényélettanban a stressz az a fiziológiai állapot, amelyben a növények növekedése, fejlődése és szaporodása a fokozott környezeti terhelés miatt a genomban meghatározott lehetőségek alatt marad. Selye János három szakaszát különbözteti meg a stressznek, az alarm fázist, ellenállás fázisát és a kimerülési fázist. Az alarm fázisban a stresszor, vagyis stresszt kiváltó komponens hatására a növényben vészreakció indul. A stresszor hatására a növény a normális viselkedésétől eltérően kezd viselkedni, és csökken a növény vitalitása. Ha a növény redoxi potenciálja lehetővé teszi, akkor az edződik a növény és ellenáll, az ellenállási fázisban, de ha az alkalmazkodó képességét meghaladó módon intenzitású a stresszor, akkor a kimerülés következik be, ami akár krónikus károsodást okozhat. Viszont, ha a stresszor már nem hat a növényre, akkor még regenerálódni képes lehet (Láng Ferenc, Növényélettan). A stresszorok lehetnek biotikus és abiotikus stresszorok is. Biotikus stresszoroknak nevezünk minden olyan stresszt előidéző komponenst, melyet egy másik élőlény okoz, vagyis ezek lehetnek mikroorganizmusok, vírusok, baktériumok, rovarok és még a csigák is. Abiotikus stresszornak nevezünk minden egyéb komponenst, vagyis a hőséget, hideget, fagyot, UV sugárzást, nehézfém szennyezést, tápanyaghiányt és minden antropogén hatást is. A stresszor hatására a növény vitalitása csökken vagyis a lebontó folyamatok dominálnak. A stresszor hatására a természetes módon jelenlevő és generálódó reaktív oxigén formák (ROS) mennyisége megnő és így az aránya az antioxidánsokkal felborul, vagyis oxidatív stressz alakul ki. Az abiotikus stresszek közül a só, az alacsony hőmérséklet illetve a nehézfém is generál ROSt, vagyis ezek a stresszek is oxidatív stresszek (Dat és mtsai, 2000). 4

12 Oxidatív stressz A növényeknek szükségük van molekuláris oxigénre, hogy energiát tudjon termelni, vagyis, hogy normális módon működhessen. A molekuláris oxigénből viszont a növény lebontó folyamatai során képződik ROS, vagyis olyan részlegesen redukált reaktív oxigén formák. Ezek a formák rövid felezési élettartalommal és nagy reaktivitással rendelkeznek. A reaktív oxigénformák (ROS) a növényi sejtekben képződhetnek a légzési elektron transzportlánc túlterheltsége során bekövetkező elektron kiáramlás következtében, fotoszintetikus úton, a gerjesztett, triplett állapotú klorofillmolekulák és oxigénmolekulák reakciója során, vagy a különböző oxidázok és peroxidázok reakciótermékeként (Mittler, 2002; Edreva, 2005). Az egyik legrövidebb életidejű és az egyik legreaktívabb forma a singlet oxigén ( 1 O2), mely a lipides frakcióban 2 µs ideig él. Gerjesztési energia hatására a molekuláris oxigénből keletkezik. A rövid életideje alatt átadja gerjesztési energiáját, illetve reakcióba lép egyes vegyületekkel és endoperoxidokat, vagy hidroperoxidokat hoz létre (Knox és Dodge, 1985). Egy elektron felvételével a molekuláris oxigénből szuperoxid-aniongyök (O2 ) keletkezik. Ez közepesen reakcióképes, átlagosan 10 µm diffúztávolságú ROS, mely nem jut át a sejtmembránon. A szuperoxid-gyök további elektronfelvétellel hidrogén-peroxiddá (H2O2) alakulhat, illetve kinonokat vagy átmeneti fémkomplexeket redukálhat, így befolyásolva egyes fémtartalmú enzimek aktivitását. Vizes oldatban egy proton felvételével hidroperoxilgyökké (HO2 ) alakul, mely már át tud jutni a sejtmembránon, és hidrogén atomok elvonásával lipid autooxidációt indíthat el (Edreva, 2005). A hidrogén-peroxid közepes reakcióképességű, viszonylag nagy távolságra képes a membránokon keresztül diffundálni. Tiol-csoportjuk oxidációja által enzimeket is inaktiválhat (Dat és mtsai, 2000). A legreaktívabb oxigénforma a hidroxil-gyök OH, mely hidrogén-peroxidból keletkezik a Haber-Weiss ciklus elemeként ismert Fenton-reakció során fém katalizátor jelenlétében. A fémionok általában oxidált formában fordulnak elő a sejtekben. Szuperoxid-gyök jelenlétében azonban redukálódnak és így képessé válnak arra, hogy a H2O2 átalakulását katalizálják hidroxil-gyökké. A hidroxil-gyök bármely biológiai molekulával képes reakcióba lépni, túlzott termelődése sejthalálhoz vezet. A sejtek nem rendelkeznek olyan enzimmel, mely képes lenne eliminálni a hidroxil-gyököt, ezért fontos, hogy szigorú szabályozás alatt álljon a H2O2 és a O2 mennyisége a sejtekben (Grant és Loake, 2000). A reaktív oxigénformák sejtkárosító hatásuk mellett, alacsony koncentrációban, szerepet játszhatnak a védekező mechanizmusok jelátviteli folyamataiban (Grant és Loake, 5

13 2000; Shao és mtsai, 2008). Számos jelátviteli útban mutatták ki reaktív oxigénformák szerepét (Van Breusegem és mtsai, 2001; Neill és mtsai, 2002). A hidrogén-peroxid különböző stresszhatások következtében aktiválódó jelátviteli utak közös komponense, így szerepe lehet a kereszttolerancia kialakulásában (Pastori és Foyer, 2002). A sejtekben a reaktív oxigénformák mennyiségét összetett antioxidáns védekező mechanizmusok szabályozzák. Ezek egyrészt megakadályozzák a reaktív oxigénformák nagy mennyiségű felhalmozódását, másrészt lehetővé teszik kis koncentrációváltozások finom szabályozását, érzékelését Antioxidáns rendszerek A ROS semlegesítésére különböző védekező rendszerek alakultak ki a növényekben. Az antioxidáns védekezőrendszert enzimatikus és nem-enzimatikus komponensekre különíthetjük el. A nem-enzimatikus rendszert antioxidáns tulajdonságú vegyületek alkotják, melyek lehetnek vízoldhatók, ezek között kiemelt fontosságú a glutation és az aszkorbinsav, illetve lipidoldhatók, mint például az α-tokoferol, vagy a β-karotin. Az enzimatikus elemek közül az aszkorbát-peroxidáz (APX) és a glutation-reduktáz (GR) az előbbi vegyületek reakcióit, regenerációját katalizálva vesz részt a reaktív oxigénformák eliminálásában. A szuperoxid-dizmutáz közvetlenül a szuperoxid-aniongyök, míg a kataláz (CAT) hidrogénperoxid semlegesítésében vesz részt (Dat és mtsai, 2000) Kataláz A kataláz (KAT) a hidrogén-peroxid közömbösítését végzi dizmutációval az alábbi reakció alapján. H2O2 H2O + 1/2O2 A H2O2 koncentrációtól függően azonban a kataláz enzimnek kétféle lehetséges működése van (Deisseroth és Dounce, 1970). Magas H2O2 koncentráció mellett a fent leírt reakció gyorsabb, ún. katalatikus módon működik. Ennek során mind a donor, mind pedig az akceptor szerepét a H2O2 tölti be, így a kataláz egyszerre két molekula H2O2-t képes közömbösíteni, és ehhez nem igényel redukáló erőt. 6

14 Alacsony hidrogénperoxid koncentráció (<10-6 M) mellett viszont, az ún. peroxidatikus út működik, ahol különböző vegyületek (etanol, aszkorbát, RH2) tölthetik be a hidrogén-donor szerepét az alábbi reakció szerint: RH2 + H2O2 R + 2 H2O A kataláz széles körben elterjedt enzim, mely aerob baktériumoktól kezdve a magasabbrendű növényekig és állatokig minden élőlényben előfordul. A kataláz egy tetramer hem enzim, mely direkt módon dizmutálja a H2O2-t H2O és O2-vé ami nélkülözhetetlen a ROS detoxifikálásához (Garg és Manchanda, 2009). A kataláz az egyik leghatékonyabb enzim, mert egy KAT molekula több mint 6 millió H2O2 molekulát tud dizmutálni percenként. Kukoricában három kataláz izoenzim van jelen (CAT1, CAT2 és a CAT3) melyeknek külön kromoszómájuk van és egymástól függetlenül szabályzódnak. A CAT1 és CAT2-es a peroxiszómában és a citoszólban lokalizálódnak, míg a CAT3 pedig a mitokondriumban lokalizálódik. A CAT1 és CAT2 izoenzimek előfordulnak homotetramerként, de ahol mindkét gén expresszálódik, heterotetramereket is alkothatnak alegységeik. A CAT3 in vivo csak homotetramer lehet, mert térben elkülönül a másik két izoformától. A háromféle izoenzim közül a KAT3 biokémiai tulajdonságai térnek el leginkább a többitől. Egyrészt nagyobb peroxidatikus aktivitással bír, mint a CAT1 vagy a CAT2. Másik jelentős különbség, hogy különféle gátlószerekkel szemben (aminotriazol, cianid, stb.) ellenállóbbnak bizonyul a CAT3 (Scandalio, 1990). Transzgenikus vizsgálok alapján a búzából (Triticum aestivum L) rizsbe (Oryza sativa L) transzformált KAT enzim az alacsonyhőmérséklet toleranciát javította, mert hatékonyabban detoxifikálta a H2O2 t (Matsumura és mtsai, 2002). A kataláz enzim aktivitása kadmium expozíció hatására megnőtt rizsben (Oryza sativa L) (Hsu és Kao, 2004), szareptai mustárban (Brassica juncea) (Mobin és Khan, 2007), búzában (Triticum aestivum L) (Khan és mtsai, 2007), fekete lencsében (Vigna mungo) gyökerében (Singh és mtsai, 2008) is Gvajakol-peroxidáz A gvájákol-peroxidáz (G(POD)) egy aspecifikus enzim, vagyis nem minden olyan reakciót katalizál, melyben a H2O2-t egy fenolos donorral detoxifikálódik, víz és fenoxil gyök 7

15 képződve. Gyakran a redukált glutation a donor, melyet oxidálva az oxidált dimer glutation alakul ki, mint az alábbi rekacióban is: H2O2 + 2GSH 2H2O + GSSG G(POD) hem típusú fehérje, vagyis a molekulában vas található. Többségében a celluláris citoplazmában található és az apoplasztban (Tayefi-Nasarabidi, 2011). Az aspecifikus volt miatt részt vesz az etilén metabólizmusában, a plazma membrán redoxi reakcióiban, a sejtfal mádolagos átalakulásában, a lignifikációban és sejtfalba épülő para (suberin) lerakodásában is (Lepedus és mtsai, 2004). A G(POD) érzékeny és jól mérhető stressz marker, dacára, hogy alacsony szubsztrát specifikációt mutat. Az antioxidáns enzimek közül a peroxidázok általában fontos szerepet töltenek be a H2O2 detoxifikációjában, így a G(POD) (Pfanz és mtsai, 1993). A növényekben a peroxidázoknak extrém sok izoeznimje figyelhető meg, több mint 40 gén vesz részt az izoformák generálásban (De Marco és mtsai., 1995) Glutation-S-transzferáz A glutation-s-transzferáz (GST) egy olyan antioxidáns enzim, mely képes egy glutation molekulát egy elektrofill xenobiotikumra kén kötéssel szubsztituálni az alábbi reakcióegyenlet alapján (Gill és Tuteja, 2010.): RX + GSH = HX + R-S-GSH (X:szulfát, nitril vagy halogenid; R: alkil csoport) Az enzimnek szerepe van a herbicideket detoxifikálásában, a hormon homeosztázisának fenntartásában, a tirozin metabólizmusában, a H2O2 detoxifikálásában, apoptózis szabályzában és a növények biotikus és abiotikus stresszre adott válaszaiban is (Dixon és mtsai, 2010.). A GST enzim potenciálisan képes lehet eltávolítani a citotoxikus vagy genotoxikus komponensket, amig reagálhatnak vagy károsíthatják a DNSt, RNSt és fehérjéket (Noctor és mtsai, 2002). Általában a citoplazmában fordul elő, de mikroszomában, plaszticidban, sejtmagban és az apoplasztban is előfordul (Frova, 2003). Megnövekedett GST aktivitást mértek borsó (Pisum sativum) levelében és gyökerében (Dixit és mtsai, 2001) illetve rizs (Oryz sativa) gyökerében (Moons, 2002) is. 8

16 Aszkorbát-glutation ciklus A glutation a legfontosabb kéntartalmú antioxidáns, ami redoxi pufferként is funkciónál a növényi szervezetben és esszenciális szerepet tölt be a növényi metabolizmusban és stressz toleranciában is (Foyer és mtsai, 2006.). A glutation egy három aminosavból álló kéntartalmú tripeptid, oxidált formája diszulfidhidat tartalmaz, de további oxidációval akár szerves kén-oxo vegyületek is létrejöhetnek, mint például a szulfoxidok, szulfonok és szulfonsavak (Foyer és Noctor, 2005). Egyik fő komponense a Halliwell-Asada ciklusnak (1. ábra). A kloroplasztiszokban nincs katalázaktivitás, így az ott keletkező H2O2-ot ez a ciklus semlegesíti, melynek két legtöbbet tanulmányozott enzime az aszkorbát-peroxidáz és a glutation-reduktáz. 1.ábra Halliwell-Asada ciklus (O2 :szuperoxid-aniongyök, OH : hidroxilgyök, OH :hidroxi ion, SOD: szuperoxi-dizmutáz, KAT: kataláz, H2O2 :hidrogénperoxid, APX: aszkorbát peroxidáz, Asc: aszkorbát, DHAsc: dehidroaszkorbát, DHAsc Reduktáz: 9

17 dehidroaszkorbát reduktáz, GSSG: oxidált glutation, GSH: redukált gluation, GR: glutation reduktáz, NADPH: nikotinamid-adenin dinukleotid foszfát oxidált, NADP+ : nikotinamidadenin dinukleotid foszfát redukált. (Az ábra Tsaniklidis és mtsai, 2014 alapján készült.) Aszkorbát-peroxidáz Az aszkorbát peroxidáz (APX) az aszkorbinsav és a hidrogénperoxid reakcióját katalizálja, hogy dehidroaszkorbát és víz keletkezzen: H2O2 + AA 2H2O + DHA Az aszkorbát-peroxidáz egy vastartalmú protein, mely erősen specifikus az aszkorbinsavra, mint elektrondonorra, míg más peroxidáz enzimek, mint pl. a gvajakolperoxidázok, többféle vegyületet is használhatnak elektrondonorként. Az APX enzimnek több izoformája is létezik, a tilakoid membránban található a tapx, a glioxiszómá membránjában a gmapx, a kloroplaszt stromaáiban oldékony formában az sapx és a citoszól ban található capx (Noctor és Foyer, 1998). A mérésinkben a kloroplasztokban található APX-et tudtuk kivonni és aktivitását mérni. A kloroplasztiszokban nincs kataláz aktivitás, így az ott keletkező H2O2 ot a már említett Halliwell-Asada ciklus semlegesíti. A rendszer enzimei és szubsztrátjai más sejtkompartmentekben is megtalálhatók (Klapheck és mtsai, 1990). Kadmium hatására a levélben megnő az APX tartalom, amit szareptai mustárban (Brassica juncea) (Mobin és Khan, 2007), búzában (Triticum aestivum L) (Khan és mtsai, 2007), fekete lencsében (Vigna mungo) (Singh és mtsai, 2008) illetve érdes tócsagazban (Ceratophyllum demersum) (Arvind és Prasada, 2003) is kimutattak. Rizsben azt is kimutatták, hogy H2O2 kezelést követően a megnövekedett APX szint megvédte a Cd hatásától a növényt (Hsu és Kao, 2007) Glutation-reduktáz A glutation-reduktáz (GR) NADPH-függő heterotetramer enzim, mely a következő reakciót katalizálja: GSSG + NADPH + H + 2GSH + NADP + 10

18 A glutation reduktáz fontos szerepet tölt be a Halliwell-Asada ciklusban, így a ROS elleni védekező mechanizmusokban is, mert fenntartja a redukált állapotát a glutation (GSH) molekulának. A GR katalizálja azt a folyamatot mely során az oxidált glutation dimer molekula (GSSG) mely egy diszulfid hídon keresztül kapcsolódott össze, NADPH jelenléte mellett redukálódjon két monomer glutation (GSH) molekulává amivel fenntartja a GSH összetételét is (Reddy és Raghavendra, 2006; (Chalapathi Rao és Reddy, 2008). A redukált és oxidált glutation (GSH:GSSG) arányának finom szabályozásával az enzim részt vesz a sejt redox állapotának kialakításában, a védekező folyamatok beindításában (Foyer és mtsai, 1991; Szalai és mtsai, 2009). Túlnyomórészt a kloroplasztiszban található meg (Bielawska és Joy, 1986) de azonosították a mitokondriumban, és a citoszólban is (Foyer és mtsai, 1991). Kukoricában a GR enzim, az aszkorbát-peroxidázzal szemben, szinte kizárólag csak a mezofill sejtekben lokalizálódik (Doulis és mtsai, 1997). Stresszhatásra általában növekedés tapasztalható az enzim aktivitásában, melynek szerepe lehet a tolerancia kialakulásában (Foyer és mtsai, 1991; 1997; Kocsy és mtsai, 2001). Kadmium hatására növekedést tapasztaltak, szareptai mustárban (Brassica juncea) (Mobin és Khan, 2007), búzában (Triticum aestivum L) (Khan és mtsi, 2007), fekete lencsében (Vigna mungo) (Singh és mtsia, 2008) is Kadmiumstressz A kadmium széleskörűen elterjedt a talajban, és vízben. Ez a kétértékű iont képző átmenetifém, rendkívül toxikus, a Földkéregben mindössze 0,16 ppm nagyságrendben fordul elő, önálló kristálya nincs, általában a cinket helyettesíti annak ásványaiban. A környezetbe való kikerülése elsősorban antropogén módon történik, a kohászat, bányászat, szemétégetés, városi közlekedés és a műtrágyagyártás és felhasználás során (Benavides és mtsi, 2005). A forgalmas utak mentén akár 3 mg/kg kadmium is felhalmozódhat, ami azért is fontos, mert ha a talaj ph-ja savassá válik, akkor a benne található kadmium 30%-a a növények által hozzáférhetővé válik (Kátai, 2011). A kadmium talajból való felvételének fokát a vele versengő elemek koncentrációja is befolyásolja, mint a kálium, kalcium, magnézium, vas, mangán, réz, cink és nikkel (Rivetta és mtsai, 1997). 11

19 Az első látható, de aspecifikus hatása a növényekre, hogy gátolja a növekedésüket, klorózist okoz (Chaffei és mtsai, 2004) és levélpöndörödést is (Zhao és mtsai, 2006). A kadmium gátolja az oldalgyökérképződést, apaptózist indukál a gyökérben, a gyökerek megbarnulnak és csavarodottakká válnak, valamint a további kadmium kezelés a növény pusztulását okozza (Gunse és mtsai, 1992; Nocito és mtsai, 2002; Wang és mtsai, 2007; Souza és mtsai, 2011). Bár a kukorica (Zea mays L.) relativ kadmiumtoleráns növény, a toxikus tüneteket is elviseli, amíg a kritikus szintet nem lép át, mely 7-70 mg/kg a talaj minőségétől függően (Verloo et al., 1986, Pál et al., 2006, Szalai et al., 2014) A nehézfémek szabad gyököket generálnak ami lipidperoxidációhoz és a permeábilitás elvesztéséhez vezethet a sejtmembránban (Pál és mtsai, 2013). A kadmium egyéb biokémiai folyamatokat indukál, mint a sejtekfalak lignifikációját, mind a gyökérben, mind a fő levél erezetben is. Befolyásolja a kloroplasztok szerkezetét, a sztóma záródását, csökkenti a fotosztintetikus háló aktivitását és a növényi légzést (Souza és mtsai, 2011), így csökkenti a fotoszintézishez kapcsolódó gének transzkripcióját is, mint a psba és psab (Qian és mtsai, 2011). A kadmium citoszólba jutásával, egy a kén metabolizmussal kapcsolatban álló rendszer aktiválódik, melynek eredményeként fontos komplexképző ágensek képződnek. A glutation SH-csoportja révén maga is képes a nehézfémek megkötésére, de az aktiválódott bioszintézise a kadmiumstressz során tapasztalt megnövekedett fitokelatin (PC) produkció során is fontossá válik. A fitokelatinok összeségében olyan biopolimerek, melyek γ-glutamilcisztein monomer egységekből és glutation lánczáró egységből állnak. A fitokelatinok szintése (2. ábra) során a cisztein γ-glutamilcisztein-szintetáz enzim katalizálása útján összekapcsolódik egy γ-peptid kötéssel, így kialakul a γ-glutamilcisztein dipeptid. A dipeptidhez α-peptid kötéssel egy glicin kötődik a glutation-szintetáz enzim segítségével, így kialakul a glutation molekula, mely a polimerizáció során lánczáró funkciót lát el. A fitokelatinszintáz enzim polimerizálja a γ-glutamilcisztein egységeket, kialakítva közöttük a peptid kötést. Az így kialakult fitokelatinok különböző tagszámúak lehetnek, hiszen a γ- glutamilcisztein-glutation egységet dimernek (PC2) nevezzük (Zenk 1996; Rauser 1995). A fitokelatinok a növényekben 2-es tagszámtól 11-es tagszámú polimerekig találhatóak meg (Torres és mtsai, 2008). A fitokelatinok szintézisét számos fém ion indukálhatja, de a legeffektívebb indukátor a kadmium, a legkevésbé effektív indukátor a réz (Cd > Pb > Zn > Ag > As > Cu) (Mitani és mtsai, 1996). A fitokelatinok strukturájának stabilitását a diszulfid hidak és az SH csoportok arány adja. A szabad kén csoportok nem csak a stabilitásért felelnek, hiszen a fitokelatinok a kadmiumot kelatálják, amit a szabad SH csoportok tesznek lehetővé. A fitokelatin-kadmium komplex kialakulása során a kadmium egy, kettő, három 12

20 vagy négy kén atomhoz koordinál, függetlenül, hogy azok a kén atomok ugyanazon a fitokelatin molekulán találhatóak vagy több molekulán. A kadmium koordinációjának maximuma a négy kén atom, így ezt nevezzük maximális kapacitásnak is. A koordináció során kialakulnak a kis molekula tömegű (low molecular weight, LMW) amorf komplexek, melyek a citoszólban akkumulálódnak (Cruz és mtsai, 2002), majd kompartmentizálódnak. Ezek az amorf komplexek transzportálják a tonoplaszton keresztül a kadmiumot a vakuolumba, ahol elraktározódik (Rauser, 1995). A vakuolumban többen is kimutatták már, hogy nagy molekula tömegű (high molecular weight, HMW) komplexek termelődnek, melyek stabilabbak a vakuolum savas környezetében és több kadmiumot tudnak kelatálni mint az LMW fitokelatinok (Rauser 1995). Szalai és munkatársai, 2013-ban különböző kadmium koncentrációkkal stresszeltek előkezelt fiatal kukorica növényeket, és mérték a fitokelatin tartalmat és annak eloszlását. Azt tapasztalták, hogy a LMW (PC2-4) fitokelatinok mennyisége a 14 napos kadmium expozíció után nem változott a koncentrációval, és a HMW (PC5-10) fitokelatinok mennyisége sem volt kadmium koncentrációfüggő, de ötszöröse volt a LMW fitokelatinoknak (Szalai és mtsai, 2013). 13

21 alapján) 2. ábra, Fitokelatinok bioszintézise, Cys: cisztein, PC: fitokelatin (Rauser, Szalicil sav Már korábban ismert volt, hogy a szalicilsavas (SA) kezelésnek védőhatása van különböző biotikus és abiotikus stresszek ellen. Az SA egy monohidroxi-benzoe sav, melyet először a fűzfa (Salix) kérgéből izoláltak. Az SA egy fitohormon, mely szerepet játszik a lokális és szisztémás szerzett rezisztencia kialakulásban (Pál és mtsai, 2013). A növényekben általában µg/g nagyságrendben fordul elő szabad formában, de megtalálható glikolizált, metilált, glükóz-észter és aminósav konjugátum formában is (Lee és mtsai, 1995). Az SA egy endogén hormon, növekedési regulátor, a növényi szignalizációban is szerepet játszik (Hayat és mtsai, 2010), valamint a környezetre adott válaszreakcióban is szerepe van (Raskin, 1992), de hatással van termogén növények virágzására (Klessig és Malamy, 1994), a gyümölcsök érésében, ionfelvételben és transzportban (Harper és Blake, 14

22 1981) is. A virágzás során pedig a hőtermelést indukálja, mint kalorigén anyag (Raskin és mtsai, 1987) A szalicilsav bioszintézise A szalicilsav (SA) bioszintézise több módon is lejátszódhat a növényekben, az egyik általunk is vizsgált útja a fenilpropanoid útvonal része. A fenilanalin fahéjsavvá (CA) alakul a fenilalanin-ammonia-liáz (PAL) enzim által katalizált reakcióban, mely lokálisan a citoszolban játszódik le. A reakció során ammónia szabadul fel egy nem-oxidatív deaminálás során (Raes és mtsai, 2003, Rohde és mtsai 2004.) A CA egy sok féle fenolos metabolit prekurzora, mert belőle kiindulva szintetizálódnak a flavonoidok, lignin, illékony benzoidészterek is. A CA-ból két úton keresztül szintetizálódhat a szalicilsav. Az útvonalak között az aromás gyűrű hidroxilációs és az oldallánc oxidációjának sorrendje tesz különbséget. Az egyik útvonalon a fahéjsavat hidroxilálja orto-hidroxi-fahéjsavvá (o-hca, o-kumársav), majd az o-hca az oldalláncon tovább oxidálódik. A másik útvonal, hogy a fahéjsavat először benzoesavvá (BA) transzformálja az oldallánc oxidációja során és a hidroxiláció ezután következik valószínűleg benzoe sav 2-hidroxiláz (BA2H) enzim útján (Métraux, 2002, Sawada és mtsai, 2006) (3. ábra). 15

23 3. számú ábra A szalicilsav bioszintézise Izotópos vizsgálatok napraforgónál, krumplinál és borsónál arra mutatnak, hogy a szalicilsav benzoátból képződik, a fahéjsav láncának rövidülésével, β-oxidációval (Klambt HD, 1962). Ezzel ellentétben Primula acaulis és a Gaultheria procumbens leveleiben azt találták, hogy a 14 C-vel jelölt fenilalanin és fahéjsav adagolásával a szalicilsav ortohidroxifahéjsavon keresztül szintetizálódott (El-Basyouni és mtsai, 1964). Természetesen azt is vizsgálták ugyanúgy kankalinban és kúszó fajdbogyóban, hogy a 14 C-vel jelölt benzoesav hatására is keletkezett szalicilsav (El-Basyouni és mtsai, 1964), ami azt sugallja, hogy mindkét útvonal jelen van a növényekben. Yalpani és mtsai (1993) dohány mozaik vírussal fertőzött dohány levelében azt tapasztalták, hogy 14 C-fahéjsavas kezelést követően 14 C-jelölt o-kumársav nem jelent meg, azaz a szalicilsav a fenilalaninból a benzoesavon keresztül szintetizálódik. Szintén dohányban mutatták ki, hogy a szalicilsav a benzoesavból szintetizálódik, de közvetlen prekurzora nem a szabad benzoesav, sokkal inkább annak konjugált, glikozidos formája (Chong és mtsai, 2001). 16

24 Uborkában, paradicsomban és rizsben is igazolást nyert, hogy a szalicilsav a fahéjsavból a benzoesavon keresztül szintetizálódik (Sticher és mtsai, 1997). Az elmúlt években több fenilalanin-ammonia-liáz enzim gén másolatot azonosítottak, négyet találtak Arabidpsisiban, öt gént nyárfákban és kilencet rizsben (Hamberger és mtsai, 2007). Nem szabad figyelmen kívül hagynunk azonban azt a tényt, hogy ezen tanulmányok a patogén-indukált szalicilsav szintézist vizsgálták. Az újabb kutatási eredmények szerint a szalicilsav abiotikus stresszek során is a benzoesavból szintetizálódik a benzoesav-2-hidroxiláz enzim katalizálta reakcióban. Először rizsben és dohány növényekben mutatták ki ezt az enzimet, egy dohány mozaik vírus (TMV) fertőzést követően (Leon és mtsai, 1995). Vízhiányos árpa növényeknél pedig azt figyelték meg, hogy a szalicilsav növekedése időfüggő viselkedést mutat, valamint hogy a benzoesav- 2-hidroxiláz enzim de novo szintetizálja a szalicilsavat, ha UV-B sugárzásnak teszik is ki a növényeket (Bandurska és Cieslak, 2013.). Valamint borsóban hőakklimatizáció során a szabad szalicilsav-szint pozitív korrelációban van a megnövekedett benzoesav-2-hidroxiláz aktivitással (Pan és mtsai, 2006). A 3-7 napon át tartó hideg stressz hatására őszi és tavaszi búzában is akkumulálódott a szalicilsav (Kosokova és mtasi, 2012). Azt is kimutatták arabidopsis genotípusokon, hogy a szalicilsav a hajtásokban akkumulálódik 5 C hőmérséklet hatására a vad típusban, míg a szalicilsav hidroxiláz enzimet szintetizáló NahG mutánsban a szalicilsav mennyisége csökken (Scott és mtsai 2004). Rizsben sóstressz, alacsony hőmérséklet és H2O2 kezelés hatására is indukálódott a benzoesav-2-hidroxiláz és megemelkedett a szalicilsav-tartalom. Ugyanakkor a NaCl-dal nem kezelt rizsnövenyekben a szalicilsav-tartalmat nem befolyásolta a benzoesav-2-hidroxiláz gátló unikonazol, ami azt feltételezi, hogy stresszmentes állapotban a szalicilsav nem a benzoesav-2-hidroxiláz segítségével szintetizálódik (Sawada és mtsai, 2006). Baktériumokban mutatták ki először, hogy szalicilsav szintetizálódhat más módon is, a sikimin sav útvonalon keresztül izokorizmát szintáz és az izokorizmát piruvát liáz által katalizált útvonalakon (El-Basyouni és mtsai, 1964). Arabidopsisban is megtalálták később a két izokorizmát szintáz enzim génjét, az ICS1 és ICS2-t (Wildermuth és mtasi, 2001) A bioszintézis során a sikimin savból korizmátszintáz enzim katalizálta reakcióban korizmát sav alakul ki, majd az izokorizmát szintáz enzim izokorizmáttá alakítja a korizmát savat. Utána az izokorizmát alakul át szalicilsavvá. Az izokorizmáton keresztüli útvonal akkor válik kifejeződővé, ha patogén fertőzés éri a növényt, legalábbis erre enged következtetni, hogy Pseudomonas syringae által fertőzött vad típushoz képest 5-10%-a volt a szalicilsav akkumulációja az ics1 mutánsnak arabidpsisban (Dewedney és mtsai, 2000). A kérdés az, 17

25 hogy vajon mikor válik aktívabbá az izokorizmát útvonal. A szalicilsav Nicotiana benthamiana növényekben izokorizmát gén (NbICS) vírus-indukált expressziójának gátlása erőteljesen csökkentette a szalicilsav akkumulációt ózon, illetve patogén stresszt követően. Így a fennmaradó szalicilsav mennyisége a fenilalanin-benzoesav útvonalon keresztül szintetizálódhatott, de ez nem képes kompenzálni a szalicilsav hiányt (Catinot és mtsai, 2008). Ez az útvonal a fő útvonala a szalicilsav bioszintézésnek Arabidpsis thalianában (Wildemuth és mtsai, 2001), ahol azt találták, hogy nem csak biotikus stressz hatására nő meg az ICS1 enzim aktivitása, hanem UV fény hatására (Kilian és mtasi, 2007), ózon stresszre (Ogawa és mtsai, 2005) és szárazságra (Wan és mtasi, 2012) is Az szalicilsav és az abiotikus stressz Az osztályunkon mutatták először, hogy az alacsony koncentrációjú szalicilsav oldattal kezelt növényeken a chilling hatása kisebb volt (Janda és mtsai, 1999), vagyis a szalicilsav kezelés eustressz volt a kukorica növények számára. A szalicilsav kezelést mint ahogyan az közismert több módon is megvalósítható, hiszen lehet a magokat áztatni, sprézni és a tápoldathoz adagolni is. Az exogén szalicilsav ezekben az esetekben más és más helyen és módon hatnak a növények metabolizmusára illetve más és más metabolikus útvonalakat indukálnak. Azt figyelték meg, hogy a szalicilsav abiotikus stressz során a kataláz enzimen keresztül hat, vagyis az enzimhez kapcsolódva gátolja annak működését. Így megnő a hidrogén-peroxid mennyisége (Janda és mtsai, 2007), ami jelátvivőként indukálja az akklimatizáció folyamatát. Az akklimáció azt jelenti, hogy a növényegyed egy adott stresszorra kompenzálja annak hatását az élettani paraméterei csökkenésére. Kimutatták, hogy a szalicilsav indukálja a ROS generálását a fotoszintézisért felelős növényi szövetekben só és ozmatikus stressz során Arabidopszis thaliana-ban (Borsani és mtsai, 2010) A szalicilsav hatással van a növény növekedésére és a terméshozamra is (Arber, 1981). A szalicilsav és az szerkezetileg analóg komponensek kukoricában és szójában hatással vannak annak levél nagyságára és a száraztömeg nagyságára (Khan és mtsai, 2003). Alacsony koncentrációjú (0,05 mm) szalicilsav oldatot használva magázatás során azt tapasztalták, hogy megnöveli a csírázást és a növekedést búza növények esetén (Shakirova, 2007). Azt is tapasztalták, hogy ha alacsony koncentrációjú (10-5M) oldatba magáztatják a búzaszemeket, akkor a levelek száma, a friss és szárazt tömeg is megnő (Hayat és mtsai, 2005). Ha más módon adták a növényeknek szalicilsavat, akkor azt tapasztalták, hogy a 18

26 száraz anyag szignifikánsan megnőtt a szeraptai mustárnövénynek (Brassica juncea L.), amikor alacsony koncentrációjú szalicilsav oldattal sprézték a növényeket (Fariduddin és mtsai, 2003). A szalicilsav exogén módon történő adagolása nem csak a növényre van jó hatással, hanem meg is védheti különböző stresszek ellen a növényt a megfelelő koncentrációjú és módon alkalmazott oldat. Hussein és munkatársai (2007) cserepes kísérletükben szalicilsav oldattal sprézték a kukorica növények leveleit, majd Földközi tengervízzel locsolták és azt tapasztaták, hogy a megnőtt a terméshozama a növényeknek és a növekedési karakterisztikája is megnőtt. Vagyis a sóstressz okozta degradációt a szalicilsav megfelelő adagolása nagymértékben enyhítette. Mind a magáztatás és mind a spré technika is megnövelte a termékenységét a búzának (Hayat és mtsai, 2005) és a repcének is (Brassica napus L.) (Ghai és mtsai, 2002). Szalicilsav oldattal kezeltek borsó levelet és azt tapasztalták, hogy 20-30%-kal kevesebb volt az Erysiphe pisi gomba fertőzése a kezeletlen levelekhez képest. Azt is megállapították, hogy a 0,15 mm koncentráció hatástalan maradt, míg a 15 mm koncentráció pedig már toxikus és a leghatékonyabb az 1,5 mm szalicilsav oldat alkalmazása volt, mely szisztematikus ellenállást tudott indukálni a borsó levelén (Frfy és Carver, 1998). Szója növények hajtásai és levelét különböző koncentrációs szalicilsav oldatba áztatták, hogy a különböző koncentrációs oldatok hatékonyságát vizsgálják. Azt tapasztalták, hogy egy szűk intervallumú koncentrációnak (0,5 mm) van pozitív hatása, annál kisebb és nagyobb viszont már negatívan hat a levél és hajtás növekedésére (Lian és mtsai, 2000). Ctenanthe setosa levelét 25 nap növekedés után szalicilsav oldattal kezelték, szárazság stressz során és vizsgálták az enzimatikus és a nem enzimatikus antioxidáns rendszer bizonyos elemeit, a ROS komponenseit és a lipidperoxidációt is. Azt tapasztalták, hogy a kontrol levelekhez képest a szalicilsav indukálta az antioxidáns rendszer elemeit, bár a ROS koncentrációja megemelkedett, míg a lipid peroxidáció mértéke alacsonyabb volt a hosszú ideig tartó szárazság során. Mérték továbbá az endogén szalicilsav szintjét is és azt tapasztalták, hogy a kezelést követő 10 napon belül vett mintáknál kis mértékben megnövekedett az endogén szalicilsav szintje a kontrolhoz képest (Kadioglu és mtsai, 2011). Közönséges bab (Phaseolus vulgaris L.) magokat alacsony koncentrációjú (0,1 mm) szalicilsav oldatba áztattak, majd csíráztatták és mérték szárazság toleranciáját (NaCl kezeléssel), a hajtáshosszt és az ozmoprotektáns molekulák mennyiségét a fiatal növényeken. Azt tapasztalták, hogy a magáztatás növelte a tolerancia mértékét, a csírázási százalékát és az ozmoprotektánsok molekulák koncentrációját is és az antioxidánsok aktivitását is a 19

27 kontrolhoz képest (Semida és Rady, 2014). Paradicsom növényeket 1 mm-os szalicilsavas hidropónikus kultúrában neveltek, majd mérték a sztóma záródást, a maximális CO2 fixáció arányát és a fotoszintetikus kvantum hatékonyságot is. Azt tapasztaták, hogy a szalicilsavas hidropónikus kezelés csökkentette a sztómák záródását és a fotoszintetikus kvantum hatékonyságot, ami a növény halálhoz is vezetett. De ha alacsonyabb szalicilsav koncentrációt alkalmaztak, 0,1 mm-t, akkor a paradicsom akklimálta és ellenállóbbá tette a NaCl-os szárazságstressz tolerálásban a megnövekedett maximális CO2 fixációs aránnyal és a belső CO2 koncentrációval (Poór és mtsai, 2010). Kukorica növények magjait alacsony koncentrációs (20 és 40 mg/l) szalicilsav oldatba áztatták 24 órára, majd kiszárították a magokat a kiindulási tömegig és elültették őket üvegházi körülmények közé. Azt tapasztalták, hogy a szalicilsavval előkezelt növények gyorsabban nőnek és az előkezelés megnövelte az antioxidáns rendszer aktivitását is (Ahmad és mtsai, 2012.). Fagytoleráns kukorica magokat szalicilsav oldatba áztattak 24 órára, majd csíráztatták őket. A szalicilsav bár a csírázási százalékot nem változtatta meg szignifikánsan, de megnövelte a növények hajtáshosszát, gyökérhosszát, a gyökér és hajtás száraztömegét is fagystressz során is. Viszont amikor hidropónikusan kezelték a növényeket szalicilsavval, akkor szignifikánsan megnőtt a gyökérben és levélben a lipidperoxidáció mértéke, a hidrogénproxid és szuperoxid gyökök mennyisége a fagystressz során, valamint a fotoszintetikus pigmentek koncentrációja, vagyis a klorofill a és klorofill b mennyisége is. Összességében a szalicilsavas kezelés megnövelte a fagystressz toleranciáját a növényben (Wang és mtsai, 2012). Búza növényeket kadmiumos tápoldatban neveltek 56 napon keresztül, előtte magáztatták szalicilsav oldatba és mérték az enzimatikus antioxidáns rendszer komponensei közül a katalázt, peroxiázokat és szuperoxid dizmutázt, a relatív víztartalmat, prolin koncentrációját, membránkárosodás mértékét és a kadmium tartalmat is. Azt tapasztalták, hogy az előkezelés csillapította a kadmium okozta negatív hatásokat az antioxidáns rendszer elemeiben, de a markáns változásokat okozott prolin koncentrációjában és a membránkárosodás mértékében is (Agami és Mohamed, 2013). Habár az exogén szalicilsav kezelés a több növénytípus esetén eustressz okozott, azért az eredmények nem egyértelműek minden esetben. Az exogén kezelés hatására az endogén szalicilsav indukálódott ami megnövelte a fitotoxikus tüneteket ólom és kadmium stressz során arabidopsziszban (Tao és mtsai, 2003). 20

28 2.3. Flavonoidok A flavonoidokat már 1664-ben Robert Boyle felfedezte, mint savas-bázikus pigmentek, de a 20. századig kellett várni, hogy le tudják írni a szerkezetüket, szabályzó génjeiket, kémiai aktivitásukat és bioszintézis útjukat. Nevük a latin flavus, sárga szóból származik, mert vizes kivonatuk sárga, melyet már régen is használtak a textilek festére. A flavonoidokat szerkezetük alapján sorolhatjuk be különböző csoportokba. Az alapvető vázuk difenil-propán (C6-C3-C6), de O-heterociklusosak vagy nyílt láncúak is lehetnek. A neoflavonoidok, izoflavonoidok, flavonoidok egymás izomerjei mint ahogyan az az alábbi ábrán is látszik (lásd 4. ábra) a B gyűrű helyzetében van csak változás. A flavonoidokat további csoportokba sorolhatjuk az alapján, hogy a szén atomjuk között van-e kettőskötés, hogy a 4.-es szénatomon van-e kettőskötésű oxigén illetve, hogy a 3. szénatomon van-e hidroxilcsoport. Ezek alapján megkülönböztetünk flavonokat, flavonolokat, flavanolokat, flavanonokat, katechineket, antocianidineket, leukoantocianidinek, proantocianidineket (csersavak). Az izoflavonoidokat is több csoportba sorolhatjuk, az izoflavonok és izoflavanonokba, míg a neoflavonoidok mesterségesen előállított anyagok (Winkel-Shirley, 2001). A flavonoidok antioxidáns vegyületek, melyek bioszintézis szintén a fenilpropanoid útvonalból indul ki, mint a szalicilsav is. Közös prekurzoruk a szalicilsavval a fahéjsav, így annak a mennyiségét fontos nyomonkövetni. A flavonoidok antioxidánsok, növényekben nagy mennyiségben előfordulnak. A flavonoidok elhelyezkedése a növény részeiben nagyon változó, hiszen akkumulálódhatnak a növény felszíni sejteiben is és a belsőbb sejtjeiben is. A felszíni sejtekben akkumulálódo flavonoidok jobb UV-B abszorbensek. Az UV-B sugárzás hatására bizonyos antioxidáns enzimek inaktiválódhatnak, de bizonyos flavonoidok bioszintézise kifejezetettebbé válik arabidpsisban (Landry és mtsai, 1995). 21

29 4.ábra. Flavonoidok főbb csoportjai (Heim és mtsai, 2002) A flavonoidok bioszintézise A flavonoidok bioszintézise a fenilpropanoid útvonal része, illetve abból indul ki (lásd 5. ábra). A fenilalanint a fenilalanin amóniumliáz (PAL) enzim alakítja át transz-fahéjsavvá, mint a már említett szalicilsav bioszintézise során is (lásd a fejezetben, a 3. ábrán). A két bioszintézis közös pontja a fahéjsav. A flavonoidok bioszintézisének következő lépéseként a fahéjsav 4-hidroxiláz (C4H) enzim alakítja át a fahéjsavat hidroxifahéjsavvá vagy parakumár savvá, amit a 4-kumár sav koenzim-a (CoA) ligáz a CoA rákapcsolásával alakít tovább para-kumaril-coa-vá. Ezután a kalkon-szintáz enzim (CHS) malonil-co-a felhasználásával, melyet az acetil-co-a-ból acetil-co-a karboxiláz enzim karboxilál malonil- Co-A-vá, szintetizál naringenin kalkonná. Amit a kalkon izomeráz (CHI) enzim izomerizál naringeninné. A naringenint az flavon-3-hidroxiláz (F3H) a 3-as pozicióban levő szén atomra hidroxil csoportot kapcsol, ezzel hidrolizálja dihidrokaemferollá. A dihidrokaemferolt vagy a flavonszintáz (FLS) útján kamferollá szintetizálódik, úgy, hogy a 2-3-as pozicióban levő szén atomok között kialakítja a kettős kötést, így stabilizálja a molekula szerkezetét vagy a flavonoid 3 -hidroxiláz enzim (F3 H) 3 -as pozicióban levő szén atomra hidroxil csoportot kapcsol, ezzel tovább hidroxilálja azt dihidroquercetinné. A kaempferolt az F3 H enzim hidroxilálhatja tovább quercetinné, ami a dihidroquercetinből FLS enzim útján szintetizálódhat. A dihidroquercetin a flavonoid 3 5 -hidroxiláz (F5 H) enzim útján dihidromiricetinné hidrolizálódhat, vagyis az 5 pozicióban levő szénatomra kapcsol hidroxil 22

30 csoportot, amiből az FLS enzim szintetizálja a miricetint, ami hidrolizálódhat quercetinből F5 H enzim útján is. A quercetin nem csak miricetin szintetizálódhat, hanem egy flavonol 3- O-glükoziltranszferáz (F3-O-GT) enzim glükolizálja a 3-as helyen levő oxigénen keresztül kötve a glükóz molekulát a quercetinhez, így kialakítva az izoquercetint, mely egy olyan flavonoid, melyhez már cukor mulekula kapcsolódott. Az izoquercetint a flavonol 3-Oglükozid L-ramnozil transzferáz (3-O-GRT) enzim további cukrot, ramnóz molekulát rákapcsolva az glükóz 6-os szénatomján levő oxigénjére, kialakítja a rutint (Saito és mtsai, 2013). 23

31 24

32 5. ábra A flavonoidok bioszintézise, PAL: fenilalanin amóniumliáz, C4H: fahéjsav 4- hidroxiláz, 4CL: 4-kumár sav koenzim-a ligáz, CoA: koenzim-a, CHS: kalkon-szintáz enzim, ACC: acetil-co-a karboxiláz enzim, CHI: kalkon izomeráz, F3H: flavon-3-hidroxiláz, FLS: flavonszintáz, F3 H: flavonoid 3 -hidroxiláz, F5 H: flavonoid 3 5 -hidroxiláz, F3-O-GT: flavonol 3-O-glükoziltranszferáz, 3-O-GRT: flavonol 3-O-glükozid L-ramnozil transzferáz Flavonoidok biofunkciója A flavonoidok biológiai funkciójuk nagyon szerteágazó, hiszen közel 4000 molekulát magába foglal ez az anyagcsoport. A leglátványosabb komponensei az antocianidinek, melyek a növényvilág pigmentjei. A pigmentek színe a ph hatására változik. Az elmúlt években már a virágok színét is befolyásolhatjuk, köszönhetően a szekunder metabólitok jobb megismerésének, melyek alapján az antocianidinek B gyűrűjén levő végbe menő hidroxilációt is jobban ismerjük. A rózsaszínból pirosba való átalakulásért a P450 enzim felel, míg a vörösből narancssárgában való átmenetet a pelargonidin alapú komponensek esetén az F3 H enzim irányítja (Winkel-Shirley, 2001). A flavonoidok lehetnek szignál molekulák ( Peer és Murphy, 2006), phytoalexinek (McNally és mtsai, 2003), detoxifikáló komponensek (Michalak, 2006), UV-szűrűk (Lanot és Morris, 2005) és segíthetik a hőmérséklet akklimációt (Kaplan és mtsai, 2004) és a szárazság ellenállást (Hernandez és mtsai, 2004 ) is. Az abiotikus környezeti stresszek hatására a növényekben a flavonoidok akkumulációja megnő (Dixon és Paiva, 1995). Arabidopsisban olyan környezeti stresszorok esetén is mérhetően megnő, mint a fény, az UV és a szárazság is (Nakabayashi és mtsai, 2014). Vannak effektive antioxidáns hatású flavonoidok, mint a kevercetin, de vannak kevésbé effektív, vagyis szegény antioxidáns hatású flavonoidok, mint a keampferol. Ezeke aránya szignifikánsan megnő, ha nagy fény hatás éri a növény levelét (Pollastri és Tattini, 2011). Arabidpsisiban a kaempferol és kvercetin-glükozid magas fényintenzitás hatására megnövekszik (Lillo és mtsai, 2008), de a kvercetin-glükozid mennyiségének növekedése nemcsak itt figyelhető meg, hanem a Ligustrum vulgare (Agati és mtsia, 2011) növényekben is. A ROS képződésében a fény fontos szerepet játszik, így a növény akkumulálja a flavonoidokat, ami arra enged következtetni, hogy a flavonoidok képesek a ROS hatását csökkenteni. (Tattini és mtsai, 2004). A flavonoid molekulák antioxidáns tulajdonsága a szerkezetükből is levezethető, hiszen van difenol csoport a molekulában, a B gyűrűn, 25

33 kettőskötés is található benne szénatomok között és vannak hidroxil csoportok is Ezek a feltételek összefüggésben állnak az antioxidáns tulajdonsággal (Samanta és mtsai, 2011). Az általunk mért flavonoid komponensek közül a flavonolok csoportjában tartozik a kvercetin, kaemferol és miricetin és a glükoflavonolok közé tartozik a rutin. Kvercetint legnagyobb koncentrációban amerikai festőtölgy kérgében, de a komlóban, galagonyában és kukoricában is előfordul. A kvercetin glükozidja rutinózzal a rutin, melynek a hajszálerek permeábilitására van hatással. A rutint Szent-Györgyi Albert P-vitaminnak nevezte, de manapság már nem sorolják a vitaminok közé (Furka, 1998). A flavonoidok a hirogén-peroxiddal szemben antioxidánként viselkednek (Yamasaki és mtsai, 1997), de nem csak antioxidánsként tudnak fellépni, hanem a szerkezetüktől függően detoxifikáló komponensként, vagyis kelatálják a fémionokat is. Alternaria alternata esetén a kvercetin és a morin hatékonyabban tudja kelatálni a rézmolekulákat, mint a rutin. Kallus kultúrában a mezei iglice (Ononis arvensis L.) növényben a flavonoidok akkumulálódtak rézszulfát és kadmiumklorid hatására (Keilig és Muller, 2009). Vizsgálták, hogy a kvercetin és kaempferol a sejteben képes-e a hidrogén-peroxidot semlegesíteni. Azt tapasztalták, hogy a kvercetin hatékonyabb a kaempferolnál és kvercetin-glükozidja is hatékonyabb antioxidáns mint a kaempferol-glüközid (Yamakasi és mtsai, 1997). Polifenolokban gazdag lágyszárú növényeket vizsgáltak és azt tapasztalták, hogy a Bidens alba növényben magas a miricetin, a Houttuynia cordata növényben a magas a kvercetin és a Centella asiatica növényben pedig magas a kaempferol mennyisége. Azt találták, hogy a kvercetin előzi meg a leghatékonyabban a peroxidációt és a DNS oxidatív károsodását a flavonidok közül (Lin és mtsai, 2013). A flavonoidok akkumulációja in vivo csillapítja a ROS hatását oxidatív és szárazságstressz során és az antocianidinek in vitro antioxidánsok (Nakabayashi és mtsai, 2014) arabidpsisban. 26

34 3. Kutatási célok Már korábban ismert volt, hogy a szalicilsavas (SA) kezelésnek védő hatása van különböző biotikus és abiotikus stresszek ellen. Ezeket a kísérleteket különböző növényfajokon és különböző kezelési módokkal végezték, de arról nincs információ, hogy a különböző kezelések hatásmechanizmusa mennyiben hasonló, és mennyiben tér el. Célul tűztük ki, hogy összehasonlítsuk, hogy a különböző kezelési formák hogyan hatnak az növény anyagcseréjére, és azt is, hogy a SA különböző formái milyen védekezési reakciókat indítanak be stresszkörülmények között. Ehhez a következő kérdések megválaszolását terveztük: Az első lépésben, arra kerestünk választ, hogy van-e különbség a magvak SA-as áztatása és a hidropónikus kezelés hatása között? Ha igen, akkor ez milyen életképességi paraméterekben nyilvánul meg, valamint a különböző SA kezelések hogyan befolyásolják a különböző SA bioszintézis utakat és a köztes termékek szintetizációját? Kérdés továbbá, hogy hogyan alakul a szintén fenilpropanoid szintézisúton szintetizálódó, antioxidáns védővegyületek, a flavonolok mennyisége a különböző SA kezelések hatására? A következő lépésben arra keresünk választ, hogy a SA és annak sója a nátrium-szalicilát (NaSA) azonos védelmet nyújt-e a növénynek Cd stressz során? Van-e különbség az egyes, a növények állapotának jellemzéséhez használt életképességi paraméterek, valamint az antioxidáns enzimek aktivitásában bekövetkezett változásokban? A nehézfémek indukálják a fitokelatinok (PC) bioszintézisét, ezért azt is tanulmányoztuk, hogyan hat a kétféle SA-forma a PC-ok bioszintézisére? 27

35 4. Anyagok és módszerek 4.1. A növényi anyagok A vizsgálathoz búza (Triticum aestivum L. var Mv Emese) növényeket használtunk. Az Mv Emese martonvásári őszi búza fajta. A másik vizsgálathoz kukorica (Zea mays L. Norma hibrid) növényt használtunk Búza növények magáztatásos és tápoldatban kezeléses kísérletének leírása A csíráztatáshoz a búzaszemeket nedves szűrőpapírra tettük, sötétben csíráztattuk 3 napig C-on. Csíráztatás után a növényeket főzőpohárban (12 növény/pohár) neveltük 250 ml módosított Hoagland-tápoldaton (összetétele az 1. táblázatban található), melyet 2 naponta cseréltünk. A növénynevelés 340 mol m -2 s -1 PPFD fényintenzitást, 75%-os páratartalmat, 20/18 C-os hőmérsékletet és 16/8 órás fény-sötét periódust biztosító Conviron PGR-15 típusú (Controlled Environments Ltd, Winnipeg, Kanada) növénynevelő kamrában történt 7 napos korig. 1. táblázat A növényneveléshez használt tápoldat összetétele. Makroelem összetétel: Mikroelem összetétel: 0,3125 mm KNO3 11,92 µm HBO3 0,45 mm Ca(NO3)2 4,57 µm MnCl2 4H2O 0,0625 mm KH2PO4 0,191 µm ZnSO4 7H2O 0,125 mm MgSO4 7H2O 0,08 µm CuSO4 5H2O 0,024 µm (NH4)6Mo7O24 4H2O 15,02 µm FeSO4 7H2O 23,04 µm Na2EDTA 5H2O A növények egyharmadát magként 0,5 mm szalicilsav oldatba áztattuk 8 órán keresztül, míg a maradékot ioncserélt vízbe áztattuk be. Az áztatás után ioncserélt vízzel átöblítettük a magokat és nedves szűrőpapíron csíráztattuk, majd tápoldaton neveltük 7 napig. Az ioncserélt vízbe áztatott növények fele 0,5 mm SA tartalmú tápoldatot kapott 7 napos 28

36 korában 1 napon keresztül, ekkor levél és gyökér mintákat szedtünk mind az SA oldatban áztatott (SAss1N), mind a SA tartalmú tápoldattal kezelt (SAh1N) növényekből. Hogy regenerálódjanak 7 napig ismét SA mentes tápoldaton neveltük a növényeket, mind a magáztatott, majd mind a hidropónikusan kezelt növényekből újra mintát szedtünk (SAss7N és SAh7N) Kukorica növények nevelése és a különböző SA formák tanulmányozása A csíráztatáshoz a kukoricaszemeket 30 percig 0,5%-os Neomagnol oldatba áztattuk fertőtlenítés céljából, majd nedves szűrőpapíron, sötétben csíráztattuk 3 napig C-on. A növényeket az előcsíráztatás után főzőpohárba (6 növény/ pohár) ültettük és ugyanolyan tápoldatban neveltük, mint a búzanövényeket (1. táblázat). A növénynevelés 340 mol m -2 s -1 PPFD fényintenzitáson, 75%-os páratartalmon, 22/20 C-os hőmérsékleten és 16/8 órás fénysötét periódussal történt, Conviron PGR-15 növénynevelő kamrában a csiranövények 7 napos koráig. A 7 napos kukorica növények egy részét 0,5 mm SA (SAek) vagy 0,5 mm NaSA-t (NaSAek) tartalmazó tápoldattal 1 napon keresztül előkezeltük. Ezt követően a gyökerek lemosása után az előkezelt növények fele 1 napig 0,5 mm Cd(NO3)2 tartalmú tápoldatot kapott. A még kezeletlen növények egy részét pedig együtt adva 0,5 mm SA és 0,5 mm Cd(NO3)2 (SA+Cd) tartalmú tápoldattal illetve 0,5 mm NaSA és 0,5 mm Cd(NO3)2 (NaSA+Cd) tartalmú tápoldattal kezeltük 1 napig. A maradék kezeletlen növényeket a kontroll elkülönítése után 0,5 mm Cd(NO3)2 tartalmú tápoldattal kezeltük 1 napon keresztül. Mind az egymást követő kezelésekből, mind az együtt adott kezelésekből, továbbá a kontroll növényekből és a kadmiummal kezelt növényekből is levél és gyökér mintákat is szedtünk Életképesség mérése Ionkiáramlás mérése Az 1 és 2 hetes búza növények leveléből középmagasságban 5 darab 1 cm-es darabot, míg a kukorica növények teljesen kifejlett 2-3. leveleiből 5 darab 1 cm átmérőjű korongot vágtunk és 2 ml ultratiszta vizet tartalmazó, zárható üvegedényben rázattuk 1 órán keresztül. A víz konduktivitását Automata Seed Analyzer berendezéssel (ASA610, Agro Science Inc. USA) megmértük, majd a levéldarabokra visszapipettáztuk a vizet és -80 C-on roncsoltuk a 29

37 membránokat egy éjszakán át. Másnap kiolvasztottuk és újra megmértük a víz vezetőképességét szobahőmérsékleten (Simon, 1974., Gondor és mtsai, 2013). Az ultratiszta vizet desztillált vízből Milli-Q 50 (Millipore, USA) berendezéssel állítottuk elő. A membrán károsodás mértékének számításakor az első mért érték a membránkárosodás aránya a második, 100%-hoz képest Gyökér életképesség vizsgálata 2,3,5-trifenil-tetrazolium-kloriddal A kukorica gyökereket átmostuk 0,5 % (w/v) EDTA oldattal, majd ioncserélt és ultratiszta vízzel is, hogy megszabaduljunk a nyomnyi szennyező ionoktól. Utána 0,1 g gyökérmintát 3 ml 0,6 %-os (w/v) 2,3,5-trifenil-tetrazolium-klorid (TTC) oldatba (50 mm foszfát-puffer, ph 7,5) zárható üvegfiolába és sötétbe helyeztünk 1 napra. Az idő letelte után 3 ml etanolban 60 C-on 30 perces inkubálással extraháltuk a keletkezett piros vegyületet (Steponkus és Lanphear, 1967 és Gondor és mtsai, 2013) és az abszorbanciát 485 nm-en mértük UV-160A spektrofotométerrel (Shimadzu, Japan). A keletkező vegyület, 1,3,5-trifenilformazan (TPF), mely a TTC redukált tetrazolium sója, piros színű a TTC-vel ellentétben, mely színtelen, vízoldható vegyület. Az enzimatikus redukció során TPF képződik, mely jó indikátora és mennyiségi mutatója is az élő szövetnek. A piros színű formazan lipidoldékony, ezért etanolban mértük Gyökér életképesség vizsgálata nitroblue-tetrazolium-kloriddal A búza gyökérzetén a TTC-s életképesség vizsgálata nem volt célravezető, így másik módszert alkalmaztunk, melyet immunológiai szövetfestéshez már rutinnal alkalmaznak. A nitroblue-tetrazolium-klorid (NBT) egy sárga kristályos por, mely vízben jól oldódik. Immunológiában és spektrofotometrikai mérésekben is használatos, hiszen a redukált NBT színes és etanolban jól oldódik. Az abszorbancia maximuma 510 nm-en van. A búza gyökereket átmostuk 0,5 % (w/v) EDTA oldattal, majd ioncserélt és ultratiszta vízzel is, hogy megszabaduljunk a nyomnyi szennyező ionoktól. A gyökérből 0,05 g mennyiségeket mértünk ki, majd 100 µl 0,1 vegyes %-os forró NBT oldatot, 50 µl 0,05M forró Na2-succinát oldatot, 50 µl 0,05 mm Tris-HCl oldatot, 50 µl 0,5 mm MgCl2 oldatot és 50 µl foszfát puffert (ph 7,3) adtunk rá (Fusconi et al, 2007; Kulikova et al, 2011). Szobahőmérsékleten rázattuk 200 percig, majd lemostuk a gyökereket. Az extrakciót 1 ml etanollal végeztük és mértük az oldat abszorbanciáját 510 nm-en (Gondor és mtsai, 2013) UV-160A spektrofotométerrel (Shimadzu, Japan). 30

38 4.3. Lipidperoxidáció meghatározása A lipidperoxidáció meghatározása a malondialdehid (MDA) tartalom mérésén alapszik. Az előkészítés során 0,2 g növényi mintát dörzsmozsárban 900 l 0,1%-os (w/v) triklór-ecetsavval (TCA) eldörzsöltünk, majd g-vel 10 percig centrifugáltuk. A felülúszó 450 l-éhez 2 ml 0,5% (w/v) tiobarbitursavat (TBA) tartalmazó 20%-os (w/v) TCAt adtunk és az elegyet 90 C-on 30 percig inkubáltuk. Az MDA tartalom meghatározása spektrofotometriásan, 532 nm-en történt, a 600 nm-en mért nem specifikus abszorpció figyelembevételével. A lipidperoxidok koncentrációját az MDA tartalomból a 155 mm -1 cm -1 extinkciós koefficiens segítségével számoltuk ki, és pmol g -1 friss tömegben adtuk meg (Thomas és mtsai, 2004) Klorofilltartalom mérése A kukoricanövények klorofilltartalmát a mintavétel előtt mértük, a levélből.a teljes klorofilltartalom meghatározásához SPAD-502 klorofillmérő (Minolta Camera Co., Ltd, Tokyo, Japan) műszert használtunk. A mérés alapját a levélen áthaladt infravörös és vörös fény erősségének aránya képezi. Ez az arány annál nagyobb, minél több vörös fény nyelődik el a levélben, ami szoros összefüggést mutat a klorofilltartalommal. A SPAD-érték 0-tól 100 feletti értékig terjedhet Antioxidáns enzimek kivonása és aktivitásuk mérése Antioxidáns enzimek izolálása és fehérje tartalmának meghatározása Az antioxidáns enzimek izolálásához 0,5 g növényi mintát 2,5 ml izoláló pufferrel, vagyis 1mM Na2EDTA-t, 3 mm MgCl2-t tartalmazó 0,5 mm Tris-HCl (ph=7,5) oldattal homogenizáltuk, kevés kvarchomok jelenlétében. A növényi extraktumot 20 percen keresztül 4 C-os centrifugában g-vel centrifugáltuk, majd a felülúszóval dolgoztunk tovább. 31

39 A fehérje meghatározást Bradford reagenssel (BioRad) végeztük (Bradford, 1976), 595 nm hullámhosszon fotometriásan mértük az abszorbanciát. A kalibrációs egyenest borjú szérum albuminnal (BSA) vettük fel. Az enzimek aktivitását a glutation-reduktáz kivételével -20 C-on fagyasztott izolátumból határoztuk meg, UV-160A spektrofotométerrel (Shimadzu, Japan), szobahőmérsékleten. Az enzimek aktivitását 1 g fehérjére vonatkoztatva 1 perces kinetikát, moláris tömeget és az oldatok extinciós koefficiensét figyelembe véve adtuk meg (nkat g -1 fehérje) Aszkorbát peroxidáz (EC ) Az aszkorbát-peroxidáz aktivitását a következő összetételű reakcióelegyben mértük: 0,2 M TRIS puffer (ph 7,8), 5,625 mm aszkorbinsav és 0,042% H2O2. A reakcióelegy 2,25 ml volt, mely 50 l mintát tartalmazott. A reakciót H2O2 hozzáadásával indítottuk. Az aszkorbinsav fogyását 290 nm-en követtük nyomon (Janda és mtsai, 1999) Gvajakol-peroxidáz (EC ) A gvajakol oxidációja nyomán bekövetkező abszorbancia növekedést 470 nm-en spektrofotométerrel nyomon követve mértük (Ádám és mtsai, 1995), H2O2 oldattal indítva a reakciót. A 3 ml reakcióelegy összetétele a következő volt: 88 mm Na-acetát puffer (ph 5,5), 0,88 mm gvajakol, 0,0375% H2O2 és 50 l növényi minta Kataláz (EC ) A fagyasztás utáni enzim izolátum aktivitását úgy mértük, hogy 50 l növényi mintát tettünk Tris-pufferbe (0,44 mm, ph=7,4) H2O2 hozzáadásával indítottuk el. Majd 240 nm hullámhosszon, a H2O2 (0,0375%) fogyásának kinetikáját követtük, (Janda és mtsai, 1999) mértük Glutation-reduktáz enzim aktivitásának mérése (EC ) Az enzim aktivitását foszfát pufferben (0,1 M ph=7,5) dietiléntriamin-pentaecesav (DTPA, 0,2 mm), oxidált glutation (GSSG, 1mM) és 1 mm NADPH jelenlétében mértük. Az enzim általi 5,5 -ditio-bis-(2-nitro-benzoesav) (DTNB) redukciót mértük 412 nm-en a Smith és mtsai (1988) által leírtak szerint, a növényi minta (50 µl) hozzáadásával indítottuk a redukciót. 32

40 Glutation-S-transzferáz (EC ) Az enzim izolátumot foszfát pufferbe (0,1 M ph=6,5) tettük, mely redukált glutationt (2,6 mm) és 1-kloro-2,4-dinitrobenzént (CDNB, 1 mm) tartalmazott, és a növényi minta (100 µl) hozzáadásával indítottuk a reakciót. Az enzim által katalizált dinitrofenil-glutation képződését mértük 340 nm-en spektrofotometriásan Mannervik és Guthenberg (1981) módszere szerint Fotoszintetikus paraméterek mérése A klorofill-a fluoreszencia mérés A levelek klorofill-a fluoreszcencia indukciós paramétereit Imaging MAXI-PAM fluorméterrel (Walz, Effeltrich, Germany) mértük, 460 nm-s kék modulációs fény alkalmazásával. A levelek 15 perces sötétadaptálása után először meghatároztuk a levelek minimális fluoreszcencia értékét (F0), majd a maximális fluoreszcencia (Fm) mérése következett, amelynek gerjesztése 5000 µmol m -2 s -1 PAR értéket meghaladó 1,0 s időtartamú fehér fény felvillanásával történt. A mért paraméterekből meghatároztuk a II. fotokémiai rendszer (PS II) optimális kvantum hatásfokát (Fv/Fm), ahol Fv/Fm = (Fm-F0)/Fm (van Kooten és Snel 1990). Ezután a fotoszintetikus folyamatokat 300 mol m -2 s -1 fényintenzitású fénnyel indukáltuk 15 percen keresztül, és mértük az effektív quantumhatásfokot ( F/Fm ). A fluoreszcencia quenching paramétereket steady state állapotban adott 5000 µmol m -2 s -1 PAR fényintenzitású (1 s időtartamú) fehér fény felvillanás alkalmazásával határoztuk meg. A fluoreszcencia paramétereket van Kooten és Snel (1990), Genti és mtsai. 1989, valamint Kramer és mtsai nomenklatúrája alapján alkalmaztuk Fitokelatin-szintézis γ-glutamil-cisztein-szintáz enzim aktivitásának mérése 0,3 g levelet, illetve 0,5 g gyökeret 1,5 ml 0,1 M TRIS-HCl pufferben (ph 8.0), mely 5 mm EDTA-t és 10 mm MgCl2-ot tartalmazott eldörzsöltünk, majd 10 percig g-vel 33

41 centrifugáltuk. A felülúszó 650 µl-ét 5 ml Sephadex G-25 gélen sótalanítottuk. Az enzimaktivitás méréséhez a következő reakcióelegyet mértük össze: 50 µl 1000 mm HEPES- NaOH (4-(2-hidroxietil)-1-piperazin-etánszulfon) puffer (ph 8,0), mely 400 mm MgCl2-ot tartalmazott, 50 µl 300 mm Na-glutamát, 50 µl 16 mm cisztein és 8 mm 1,4-ditioeritritol (DTE) 1:1 arányú keveréke, 50 µl 70 mm adenozin-trifoszfát (ATP) és 50 µl víz. A reakcióelegyet 45 percig 37 C-on inkubáltuk, majd a reakcióelegy 50 µl-ét származékképeztük monobromo-bimánnal (10 µl 15 mm monobromo-bimán, 200 µl 50 mm 2-(ciklohexilamino)etánszulfonsav (CHES) (ph 9,0), 50 µl reakcióelegy, 15 perc szobahőmérsékleten sötétben). A reakciót 700 µl 5 %-os ecetsav hozzáadásával állítottuk le. A 0 perces mintához az inkubálás előtt kivettünk 50 µl-t a reakcióelegyből és származékképeztük. A kiindulási és keletkezett γ-glutamil-cisztein mennyiségét a pontban ismertetett HPLC-s módszerrel határoztuk meg. Az enzimaktivitást a kiindulási és a keletkezett γ-glutamil-cisztein mennyiségének különbsége alapján számoltuk (Hell és Bergmann, 1990) Glutation-szintetáz enzim aktivitásának mérése 0,3 g levelet illetve 0,5 g gyökeret 1,5 ml 0,1 M TRIS-HCl pufferben (ph 8.0), mely 5 mm EDTÁ-t és 10 mm MgCl2-ot tartalmazott eldörzsöltünk, majd 10 percig g-vel centrifugáltuk. A felülúszó 650 µl-ét 5 ml Sephadex G-25 gélen sótalanítottuk. Az enzimaktivitás méréséhez a következő reakcióelegyet mértük össze: 75 µl 600 mm Tris-HCl puffer (ph 8,4), mely 130 mm MgCl2-ot és 300 mm KCl-t tartalmazott, 15 µl 150 mm 1,4-ditioeritritol (DTE), 10 µl 100 mm glicin, 50 µl 5 mm -glutamil-cisztein, 50 µl 50 mm adenozin-trifoszfát (ATP), 50 µl 50 mm foszfoenolpiruvát (PEP), 50 µl 100 U/ml piruvát-kináz és 200 µl növényi extraktum. A reakcióelegyet 60 percig 37 C-on inkubáltuk, majd a reakcióelegy 25 µl-ét származékképeztük monobromo-bimánnal (20 µl 15 mm monobromo-bimán, 200 µl 50 mm 2-(ciklohexilamino)etánszulfonsav (CHES) (ph 9,0), 50 µl reakcióelegy, 15 perc szobahőmérsékleten sötétben). A reakciót 1000 µl 5%-os ecetsav hozzáadásával állítottuk le. A 0 perces mintához az inkubálás előtt kivettünk 25 µl-t a reakcióelegyből és származékképeztük. A kiindulási és keletkezett glutation mennyiségét a pontban ismertetett HPLC-s módszerrel határoztuk meg. Az enzimaktivitást a kiindulási és a keletkezett glutation mennyiségének különbsége alapján számoltuk (Hell és Bergmann, 1988). 34

42 Cisztein, γ-glutamil-cisztein és glutation meghatározása A redukált és oxidált tioltartalom meghatározáshoz 0,2 g növényi mintát 2 ml 1 mm Na2EDTA-t tartalmazó 0,1 M HCl oldatban homogenizáltuk (Kocsy és mtsai., 2004), majd 4 C-on centrifugáltuk g-vel 20 percen keresztül. Az össztioltartalom meghatározásához a felülúszó 120 l-éhez 180 l 0,2 M 2- (ciklohexilamino)etánszulfonsavat (CHES, ph 9,3) és 30 l 3 mm ditiotreitolt (DTT) adtunk. A reakcióelegyet szobahőmérsékleten 60 percig inkubáltuk, hogy a diszulfid hidak redukálódjanak. A származékképző szerként adtunk hozzá 20 l 15 mm monobromobimánt és sötétben, szobahőmérsékleten 15 percig inkubáltuk. A tiolcsoportok származékképzése ez idő alatt történt meg, majd a reakciót 350 l 0,25%-os (v/v) metánszulfonsavval leállítottuk. Az oxidált tioltartalom meghatározásához a felülúszó 400 l-éhez 30 l 50 mm N-etilmaleimidet (NEM) és 600 l 0,2 mm CHES puffert adtunk, hogy lekössük a szabad SH csoportokat. 15 percig szobahőmérsékleten inkubáltuk, majd 3x750 l toluollal extraháltuk, hogy eltávolítsuk a feleslegben maradt NEM-et. Ezután 300 l NEM-kezelt felülúszót DTTvel redukáltunk és monobromobimánnal származékképeztünk a fent leírt módon. A mintákat a HPLC analízis előtt 0,45 m pórusméretű teflon szűrőn membránszűrtük. A folyadékkromatográfiás méréshez Waters típusú HPLC-t (WATERS, Milford, MA, USA) használtunk, mely a következő részegységekből állt: W2690 pumparendszer, mely tartalmazott egy automata mintaadagolót, oszloptermosztátot és gradiens keverésre alkalmas pumparendszert és egy W474 scanning fluoreszcens detektort. A mérési adatok kiértékelése Millenium32 program (WATERS, Milford, MA, USA) segítségével történt. A mintákból 20 l-t injektáltunk a 10 m szemcseméretű, 250 x 4,6 mm méretű HyperPrep HS C18 oszlopra, mely elé egy HyperPrep HS BD C18 10x4 mm-es előtétoszlopot csatalkoztattunk. A mérés során az alábbi szolvenseket használtuk: A: 90% víz, 10% metanol (MeOH), 0,25% ecetsav (ph 3,9) B: 90% MeOH, 10% víz, 0,25% ecetsav. Az elválasztás a 2. táblázatban található gradiens programmal történt. Az áramlási sebesség az analízis során 1 ml/perc, az oszlophőmérséklet 30 C volt. 35

43 2. táblázat A cisztein, γ-glutamilcisztein és glutation HPLC analízise során használt gradiens program. Idő (perc) A% B% , , , A származékképzett minták detektálása fluoreszcens detektorral 380 nm-es gerjesztési és 480 nm-es kisugárzási hullámhosszon történt Fitokelatinok és fitokelatin-szintáz aktivitásának mérése A 750 mg növényi mintát kvarchomokkal dörzsmozsárban 750 l 50 mm TRIS (ph 8,0) pufferrel, mely 10 mm -merkaptoetanolt és 14% (v/v) glicerolt tartalmazott, homogenizáltuk. Eppendorf centrifugában g-vel 10 percig centrifugáltuk a homogenizátumot, majd az aktivitásméréshez a felülúszót használtuk. A fitokelatin-szintáz aktivitását Chen és mtsai (1997) által leírt módszerrel végeztük. A 300 l végtérfogatú reakcióelegy összetétele a következő volt: 100 µl 200 mm TRIS-puffer (ph 8,0), ami 10 mm -merkaptoetanolt, 10 mm GSH-t, és 0,5 mm Cd(NO3)2 ot, valamint 200 l növényi mintát tartalmazott. A reakciót a növényi minta hozzáadásával indítottuk és 60 percig 35 C-on inkubáltuk. A reakció leállításához 30 l 50%-os 5-szulfoSA-at használtunk, majd 10 percig jégen inkubáltuk. A 0. perces mintákhoz, mely az in vivo fitokelatinokat tartalmazták a reakcióelegyhez inkubáció nélkül rögtön hozzáadtuk a 30 µl 50%-os 5-szulfoSA-at. A kicsapodott fehérjéket 5 perces g-vel való centrifugálással távolítottuk el és a felülúszót használtuk a HPLC analízishez. 36

44 A folyadékkromatográfiás méréshez Waters típusú HPLC-t (WATERS, Milford, MA, USA) használtunk, mely a következő részegységekből állt: W2690 pumparendszer, (mely tartalmazott egy automata mintaadagolót, oszloptermosztátot és gradiens keverésre alkalmas pumparendszert), egy darab W 501 pumpa (a származékképzéshez) és egy diódasoros UV/VIS detektor (W996). A mérési adatok kiértékelése Millenium32 program (WATERS, Milford, MA, USA) segítségével történt. A mintából 100 l-t injektáltunk a fordított fázisú, 5 m szemcseméretű, 100 x 2,1 mm méretű Hypersil ODS analitikai oszlopra. A mérés során az alábbi szolvenseket használtuk: A: víz, 0,1% trifluor-ecetsav (TFA) B: víz, 20% acetonitril (ACN), 0,1% TFA Az elválasztás a 3. táblázatban található gradiens programmal történt. Az áramlási sebesség az analízis során 0,5 ml/perc, az oszlophőmérséklet 25 C, a mintatér hőmérséklete 6 C volt. A fitokelatinok mennyiségi meghatározása post-column származékképzéssel történt, a következő összetételű Ellman-reagenssel: 50 mm Na-foszfát puffer (ph 8), 10% ACN és 74,5 M DTNB. A reagens áramlási sebessége 1,5 ml/perc volt. A reagens és a minta egy 20 cm hosszú és 1 mm átmérőjű tefloncsőben keveredett. A származékképzés után az elegy abszorbanciáját 410 nm-en mértük az UV/VIS detektorral. 3. táblázat A fitokelatinok HPLC analízise során használt gradiens program. Idő (perc) A% B% , ,

45 A 2 -Glu-Cys dipeptid egységet tartalmazó fitokelatinok [PC2; ( -Glu-Cys)2-Gly] koncentrációját a GSH-ra felvett kalibrációs görbe segítségével határoztuk meg. A képződött fitokelatinok mennyiségét a 60 percig inkubált és a 0. perces mintákban levő fitokelatinok különbsége adja. A fitokelatin-szintáz specifikus aktivitását a képződött PC nmól mg -1 fehérje min -1 egységre adtuk meg. A minták fehérjetartalmát a pont alatt leírt módszerrel mértük Szalicilsav szintézisben jelen levő vegyületek és flavonoidok extrahálása és mennyiségi meghatározása A szalicilsav HPLC-s analízisét Meuwly és Métraux (1993) által leírt módszer szerint végeztük, mellyel többek között a benzoesavat (BA), fahéjsavat (CA), orto-hidroxi-fahéjsavat (ohca), szalicilsavat (SA) és a flavonoidok közül, a rutint (R), miricetint (M), kaempferolt (K) és quercetint (Q) határoztuk meg. A 0,5 g növényi mintát folyékony nitrogénben, 0,25 g kvarchomok hozzáadásával dörzsmozsárban eldörzsöltük. A homogenátumot centrifugacsövekbe öntöttük és 2 ml 70%-os metanolt adtunk hozzá, mely 250 ng ortoanizinsavat (o-ani: belső standerdként használva) és 25 g para-hidroxi-benzoesavat (p- HBA: extrakciós karrierként használva) tartalmazott. Az extraktumot g-vel 20 percig centrifugáltuk. A felülúszót félretettük, 2 ml 90%-os metanollal a csapadékot újra extraháltuk, majd utána g-vel 20 percig centrifugáltuk. Az így képződött felülúszót az előzőekben félretetthez öntöttük. Ezzel az eljárással a növényben lévő szabad vegyületeket illetve a kötöttek közül a metanolban oldódókat lehet kinyerni. Az összegyűjtött felúszókat vákuumbepárlóban vizes fázisig bepároltunk, majd 1 ml 5%-os (w/v) TCA-t mértünk hozzájuk. Vortexelést követően g-vel 10 percig centrifugáltuk. A felülúszókat 3,6 ml ciklohexán: etilacetát = 1:1 (v/v) elegyével extraháltuk. A felső szerves fázis a szabad fenolos vegyületeket, míg az alsó vizes fázis a metanolban oldódó kötött fenolos vegyületeket tartalmazta. A felső szerves fázist Pasteur pipettával üvegfiolákba helyeztük át vákuumban szárazra pároltuk majd mérésig 20 C-on tároltuk. A metanolban oldódó kötött fenolos vegyületek savas hidrolízise a következőképpen történt. Az alsó vizes fázishoz 250 l 0,1 mg/ml p-hba-t, 5 l 0,05 mg/ml o-ani-t és 1,3 ml 8N HCl-t adtunk és 80 C-on 60 percig inkubáltuk. Majd a fent leírt módon extraháltuk, és a felső szerves fázisokat a bepárlást követően felhasználásig 20 C-on tároltuk. 38

46 A metanolban nem oldódó kötött fenolos vegyületek extraháláshoz a centrifugálás utáni üledéket, vagy pelletet savasan hidrolízáltuk a következőképpen. A pellethez 250 l 0,1 mg/ml p-hba-t, 5 l 0,05 mg/ml o-ani-t adtunk és 3 ml vizet és 2 ml 8N HCl-t adtunk, majd 60 percen keresztül inkubáltuk 80 C on. A hidrolízis után 10 percen kersztül centrifugáltuk és 3,6 ml ciklohexán: etilacetát = 1:1 (v/v) elegyével extraháltuk. A szerves, felső fázisokat bepároltuk és -20 C-on tároltuk az analízisig. A HPLC analízis előtt a szárazra párolt mintákat A szolvens 500 l-ében visszaoldottuk. A folyadékkromatográfiás méréshez Waters típusú HPLC-t (WATERS, Milford, MA, USA) használtunk, mely a következő részegységekből állt: W2690 pumpa rendszer, (mely tartalmazott egy automata mintaadagolót, oszloptermosztátot és gradiens keverésre alkalmas pumparendszert) UV/VIS diódasoros detektor (W996) és egy W474 scanning fluoreszcens detektor. A mérési adatok kiértékelése Millenium32 program (WATERS, Milford, MA, USA) segítségével történt. A mintából 40 l-t injektáltunk az 5 m szemcseméretű, 150 x 4,6 mm méretű Supelcosil ABZ Plus analitikai oszlopra. A mérés során az alábbi szolvenseket használtuk: A: 25 mm Na-acetát (ph 2,6), 15% ACN B: 100% ACN. Az elválasztás a 4. táblázatban található gradiens programmal történt. Az oszlophőmérséklet az analízis során 40 C volt. 39

47 4. táblázat A benzoesav, o-hidroxi-fahéjsav és szalicilsav HPLC analízise során használt gradiens program. Idő (perc) Áramlási sebesség (ml/perc) A% B% ,1 1, Detektáláshoz a diódasoros UV/VIS detektorral 230 és 300 nm között teljes spektrumot vettünk fel, melynek egyik célja az, hogy minden vegyületet a maximális abszorbanciánál tudjunk kiértékelni, másrészt a jellemző UV spektrum alapján is lehet azonosítani a csúcsot a retenciós idő figyelembe vételével. A vizsgált vegyületek közül az orto-hidroxi-fahéjsav és a SA fluoreszkál is. Detektálásuk 317 nm gerjesztési és 436 nm kisugárzási (o-hca), illetve 305 nm gerjesztési és 407 nm kisugárzási hullámhosszon (SA) történt. 40

48 4.9. Kadmiumtartalom meghatározása A kadmiumtartalmat Hegedűs és mtsai (2001) módszere alapján határozták meg. 0,1 g száraz elporított növényi részt 2 ml 30%-os hidrogén-peroxid és 2 ml 65%-os salétromsav elegyével roncsolták (1 napig 25 C-on, majd 20 percig 120 C-on túlnyomáson forralták). A minták fémtartalmának meghatározása ICAP-61E típusú atomabszorpciós készülék segítségével történt, az MTA ATK Talajtani és Agrokémiai Intézet-ben Aszkorbinsav meghatározása A növényi mintát (Szalai és mtsai, 2014) az aszkorbinsav mérésre úgy készítettük elő, hogy a fél gramm növényi anyagot folyékony nitrogénben összetörtük, majd 3 ml 5%-os metafoszforsavval homogenizáltuk g-n 10 percen keresztül 4 C-on centrifugáltuk, majd a felülúszót gyűjtöttük össze a további vizsgálatokhoz. A totál aszkorbát mennyiségét a dehidroaszkorbát (DHA) ditiotreitollal (DTT) való redukciója után mértük. A DHA mennyiségét a totál aszkorbinsav és az natív aszkorbinsav mennyiségének a különbsége adja. A redukcióhoz 950 µl felülúszóhoz 50 µl 40 mg/ml DTT-t adtunk, illetve hogy az aszkorbinsav mennyiségét meghatározzuk, 50 µl vízet adtunk a 950 µl felülúszóhoz, majd inkubáltuk 25 percen keresztül sötétben, szobahőmérsékleten. Az inkubáció után 10 µl-t injektáltunk a műszerbe. Az elválasztás izokratikus módon, 0,1%-os TFA (ph 2,7) eluensben Hyperprep HS C18 250x4,6 mm-es oszlopon (részecske méret 8 µm, 100 Å) (ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA) és hozzákapcsolt 10x4 mm Hypeprep HS BDS C Å 8 µm előtétoszloppal 1 ml/perc átfolyási sebességgel történt. Az oszlopot 30 C-ra, a mintákat 8 C-ra termosztáltuk. A futási idő 7 perces volt mind a standard oldatokkal, mind a mintákkal. A komponenseket PDA detektorral detektáltuk Az 1-aminociklopropán-1-karboxilsav meghatározása Az 1-aminociklopropán-1-karboxilsav (ACC) meghatározását Tari és Nagy (1994) szerint végeztük, melyhez 2 g növényi anyagot dörzsöltünk el 10 ml 80%-os etanolban, centrifugáltuk 20 percig g-vel, majd a felülúszót fiolába öntöttük, a csapadékot pedig 41

49 újra extraháltuk és centrifugáltuk a fent leírtak szerint. A felülúszót az előzőhöz öntöttük, majd vákuumbepárlóban szárazra pároltuk. A bepárlást követően 5 ml vízzel oldjuk és kloroformos kirázás után a vizes fázist mértük meg. Az ACC-ből az etilént Hg2Cl2 és NaOCl hozzáadásával szabadítottuk fel, standard addícióval mértük (Lizada és Yang, 1979). Az átalakítás hatékonysága 85% volt. A MACC-t sósavas hidrolízist követően mértük, mely során 0,5 ml mintához 0,5 ml 4N-os HCl-t adtunk, 3 órán keresztül inkubáltuk 100 C-on és lúgosítottuk 2 ml 10,5 N-os NaOH-val. Az MACC-tartalmat a hidrolízis előtt és után mért ACC-tartalom különbsége adja. Az ACC-ból keletkező etilént gázkromatográfiásan mértük, a mérés paraméterei a következők voltak: Gázkromatográf típusa: Hewlett-Packard 5890 Series II. Oszlop típusa: 305 x 0,3 cm rozsdamentes acél, töltet típusa: Alumina F-1 80/100 mesh (Supelco Inc. Bellefonte, Pennsylvania, USA) Termosztát hőmérséklete: 100 C Injektor hőmérséklete: 120 C Vivőgáz: He, sebessége: 35 ml/perc Detektor: lángionizációs (FID) hőmérséklete: 160 C FID H2 sebessége: 30 ml/perc FID levegő sebessége: 300 ml/perc Statisztikai analízis Az eredmények 10 ismétlés átlagai a klorofill-a fluoreszcencia indukciós mérések és a klorofilltartalom esetében, 5 ismétlés átlagai az MDA-tartalom meghatározása, és a HPLC-s analízisek során, 3 5 mérés átlagai az enzimaktivitási adatok, illetve a GC analízis eredményei. Mivel az általunk vizsgált paramétereket az öregedési folyamatok is befolyásolhatják (Prochazkova és mtsai, 2001), a paraméterek változásait az azonos napos kontroll növényekben mért értékekhez hasonlítottuk. A szignifikanciavizsgálathoz Studentféle kétmintás t-próbát használtunk. 42

50 5. Eredmények 5.1. A különböző exogén szalicilsav kezelések hatása a búza metabolizmusára Kutatási célkitűzésünk között szerepel, hogy megvizsgáljuk, hogy a különböző SA kezelések hogyan hatnak az SA anyagcserére, valamint a fenilpropanoid útvonal részét képező és a SA-val közös prekurzorral rendelkező flavonoidokra. Ezért neveltük és kezeltük a növényeket a es fejezetben leírtak szerint úgy, hogy a növények egy részénél csíráztatás előtt a magokat áztattuk SA-ban, a növények másik része fiatal, de kifejlett korban a tápoldathoz adagolva kapta a SA-t A különböző exogén szalicilsav kezelések hatása a növények életképességére A búza növények állapotát a különböző SA kezelések után egyrészt az életképesség mérésével (leveleknél az elektrolitkiáramlás, gyökereknél pedig a gyökér NBT redukáló képessége), másrészt a PSII kvantumhatékonyságával, valamint a lipidperoxidáció mértékének mérésével jellemeztük a hidropónikus kezelés utáni 1. és 7. napon. Mivel ezeket az eredményeket az öregedés is befolyásolja, ezért a mért értékeket mindig az azonos napi kontroll növényeken mért értékekkel hasonlítottuk össze. Az eredményeket az 1. táblázat tartalmazza. 43

51 1. táblázat Különböző szalicilsav kezelések hatása az életképességre levélben és gyökérben. SAh: 1 hetes növények 1 napos tápoldatos kezelése 0,5 mm SA-val; SAss: magvak 12 órás kezelése 0,5 mm SA-val csíráztatás előtt; 1 nap: a SA tápoldatos kezelését követő napon szedett minták; 7 nap: a SA tápoldatos kezelését követő 7. napon szedett minták; *, **, ***: szignifikáns P 0,05, 0,01 és 0,001 szinten a kontrollhoz képest (n=5, az MDA, gyökéréletképesség esetén és n=10 a levél életképesség és PSII kvantumhatékonysága esetén). 1 nap 7 nap levél gyökér levél gyökér Kezelések ionkiáramlás (%) gyökéréletképesség (%) PSII kvantumhatékonysága Fv/Fm MDA tartalom (nmól/g friss tömeg) kontroll 22,4±2,8 0,67±0,0 2,86±0,8 SA h 37,8±4,7** 0,62±0,04 4,16±1,4 SA ss 30,7±7,1 0,68±0,0 2,02±0,7 kontroll 100 1,40±0,3 SA h 22,2±2,6* 2,49±1,4 SA ss 61,7±21,6 1,35±0,1 kontroll 19,6±1,9 0,65±0,05 3,94±0,5 SA h 20,1±2,2 0,59±0,11 15,22±1,8*** SA ss 16,3±1,6* 0,67±0,04 3,61±0,7 kontroll 100 1,65±0,2 SA h 25,4±2,56*** 0,37±0,00** SA ss 97,3±28,5 1,61±0,3 A levél membránjának permeábilitásvizsgálatánál azt tapasztaltuk, hogy az 1 napos hidropónikus kezelés szignifikánsan növelte meg az áteresztő képességét. A hidropónikus kezelés utáni 7. napon vett mintáknál a hidropónikus kezelésnek nem volt hatása, míg a magáztatás kismértékben (0,8-szorosára) csökkentette a permeábilitást. A gyökerek életképességének vizsgálatakor azt tapasztaltuk, hogy a hidropónikus kezelés ötödére csökkentette az életképességet a többi kezeléshez képest már 1 nappal a kezelés után és ez 7 nappal a kezelés után is ezen a szinten maradt. Az 1. táblázatban százalékra számítva tüntettük fel a gyökér életképességét. A PSII kvantumhatékonysága a kezelések során nem változott. Az lipidperoxidációmérés eredményei azt mutatják, hogy a hidropónikus SA kezelés utáni 1. napon szedett mintákban az MDA tartalom majdnem kétszeresére nőtt. A 7 nappal a kezelés után szedett levélminták esetén azt lehetett megfigyelni, hogy a hidropónikus kezelés szignifikánsan (3,8- szorosára) megnövelte az MDA tartalmat. A magáztatásos növényekben a hidropónikus kezelés utáni napon, ugyan csak kis mértékben, de csökkent az MDA tartalom a levélben, míg a 7 napos minták esetén nem változott. Ezzel ellentétben a gyökérben az MDA tartalom 1 44

52 nappal a hidropónikus kezelés után nem változott szignifikánsan, míg 7 nap után kis mértékben csökkent a SA-val hidropónikusan kezelt növényekben A különböző exogén szalicilsav kezelések hatása az antioxidáns enzimek aktivitására A különböző SA kezelések hatását vizsgáltuk bizonyos antioxidáns enzimek aktivitására. Az eredmények a 2. táblázatban láthatóak. Az antioxidáns enzimek aktivitását az öregedés is befolyásolja, ezért a mért aktivitást mindig azonos napi kontroll növényekkel hasonítottuk össze. A méréseket levél és gyökér mintákon is elvégeztük. A levélben a hidropónikus kezelést követő napon szedett mintákban nem volt változás, de 7 nap után a hidropónikusan kezelt növények APX enzimaktivitása nagymértékben megnőtt. Gyökérben is a hidropónikus kezelés okozott növekedést, mind a kezelés után 1 nappal, mind a kezelés után 7 nappal szedett mintáknál. A POD aktivitásában sem a hidropónikus kezelést követő napon, sem a 7 nap után szedett mintákban nem változott a levélben. Gyökérben a hidropónikus kezelés okozott növekedést, a 7 nap után szedett mintákban megnőtt az enzimaktivitása a kezelést követően. A KAT aktivitása csökkenést mutatott a levelekben, mind a hidropónikus, mind a magáztatott minták esetén. Gyökérben sem a hidropónikus kezelést követő napon szedett mintákban, sem a 7 nap utáni mintákban nem volt változás. A levélben a hidropónikus kezelést követő napon szedett mintákban a GR-ban nem volt változás, de 7 nap után a magáztatásos módon kezelt növények GR aktivitása lecsökkent. Gyökérben sem a hidropónikus kezelést követő napon szedett mintákban, sem a 7 nap utáni mintákban nem volt változás. A GST enzim mérésekor a levélben a hidropónikus kezelés utáni minták enzimaktivitása csökkenést mutatott, mind a hidropónikus, mind a magáztatott minták esetén. Gyökérben is a hidropónikus kezelés okozott csökkentést a kezelés után 1 nappal. 45

53 2. táblázat Különböző szalicilsav kezelések hatása az antioxidáns enzim aktivitására fehérjére vonatkoztatva nkatal/fehérjemértékegységben levélben és gyökérben. SA h: 1 hetes növények 1 napos tápoldatos kezelése 0,5 mm SA-val; SA ss: magvak 12 órás kezelése 0,5 mm SA-val csíráztatás előtt; 1 nap: a SA tápoldatos kezelését követő napon szedett minták; 7 nap: a SA tápoldatos kezelését követő 7. napon szedett minták; *, **, ***: szignifikáns P 0,05, 0,01 és 0,001 szinten a kontrollhoz képest *, **, ***: szignifikáns P 0,05, 0,01 és 0,001 szinten a kontrollhoz képest (n=5 esetén). Levél 1 nap 7 nap Kontroll SA h SA ss Kontroll SA h SA ss APX 6,3±1,5 7,9±1,8 7,5±0,5 6,5±0,8 11,3±0,9 *** 7,2±0,4 POD 30,5±6,4 32,9±6,0 35,7±8,4 72,7±17,5 92,8±53,5 57,8±15,3 KAT 1476± ±161 * 1255±120 * 1159± ± ±309 GR 8,2±1,0 7,6±0,5 6,8±2,1 8,0±1,0 8,0±2,0 5,6±0,5 ** GST 4,3±0,5 3,4±0,7 ** 3,5±0,6 * Gyökér 4,4±0,8 3,6±0,5 3,8±0,6 1 nap 7 nap Kontroll SA h SA ss Kontroll SA h SA ss APX 31,3±7,9 117±9 *** 28,5±16,6 38,9±12,4 75,4±25,4 * 38,8±11,8 POD 611± ±77 492±30 752± ±20 * 545±56 KAT 33±12 30±22 72±30 59±29 55±26 61±22 GR 12,8±1,3 9,4±2,2 11,2±1,5 13,3±4,4 9,0±1,1 7,6±1,5 GST 3,3±0,7 1,9±0,5 ** 4,1±1,2 3,3±1,1 2,2±0,8 2,6±0,6 46

54 A különböző exogén szalicilsav kezelés hatása az endogén szalicilsav szintjére A mérés során külön mértük a levél és gyökér endogén SA szintjét szabad és kötött frakciókban is. A szabad frakcióban levő endogén SA szintjét mérve azt tapasztaltuk, hogy a hidropónikus kezelés hatására levélben szignifikánsan (több mint 14-szeresére) megnőtt a kezelést követő napon, a kezelés utáni 7. napon viszont visszaesett, de még így is 2,3-szorosa volt a kontrollnak (6A ábra). A szabad frakcióban található endogén SA mennyisége a gyökérben a hidropónikus kezelés hatására 9-szeresére nőtt a kezelés utáni napon, viszont a 7. napra a kontroll szintjére csökkent (6B ábra). A magáztatás hatására is hasonló változásokat tapasztaltunk, de ott csak 1,2-szeres növekedés történt. A metanolban oldódó kötött frakcióban (2. frakció) a hidropónikus kezelés nagymértékben megnövelte az endogén SA mennyiségét mind a levélben (230-szorosára) (6C ábra), mind a gyökérben (háromszorosára) (6D ábra), de míg a levélben 7 nap után is hasonló mennyiségben volt, addig a gyökérben lecsökkent a kontroll szintjére. A harmadik frakcióban (metanolban nem oldódó kötött frakció) hasonló változásokat tapasztaltunk, mint a metanolban oldódó kötött frakcióban, annyi különbséggel, hogy itt a levélben található SA mennyisége csak 100 g/g friss tömeg körül volt a SA h növényekben (6E ábra), míg a 2. frakcióban ez az érték meghaladta a 200 g/g friss tömeget. 47

55 6. ábra Különböző szalicilsav kezelések hatása az endogén szalicilsav (SA) szintre búza növények levelében (A, C, E) illetve gyökerében (B, D, F). Az A, B: metanolban oldódó szabad SA; C, D: metanolban oldódó kötött SA; E, F: metanolban nem oldódó kötött SA; SA h: 1 hetes növények 1 napos tápoldatos kezelése 0,5 mm SA-val; SA ss: magvak 12 órás kezelése 0,5 mm SA-val csíráztatás előtt; 1 nap: a SA tápoldatos kezelését követő napon szedett minták; 7 nap: a SA tápoldatos kezelését követő 7. napon szedett minták; *,**, ***: szignifikáns P 0,05, 0,01 és 0,001 szinten a kontroll értékhez képest (n=5) 48

56 A különböző exogén szalicilsav kezelés hatása az endogén orto-hidroxi-fahéjsav szintjére Különböző exogén SA kezelések hatását vizsgáltuk az orto-hidroxi-fahéjsav (ohca) szintjére. A mérés során külön mértük a levél és gyökér ohca szintjét a szabad és a kötött frakciókban is. A levélben a szabad ohca mennyisége kimutathatósági határ alatt volt, csak a hidropónikus kezelés hatására jelent meg (7A ábra). A kezelés első napja után kb 60 g/g friss tömeg mennyiségben volt kimutatható, míg a 7. napra több, mint kétszeresére emelkedett. Ezzel ellentétben a metanolban oldódó kötött frakcióban, ha kis mennyiségben is, kimutatható volt az ohca a kontroll és magáztatott növények leveleiben (7B ábra), de a hidropónikus kezelés hatására kimutathatósági határ alá csökkent a mennyisége, és 7 nap után is ezen a szinten maradt. Gyökérben a hidropónikus kezelés 1 nap után lecsökkentette a ohca mennyiségét kimutathatósági határ alá (8. ábra), de 7 nap után ismét detektálható volt a szintje, bár alacsonyabb volt, mint a kontroll és magáztatott növényeké. A többi frakcióban az ohca nem volt detektálható mennyiségben. 49

57 7. ábra Különböző szalicilsav (SA) kezelések hatása az endogén orto-hidroxi-fahéjsav (ohca) szintre búza növények levelében (A, B) Az A: metanolban oldódó szabad ohca; B: metanolban oldódó kötött ohca; SA h: 1 hetes növények 1 napos tápoldatos kezelése 0,5 mm SA-val; SA ss: magvak 12 órás kezelése 0,5 mm SA-val csíráztatás előtt; 1 nap: a SA tápoldatos kezelését követő napon szedett minták; 7 nap: a SA tápoldatos kezelését követő 7. napon szedett minták; **, ***: szignifikáns P 0,01 és 0,001 szinten a kontroll értékhez képest (n=5) 50

58 8. ábra Különböző szalicilsav kezelések hatása az endogén orto-hidroxi-fahéjsav (ohca) szintre búza növények gyökerében. A metanolban oldódó szabad ohca, SA h: 1 hetes növények 1 napos tápoldatos kezelése 0,5 mm SA-val; SA ss: magvak 12 órás kezelése 0,5 mm SA-val csíráztatás előtt; 1 nap: a SA tápoldatos kezelését követő napon szedett minták; 7 nap: a SA tápoldatos kezelését követő 7. napon szedett minták; ***: szignifikáns P 0,001 szinten a kontroll értékhez képest (n=5) A különböző exogén szalicilsav kezelés hatása az endogén benzoesav szintjére Különböző exogén SA kezelések hatását vizsgáltuk az endogén benzoesav (BA) szintjére. A mérés során külön mértük a levél és gyökér endogén BA szintjét szabad és kötött frakciókban is. A szabad frakcióban levő BA szintjét mérve azt tapasztaltuk, hogy a hidropónikus kezelés hatására levélben szignifikánsan (1,9-szeresére) megnőtt a kezelést követő napon, viszont a kezelés utáni 7. napon a kimutathatósági határ alá csökkent (9A ábra). A szabad frakcióban található BA mennyisége a gyökérben a hidropónikus kezelés hatására a kimutathatósági határ alá csökkent a kezelés utáni 1. és 7. napon is (9B ábra). A másik két kezelésnél nem tapasztaltunk szignifikáns változást. A levél kötött frakciójában a hidropónikus kezelés a BA mennyisége szignifikánsan lecsökkent a kezelés utáni napon (9C ábra), míg a 7. napon a 3-szorosára növekedett. 51

59 Gyökérben a hidropónikus kezelés hatására BA mennyisége kimutathatósági határ alá csökkent az 1. nap után (9D ábra), míg 7 nap után kismértékű emelkedést tapasztaltunk. A mennyisége viszont még így is sokkal kisebb volt a kontrollhoz és a magáztatott növényekhez képest. A kontroll és magáztatott növényeknél itt sem tapasztaltunk szignifikáns változást. 9. ábra Különböző szalicilsav (SA) kezelések hatása az endogén benzoesav (BA) szintre búza növények levelében (A, C) illetve gyökerében (B, D). Az A, B: metanolban oldódó szabad BA; C, D: metanolban oldódó kötött BA; SA h: 1 hetes növények 1 napos tápoldatos kezelése 0,5 mm SA-val; SA ss: magvak 12 órás kezelése 0,5 mm SA-val csíráztatás előtt; 1 nap: a SA tápoldatos kezelését követő napon szedett minták; 7 nap: a SA tápoldatos kezelését követő 7. napon szedett minták; *, ***: szignifikáns P 0,05, és 0,001 szinten a kontroll értékhez képest (n=5) A különböző exogén szalicilsav kezelés hatása az endogén fahéjsav szintjére Különböző exogén SA kezelések hatását vizsgáltuk az endogén fahéjsav (CA) szintjére, ezért a 4.8.-as fejezetben leírtak szerint mértük. A mérés során külön mértük a levél és gyökér CA szintjét szabad és kötött frakciókban is. A szabad frakcióban levő CA szintjét mérve azt tapasztaltuk, hogy a hidropónikus kezelés hatására levélben kezelést követő napon megnőtt (11,8-szorosára), és a kezelés utáni 7. napon is magas maradt (5,8-szeres) (10A ábra). 52

60 A magáztatásos kezelés hatására a CA mennyisége nagymértékben lecsökkent a kezelés utáni napon és a kezelés utáni 7. napon sem változott (10A ábra). A szabad frakcióban található CA mennyisége a gyökérben a hidropónikus kezelés hatására mind a kezelés utáni napon, mind a kezelés utáni 7. napon szignifikánsan a kimutatási határ alá csökkent (10B ábra). A magáztatás hatására pedig az 1. napon kis mértékben (0,9-szeresére és 0,6-szorosára) csökkent. A kötött frakcióban a hidropónikus kezelés a CA mennyiségét szignifikánsan lecsökkentette a levélben a kezelés utáni napon (0,04-szeresére) míg a 7. napon szignifikánsan (5,3-szorosára) növekedett (10C ábra). A magáztatás nem volt ilyen nagy hatással; a hidropónikus kezelést követően szedett mintában is, és a 7 nappal később szedett mintában is lecsökkent (0,7-szeresére és 0,9-szeresére) az SA mennyisége. Gyökérben a hidropónikus kezelés az 1. napon szignifikánsan lecsökkentette (a kimutatási határ alá), de a 7. nap után megnőtt a CA mennyisége (1,7-szeresére). Ellenben a magáztatással, ahol a kezelés mind az 1. mind a 7. napon csökkentette a CA mennyiségét (0,9-szeresére és 0,7-szeresére) (10D ábra). A metanolban nem oldódó kötött frakcióban a hidropónikus kezelés megnövelte a kötött CA mennyiségét mind az 1, mind a 7. napon is (1,3-szorosan és szignifikánsan 2,4- szeresére) a levélben (10E ábra). A magáztatásos kezelés utáni 1. napon nem változott, míg a 7. napon szedett mintában kismértékben lecsökkent (0,9-szeresére). A gyökérben a hidropónikus kezelés utáni napon kismértékű változás volt megfigyelhető (1,6-szoros), míg a 7. napon vett mintában nem volt változás (10F ábra). A magáztatás a kezelés utáni napon csökkent (0,9-szeresére), míg a 7. napon pedig szignifikánsan megnőtt (1,3-szorosára) a kötött CA tartalom. 53

61 10. ábra Különböző szalicilsav kezelések hatása az endogén fahéjsav szintre búza növények levelében (A, C, E) illetve gyökerében (B, D, F). A (A, B: metanolban oldódó szabad CA; C, D: metanolban oldódó kötött CA; E, F: metanolban nem oldódó kötött CA; SA h: 1 hetes növények 1 napos tápoldatos kezelése 0,5 mm SA-val; SA ss: magvak 12 órás kezelése 0,5 mm SA-val csíráztatás előtt; 1 nap: a SA tápoldatos kezelését követő napon szedett minták; 7 nap: a SA tápoldatos kezelését követő 7. napon szedett minták; *, ***: szignifikáns P 0,05 és 0,001 szinten a kontroll értékhez képest (n=5) 54

62 A különböző exogén szalicilsav kezelés hatása az endogén kaempferol szintjére Különböző exogén SA kezelések hatását vizsgáltuk a flavonoidok közül a kaempferol (K) szintjére. A mérés során külön mértük a levél és gyökér K szintjét szabad és kötött frakciókban is. A levélben szabad és kötött frakcióban is a SA kezelt növények K szintje alacsonyabb volt a hidropónikus kezelést követő napon (11A és 11B ábra), s a hidropónikusan kezelt növényekben a kezelés utáni 7. napon a kimutathatósági határ alá csökkent. A hidropónikus kezelés hatására a kezelés utáni első és 7. napon is a kimutathatósági határ alá csökkent a K mennyisége a gyökérben, míg a magáztatott növényekben a kontrollnál kicsit magasabb értékeket mértünk a szabad frakcióban (11B ábra). A kötött frakcióban 1 nap után a K kimutathatósági határ alatt volt a hidropónikus kezelés hatására, de a 7. napon a kontrollhoz közeli értékeket mértünk (11C ábra). 11. ábra Különböző szalicilsav kezelések hatása az endogén kaempferol szintre búza növények levelében (A, C) illetve gyökerében (B, D). A (A, B: metanolban oldódó szabad K; C, D: metanolban oldódó kötött K; SA h: 1 hetes növények 1 napos tápoldatos kezelése 0,5 mm SA-val; SA ss: magvak 12 órás kezelése 0,5 mm SA-val csíráztatás előtt; 1 nap: a SA tápoldatos kezelését követő napon szedett minták; 7 nap: a SA tápoldatos kezelését követő 7. 55

63 napon szedett minták; *,**, ***: szignifikáns P 0,05, 0,01 és 0,001 szinten a kontroll értékhez képest (n=3) A különböző exogén szalicilsav kezelés hatása az endogén kvercetin szintjére Különböző exogén SA kezelések hatását vizsgáltuk a flavonoidok közül a kvercetin (Q) szintjére A mérés során külön mértük a levél és gyökér Q szintjét szabad és kötött frakciókban is. A szabad frakcióban levő Q szintjét mérve azt tapasztaltuk, hogy a hidropónikus kezelés hatására levélben szignifikánsan megnőtt (5,7-szeresére) a kezelést követő napon (12A ábra) és tovább emelkedett a szinje (15,6-szorosára) a kezelés utáni 7. napon is. A kötött frakcióban a hidropónikus kezelés hatására a Q mennyisége szignifikánsan lecsökkent a levélben a kezelés utáni napon (12C ábra), míg a 7. napon nagymértékű növekedést lehetett tapasztalni. A szabad Q mennyisége a gyökérben kimutathatósági határ alatt volt (12B ábra) a hidropónikus kezelést követő napon, a kezelést követő 7. napon a hidropónikusan nem kezelt növények gyökereiben már kicsivel e fölé emelkedett. A metanolban oldódó kötött frakcióban jóval nagyobb mennyiségben volt ( g/ friss tömeg, 12D ábra), de jelentős különbség nem volt a kezelések között. 56

64 12. ábra Különböző szalicilsav kezelések hatása az endogén kvercetin szintre búza növények levelében (A, C) illetve gyökerében (B, D). A (A, B: metanolban oldódó szabad Q; C, D: metanolban oldódó kötött Q; SA h: 1 hetes növények 1 napos tápoldatos kezelése 0,5 mm SA-val; SA ss: magvak 12 órás kezelése 0,5 mm SA-val csíráztatás előtt; 1 nap: a SA tápoldatos kezelését követő napon szedett minták; 7 nap: a SA tápoldatos kezelését követő 7. napon szedett minták; ***: szignifikáns P 0,001 szinten a kontroll értékhez képest (n=3)) A különböző exogén szalicilsav kezelés hatása az endogén miricetin szintjére Különböző exogén SA kezelések hatását vizsgáltuk a flavonoidok közül a miricetin (M) szintjére. Mértük a M szintjét levél és gyökér mintákban szabad és kötött frakciókban is. A szabad frakcióban levő M szintjét mérve azt tapasztaltuk, hogy a hidropónikus kezelés hatására levélben szignifikánsan megnőtt (4,6-szorosára) a kezelést követő napon (13A ábra), míg a kezelés utáni 7. napon a kontroll növények szintjére esett vissza. A kötött frakcióban az 1 nap után kimutathatósági határ alá csökkent a szintje a hidropónikusan kezelt növényekben (13C ábra), míg a 7. nap után kb. négyszeresére emelkedett. A gyökérben hasonló változásokat tapasztaltunk, mint a kvercetin esetében: A szabad miricetin mennyisége a gyökérben kimutathatósági határ alatt volt (13B ábra) a hidropónikus kezelést követő napon, viszont a kezelést követő 7. napon a hidropónikusan nem kezelt növények gyökereiben már kicsivel e fölé emelkedett. A kvercetinnel ellentétben a 57

65 metanolban oldódó kötött frakcióban nem volt szignifikánsan több miricetin, mint a szabad frakcióban (13D ábra), de jelentős különbség itt sem volt a kezelések között. 13. ábra Különböző szalicilsav kezelések hatása az endogén miricetin szintre búza növények levelében (A, C) illetve gyökerében (B, D). A (A, B: metanolban oldódó szabad M; C, D: metanolban oldódó kötött M; SA h: 1 hetes növények 1 napos tápoldatos kezelése 0,5 mm SA-val; SA ss: magvak 12 órás kezelése 0,5 mm SA-val csíráztatás előtt; 1 nap: a SA tápoldatos kezelését követő napon szedett minták; 7 nap: a SA tápoldatos kezelését követő 7. napon szedett minták; *, ***: szignifikáns P 0,05 és 0,001 szinten a kontroll értékhez képest (n=3) A különböző exogén szalicilsav kezelés hatása az endogén rutin szintjére Különböző exogén SA kezelések hatását vizsgáltuk a flavonoidok közül a rutin (R) szintjére. A mérés során külön mértük a levél és gyökér R szintjét. A hidropónikus kezelés hatására levélben szignifikánsan megnőtt (2,1-szeresére) a rutin mennyisége (14A ábra) a kezelést követő napon, míg a kezelés utáni 7. napon lecsökkent a kimutathatósági határ alá. A rutin mennyisége a gyökérben a hidropónikus kezelés utáni napon a kimutathatósági határ alá csökkent (14B ábra), és ez nem változott a 7. napon sem. A fiatalabb növényeknél a 58

66 magáztatás hatására magasabb volt a hidropónikus kezelés utáni napon mért rutin mennyisége (5,2szeres), de a 7. napon már a kontrollhoz közeli értékeket lehetett detektálni. 14. ábra Különböző szalicilsav kezelések hatása az endogén rutin szintre búza növények levelében (A, C) illetve gyökerében (B, D). A (A, B: metanolban oldódó szabad R; C, D: metanolban oldódó kötött R; SA h: 1 hetes növények 1 napos tápoldatos kezelése 0,5 mm SA-val; SA ss: magvak 12 órás kezelése 0,5 mm SA-val csíráztatás előtt; ; 1 nap: a SA tápoldatos kezelését követő napon szedett minták; 7 nap: a SA tápoldatos kezelését követő 7. napon szedett minták; *,***: szignifikáns P 0,05 és 0,001 szinten a kontroll értékhez képest (n=3) A különböző exogén szalicilsav kezelés hatása az 1-aminociklopropán-1-karboxilsav mennyiségére A különböző kezelések után mértük a növények 1-aminociklopropán-1-karboxilsav (ACC) tartalmát a hidropónikus kezelés utáni 1. és 7. napon. Mivel ezeket az eredményeket az öregedés is befolyásolja, ezért a mért értékeket mindig az azonos napi kontroll növényeken mért értékekkel hasonítottuk össze. A mért ACC eredmények alapján (15A ábra) a levélben a hidropónikus kezelés nem okozott szignifikáns változást sem 1 nappal, sem 7 nappal a kezelés után. A magáztatásos 59

67 kezelés szignifikáns változást okozott; a levélben (0,67-szeresére) csökkent a kontrollban mért ACC mennyiségéhez képest. A gyökérben az ACC mennyiségében (15B ábra) a hidropónikus kezelés nem okozott változást sem 1 nappal, sem 7 nappal a kezelés után. A magáztatás kismértékű növekedést okozott a hidropónikus kezelés után 1 nappal, de 7 nappal a kezelés után nem volt mérhető változás a kontrollhoz képest. 15. ábra Különböző szalicilsav kezelések hatása az endogén 1-aminociklopropán-1- karboxilsav szintre búza növények levelében (A) illetve gyökerében (B). Az SA h: 1 hetes növények 1 napos tápoldatos kezelése 0,5 mm SA-val; SA ss: magvak 12 órás kezelése 0,5 mm SA-val csíráztatás előtt; 1 nap: a SA tápoldatos kezelését követő napon szedett minták; 7 nap: a SA tápoldatos kezelését követő 7. napon szedett minták; *,: szignifikáns P 0,05 szinten a kontroll értékhez képest (n=5)) 60

68 5.2. A különböző szalicilsav formák hatása a kukorica növényekre stresszkörülmények között A különböző SA kezelések után különböző SA formák (sav, illetve Na-só) hatását vizsgáltuk meg vizes közegben, valamint Cd stressz során. Ehhez kukorica (Norma hibrid) növényt neveltünk és kezeltünk a es fejezetben leírtak alapján, hidropónikus közegben fitotron kamrákban A különböző szalicilsav formák hatása a kadmium felvételre A különböző SA-formák kadmiumfelvételre gyakorolt hatását levélben és gyökérben vizsgáltuk. A kadmiumfelvétel vizsgálata során azt tapasztaltuk, hogy levélben a SA előkezelés utáni kadmium adagolás drasztikusan megnövelte a Cd-tartalmat, de a SA és Cd együttes adagolása még nagyobb mértékben növelte a felvételt (21A ábra), ellentétben a NaSA előkezelés utáni és az együttesen adagolt Cd kezeléssel, ahol bár megnövelte a Cd akkumulációját, de nem olyan mértékben, mint a SA előkezelés hatására. A gyökérben a Cd-kezelés hatására akkumulálódott a legnagyobb mértékben a Cd, viszont a SA előkezelés után a Cd felvétele csökkent, de nem olyan nagy mértékben, mint az SA és Cd együttes adagolása esetén (21B ábra). A NaSA előkezelés után Cd adagolás drasztikusabban csökkentette a Cd akkumulációját gyökérben, mint a NaSA és Cd együttes adagolása. 61

69 21 ábra Különböző szalicilsav formákkal végzett előkezelésének hatása az Cd tartalomra levélben (A) és gyökérben (B), Cd: 1 hetes növények 1 napos tápoldatos kezelése 0,5 mm Cd(NO3)2-val; SAekCd: 1 hetes növények 1 napos tápoldatos kezelése 0,5 mm SA-val, utána 1 napos tápoldatos kezelése 0,5 mm Cd(NO3)2-val; SA+Cd: 1 hetes növények 1 napos tápoldatos kezelése 0,5 mm SA-val és 0,5 mm Cd(NO3)2-val; NaSAekCd: 1 hetes növények 1 napos tápoldatos kezelése 0,5 mm NaSA-val utána 1 napos tápoldatos kezelése 0,5 mm Cd(NO3)2-val; NaSA+Cd: 1 hetes növények 1 napos tápoldatos kezelése 0,5 mm NaSA-val és 0,5 mm Cd(NO3)2-val. **, ***: szignifikáns P 0,01 és 0,001 szinten a Cd-hoz. (n=3). 62

70 A különböző szalicilsav formák hatása az életképességi paraméterekre Az életképességi paramétereket, vagyis a gyökérben mért 2,3,5-trifenil-tetrazolium klorid (TTC) tesztet és levélből mért ionkiáramlást, a klorofilltartalmat, az malondialdehid (MDA) mennyiségét és a fotoszintetikus paramétereket, vagyis az optimális kvantumhatásfokot, az effektív kvantumhatásfokot, a nem fotokémiai kioltást és a nemszabályzott nem fotokémiai fluoreszencia kioltást is mértük a Cd kezelés utáni napon. Az eredményeket a 6. táblázat tartalmazza. A gyökerek életképességét, melyet TTC teszttel mértünk, a SA előkezelés nagymértékben csökkentette. Csökkenést tapasztaltunk NaSA előkezelésnél is, de ez közel sem volt olyan drasztikus, mint a SA esetében. A Cd-kezelés olyan mértékű csökkenést okozott, mint a SA előkezelés önmagában. Ez a csökkenés még kifejezettebb volt mind az SA előkezelt, mind pedig a Cd-ot és SA-t együtt kapó növények esetében. Ezzel szemben a NaSA-val előkezelt növények életképessége Cd kezelés után nem csökkent és azokban a növényekben is csak kismértékű csökkenést tapasztaltunk, amelyek a NaSA-t a Cd-mal együtt kapták. A levél életképességének vizsgálatánál nem tapasztaltunk drasztikus csökkenést a kontrolhoz képest. A Cd lecsökkentette és mind az SA előkezelés utána Cd, mind pedig az SA és Cd együttes adagolása sem mutatott változást a Cd kezeléshez képest. A NaSA-val előkezelt növények esetén csak kismértékű csökkenést tapasztaltunk. A levél klorofill tartalmát a SA előkezelés nagymértékben csökkentette. Csökkenést tapasztaltunk NaSA előkezelésnél is, de ez közel sem volt olyan drasztikus, mint a SA esetében. A Cd kezelés olyan mértékű klorofill tartalom csökkenést okozott, mint a NaSA előkezelés önmagában. A SA előkezelés utáni Cd és az SA és Cd együttes adagolása is tovább csökkentette, míg a NaSA előkezelés után Cd és az együttes adagolás nem csökkentette tovább a klorofill tartalmát a leveleknek. A lipidperoxidáció mérés eredményei azt mutatják, hogy mind a SA előkezelés, mind a NaSA előkezelés és mind a Cd megnövelte az MDA mennyiségét. A SA előkezelés utáni Cd adagolás kifejezettebbé tette a növekedést, míg a SA és Cd együttes adagolása nem növelte tovább az MDA mennyiségét. A fotoszintetikus paraméterek mérése során azt tapasztaltuk, hogy az optimális kvantum hatásfokot a SA előkezelés is és a Cd kezelés is lecsökkentette, de sem az utána való Cd, sem az együttes adagolás már nem csökkentette tovább. Ugyanakkor a NaSA kezelés nem 63

71 befolyásolta, de az előkezelést követő Cd adagolás és az együttes adagolás egyforma mértékben csökkentette. Az effektív kvantum hatásfokot a SA drasztikusan lecsökkentette, a Cd kezelés is csökkentette, míg a NaSA előkezelés növelte. A SA előkezelés után a Cd adagolás sem és az együttes adagolás sem csökkentette tovább. Ezzel ellentétben a NaSA előkezelés utáni Cd kezelés növelte, míg az együttes adagolás csökkentette a hatásfokot. A nem fotokémiai kioltást a SA előkezelés és Cd is növelte, míg a NaSA előkezelés csökkentette. A SA előkezelés utáni Cd és az együttes adagolás sem tette a növekedést drasztikusabbá. A NaSA előkezelés utáni Cd adagolás nem változtatott a kioltáson, míg az együttes adagolás megnövelte. A nem szabályozott nem fotokémiai fluoreszcencia kioltás mérése során azt tapasztaltuk, hogy a SA előkezelés és a NaSA előkezelés is megnövelte a kioltást, míg a Cd kezelés nem változtatta meg. A SA előkezelés utáni Cd kezelés és a SA és Cd együttes adagolása a növekedést kifejezettebbé tette. A NaSA előkezelés után a Cd nem növelte tovább a kioltást. 64

72 3. táblázat Különböző szalicilsav formákkal történt előkezelések hatása az életképességre levélben és gyökérben. SAek: 1 hetes növények 1 napos tápoldatos kezelése 0,5 mm SA-val; NaSAek: 1 hetes növények 1 napos tápoldatos kezelése 0,5 mm NaSA-val; Cd: 1 hetes növények 1 napos tápoldatos kezelése 0,5 mm Cd(NO3)2-val; SAekCd: 1 hetes növények 1 napos tápoldatos kezelése 0,5 mm SA-val, utána 1 napos tápoldatos kezelése 0,5 mm Cd(NO3)2-val; SA+Cd: 1 hetes növények 1 napos tápoldatos kezelése 0,5 mm SA-val és 0,5 mm Cd(NO3)2-val; NaSAekCd: 1 hetes növények 1 napos tápoldatos kezelése 0,5 mm NaSAval, utána 1 napos tápoldatos kezelése 0,5 mm Cd(NO3)2-val; NaSA+Cd: 1 hetes növények 1 napos tápoldatos kezelése 0,5 mm NaSA-val és 0,5 mm Cd(NO3)2-val. *, **, ***: szignifikáns P 0,05, 0,01 és 0,001 szinten a kontrollhoz képest (n=3 a fotoszintetikus paraméterek esetén, n=5, az MDA, gyökéréletképesség esetén és n=10 az levél életképesség és a klorofill tartalom esetén). ionkiáramlás (%) gyökéréletképesség (%) klorofill tartalom MDA (nmolg -1 FW) optimális kvantumhatásfok effektiv kvantumhatásfokot nem fotokémiai kioltás nem szabályzott kioltás Kontroll 30,8 ±7,5 12,42 ±1,52 2,03 ±0,27 0,777 ±0,006 0,371 ±0,025 0,385 ±0,022 0,242 ±0,013 levél gyökér SAek NaSAek Cd SAekCd SA+Cd NaSAekCd NaSA+Cd 56,9 ±12,3 48,8 ±2,2 63,9 ±11,6 65,5 ±5,7 76,0 ±7,6 57,9 ±3,9* 76,6 ±2,9* Kontroll 100 SAek NaSAek Cd SAekCd SA+Cd NaSAekCd NaSA+Cd KH 10,9 ±2,9*** 51,9 ±3,5*** 8,13 ±6,13 6,1 ±2,4*** 5,7 ±1,8* 64,4 ±28,5 25,5 ±13,2** 11,0 ±1,4 7,64 ±1,43*** 8,87 ±1,62*** 8,66 ±0,93*** 6,21 ±1,5* 7,7 ±1,05 8,13 ±1,16 8,07 ±1,18 3,46 ±0,425** 3,21 ±0,43** 3,41 ±0,44** 7,52 ±0,73*** 3,89 ±0,7 3,07 ±0,36 3,59 ±0,39 1,63 ±0,03 0,79 ±16** 2 ±0,28 1,25 ±0,18 0,96 ±0,05 0,83 ±0,13 1,95 ±0,13 1,4 ±0,27* 0,639 ±0,049*** 0,764 ±0,005 0,719 ±0,014*** 0,633 ±0,045*** 0,676 ±0,042*** 0,737 ±0,006*** 0,737 ±0,018*** 0,122 ±0,039*** 0,415 ±0,008** 0,105 ±0,009*** 0,111 ±0,011*** 0,141 ±0,043*** 0,421 ±0,024** 0,320 ±0,051* 0,644 ±0,047*** 0,324 ±0,019** 0,655 ±0,041*** 0,577 ±0,041*** 0,526 ±0,046*** 0,315 ±0,023** 0,468 ±0,070** 0,270 ±0,039** 0,255 ±0,013 * 0,235 ±0,025 0,314 ±0,071 *** 0,318 ±0,062 *** 0,258 ±0,017* 0,246 ±0,016 65

73 A különböző szalicilsav formák hatása a fitokelatin tartalomra és a fitokelatin-szintáz aktivitására Az fitokelatinok és a fitokelatin-szintáz enzim aktivitását mértük levélben és gyökérben. A fitokelatinok mennyiségét levélben a SA előkezelés utáni Cd adagolás és a SA és Cd együttes adagolása is drasztikusan megnövelte (16A ábra), míg a gyökérben a NaSA előkezelés utáni Cd kezelés növelte meg sokkal nagyobb mértékben, mint a NaSA és Cd együttes adagolása (16A ábra), habár ez a kezelés is megnövelte a mért mennyiséget. A fitokelatin-szintáz enzim aktivitását levélben az SA- és kadmiumkezelés, míg a gyökérben a SA előkezelés utáni Cd kezelés növelte meg a legdrasztikusabban. Az SA és Cd együttes adagolása is megnövelte, de nem olyan kifejezetten. A NaSA előkezelés utáni Cd kezelés jobban megnövelte az enzim aktivitását (16B ábra), mint a NaSA és Cd együttes adagolása. 66

74 16. ábra Különböző szalicilsav formákkal történt előkezelések hatása az fitokelatintartalomra és a fitokelatin szintáz enzim aktivitásra levélben és gyökérben. SAek: 1 hetes növények 1 napos tápoldatos kezelése 0,5 mm SA-val; NaSAek: 1 hetes növények 1 napos tápoldatos kezelése 0,5 mm NaSA-val; Cd: 1 hetes növények 1 napos tápoldatos kezelése 0,5 mm Cd(NO3)2-val; SAekCd: 1 hetes növények 1 napos tápoldatos kezelése 0,5 mm SA-val, utána 1 napos tápoldatos kezelése 0,5 mm Cd(NO3)2-val; SA+Cd: 1 hetes növények 1 napos tápoldatos kezelése 0,5 mm SA-val és 0,5 mm Cd(NO3)2-val; NaSAekCd: 1 hetes növények 1 napos tápoldatos kezelése 0,5 mm NaSA-val, utána 1 napos tápoldatos kezelése 0,5 mm Cd(NO3)2-val; NaSA+Cd: 1 hetes növények 1 napos tápoldatos kezelése 0,5 mm NaSA-val és 0,5 mm Cd(NO3)2-val. *, **, ***: szignifikáns P 0,05, 0,01 és 0,001 szinten a kontrollhoz. (n=3). 67

75 A különböző szalicilsav formák hatása a redukált és oxidált cisztein, - glutamilcisztein és glutation mennyiségére és - glutamil-cisztein-szintáz és glutation-szintetáz enzimek aktivitására A különböző SA formák hatását vizsgáltuk a tiolokra, glutation (GSH és GSSG), - glutamil-cisztein ( -EC) az cisztein (cys és cys-cys) oxidált és redukált formáinak mennyiségére, valamint -glutamil-cisztein-szintáz ( -ECS) enzim és a glutation-szintetáz (GSHS) enzim aktivitására. A glutation mennyiségét mérve levélben azt tapasztaltuk, hogy a GSH, vagyis az redukált forma a NaSA és Cd együttes adagolásának hatására nő drasztikusan meg (17B ábra). A GSSG, vagyis a oxidált forma a SA előkezelés hatására csökken, a NaSA előkezelés hatására és a Cd kezelés hatására szintén csökken (17A ábra). A SA és Cd együttes adagolása a csökkenést még kifejezettebbé teszi (17A ábra). Ezzel ellentétben a NaSA előkezelés után adagolt Cd és a NaSA-val együttesen adagolt Cd is megnöveli az előkezeléshez viszonyítva a GSH mennyiségét (17A ábra). Az oxidált -glutamil-cisztein mennyiségére a SA előkezelés nincs hatással, míg a NaSA előkezelés lecsökkenti az oxidált forma mennyiségét, és minden Cd-mal való kezelés megnöveli a -EC mennyiségét (17C ábra). A redukált -EC mennyiségét a NaSA előkezelés és a Cd is megnöveli (17D ábra), de a NaSA előkezelés utáni és az együttesen adagolt Cd is csökkenti az előkezeléshez képest a levélben. A cisztein mindkét formájánál szignifikáns növekedést a NaSA és Cd együttes adagolása okozott (17E és 17F ábra), míg az oxidált cisztein mennyiségét a SA előkezelés után adagolt Cd növelte meg (17F ábra). 68

76 17. ábra Különböző szalicilsav-formákkal történő előkezelések hatása a tiolok mennyiségére levélben, a glutation (A,B); γ-ec (C,D); Cys (E,F) redukált (A,C,E) és oxidált (B,D,F) formái. SAek: 1 hetes növények 1 napos tápoldatos kezelése 0,5 mm SA-val; NaSAek: 1 hetes növények 1 napos tápoldatos kezelése 0,5 mm NaSA-val; Cd: 1 hetes növények 1 napos tápoldatos kezelése 0,5 mm Cd(NO3)2-val; SAekCd: 1 hetes növények 1 napos tápoldatos kezelése 0,5 mm SA-val utána 1 napos tápoldatos kezelése 0,5 mm Cd(NO3)2-val; SA+Cd: 1 hetes növények 1 napos tápoldatos kezelése 0,5 mm SA-val és 0,5 mm Cd(NO3)2- val; NaSAekCd: 1 hetes növények 1 napos tápoldatos kezelése 0,5 mm NaSA-val utána 1 napos tápoldatos kezelése 0,5 mm Cd(NO3)2-val; NaSA+Cd: 1 hetes növények 1 napos tápoldatos kezelése 0,5 mm NaSA-val és 0,5 mm Cd(NO3)2-val. *, **, ***: szignifikáns P 0,05, 0,01 és 0,001 szinten a kontrollhoz. (n=3). 69

77 A glutation mennyiségét mértük gyökérben és azt tapasztaltuk, hogy a GSH, vagyis az oxidált forma a NaSA előkezelés hatására drasztikusan megnőtt, míg és Cd hatására lecsökkent (18B ábra). A NaSA előkezelés után adagolt Cd lecsökkentette, de a NaSA és Cd együttes adagolása csökkentette le a legnagyobb mértékben (18B ábra). A GSSG, vagyis a redukált forma a NaSA előkezelés hatására drasztikusan megnőtt, míg és Cd hatására lecsökkent (18A ábra). A NaSA és Cd együttes adagolása csökkentette le a legdrasztikusabban (18A ábra). Az redukált -glutamil-cisztein mennyiségére a SA előkezelés lecsökkentette, míg a Cd kezelés megnövelte (18C ábra). A NaSA előkezelés utáni Cd adagolás és az együttes adagolás is megnövelte az redukált forma mennyiségét (18C ábra). A oxidált -EC mennyiségét a SA előkezelés lecsökkentette, míg a NaSA előkezelés és a Cd is megnöveli (18D ábra), de a NaSA előkezelés utáni és együttesen adagolt Cd is növelte az előkezeléshez képest a gyökérben. A cisztein redukált formájánál szignifikáns csükkenést a NaSA és Cd együttes adagolása valamint a Cd kezelés okozott (18E ábra), míg az oxidált cisztein mennyiségét a SA előkezelés szignifikánsan csökkentette ellentétben a NaSA előkezeléssel, ahol drasztikus növekedés mérhető (18F ábra) és ez a szignifikáns növekedés az előkezelés után adagolt Cd kezelésnél is kifejezett maradt (18F ábra). 70

78 18. ábra Különböző szalicilsav-formákkal történő előkezelések hatása a tiolok mennyiségére gyökérben, a glutation (A,B); γ-ec (C,D); Cys (E,F) redukált (A,C,E) és oxidált (B,D,F) formái. SAek: 1 hetes növények 1 napos tápoldatos kezelése 0,5 mm SA-val; NaSAek: 1 hetes növények 1 napos tápoldatos kezelése 0,5 mm NaSA-val; Cd: 1 hetes növények 1 napos tápoldatos kezelése 0,5 mm Cd(NO3)2-val; SAekCd: 1 hetes növények 1 napos tápoldatos kezelése 0,5 mm SA-val utána 1 napos tápoldatos kezelése 0,5 mm Cd(NO3)2-val; SA+Cd: 1 hetes növények 1 napos tápoldatos kezelése 0,5 mm SA-val és 0,5 mm Cd(NO3)2- val; NaSAekCd: 1 hetes növények 1 napos tápoldatos kezelése 0,5 mm NaSA-val utána 1 napos tápoldatos kezelése 0,5 mm Cd(NO3)2-val; NaSA+Cd: 1 hetes növények 1 napos tápoldatos kezelése 0,5 mm NaSA-val és 0,5 mm Cd(NO3)2-val. *, **, ***: szignifikáns P 0,05, 0,01 és 0,001 szinten a kontrollhoz. (n=3). 71

79 Az -ECS aktivitását a levélben a SA és Cd együttes adagolása növelte meg (19A ábra). Ezzel ellentétben gyökérben a NaSA előkezelés utáni Cd adagolás növelte meg jelentősen (19A ábra). Az GSHS aktivitását a levélben a SA előkezelés csökkentette le drasztikusan, de a NaSA előkezelés is csökkentette (19B ábra) levélben. Gyökérben a NaSA előkezelés utáni Cd adagolás növelte meg a legnagyobb mértékben, de a NaSA és Cd együttes adagolása is növelte (19B ábra) az enzim aktivitását. 72

80 19. ábra Különböző szalicilsav-formákkal történő előkezelések hatása a tiolok bioszintézisében résztvevő enzimek aktivitására levélben és gyökérben, a γ-ecs (A); GSHS (B). SAek: 1 hetes növények 1 napos tápoldatos kezelése 0,5 mm SA-val; NaSAek: 1 hetes növények 1 napos tápoldatos kezelése 0,5 mm NaSA-val; Cd: 1 hetes növények 1 napos tápoldatos kezelése 0,5 mm Cd(NO3)2-val; SAekCd: 1 hetes növények 1 napos tápoldatos kezelése 0,5 mm SA-val utána 1 napos tápoldatos kezelése 0,5 mm Cd(NO3)2-val; SA+Cd: 1 hetes növények 1 napos tápoldatos kezelése 0,5 mm SA-val és 0,5 mm Cd(NO3)2-val; NaSAekCd: 1 hetes növények 1 napos tápoldatos kezelése 0,5 mm NaSA-val utána 1 napos 73

81 tápoldatos kezelése 0,5 mm Cd(NO3)2-val; NaSA+Cd: 1 hetes növények 1 napos tápoldatos kezelése 0,5 mm NaSA-val és 0,5 mm Cd(NO3)2-val. *, **, ***: szignifikáns P 0,05, 0,01 és 0,001 szinten a kontrollhoz. (n=3). A GSH redoxipotenciál számítása során (Schafer és Buettner, 2001) azt tapasztaltuk, hogy a levélben a NaSA előkezelés önmagában csökkentette az értéket, ami még a NaSA és Cd együttes adagolása során is csökkent (20A ábra). A gyökerek esetében is azt tapasztaltuk, hogy a NaSA előkezelés nem növelte az értéket, szemben minden SA előkezeléssel és az előkezelés utáni, vagy együttes Cd kezeléssel. A NaSA előkezelést követő Cd kezelés sem növelte a redoxipotenciál értékét (20B ábra). 74

82 20. ábra Különböző szalicilsav-formákkal történő előkezelések hatása a redoxi potenciálra levélben (A) és gyökérben (B). SAek: 1 hetes növények 1 napos tápoldatos kezelése 0,5 mm SA-val; NaSAek: 1 hetes növények 1 napos tápoldatos kezelése 0,5 mm NaSA-val; Cd: 1 hetes növények 1 napos tápoldatos kezelése 0,5 mm Cd(NO3)2-val; SAekCd: 1 hetes növények 1 napos tápoldatos kezelése 0,5 mm SA-val, utána 1 napos tápoldatos kezelése 0,5 mm Cd(NO3)2-val; SA+Cd: 1 hetes növények 1 napos tápoldatos kezelése 0,5 mm SA-val és 0,5 mm Cd(NO3)2-val; NaSAekCd: 1 hetes növények 1 napos tápoldatos kezelése 0,5 mm NaSA-val, utána 1 napos tápoldatos kezelése 0,5 mm Cd(NO3)2-val; NaSA+Cd: 1 hetes növények 1 napos tápoldatos kezelése 0,5 mm NaSA-val és 0,5 mm Cd(NO3)2-val. *, **, ***: szignifikáns P 0,05, 0,01 és 0,001 szinten a kontrollhoz. (n=3). 75

83 A különböző szalicilsav formák hatása az antioxidáns enzimekre Az APX aktivitását mértük a levelekben, és azt tapasztaltuk, hogy mind a SA előkezelés, mind a Cd kezelés növelte az aktivitást. A SA előkezelés utáni Cd adagolás és a SA és a Cd együttes adagolása a növekedést kifejezettebbé tette. A NaSA és Cd együttes adagolása is növelte az enzim aktivitását. A POD aktivitás a Cd kezelés hatására megnőtt levélben (4. táblázat). A SA előkezelés utáni Cd adagolás és a NaSA előkezelés utáni Cd adagolás is megnövelte a POD aktivitását. A gyökérben a SA és Cd együttes adagolása csökkentette az aktivitást. A NaSA előkezelés utáni Cd adagolás és a SA és a Cd együttes adagolása is csökkentette a POD aktivitását a gyökérben. A KAT aktivitását mérve levélben azt tapasztaltuk, hogy a NaSA előkezelés csökkentette az aktivitást. A SA előkezelés és Cd együttes adagolása is csökkentette azt. A GR aktivitását a SA előkezelés és a Cd kezelés is megnövelte. A SA előkezelés utáni Cd adagolás és az együttes adagolás ugyancsak megnövelte a GR aktivitását. A NaSA előkezelés utáni Cd adagolás szintén megnövelte az enzim aktivitását levélben. A gyökérben a NaSA előkezelés csökkenést, míg a NaSA és Cd együttes adagolása növekedést okozott. A GST aktivitását mértük a levélben, és azt figyeltük meg, hogy a NaSA előkezelés csökkentette és a Cd kezelés is csökkentette az aktivitást. A NaSA előkezelés utáni Cd és együttes adagolása is kifejezettebbé tette a csökkenést levélben. A SA előkezelés csökkenést okozott gyökérben míg a NaSA előkezelés növekedést. A NaSA előkezelés utáni Cd és az együttes adagolás még kifejezettebbé tette a növekedést a gyökérben. 4. táblázat Különböző szalicilsav-formákkal történő előkezelések hatása az antioxidáns enzimek aktivitására fehérjére vonatkoztatva levélben és gyökérben. Aszkorbát peroxidáz (APX); gvajakol-peroxidáz (POD); kataláz (KAT) glutation reduktáz (GR);glutation-S-transzferáz (GST); SAek: 1 hetes növények 1 napos tápoldatos kezelése 0,5 mm SA-val; NaSAek: 1 hetes növények 1 napos tápoldatos kezelése 0,5 mm NaSA-val; Cd: 1 hetes növények 1 napos tápoldatos kezelése 0,5 mm Cd(NO3)2-val; SAekCd: 1 hetes növények 1 napos tápoldatos kezelése 0,5 mm SA-val, utána 1 napos tápoldatos kezelése 0,5 mm Cd(NO3)2-val; SA+Cd: 1 hetes növények 1 napos tápoldatos kezelése 0,5 mm SA-val és 0,5 mm Cd(NO3)2-val; NaSAekCd: 1 hetes növények 1 napos tápoldatos kezelése 0,5 mm NaSA-val, utána 1 napos tápoldatos kezelése 0,5 mm Cd(NO3)2-val; NaSA+Cd: 1 hetes növények 1 napos tápoldatos kezelése 0,5 mm NaSA-val és 0,5 mm Cd(NO3)2-val. *, **, ***: szignifikáns P 0,05, 0,01 és 0,001 szinten a kontrollhoz. (n=3). 76

84 Kontroll SAek NaSAek Cd SAekCd SA+Cd NaSAek Cd NaSA+Cd Levél APX 1,96 ± 0,83 2,71 ± 0,37* 1,85 ± 1,19 3,32 ± 0,69** 4,33 ± 1,19** 5,00 ± 1,51*** 2,61 ± 0,65 4,62 ± 0,53*** POD 11,1 ± 3,4 13,9 ± 0,9 9,03 ± 1,42 17,7 ± 3,9* 20,7 ± 3,1** 17,1 ± 5,6 16,3 ± 2,7* 15,9 ± 5,8 KAT 71,6 ±21,5 64,9 ± 5,4 41,8 ± 7,3* 67,2 ± 26,6 57,4 ± 19,3 44,8 ± 17,7* 89,0 ± 40,4 78,6 ± 20,2 GR 0,49 ± 0,18 1,19 ± 0,13*** 0,58 ± 0,24 0,83 ± 0,15** 1,35 ± 0,38*** 0,78 ± 0,42 0,73 ± 0,11* 0,54 ± 0,11 GST 1,02 ± 0,16 0,95 ± 0,26 0,73 ± 0,27* 0,69 ± 0,31* 0,88 ± 0,26 0,64 ± 0,15*** 0,53 ± 0,23*** 0,74 ± 0,11** Gyökér 607 ± 251 ± 313 ± APX 273 ± ± ± ± 27* 367 ± 137 POD 1671 ± ± ± ± ± ± 1317* 880 ± 86** 1114 ± 233* KAT 161 ± ± ± ± ± ± ± ± 87 GR 7,19 ± 2,64 34,8 ± 24,1 63,7 ± 22,1* 22,4 ± 10,7 7,25 ± 2,67 52,3 ± 22,4* 14,5 ± 5,7 13,0 ± 4,5* GST 35,7 ± 10,7 4,20 ± 5,35** 80,6 ± 14,8*** 56,9 ± 26,7 16,5 ± 23,4 19,1 ± 9,4* 108 ± 33** 75,7 ± 9,5*** 77

85 A különböző szalicilsav formák hatása az aszkorbáttartalomra A különböző SA-formák hatását vizsgáltuk az aszkorbát mennyiségére levélben és gyökérben. Levélben az aszkorbát mennyiségében a kontrollhoz képest a kezelések hatására szignifikáns változást nem tapasztaltunk (21. ábra). A gyökérben a SA előkezelés drasztikusan lecsökkentette az aszkorbát mennyiségét, ami az előkezelés utáni Cd adagolás és az együttes adagolás után is megmaradt (21. ábra). A Cd kezelés is lecsökkentette, de nem olyan mértékben, mint a SA előkezelés. A NaSA és Cd együttes adagolása- ellentétben a NaSA előkezeléssel- lecsökkentette az aszkorbát tartalmat a gyökérben. 21 ábra Különböző szalicilsav-formákkal történő előkezelések hatása az aszkorbát tartalomra levélben és gyökérben, SAek: 1 hetes növények 1 napos tápoldatos kezelése 0,5 mm SA-val; NaSAek: 1 hetes növények 1 napos tápoldatos kezelése 0,5 mm NaSA-val; Cd: 1 hetes növények 1 napos tápoldatos kezelése 0,5 mm Cd(NO3)2-val; SAekCd: 1 hetes növények 1 napos tápoldatos kezelése 0,5 mm SA-val, utána 1 napos tápoldatos kezelése 0,5 mm Cd(NO3)2-val; SA+Cd: 1 hetes növények 1 napos tápoldatos kezelése 0,5 mm SA-val és 0,5 mm Cd(NO3)2-val; NaSAekCd: 1 hetes növények 1 napos tápoldatos kezelése 0,5 mm NaSAval, utána 1 napos tápoldatos kezelése 0,5 mm Cd(NO3)2-val; NaSA+Cd: 1 hetes növények 1 napos tápoldatos kezelése 0,5 mm NaSA-val és 0,5 mm Cd(NO3)2-val. **, ***: szignifikáns P 0,01 és 0,001 szinten a kontrollhoz. (n=3). 78

86 6. Eredmények megvitatása 6.1. A különböző exogén szalicilsav kezelések hatása a búza metabolizmusára Már korábban kimutatták, hogy a SA tápoldathoz adagolva (Janda és mtsai, 1999) vagy a magok SA oldatba való áztatása vetés előtt (Krantev és mtsai, 2008) megvédi a növényt egyes abiotikus stresszorok káros hatásától. A különböző SA kezelési módok közül a tápoldathoz való adagolást és a magáztatást alkalmaztuk. A SA oldat koncentrációját a szakirodalomból ismert koncentrációk alapján választottuk, hiszen a 0,5 mm koncentráció már több alkalommal pozitív hatással volt a növényekre (Janda és mtsai, 1999; Krantev és mtsai, 2008). Sokan leírták a SA szerepét a stresszadaptációs folyamatok során, a SA oxidatív stresszt is okozhat a növényeknek, mely részben a hidrogén-peroxid akkumulációjának következménye lehet (Horváth és mtsai, 2007). A hidrogén-peroxid azért tud akkumulálódni SA hatására a növényben, mert az SA kötődik a KAT enzimhez, deaktiválja azt (Sánchez- Casas és Klessig, 1994). A ROS egyik fő forrása a fotoszintézis, ezért általában a levélben képződnek nagyobb mennyiségben. A vizsgálataink során az MDA mennyisége csak a levélben nőtt meg a SAh kezelt növényekben. A PSII kvantumhatékonyságának csökkenése nem volt drasztikus, vagyis a kezelés nem okozott komoly károkat a növényben. A SAss növények nem mutattak stressztüneteket, bár a SA így is gátolhatta a KAT enzim aktivitását, ami a hidrogén-peroxid mennyiségének emelkedéséhez vezethetett. Átmeneti KAT enzimaktivitás-csökkenést csak az SA kezelt növények mérésekor találtunk. Amíg bizonyos antioxidáns enzimek esetén is (POD, GR, GST) aktivitás-csökkenést tapasztatunk, addig az APX enzim esetén magas aktivitást figyeltünk meg a SAh kezelt növények gyökerében. Hasonlóan kukoricában (Janda és mtsai, 1999) időszakosan A SA csökkenti a KAT aktivitását, de ez csak az SAh levélben volt megfigyelhető. Habár az SAss növények nem mutattak semmilyen stressztünetet, a kezelés mégis mérhetően hatással volt az antioxidáns enzimek egy részére. Hasonló változásokat tapasztaltak magáztatás után kukoricában és borsó növényekben is (Krantev és mstai, 2008; Popova és mtsai, 2009). 79

87 A részletes microarray génexpressziós vizsgálatok azt mutatják, hogy mind az SAh és SAss kezelések is nagyszámú gént aktiváltak. Számos aktivált gén direkt vagy indirekt módon kapcsolódik a fenil-propanoid metabolizmushoz (Gondor és mtsai, 2016b) Azt már korábban is feltételezték, hogy a sejt redoxhomeosztázisában bekövetkező változás aktivizálja a flavonoidok bioszintézisét, különösképpen a flavonolok metabolizmusát (Taylor és Grotewold, 2005). A flavonoidok képezhetik a másodlagos antioxidáns rendszert, ami az antioxidáns rendszer kimerülése esetén aktivizálódhat (Agati és mtsai, 2012). Drasztikus növekedést tapasztaltunk a szabad kvercetin-frakcióban (Q), levélben a SAh kezelt növények esetén, amely növekedés megmaradt a hidropónikus kezelés befejezése után is. A Q-tartalom a metanolban oldódó kötött frakcióban lecsökkent 1 nappal a kezelés után a kontrollhoz képest. Ezek alapján úgy tűnik, hogy ez volt a Q-tartalom növekedésének a forrása a szabad frakcióban, de később a kötött Q frakció is a szabadhoz hasonlóan megemelkedett, ami arra mutat, hogy a Q szintézise indukálódott. A Q származékai hatékonyabbak, mint a monohidroxi B-gyűrűs flavonoidok, melyeknek sokféle szerepük van a növényekben, mint például a réz és vas komplexbe zárása, ami gátolja azt, hogy a Fentonreakció során ROS képződjön (Brown és mtsai, 1998), és redukálja a már jelen levő ROS-t is. A Q-származékok megvédhetik a kloroplasztiszokat a szinglet oxigéntől, mely a látható fény hatására képződik. Ezt a feltételezést támasztja alá, hogy fehér fény hatására mások is megemelkedett flavonol szintet írtak le, valamint glikolizált flavonoidoknak redukáló aktivitását (Agati és mtsai, 2012). Ezzel ellentétben a Q-tartalom a gyökérben a kimutathatósági határ alatt volt, míg a K mennyisége a kontrollban is és a SAss növényekben is detektálható volt, de csak nagyon kis mennyiségben. Levélben, amelyet a fény ért, a Q akkumulálódott, főleg a SAh kezelés során, míg a gyökérben a K mérhetően csak a kontrollban és a SAss kezelt növényekben fordult elő. A növények a flavonolokat CA-ból szintetizálják, ami szintén fontos intermediere a SA bioszintézisének. A szabad CA mennyisége nagyon alacsony volt a gyökérben és a kimutathatósági határ alá csökkent a SA hidropónikus kezelése után. Hasonló változást tapasztaltunk a SA prekurzorainál (BA és ohca), bár a SA mennyisége megnőtt mind a három frakcióban. Feltehetjük persze, hogy a SA mennyiségének növekedése a gyökérben a hidropónikus SA kezelésből eredeteztethető. Ellentétben a gyökérrel a szabad BA forma megnövekedett a levélben 1 nappal a kezelést követően, ami a megemelkedett SA mennyiségének a forrása lehet. Az osztályunkon korábban már 14 C-es izotóppal jelölt radioaktív szabad SA-val kezelt borsó növényekben sem a levélben sem a gyökérben nem mutattak ki radioaktív SA növekedést. Mindemellett radioaktivitást mindössze a kötött SA 80

88 formában a magban mértek, ami azt mutatja, hogy a felvett SA-t a növény kismolekulás kötött formává alakította. Ez azt is jelenti, hogy a felesleges szabad SA-t, ami már károsíthatja a növényt, így próbálta eltávolítani (Szalai és mtsai, 2010). Hasonló eredményeket kaptunk: SA-t főként kötött formában találtunk a levelekben a hidropónikus kezelés után, de a szabad SA mennyisége a SAh kezelt növényekben majdnem azonos volt a kontrol növényekben talált mennyiséggel 7 nap után. Az ohca mennyisége, ami egy másik prekurzora a SA-nak, sokkal nagyobb mértékben nőtt, mint a BA a levélben a SAh kezelt növények esetében, és ez a növekedés sokkal kifejezettebbé vált 7 nap után, amikor a magas MDA mennyiséget is mértük. A hidroxifahéjsavak, amik a fenolos vegyületek közül leginkább a gabonafélékben fordulnak elő, jó antioxidáns tulajdonsággal rendelkeznek. A ferulasav és oxidatív termékei, a diferulasavak a legnagyobb mértékben előforduló hidroxifahéjsavak gabonafélékben, de kis mennyiségében egyéb hidroxifahéjsavak (mustársav, ohca és kávésav) is előfordulnak (Gallardo és mtsai, 2006). A hidroxifahéjsavak, mint az ohca, antioxidáns képességét a szinglet molekuláris oxigén kioltásával demonstrálták. Ez arra enged következtetni, hogy az ohca mennyiségének növekedését a SA bioszintézisétől független okok vezérelhetik, vagyis a növény antioxidáns válaszreakciójában is szerepe van (Foley és mtsai, 1999). Drasztikus növekedést a kötött ohca mennyiségében őszi búzában hidegkezelési periódusban (Janda és mtsai, 2007) és só stressz során (Szalai és Janda, 2009) figyeltek meg. Vagyis az ohca nem csak a prekurzora a SA-nak, hanem antioxidáns szerepet is betölt az abiotikus stresszek, a regenerálódás és az adaptációs folyamatok során. Az SAh kezelés csökkentette a PAL enzim aktivitását egy kismértékű génexpresszió növekedéssel (Gondor és mtsai, 2016b), ami arra enged következtetni, hogy a PAL aktivitásának szabályozása poszttranszkripciós szinten történik. A SA mennyisége is megnőtt, de a hidropónikus kezelést befejezve, a levéllel ellentétben a szabad és a kötött forma mennyisége is csökkent. A mért szabad flavonoidok mennyisége is lecsökkent, de a kötött Q akkumulációja mérhető maradt. A SAss kezelésnek a hatása kevésbé fejeződött ki, habár nyilvánvaló csökkenés tapasztalható a PAL aktivitásában a levélben. Hasonlóan a PAL gén expressziója is lecsökkent a 3 napos fiatal növényekben (Gondor és mtsai, 2016b). Ez a csökkenés nem volt hatással az SA mennyiségére, de a K mennyisége a levélben szintén csökkent. Összefoglalva, az eredmények azt mutatják, hogy a flavonoidok is részei lehetnek a SA indukálta védekező mechanizmusnak, és hogy a flavonoidok szerepet játszhatnak a védekezésben különböző stresszekkel szemben. Mindemellett a különböző SA kezelések 81

89 különböző fiziológiai és biokémiai folyamatokat indukálnak és a válaszreakciók is különbözők levélben és gyökérben is. A SAh kezelés oxidatív stesszt okozott a levélben és megnövelte a nem-enzimatikus antioxidáns komponensek mennyiségét, vagyis az ohca-t, ami a SA prekurzor, és a flavonolok közül a Q mennyiségét. Ezzel ellentében, a SAss kezelés csekély növekedést okozott a flavonolok mennyiségében a gyökérben, míg a SAh kezelés csökkentette az ohca és flavonolok mennyiségét, de erősítette az APX enzim aktivitását. Ezek az eredmények arra mutatnak, hogy a különböző exogén SA kezelések hatásai nem általánosíthatóak, vagyis határozott különbség van a különböző kezelési módok hatásai között A különböző szalicilsav formák hatása a kukorica növényekre stresszkörülmények között Sokan kimutatták már, hogy az SA védőkomponens lehet a Cd-mal szemben kukoricában (Krantev és mtsai, 2005), habár az SA oxidatív stresszt is indukálhat. Az általunk vizsgált két SA forma között a kémiai különbség az, hogy az SA gyenge savként nem disszociál teljesen, míg a NaSA, mely só forma, teljesen disszociált formában van jelen. A növények ezért eltérő módon reagálhatnak az előkezelésekre. A SA előkezelés oxidatív stresszt jelent a növény számára, habár nem minden esetben van hatással a fotoszintézisre (Coronado és mtsai, 1998). Ezzel ellentétben a mi munkánk során a SA előkezelés önmagában annyira csökkentette le az effektív kvantumhatásfokot ( F/Fm ), mint a Cd kezelés. Ezzel párhuzamosan növelte a nem fotokémiai kioltást (NPQ) is. A SA kezelés ezen tulajdonságát paradicsomban is tapasztalták magas SA-koncentráció mellett (Poór és Tari, 2012.), tehát elmondható, hogy nem csak kukoricán volt mérhető a hatás. A SA-kezeléssel ellentétben áll a NaSA-kezelés, hiszen növelte a F/Fm -et, és csökkentette a NPQ-t, vagyis a növény fotoszintetikus paraméterei alapján jobb állapotban került a kontrollnál is a mért adatok alapján. A jó kondíciókat a Cd kezelés sem tudta degradálni, tehát a NaSA előkezelés jó védő kezelésnek bizonyult, viszont a Cd és NaSA együttes adagolás során a fotoszintetikus paraméterek is romlottak. A SA előkezelés után adagolt Cd hatása nem adódott össze, vagyis az előkezelés után hasonló hatást tapasztaltunk, mint hidegstressznél (Janda és mtsai, 1999), hogy a Cd hatása is kisebb volt. Összességében elmondható tehát, hogy a SA védőhatása függ a koncentrációtól, a kezelés idejétől, a SA forma adagolásától is (Janda és mtsai, 2014). 82

90 A Cd felvételének vizsgálata során azt tapasztaltuk, hogy az előkezelések és együttes adagolások is csökkentették a gyökérben a Cd mennyiségét a nem előkezelt növényekhez képest. A SA és Cd együttes adagolása csökkentette legkifejezettebben a Cd felvételt, habár a NaSA és Cd együttes adagolása is hatással volt a felvételre. Rizs növényeket szulfo-sa oldatos kezelés csökkentette a Cd felvételt gyökérben és levélben is (Singh és Shang, 2015). Ezzel ellentétben a levélben a SA és Cd együttes adagolás növelte leginkább a Cd akkumulálációt, vagyis ebben az esetben volt a legintenzívebb a Cd transzportja a gyökérből a levél irányába annak ellenére, hogy a Cd legtöbbször a gyökérben akkumulálódik nagyobb mértékben, vagyis a növény képes korlátozni a Cd-nak a xilémen keresztüli transzportját (Conn és Giliham, 2010; Gallego és mtsai, 2012). Habár minden előkezelés hatására nagyobb volt a Cd tartalom a levélben, mint az előkezeletlen növények esetén, a Cd mennyisége abszolút értékben sokkal kisebb volt, mint a gyökérben. Ahogyan azt már korábban tapasztalták, hogy a Cd felvétel nagymértékben befolyásolható a talaj és a közeg ph értékével (Hatch és mtsai, 1988) vagyis a csökkent Cd felvétel a kukoricában is a ph hatása miatt is lehetett. A Cd és az SA együttes adagolásakor a tápoldat ph-ja alacsonyabb volt, mint a többi kezelt vagy kezeletlen tápoldatnál, ami okozhatta a csökkent Cd felvételt. Habár sem a hozzáadott NaSA, sem pedig az előkezelések (SA és NaSA) sem változtatta meg szignifikánsan a tápoldat ph értékét, vagyis a csökkent Cd felvételt nem okozhatta kizárólag a ph hatása (Gondor és mtsai, 2016). A nem kezelt növényekben inkább a gyökérben akkumulálódik a Cd, és kevésbé továbbítódik a levél felé. Ezzel ellentétben a kezelt növények kevesebb Cd-ot vesznek fel és annak egy részét továbbítják a levélbe. Fiatal kukoricanövényekben a Cd gyökéren való felvételét és transzportját 10 napos hidropónikus Si-előkezeléssel csökkentették (Vaculik és mtsai, 2012). Ólom esetében búza növényeknél figyelték meg, hogy a Pb inkább a vegetatív szövetekben akkumulálódik és kevésbé a zászlós levelekben, illetve a reprodukciós szervekben (Ramesar és mtsai, 2014). A fitokelatinoknak (PC) fontos szerepük van a nehézfémek detoxifikálásban, elszállítva azokat a vakuolumba és ott komplexbe zárva. Habár magas PC mennyiséget mértünk a Cd kezelés után a gyökérben az SA előkezelt növényeknél, de a legmagasabb PC akkumuláció mégis az NaSA kezelés után tapasztalható a gyökérben. Hasonlóan a gyökérhez a kezelést követően a levélben is magas PC akkumulációt mértünk, ami arra enged következtetni, hogy a gyökérben szintetizálódott PC-t a xilémen keresztül a növény transzportálta a levélbe, hiszen a fitokelatinszintáz (PCS) enzim aktivitása nem emelkedett a kontrolhoz képest. Vagyis a PC mennyisége gyökérben a NaSA kezelések esetén a legnagyobb, míg sem a Cd kezelés, sem a SA kezelések nem növelték meg olyan mértékben. 83

91 Viszont a fitokelatin-szintáz (PCS) enzim aktivitása ugyanakkora volt a kontrollban, mint a NaSA kezelések esetén. A legnagyobb enzimaktivitást a SA előkezelés utáni Cd adagolás okozta a gyökérben, míg a PC tartalom alacsony volt. A PC tartalom a levélben leginkább a SA előkezelés után és az együttesen adagolt Cd hatására nőtt, de a PCS aktivitása a levélben nem volt drámai. Ez arra enged következtetni, hogy a SA előkezelés utáni Cd adagolás során a gyökérből, ahol a PCS aktivitása magas volt, a PC transzportálódott a levélbe. A SA és Cd együttes adagolás során is magas PC tartalmat tapasztatunk levélben, de ott a PCS aktivitása is emelkedett, vagyis ebben az esetben a PC a levélben szintetizálódik. A PC prekurzora, a redukált glutation (GHS) is fontos szerepet játszik a nehézfémek fitoextrakciójában, hiszen közreműködik a fémkelatálásban, a kompartmentációban, a homeosztázis fenntartásában, az antioxidatívvédelemben és a szignáltranszdukcióban is (Jozefczak és mtsai, 2012). Valóban a GHS hatékonyan kelatálja a Cd-t élő szervezetekben, így egy nem toxikus formát alakít ki a Cd-mal (Delalande és mtsai, 2010). Általában, a γecs enzim a limitáló enzim a GSH szintézisében, nem a GSHS (Galant és mtsai, 2011). Habár farkasbogyóban (Lycium chinense) a Cd stressz körülmények között a γecs gének nem voltak hatással az endogén SA-ra, míg az LcGSHS traszkripciós szintje szingifikánsan megnőtt a GSHS enzim aktivitásával együttesen (Guan és mtsai, 2015). Ez a növekedés az LcGSHS tranckripciós szintjében lecsökkent amikor a növényeket 2-aminoindan-2-foszfát savval (AIP) kezelték, mely gátolja a SA bioszintézisét,. Vagyis a Cd-függő LcGSHS transzkripciójnak expresszióját kontrolálja vagy legalábbis részben kontrolálja az endogén SA-függő útvonal (Guan és mtsai, 2005). B. juncea növényekben azt tapasztalták, hogy a jelenlevő Cd egy bizonyos küszöb-arány fölé emeli a GSHS enzim aktivitását a szintézisben (Zhu és mtsai, 1999). A -EC tartalom a gyökérben a SA-előkezelés hatására lecsökkent, ami az előkezelés utáni és együttesen adagolt Cd hatására sem nőtt meg kifejezetten. A GSH mérés esetén ugyanezt tapasztaltuk, vagyis lecsökkent a SA előkezelés hatására és az előkezelés utáni, és együttesen adagolt Cd hatására sem változott. A NaSA előkezelés hatására a -EC nem változik, de a NaSA előkezelés utáni és együttesen adagolt Cd hatására megnő, valamint a - ECS aktivitása is fokozódik. A NaSA előkezelés hatására a GSH mennyisége megnő a gyökérben, bár az előkezelés utáni és együttesen adagolt Cd lecsökkenti azt, de fokozza a GSHS aktivitását és nagymértékű PC akkumulációt is tapasztatunk. Ez arra enged következtetni, hogy a PC szintézisére fordítódott a GSH. A NaSA előkezelés hatására a redoxipotenciál a kontrollhoz közeli érték maradt, míg minden más kezelés hatására megnőtt, 84

92 vagyis azt lehet mondani, hogy a NaSA használ a növényeknek, jobb kondícióban lesznek a kezelést követően, a számításaink alapján (Schafer és Buettner, 2001). A növények jó kondícióját a fiziológia paraméterek (gyökéréletképesség, levelek membránpermeábilitás vizsgálata, fotoszintetikus paramétereket vizsgálata, vagyis az optimális kvantumhatásfok, az effektív kvantumhatásfok, a nem fotokémiai kioltás) is alátámasztják. A -EC mennyisége levélben mind a SA mind a NaSA előkezelés hatására lecsökken, míg az előkezelések utáni és együttesen adagolt, valamint önmagában alkalmazott Cd hatására megnőtt, de a legdrasztikusabban a NaSA és Cd együttes adagolásának a hatására, mint a GSH tartalom is. A redoxipotenciálokban ezen kezelés során tapasztaltuk a legnegatívabb értéket is a Cd-os kezelések közül, ami a kontrollnál is jobb volt, hasonlóan a NaSA előkezeléshez. Vagyis a γecs és a GSHS enzimek aktivitása megnőtt a Cd kezelés során, de csak a NaSA-val kezelt növények gyökerében. A GSH mennyiségének növekedés a gyökérben lehetett a NaSA kezelésre a növény válasza, amit a Cd kezelés után is fenntartott és a termelt GSH a PC szintézise során felhasználódott. A gyökérben a γec mennyiségének növekedése a Cd-kezelt és a NaSA-val kezelt növényekben volt szignifikáns. Tehát a GSH szintézisére fiatal kukorica növényekben Cd stressz során a NaSA volt hatással és nem a SA. Korábban már kimutatták, hogy az SA kezelés csökkenti a Cd által okozott oxidatív stressz sérüléseket (Popova és mtsai, 2009). A keletkező H2O2 abiotikus stressz során részt vesz a szignalizációs kaszkád rendszerben, és megnöveli a ROS mennyiségét ami kölcsönhat az SA-val. Ezért igyekeztünk alaposan megvizsgálni a Cd hatását a fotoszintetikus folyamatokra és az MDA tartalomra is, de szignifikáns különbséget nem tapasztaltunk, habár szignifikáns változásokat mértünk az antioxidáns rendszerben, ami jelzi, hogy indukálódott a redoxszignalizáció is. Az SA kezelés csökkentette az MDA mennyiségét a gyökérben Cd kezelés után, míg a NaSA kezelés növelte. A SA előkezelés drámain növelte a kataláz (KAT) aktivitását, míg a NaSA moderált változást idézett elő, ami Cd kezelés hatására megnőtt. Hasonlóan rizsben a peroxidázok (POD) aktivitása növekedett SA hatására, előidézve annak Cd toleranciáját (Singh és Shang, 2015). A G(POD) aktivitása szintén megnövekedett SA kezelés hatására a kukorica növényekben, míg a NaSA kezelés után lecsökkent. Ezek a változások okozhatják a különböző oxidatív stressz szinteket a gyökérben a különböző SA formák kezelése során. Az APX enzim aktivitása a SA előkezelés során nőtt, míg az aszkorbáttartalom csökkent mind a levélben mind a gyökérben. A SA-előkezelés utáni és az együttesen adagolt Cd is kifejezettebbé tette az enzimaktivitás növekedését levélben, noha az előkezelés után 85

93 adagolt Cd kismértékben csökkentette az aszkorbát mennyiségét. Ellentétben ezzel, az aszkorbát tartalom drasztikusan csökkent az SA előkezelés utáni és együttesen adagolt Cd hatására, míg az enzim aktivitása nem növekedett. A nagy mennyiségű endogén aszkorbát is esszenciális szerepet játszik az antioxidáns kapacitásban és a növény oxidatív károsodásától való védelmében. A SA kezelés és a Cd stressz is csökkentette az aszkorbát (AsA) mennyiségét, ellenben a NaSA kezeléssel. Egy bizonyos mértékben az AsA csökkenése szabályos, hiszen a GSH redukálása során felhasználja, hogy oxidált GSSG képződjön glutation-reduktáz (GR) enzim hatására. Alacsonyabb GSH/GSSG arány található a vad típusú Arabidopsisban, mint az SA hiányos transzgenikus vonalakban (Zawoznik és mtsai, 2007). Ezzel ellentétben magasabb endogén SA szint található Cd-toleráns búza növényekben megnövekedett GSH/GSSG arány mellett Cd stressz alatt, vagyis amíg megnövekedett a GR aktivitása, addig stimulálta az antioxidáns és a fém detoxifikáló rendszert és megnőtt a Cd toleranciája is (Kovács és mtsai, 2014a). A legmagasabb GR aktivitást a NaSA előkezelés után gyökérben mértük, ami extrém magas GSH/GSSG arányt eredményezett. A glutation-stranszferáz (GST) aktivitása, mely szintén a GSH-hoz kapcsolódó enzim, szintén növekedett NaSA vagy Cd kezelés után is, míg a SA kezelés után csökkent. A GSH mennyiségének változás és a GSH/GSSG (vagyis a redukált glutation és az oxidált glutation) arányának csökkenésének hatására a sejtnek csökken a kapacitása és a redukciós potenciálja (EGSSG/2GSH) is melyek stresszmarkerek (Schafer és Buettner, 2006). Nem változott az EGSSG/2GSH arány a NaSA előkezelés során, míg a Cd és SA kezeléskor megnőtt. Az alacsonyabb EGSSG/2GSH a NaSA előkezeléskor indikátora lehet a Cd toleranciának, hiszen a EGSSG/2GSH alacsonyabb, vagyis neagtívabb érték volt azokban az átokhínár (Elodea canadensis) növényekben, melyek Cd toleránsak mint a Cd szenzitív növények esetén Cd kezelés után (Török és mtsai, 2015). Ezen eredmények tükrében tehát a GSH-rokon antioxidáns enzimek működését a NaSA támogatta, míg valószínűleg az egyéb antioxidáns enzimeket a SA befolyásolta. Az antioxidáns enzimek közül a GR enzim aktivitása növekedett a SA előkezelés hatására, de a GSSG:GSH aránya nem változott. A SA előkezelés utáni Cd adagolás a GR aktivitását növelte és a tiolok arányát csökkentette, de nem olyan drámai a változás, mint az együttes adagolás hatására a levélben. A redoxipotenciál viszont nem változott nagymértékben, vagyis a növény élőképes maradt (Freya és mtsai, 2001.). Habár az arány csak kismértékben csökkent, a GSSG csökkenő mennyiségéből keletkező GSH a szintetizálódó PC-okba épülhetett be, mert ebben az esetben a levélben szintetizálódott a PC. A gyökérben a SA előkezelés mind Cd kezelés nélkül, mind Cd kezeléssel kis mértékben csökkentette a GSSG:GSH arányát és a GST aktivitását, mint ahogyan búzában 7 napon 86

94 keresztüli Cd kezelés után is (Gajewska és mtsai, 2013). Míg a GSSG-t csak a SA előkezelés utáni Cd adagolás csökkentette, vagyis a GSH a PC-ba épült be, ami transzportálódik a gyökérből a levélbe. Ezzel ellentétben áll, hogy Arabidopsisban megfigyelték, hogy az ABCC-típusú transzporterek a PC-Cd komplexeket a vakuolumba szegregálják (Park és mtsai, 2012). A NaSA-kezelés a gyökérben önmagában növelte a GR és GST enzimek aktivitását, bár a GSSG:GSH arányt nem befolyásolta, míg a Cd-mal való együttes adagolás az enzimek aktivitását csökkentette. Ez a kezelés a PC-ok mennyiségét növelte, annak ellenére, hogy a PCS enzim aktivitása nem volt magas. Mivel a mintákat az 1 napos kezelés után szedtük, így lehetséges, hogy a PC termelődés intenzív szakasza már lezárult. Összefoglalva a Cd főként a gyökérben akkumulálódik előkezelés nélkül, de az előkezelések hatására, főként a SA és Cd együttes adagolása során intenzíven transzportálódik a levélbe. A SA előkezelés utáni Cd adagolás során a PC-ok mennyisége a levélben nő meg, míg a PCS aktivitása a gyökérben kifejezett, vagyis a növény transzportálja a gyökérben szintetizált PC-t a levélbe. Ezzel ellentétben a SA előkezeléssel együttesen adagolt Cd kezelés során a levélben szintetizálódik és a levélben is marad a PC. A NaSA előkezelés jót tett a növényeknek a fotoszintetikus (effektív kvantumhatásfok és a nemszabályzott kioltás) értékek alapján, valamint a redoxipotenciálja is jobb értékű, mint a kontrollnak, vagyis hatékony védő vegyület lehet. Cd stressz során a SA és a NaSA is számtalan védőmechanizmust indukált, habár ezek hatékonysága és mechanizmusa különböző volt. A mi kísérleti beállításunkban a NaSA előkezelés utáni Cd stressz bizonyult a legjobbnak a védő mechanizmusok beindulása szempontjából. A SA és NaSA más módon hathatott az antioxidáns rendszerre. A hatása a SA-nak és a NaSA-nak a nehézfémek transzportjára is más lehet. A SA főként megkönnyíti a Cd transzportját a levelekbe, míg a NaSA megnöveli a PC mennyiségét a gyökérben. Az egzakt ok a másként hatásra még várat magára, hiszen az egyik sav, a másik só, így lehetséges, hogy a közeg ph-ja vagy az ionerőssége is szerepet játszik ebben. Akárhogyan is, sem a NaSA oldat sem az előkezelés NaSA-val vagy SA-val nem változtatta meg szignifikánsan a tápoldat ph-ját ebben az esetben, tehát a különbség nem lehet csak a ph hatása. A munkánk során feltártuk a SA sav és só formái közötti védőhatás különbségét Cd stressz során. Ezek a különbségek arra is felhívják a figyelmet, hogy fontos és korrekt módon csak úgy lehet interpretálni a SA hatásának vizsgálatát növényeken, ha odafigyelünk a kezeléshez használt vegyület pontos összetételére, mert mint látható, más mechanizmus szerint hat, ha más formában adagolják a SA-t. 87

95 7. Összefoglalás Munkánk során különböző exogén SA-kezelések hatásait vizsgáltuk. Az első kísérletsorozatban kétféle exogén kezelést használtunk, a magok SA-oldatba való áztatását, és a fiatal növények tápoldatához való SA-adagolást. Ehhez modellnövényül búzát (Triticum aestivum L.) alkalmaztunk. A következő sorozatban a különböző SAformák hatását vizsgáltuk Cd-stressz során, melyhez modellnövényként kukoricát (Zea mays L.) használtunk. Az eredményeket az alábbiakban foglalhatjuk össze: Az MDA mennyisége csak a levélben nőtt meg a SAh kezelt búzanövényekben. A PSII kvantumhatékonyságának csökkenése nem volt drasztikus, vagyis a kezelés nem okozott komoly károkat a növényben. A SA a kezelés utáni napon minden mért frakcióban megnövekedett, de 7 nappal később lecsökkent. Míg az ohca mennyisége is megnőtt a kezelés után, és tovább nőtt 7 nappal később is a szabad frakcióban. A BA mennyisége a kezelés után megnőtt, de 7 nappal később lecsökkent. A SAss növények nem mutattak stressztüneteket. A SA bioszintézisében résztvevő komponensek nem mutattak változást a kezelés során a kontrollhoz képest. A CA a SAh kezelés után megnövekedett, de mivel a flavonoidok is CA-ból szintetizálódnak, így nagyon kis mértékben növekedett meg. A kaempferol a SAh kezelés után lecsökkent. A kvercetin mennyisége megnőtt a szabad frakcióban levélben, továbbá belőle szintetizálódott a rutin, aminek a mennyisége szintén megnőtt. A felvett Cd a kezeletlen kukoricanövények esetén a gyökérben akkumulálódott, míg az előkezelések hatására a felvett Cd transzportálódott a gyökerekből a levelek irányába. A felvett Cd mennyisége abszolút értékben a kezeletlen növények esetén magasabb volt, mint a kezelt növények esetén. A NaSA előkezelést kapott növények a fotoszintetikus mérések és GSH redoxpotenciál-számítás alapján is egészségesebb állapotban voltak, mint a kontroll növények, vagyis a NaSA-kezelés növeli a növények stressztűrését. A SA előkezelés után adagolt Cd hatására a gyökérben szintetizálódott fitokelatin a levélbe transzportálódott, míg a SA és Cd együttes adagolására a fitokelatin a levélben szintetizálódott. 88

96 8. Summary In the course of this work the effect of various exogenous SA treatments was investigated. In the first series of experiments two types of exogenous treatment were applied: soaking the seeds in SA solution, and adding SA to the nutrient solution of young plants. In these experiments the model plant was wheat (Triticum aestivum L.). The following series of experiments, which examined the effects of various SA forms during Cd stress, the model plant was maize (Zea mays L.). The results can be summarised as follows: In wheat plants in the SAh treatment the quantity of MDA only increased in the leaves. The decline in the quantum efficiency of PSII was not drastic, suggesting that the treatment did not cause serious damage to the plants. On the day after the treatment the quantity of SA increased in all the fractions recorded, but had decreased again 7 days later. The ohca quantity also rose after the treatment, and was even higher in the free fraction after 7 days. Although the quantity of BA increased after the treatment, it declined again 7 days later. The SAss plants exhibited no stress symptoms. In the course of the treatment, components involved in SA biosynthesis showed no change compared with the control. CA also increased after the SAh treatment, but as flavonoids are also synthesised from CA, the increase was very slight. The quantity of kaempferol decreased after the SAh treatment, while that of quercetin rose in the free fraction in the leaves. The quantity of rutin, which is synthesised from quercetin, also increased. The Cd taken up by untreated maize plants accumulated in the roots, while preliminary treatment with SA resulted in the transport of adsorbed Cd from the roots into the leaves. The absolute quantity of Cd taken up by untreated plants was higher than in treated plants. On the basis of both photosynthesis and GSH redox potential calculations, plants pretreated with NaSA were in a healthier state than the control plants, indicating that NaSA treatment improved the stress tolerance of the plants. When Cd was applied after SA pretreatment, phytochelatin was synthesised in the roots and then transported into the leaves, while the joint application of SA and Cd resulted in phytochelatin being synthesised in the leaves. 89

97 9. Felhasznált irodalom Ádám, A., Bestwick, C.S., Barna, B., Mansfield, J.W. (1995): Enzymes regulating the accumulation of active oxygen species during the hypersensitive reaction of bean to Pseudomonas syringae pv. phaseolicola. Planta, 197: Agami, R. A., Mohamed, F.G. (2013): Exogenous treatment with indole-3-acetic acid and salicylic acid alleviates cadmium toxicity in wheat seedlings. Ecotoxicol. Environ. Safety, 94: Agati G., Biricolti S., Guidi L., Ferrini F., Fini A., Tattini M. (2011): The biosynthesis of flavonoids is enhanced similarly by UV radiation and root zone salinity in L. vulgare leaves, J. Plant Physiol. 168: Agati, G., Azzarello, E., Pollastri, S., Tattini, M. (2012): Flavonoids as antioxidants in plants: Location and functional significance. Plant Science 196: Ahmad, I., Khaliq, T., Ahmad, A., Shahzas, M., Basra, A., Hasnain, Z., Ali, A. (2012): Effect of seed priming with ascorbic acid, salicylic acid and hydrogen peroxide on emergence, vigor and antioxidant activities of maize. Afr.J. Bioltech. 11(5): Aravind, P., Prasad, M.N.V. (2005): Cadmium±Zinc interactions in a hydroponic system using Ceratophyllum demersum L.: adaptive ecophysiology, biochemistry and molecular toxicology Braz. J. Plant Physiol., 17(1):3-20. Bandurska H., Cieślak M. (2013): The interactive effect of water deficit and UV-B radiation on salicylic acid accumulation in barley roots and leaves. Environ. Exp. Bot Benavides, M.P., Gallego, S.M., Tomaro, M.L. (2005): Cadmium toxicity in plants. Braz. J Plant Physiol. 17: Bielawski, W., Joy, K.W. (1986): Properties of glutathione reductase from chloroplasts and roots of pea. Phytochem., 25: Borsani, O., Valpuesta, V., Botella, M., A., (2001) Evidence for a role of salicylicacid in the oxidative damage generated by NaCl and osmotic stress in Arabidopsis seedlings. Plant Physiol 126: PMID:

98 Bradford, M.M. (1976): A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem., 72: Brown, J.E., Khodr, K., Hider, R.C., Rice-Evans, C.A. (1998): Structural dependence of flavonoid interactions with Cu(II) ions: implication for their antioxidant properties, Biochem. J. 339: Catinot, J., Buchala, A., Abou-Mansour, E., Métraux, J.P. (2008): Salicylic acid production in response to biotic and abiotic stress depends on isochorismate in Nicotiana benthamiana. FEBS Letters, 582: Chaffei, C., Pageau, K., Suzuki, A., Gouia, H., Ghorbel, M.H., Masclaux-Daubresse, C. (2004): Cadmium toxicity induced changes in nitrogen management in Lycopersicum esculentum leading to a metabolic safeguard through an amino acid storage strategy. Plant Cell Physiol. 45: Chalapathi-Rao, A.S.V., Reddy, A.R. (2008): Glutathione reductase: a putative redox regulatory system in plant cells. In Sulfur assimilation and abiotic stresses in plants. in Khan, N.A., Singh, S., Umar, S. (eds), Springer, The Netherlands Chen, J., Zhou, J., Goldsbrough, P.B. (1997): Characterization of phytochelatin synthase from tomato. Physiol. Plant., 101: Chong, J., Pierrel, M.A., Atanassova, R., Werck-Reichhart, D., Fritig, B., Saindrenan, P. (2001): Free and conjugated benzoic acid in tobacco plants and cell cultures. Induced accumulation upon elicitation of defence responses and role as salicylic acid precursors. Plant Physiol., 125: Conn, S., Gilliham M. (2010): Comparative physiology of elemental distributions in plants. Ox. J. Sci. & Mat. An. Bot. 105(7): Crisp, P. A., Ganguly, D., Eichten, S. R., Borevitz, J. O., and Pogson, B. J. (2016):. Reconsidering plant memory: intersections between stress recovery, RNA turnover,andepigenetics. Sci.Adv.2, e doi: /sciadv Dat, J.F., Lopez-Delgado, H., Foyer, C.H., Scott, I.M. (2000): Effects of salicylic acid on oxidative stress and thermotolerance in tobacco. J. Plant Physiol., 156: de la Cruz, M.J., Garcia, H.S. (2002): Mango: Postharvest operations. In: Mejia, D.; Lewis, B. InPho Post-Harvest Compendium. AGSI/FAO. 91

99 Delalande, O., Desvaux, H., Godat, E., Valleix, A., Junot, C., Labarre, J. (2010): Cadmiumglutathione solution structures provide new insights into heavy metal detoxification. FEBS Journal 277: De Marco, A., Pinton, R., Fischer-Schliebs, E., Varanini, Z. (1995): Possible interaction between peroxidase and NAD(P) H-dependent nitrate reductase activities of plasma membranes of corn roots. J Exp Bot 46: Deisseroth, A., Dounce, A. (1970): Catalase: physical and chemical properties, mechanism of catalysis and physiological role. Physiol. Rev., 50: Dewdney, J., Reuber, T.L., Wildermuth, M.C., Devoto, A., Cui, J., Stutius, L.M., Drummond, E.P., Ausubel, F.M. (2000): Three unique mutants of Arabidopsis identify EDS loci required for limiting growth of a biotrophic fungal pathogen. The Plant Journal 24: Dixit, V., Pandey, V., Shyam, R. (2001): Differential oxidative responses to cadmium in roots and leaves of pea (Pisum sativum L cv. Azad), J. Exp. Bot. 52: Dixon, R.A., Paiva, N.L. (1995): Stress-Induced Phenylpropanoid Metabolism. Plant Cell. 7(7): Dixon. D.P., Skipsey M., Edwards R. (2010): Roles for glutathione transferases in plant secondary metabolism, Phytochemistry 71(4): Doulis, A.G., Debian, N., Kingston-Smith, A.H., Foyer, C.H. (1997): Differential localization of antioxidants in maize leaves. Plant Physiol., 114: Edreva, A. (2005): Generation and scavenging of reactive oxygen species in chloroplasts: a submolecular approach. Agr., Ecosyst. Environ., 106: El-Basyouni, S.Z., Chen, D., Ibrahim, R.K., Neish, A.C., Towers, G.H.N. (1964): The biosynthesis of hydroxybenzoic acid in higher plants. Phytochem., 3: Fariduddin Q., Hayat S., Ahmad A. (2003): Salicylic acid influences net photosynthetic rate, carboxylation efficiency, nitrate reductase activity, and seed yield in Brassica juncea. Photosynthetica, 41: Foley, C.H., Navaratnam, D. J., McGarvey, E. J., Land, G., Truscott, Rice-Evans, C. A. (1999): Singlet oxygen quenching and the redox properties of hydroxycinnamic acids. Free Radic. Biol. Med. 26,

100 Foyer, C.H., Lelandais, M., Galap, C., Kunert, K.J. (1991): Effects of elevated cytosolic glutathione reductase activity on the cellular glutathione pool and photosynthesis in leaves under normal and stress conditions. Plant Physiol., 97: Foyer, C.H., Noctor, G. (2005): Oxidant and antioxidant signalling in plants: a reevaluation of the concept of oxidative stress in a physiological context. Plant, Cell and Environment 28: Foyer, C.H., Trebst, A., Noctor, G., (2006): Protective and signalling functions of ascorbate, glutathione and tocopherol in chloroplasts. In: Demmig-Adams, B., Adams, W.W. (Eds.), Advances in Photosynthesis and Respiration: Photoprotection, Photoinhibition, Gene Regulation, and Environment. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, The Netherlands, Frova, C. (2003): The plant glutathione transferase gene family: genomic structure, functions, expression and evolution, Physiol. Plant. 119: Fusconi, A., Gallo, C., Camusso, W. (2007): Effects of cadmium on root apical meristems of Pisum sativum L.: Cell viability, cell proliferation and microtubule pattern as suitable markers for assessment of stress pollution. Mutat. Res., 632: Gajewska, E., Głowacki, R., Mazur, J., Skłodowska, M. (2013): Differential response of wheat roots to Cu, Ni and Cd treatment: oxidative stress and defense reactions. Plant Growth Regul 71: Galant, A., Preuss, M., L., Cameron, J., C., Jez, J., M. (2011): Plant glutathione biosynthesis: diversity in biochemical regulation and reaction products. Front Plant Sci doi: /fpls Gallardo, C., Jimenez, L., Garcia-Conesa, M.-T. (2006): Hydroxycinnamic acid composition and in vitro antioxidant activity of selected grain fractions. Food. Chem. 99: Gallego, S.M., Pena, L.B., Barcia, R.A., Azpilicueta, C.E., Iannone, M.F., Rosales, E.P., Zawoznik, M.S., Groppa, M.D., Benavides, M.P. (2012): Unravelling cadmium toxicity and tolerance in plants: Insight into regulatory mechanisms. Environ. Exp. Bot. 83: 33:46. Garg N., Manchanda G. (2009): ROS generation in plants: boon or bane? Plant Biosys. 143:

101 Genty, B., Briantais, J.-M., Baker, N.R. (1989): The relationship between the quantum yield of photosynthetic electron transport and photochemical quenching of chlorophyll fluorescence. Biochim Biophys Acta 990: Ghai, N., Setia, R.C., Setia, N. (2002): Effects of paclobutrazol and salicylic acid on chlorophyll content, hill activity and yield components in Brassica napus L. (cv. GSL- 1). - Phytomorphology 52: Gill, S.S., Tuteja, N. (2010): Reactive oxygen species and antioxidant machinery in abiotic stress tolerance in crop plants. Plant Physiol Biochem 48(12): Gondor, O.K., Janda, T., Szalai, G. (2013): Comparative study of viability measurement methods in crop plants, Acta Agronomica Hungarica 61:(3) Gondor, O.K., Janda, T., Soós, V., Pál, M., Majláth, I., Adak, M.K., Balázs, E., Szalai, G. (2016b): Salicylic Acid Induction of Flavonoid Biosynthesis Pathways in Wheat Varies by Treatment. Front. Plant Sci. 7:1447. doi: /fpls Gondor O.K., Pál, M., Darkó, É., Janda, T., Szalai, G. (2016a): Salicylic acid and sodium salicylate alleviate cadmium toxicity to different extents in maize (Zea mays L.). PLoSONE 11(8): e doi: /journal.pone Grant, J.J., Loake, G.J. (2000): Role of reactive oxygen intermediates and cognate redox signaling in disease resistance. Plant Physiol., 124: Guan, C., Ji, J., Jia, C., Guan, W., Li, X., Jin, C. (2015): A GSHS-like gene from Lycium chinense maybe regulated by cadmium-induced endogenous salicylicacid and overexpression of this gene enhances tolerance to cadmium stress in Arabidopsis. Plant Cell Rep 34: Gunse, B., Llugany, M., Poschenrieder, C., Barcelo, J. (1992): Growth, cell wall elasticity and plasticity in Zea mays L. coleoptiles exposed to cadmium. Suelo y Planta, 2: Gutiérrez-Coronado, M.A., Trejo-López, C., Larqué-Saavedra, A. (1998): Effect of salicylic acid on the growth of roots and shoots in soybean. Plant Physiol Biochem 36: Hamberger, B., Ellis, M., Friedmann, M., Souza, C., Barbazuk, B., Douglas, C.J. (2007): Genome-wide analyses of phenylpropanoid-related genes in Populus trichocarpa, Arabidopsis thaliana, and Oryza sativa: the Populus lignin toolbox and conservation and diversification of angiosperm gene families.can J Bot 2007, 85:

102 Harper, J.R., Balke, N.E. (1981): Characterization of the inhibition of K + absorption in oats roots by salicylic acid. Plant Physiol., 68: Hatch, D., J., Jones, L., H., P., Burau, R., G. (1988): The effect of ph on the uptake of cadmium by four plantspecies grown in flowing solution culture. Plant Soil 105: Havaux, M., and Kloppstech, K. (2001). The protective functions of carotenoid and flavonoid pigments against excess visible radiation at chilling temperature investigated in Arabidopsis npq and tt mutants. Planta 213, Hayat, Q., Fariduddin Q., Ali B., Ahmad A. (2005): Effect of salicylic acid on growth and enzyme activities of wheat seedlings. Acta Agronomica Hungarica, 53: Hayat, Q., Hayat, S., Irfan, M., Ahmad, A. (2010): Effect of exogenous salicylic acid under changing environment: A review. Environ. Exp. Bot. 68: Hegedüs, A., Erdei, S,. Horváth, G. (2001): Comparative studies of H2O2 detoxifying enzymes in green and greening barley seedlings under cadmium stress. Plant Sci. 160(6): Heim, K.E., Tagliaferro, A.R., Bobilya, D.J. (2002): Flavonoid antioxidants: chemistry, metabolism and structure-activity relationships. J Nut. Biochem. 13: Hell, R., Bergmann, L. (1990) -Glutamylcysteine synthetase in higher plants: catalytic properties and subcellular localisation. Planta 180, Hell, R., Bergmann, L. (1988) Glutathione synthetase in tobacco suspension cultures: catalytic properties and localisation. Physiol. Plant. 72, Hernandez, I., Alegre, L., Munne-Bosch, S. (2004): Drought-induced changes in flavonoids and other low molecular weight antioxidants in Cistus clusii grown under Mediterranean field conditions. Tree Physiol. 24: Horváth, E., Szalai, G., and Janda, T. (2007): Induction of abiotic stresstolerance by salicylic acid signaling. J. Plant Growth Reg Hsu, Y.T., Kao, C.H. (2004): Cadmium toxicity is reduced by nitric oxide in rice leaves, Plant Growth Regul. 42: Hussein, M.M., Balbaa, L.K., Gaballah M.S. (2007): Salicylic acid and salinity effects on growth of maize plants. Res. J. Agric. &Biol. Sci., 3(4):

103 Janda, T., Gondor, O.K., Yordanova, R., Szalai, G., Pal, M. (2014): Salicylic acid and photosynthesis: signalling and effects. Act. Physiol. Planta. 36:(10): Janda, T., Szalai, G., Leskó, K., Yordanova, R., Apostol, A., Popova, L.P. (2007):Factors contributing to enhanced freezing tolerance in wheat during frost hardening in the light Phytochemistry 68:(12) Janda, T., Szalai, G., Tari, I., Páldi, E. (1999): Hydroponic treatment with salicylic acid decreases the effect of chilling injury in maize (Zea mays L.) plants. Planta 208: Jozefczak, M., Remans, T., Vangronsveld, J., Cuypers, A. (2012): Glutathione is a keyplayer in metal-induced oxidative stress defenses. Int J Mol Sci 13: Kadioglu, A., Saruhan, N., Saglam, A., Terzi, R., Acet, T. (2014): Exogenous salicylic acid alleviates effects of long term drought stress and delays leaf rolling by inducing antioxidant system. Plant Growth Reg. 64: Kaplan, F., Kopka, J., Haskell, D.W., Zhao, W., Schiller, K.C., Gatzke, N., Sung, D.Y., Guy, C.L. (2004): Exploring the temperature-stress metabolome of Arabidopsis. Plant Physiol, 136: Kátai János (2011): Alkalmazott talajtan, kiadó: Debreceni Egyetem, Nyugat-Magyarországi Egyetem, Pannon Egyetem Keilig K., Ludwig-Müller, J. (2009): Effect of flavonoids on heavy metal tolerance in Arabidopsis thaliana seedlings. Bot Stud. 50: Khan, N.A., Samiullah, S., Singh, R., Nazar, R. (2007): Activities of antioxidative enzymes, sulphur assimilation, photosynthetic activity and growth of wheat (Triticum aestivum) cultivars differing in yield potential under cadmium stress, J. Agro. Crop Sci. 193: Khan, W., Prithiviraj, B., Smith, D.L. (2003): Photosynthetic responses of corn and soybean to foliar application of salicylates. J. Plant Physiol. 160: Kilian, J., Whitehead, D., Horak, J., Wanke, D., Weinl, S., Batistic, O., D'Angelo, C., Bornberg-Bauer, E., Kudla, J., Harter, K.(2005): The AtGenExpress global stress expression data set: protocols, evaluation and model data analysis of UV-B light, drought and cold stress responses. Sci. 307(5710):

104 Klämbt, H.D. (1962): Conversion in plants of benzoic acid to salicylic acid and its βdglucoside. Nature, 196: 491. Knox, J.P., Dodge, A.D. (1985): Singlet oxygen and plants. Phytochem., 24: Kocsy, G., Szalai, G. Sutka, J., Páldi, E., Galiba, G. (2004): Heat tolerance together with heat stress-induced changes in glutathione and hydroxymethylglutathione levels is affected by chromosome 5A of wheat. Plant Sci., 166: Kocsy, G., von Ballmoos, P., Rüegsegger, A., Szalai, G., Galiba, G., Brunold, C. (2001): Increasing the glutathione content in a chilling-sensitive maize genotype using safeners increased protection against chilling-induced injury. Plant Physiol., 127: Kosova, K., Prasil, I.T., Vitamvas, P., Dobrev, P., Motyka, V., Flokova, K., Novak, O., Turecková, V., Rolcik, J., Pesek, B., Travnickova, A., Gaudinova, A., Galiba, G., Janda, T., Vlasakova, E., Prasilova, P., Vankova, R. (2012): Complex phytohormone responses during the cold acclimation of two wheat cultivars differing in cold tolerance, winter Samanta and spring Sandra. J Plant Physiol. 169: Kovács, K., Kuzmann, E., Vértes, A., Lévai, L., Cseh, E., Fodor, F. (2009): Effect of cadmium on iron uptake in cucumber roots: A Mössbauer-spectroscopic study. Plant and Soil 327: Kovács, V., Gondor, O., K., Szalai, G., Darkó, É., Majláth, I., Janda, T, (2014): Synthesis and role of salicylicacid in wheat varieties with different levels of cadmium tolerance. J Hazard Mat 280: Kramer, D.M., Johnson, G., Kiirats, O., Edwards, G.E. (2004): New fluorescence parameters for the determination of q(a) redox state and excitation energy fluxes. Photosynth Res. 79(2): Krantev, A., Yordanova, R., Janda, T., Szalai, G., Popova, L. (2008): Treatment with salicylic acid decreases the effect of cadmium on photosynthesis in maize plants. J Plant Physiol 165: Kulikova, A.L., Kuznetsova, A.L., Kholodova, V.P. (2011): Effect of copper excess in environment on soybean root viability and morphology. Russ. J. Plant. Physl., 58,

105 Landry, L.G., Chapple, C.C.S., Last, R.L. (1995): Arabidopsis mutants lacking phenolic sunscreens exhibit enhanced ultraviolet-b injury and oxidative damage, Plant Physiol. 109: Lanot, A., Morris, P. (2005): Elicitation of isoflavan phytoalexins, in Márquez, A.J. (ed) Lotus Jappnicus Handbook, Springer, printed in Netherland Lee, H., León, J., Raskin, I. (1995): Biosynthesis and metabolism of salicylic acid. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: León, J., Lawton, M.A., Raskin, I. (1995): Hydrogen peroxide stimulates salicylic acid biosynthesis in tobacco. Plant Physiol., 108: León, J., Shulaev, V., Yalpani, N., Lawton, M.A., Raskin, I. (1995): Benzoic acid 2- hydroxylase, a soluble oxygenase from tobacco, catalyses salicylic acid biosynthesis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: Lepedus, H., Ceasar, V., Krsnik-Rasol, M. (2004): Guaiacol peroxidases in carrot root, food technol. Biotechnol. 42 (1): Lillo, C., Lea, U.S., Ruoff, P. (2008): Nutrient depletion as a key factor for manipulating gene expression and product formation in different branches of the flavonoid pathway, Plant Cell Environ. 31: Lin, K.-H., Yang, Y.-Y., Yang C.-M., Huang, M.-Y., Lo, H.-F., Liu, K.-C., Lin, H.-S., Chao, P.-Y. (2013): Antioxidant activity of herbaceous plant extracts protect against hydrogen peroxide-induced DNA damage in human lymphocytes. BMC Res. Not., 6:490. Lizada, M.C.C., Yang, S.F. (1979) A simple and sensitive assay for 1-aminocyclopropane-lcarboxylic acid. Anal. Biochem.100, Maitani, T., Kubota, H., Sato, K., Yamada, T. (1996): The composition of metals bound to class III metallothionein (phytochelatin and its desglycyl peptide) induced by various metals in root cultures of Rubia tinctorum. Plant Physiol. 110: Mannervik, B., Guthenberg, C. (1981): Glutathione transferase (Human placenta). Methods Enzymol., 77:

106 Martens, S., Preuss, A., and Matern, U. (2010). Multifunctional flavonoid dioxygenases: flavonol and anthocyanin biosynthesis in Arabidopsis thaliana L. Phytochemistry71, Matsumura, T., Tabayashi, N., Kamagata, Y., Souma, C., Saruyama, H. (2002): Wheat catalase expressed in transgenic rice can improve tolerance against low temperature stress, Physiol. Plant. 116: McNally, D.J., Wurms, K.V., Labbé, C., Quideau, S., Bélanger, R.R.(2003): Complex C- glycosyl flavonoid phytoalexins from Cucumis sativus. J Nat Prod. 66(9): Métraux, J.P. (2002): Recent breakthroughs in the study of salicylic acid biosynthesis. Trends Plant Sci., 7: Meuwly, P., Métraux, J. P. (1993): Ortho-anisic acid as internal standard for the simultaneous quantitation of salicylic acid and its putative biosynthetic precursors in cucumber leaves. Anal. Biochem., 214: Michalak, A. (2006): Pnenolic compounds and their antioxidant activity in plants growing under heavy metal stress. Pol J Environ Stud 15: pp Mittler, R. (2002): Oxidative stress, antioxidants and stess tolerance. Trends Plant Sci., 7: Mobin M, Khan, N.A. (2007): Photosynthetic activity, pigment composition and antioxidative response of two mustard (Brassica juncea) cultivars differing in photosynthetic capacity subjected to cadmium stress, J. Plant Physiol. 164: Moons, A. (2003): Osgstu3 and osgtu4, encoding tau class glutathione S-transferases, are heavy metal- and hypoxic stress-induced and differentially salt stressresponsive in rice roots, FEBS Lett. 553: Morel, M., Crouzet, J., Gravot, A., Auroy, P., Leonhardt, N., Vavasseur, A., Richaud, P., (2009): AtHMA3, a P1B-ATPase allowing Cd/Zn/Co/Pb vacuolar storage in Arabidopsis. Plant Physiol. 149: Nakabayashi, R,, Yonekura-Sakakibara, K., Urano, K., Suzuki, M., Yamada, Y., Nishizawa, T., Matsuda, F., Kojima, M., Sakakibara, H., Shinozaki, K., Michael, A.J., Tohge, T., Yamazaki, M., Saito, K. (2014b): Enhancement of oxidative and drought tolerance in Arabidopsis by overaccumulation of antioxidant flavonoids. Plant J. 77(3):

107 Nakabayashi, R., Mori, T., Saito, K. (2014a): Alternation of flavonoid accumulation under drought stress in Arabidopsis thaliana. Plant Signal Behav. 9(8): 295. Neill, S., Desikan, R., Hancock, J. (2002): Hydrogen peroxide signaling. Curr. Opin. Plant Biol., 5: Nocito, F.F., Lancilli, C., Crema, B., Fourcroy, P., Davidian, J.C., Sacchi, G.A. (2006): Heavy metal stress and sulfate uptake in maize roots. Plant Physiol. 141: Noctor, G., Foyer, C.H. (1998): A re-evaluation of the ATP: NADPH budget during C3 photosynthesis. A contribution from nitrate assimilation and its associated respiratory activity? J. Exp. Bot. 49: Noctor, G., Queval, G., Mhamdi, A., Chaouch, S., Foyer, C.H. (2011): Glutathione. The Arabidopsis Book 9: Ogawa, M., Yoshimori, T., Suzuki, T., Sagara, H., Mizushima, N., Sasakawa, C. (2014): Escape of intracellular Shigella from autophagy. Act. Physiol. Plant. 36 (10): Pál, M., Kovács, V., Vida, Gy., Szalai, G., Janda, T. (2013a): Changes induced by powdery mildew in the salicylic acid and polyamine contents and the antioxidant enzyme activities of wheat lines. Eur. J. Plant Pathol. 135:(1) Pál, M., Szalai, G., Kovacs, V., Gondor, O.K., Janda, T. (2013b): Salicylic acid-mediated abiotic stress tolerance in Hayat, Shamsul, Ahmad, Aqil, Alyemeni, Mohammed Nasser (Eds.): SA Plant Growth and Development, Pál, M., Horváth, E., Janda, T., Páldi, E., Szalai, G. (2006): Physiological changes and defence mechanisms induced by cadmium stress in maize. J. Plant Nutr. Soil Sci 169: Pan, Q., Zhan, J., Liu, H., Zhang, J., Chen, J., Wen, P., Huang, W. (2006): Salicylic acid synthesized by benzoic acid 2-hydroxylase participates in the development of thermotolerance in pea plants. Plant Sci., 171: Park, J., Song, W.Y., Ko, D., Eom, Y., Hansen, T.H., Schiller, M., Lee, T.G., Martinoia, E., Lee, Y. (2012): The phytochelatin transporters AtABCC1 and AtABCC2 mediate tolerance to cadmium and mercury. Plant J. 69(2):

108 Pastori, G., Foyer, C.H. (2002): Common components, networks, and pathways of crosstolerance to stress. The central role of redox and abscisic acid-mediated controls. Plant Physiol., 129: Peer, W.A., Murphy, A.S. (2006): Flavonoids as signal molecules: Targets of flavonoid action. In Peer, W.A., and Murphy, A.S. (eds.), The Science of Flavonoids. Springer, New York, Pollastri S., Tattini M. (2011): Flavonols: old compound for old roles, Ann. Bot. 108: Poór, P., Gémes, K., Horváth, F., Szepesi, Á., Simon, M.L., Tari, I. (2011): Salicylic acid treatment via the rooting medium interferes with stomatal response, CO2 fixation rate and carbohydrate metabolism in tomato, and decreases harmful effects of subsequent salt stress. Plant Biol 13: Poór, P., Tari, I. (2012): Regulation of stomatal movement and photosynthetic activity in guard cells of tomato abaxial epidermal peels by salicylic acid. Funct Plant Biol 39(12): Popova, L. P., Maslenkova, L. T., Yordanova, L. Y., Ivanova, A. P., Krantev, A. P., Szalai, G., et al. (2009). Exogenous treatment with salicylic acid attenuates cadmium toxicity in pea seedlings. Plant Physiol. Biochem. 47, doi: /j.plaphy Prochazkova, D., Sairam, R.K., Srivastava, G.C., Singh, D.V (2001): Oxidative stress and antioxidant activity as the basis of senescence in maize leaves. Plant Sci., 161: Qian, B., Gregorich, E.G., Gameda, S., Hopkins, D.W., Wang, X.L. (2011): Observed soil temperature trends associated with climate change in Canada. J. Geophys. Res. 116: Raes, J., Rohde, A., Christensen, J.H., Peer, Y.V., Boerjan, W. (2003): Genome-wide characterization of the lignification toolbox in arabidopsis. Am. Soc. Plant Biol. 133(3): Ramesara, N.S., Tavareza, M., Ebbsb, S.D., Sankaran, R.P. (2014): Transport and Partitioning of Lead in Indian Mustard (Brassica juncea) and Wheat (Triticum aestivum) Bioremed. J. 18(4):

109 Rauser, W.E., Meuwly, P. (1995): Retention of cadmium in roots of maize seedlings. Plant Physiol., 109: Reddy, A.R., Raghavendra, A.S. (2006): Photooxidative stress. in: Madhava Rao, K.V., Raghavendra, A.S., Reddy K.J. (Eds.), Physiology and Molecular Biology of Stress Tolerance in Plants. Springer, The Netherlands, Rivetta A, Negrini N, Cocucci M (1997): Involvement of Ca 2+ calmodulin in Cd 2+ toxicity during the early phases of radish (Raphanus sativus L.) seed germination. Plant Cell Environ. 20: Rohde, A., Morreel, K., Ralph, J. (2004): Molecular phenotyping of the pal1 and pal2 mutants of Arabidopsis thaliana reveals far-reaching consequences on phenylpropanoid, amino acid, and carbohydrate metabolism. Plant Cell, 16: Saito, K., Yonekura-Sakakibara, K., Nakabayashi, R., Higashi, Y., Yamazaki, M., Tohge, T., Fernie, A.R. (2013): The flavonoid biosynthetic pathway in Arabidopsis: Structural and genetic diversity. Plant Physiol. Biochem. 72: Samanta, A., Das, G., Das, S.K. (2011): Roles of flavonoids in plants. Int J Pharm Sci Tech 6 (1) Sanchez-Casas, P., Klessig, D.F. (1994): A salicylic acid-binding activity and a salicylic acidinhibitable catalase activity are present in a variety of plant species. Plant Physiol. 106(4): Sawada, H., Shim, I.S., Usui, K. (2006): Induction of benzoic acid 2-hydroxylase and salicylic acid biosynthesis Modulation by salt stress in rice seedlings. Plant Sci., 171: Scandalios, J.G., Guan, L., Polidoros, A.N. (1997): Catalases in plants: gene structure, properties, regulation and expression. In: Scandalios, J.G. (ed.) Oxidative stress and the molecular biology of antioxidant defenses. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York Schafer, F.Q., Buettner, G.R. (2001): Redox environment of the cell as viewed through the Redox state of the glutathione disulfide/glutathione Couple. Free Rad. Biol. & Med. 30(11): Scott, R.C., Schuldiner, O., Neufeld, T.P. (2004). Role and regulation of starvation-induced autophagy in the Drosophila fat body. Dev. Cell 7(2):

110 Semida, W.M., Rady, M.M. (2014): Pre-soaking in 24-epibrassinolide or salicylic acid improves seed germination, seedling growth, and anti-oxidant capacity in Phaseolus vulgaris L. grown under NaCl stress. J. Hort. Sci. & Biotechnol. 89(3): Shakirova, F.M. (2007): Role of hormonal system in the manisfestation of growth promoting and anti-stress action of salicylic acid. In: Hayat, S., Ahmad, A. (Eds.), Salicylic Acid, A Plant Hormone. Springer, Dordrecht, Netherlands, Shao, H.B., Chu, L.Y., Shao, M.A., Jaleel, C.A., Mi, H.M. (2008): Higher plant antioxidants and redox signaling under environmental stresses. CR Biol., 331: Simon, E. W. (1974), Phospholipids and plant membrane permeability. New Phytologist, 73: Singh, S., Khan, N.A., Nazar, R., Anjum, N.A. (2008): Photosynthetic traits and activities of antioxidant enzymes in blackgram (Vigna mungo L. Hepper) under cadmium stress, Am. J. Plant Physiol. 3: Singh, I., Shah, K. (2015): Evidences for suppression of cadmium induced oxidative stress inpresence of sulphosalicylicacid in rice seedlings. Plant Growth Regul 76: Smith, I.K., Vierheller, T.L., Thorne, C.A. (1988): Assay of glutathione reductase in crude tissue homogenates using 5,5 -dithiobis (2-nirtobenzoic acid). Anal. Biochem., 175: Solti, Á., Gáspár, L., Vági, P., Záray, Gy., Fodor, F., Sárvári, É. (2011): Cd, Fe and light sensitivity: interrelationships in Cd treated Populus. OMICS - A Journal of Integrative Biology. 15: Sousa, A.I., Cacador, I. Lillebo, A.I., Pardal, M.A. (2008): Heavy metal accumulation in Halimione portulacoides: Intra- and extra-cellular metal binding sites. Chemosphere 70(5): Steponkus, P.L. and Lanphear, F.O. (1967): Refinement of the triphenyl tetrazolium chloride method of determining cold injury. Plant Physiol. 42: Sticher, L., Mauch-Mani, B., Métraux, J.P. (1997): Systemic acquired resistance. Annu. Rev. Plant Pathol., 35:

111 Szalai, G., Dai, N., Danin, A., Dudai, N., Barazani. O. (2010): Effect of nitrogen source in the fertilizing solution on nutritional quality of three members of the Portulaca oleracea aggregate. J. Sci. Food and Agr. 90: Szalai, G., Janda, T. (2009b): Effect of salt stress on the salicylic acid synthesis in young maize (Zea mays L.) plants. J. Agron. Crop Sci. 195: Szalai, G., Janda, T., Pál, M. (2014): Routine sample preparation and HPLC analysis for ascorbic acid (vitamin C) determination in wheat plants and Arabidopsis leaf tissues. Acta Biol Hung. 65(2): Szalai, G., Krantev, A., Yordanova, R., Popova, L.P., Janda, T. (2013): Influence of salicylic acid on phytochelatin synthesis in Zea mays during Cd stress. Turkish Journal Of Botany 37:(4) Szalai, G., Pap, M., Janda, T. (2009a): Light-induced frost tolerance differs in winter and spring wheat plants, J. Plant Physiol. 166:(16): Tao, S., Sun, L., Ma, C., Li, L., Li, G., Hao,L. (2013): Reducing basal salicylicacid enhances Arabidopsis tolerance to lead or cadmium. Plant Soil 372: Tari, I., Nagy, M. (1994): Enhancement of extractable ethylene at light/dark transition in primary leaves of paclobutrazol treated Phaseolus vulgaris seedlings. Physiol. Plantarum, 90(2): Tattini, M., Galardi, C., Pinelli, P., Massai, R., Remorini, D., Agati, G. (2004): Differential accumulation of flavonoids and hydroxycinnamates in leaves of Ligustrum vulgare under excess light and drought stress, New Phytol. 163: Tayefi-Nasrabadi, H., Dehghan, G., Daeihassani, B., Movafegi, A., Samadi, A. (2011): Some biochemical properties of guaiacol peroxidases as modified by salt stress in leaves of salt-tolerant and salt-sensitive safflower (Carthamus tinctorius L.cv.) cultivars, Afr. J. Biotech. 10 (5): Taylor, L.P., Grotewold, E. (2005): Flavonoids as developmental regulators, Curr. Opin. Plant Biol. 8: Thomas, J.C., Perron, M., Davies, E.C. (2004): Genetic responsiveness to copper in the ice plant, Mesembryanthenuum crystallinum. Plant Sci., 167:

112 Torres, E., Cid, A., Fidalgo, P., Herrero, C., Abalde, J. (1997): Long-chain class III metallothioneins as a mechanism of cadmium tolerance in the marine diatom Phaeodactylum tricornutum Bohlin. Aquat Toxicol 39: Török, A., Gulyás, Z., Szalai, G., Kocsy, G., Majdik, C. (2015): Phytoremediation capacity of aquatic plants associated with the degree of phytochelatin polymerization. J Hazard Mat 299: Tsaniklidis, G., Delis, C., Nikoloudakis, N., Katinakis, P., Passam H.C., Aivalakis, G. (2014): l-ascorbic acid metabolism in parthenocarpic and seeded cherry tomatoes. Plant Growth Reg. 72(2) Vaculík, M., Landberg, T., Greger, M., Luxová, M., Stoláriková, M., Lux, A. (2012): Silicon modifies root anatomy, and uptake and subcellular distribution of cadmium in young maize plants. Ann Bot 110(2): Van Breusegem, F., Vranova, E., Dat, J.F., Inzé, D. (2001): The role of active oxygen species in plant signal transduction. Plant Sci., 161: Van Kooten, O., Snell, J.F.H. (1990): The use of chlorophyll fluorescence nomenclature in plant stress physiology. Photosynthesis Research 25: Wan, D., Li, R., Zou, B., Zhang, X., Cong, J., Wang, R., Xia, Y., Li, G. (2012). Calmodulinbinding protein CBP60g is a positive regulator of both disease resistance and drought tolerance in Arabidopsis. Plant Cell Rep Wang, Y., Hu, J., Qin, G., Cui, H., Wang, Q. (2012): Salicylic acid analogues with biological activity may induce chilling tolerance of maize (Zea mays) seeds. Botany Verloo, M., Willaert, G., Cottenie, A., (1986): Determination of the upper critical level soft heavymetals in plant sand soils. Studies Environ. Sci Wildermuth, M.C., Dewdney, J., Wu, G., Ausubel, F.M. (2001): Arabidopsis defence againts pathogens requires salicylic acid synthesized isochorismate synthase. Nature, Winkel-Shirley, B. (2001): Flavonoid Biosynthesis. A Colorful Model for Genetics, Biochemistry, Cell Biology, and Biotechnology. Plant Physiol. 126: , Yalpani, N., Léon, J., Lawton, M.A., Raskin, I. (1993) Pathway of salicylic acid biosynthesis in healthy and virus-inoculated tobacco. Plant Physiol., 103:

113 Yamasaki, H., Sakihama, Y., lkehara, N. (1997): Flavonoid-peroxidase reaction as a detoxification mechanism of plant cells against H2O2. Plant Physiol. 115: Zawoznik, M., S., Groppa, M., D., Tomaro, M., L., Benavides, M., P. (2007): Endogenous salicylicacid potentiates cadmium-induced oxidative stress in Arabidopsis thaliana. Plant Sci 173: Zenk, M. (1996) Heavy metal detoxification in higher plants: a review. Gene, 179, Zhao, H.J., Zhao, X.J., Ma, P.F., Wang, Y.X., Hu, W.W., Li, L.H., Zhao, Y.D. (2011) Effects of salicylic acid on protein kinase activity and chloroplast D1 protein degradation in wheat leaves subjected to heat and high light stress. Acta Ecol Sinica 31: Zhu, Y., L., Pilon-Smits, E., A., Jouanin, L., Terry, N. (1999): Overexpression of glutathione synthetase in Indian mustard enhances cadmium accumulation and tolerance. Plant Physiol 119:

114 10. Köszönetnyilvánítás Köszönöm az MTA Agrártudományi Kutatóközpont Mezőgazdasági Intézetének vezetőségének, hogy lehetővé tették ezen munka elvégzését és a disszertáció elkészítését. Köszönetemet szeretném kifejezni témavezetőmnek, Dr. Szalai Gabriellának, hogy munkámat irányította és türelemmel volt hozzám. Köszönöm Dr. Janda Tibornak a tanácsait és támogatását, amit az évek során kaptam. Külön köszönettel tartozom Dr. Pál Magdának, hogy támogatott és bizalommal fordulhattam hozzá minden időben. Köszönöm közvetlen kollégáimnak, Dr. Darkó Évának, Dr. Majláth Imrének, Dr. Kovács Viktóriának, Kövesdi Ferencnének és Janicskáné Oláh Tímeának kísérletek kivitelezése során nyújtott nélkülözhetetlen segítségüket és az általuk biztosított légkört. Köszönöm a Fitotron munkatársainak a növénynevelés során nyújtott segítségükért. Köszönöm mindazoknak a kollégáknak, akik bármilyen formában segítették a munkámat. Végül szeretném külön megköszönni Szüleimnek, hogy végig támogattak a dolgozat írása közben, és Férjemnek, hogy biztosította otthon a megfelelő légkört. Külön köszönöm Marci fiamnak, hogy hagyott írni, valamint Születendő Gyermekemnek, hogy türelemmel volt az írás alatt. 107

115 108