Gyógyszerhatóanyagok felszívódásának és szöveti megoszlásának modellezése in vitro nem sejtes módszerekkel

Átírás

1 BUDAPESTI MŰSZAKI ÉS GAZDASÁGTUDOMÁNYI EGYETEM VEGYÉSZMÉRNÖKI ÉS BIOMÉRNÖKI KAR OLÁH GYÖRGY DOKTORI ISKOLA Gyógyszerhatóanyagok felszívódásának és szöveti megoszlásának modellezése in vitro nem sejtes módszerekkel TÉZISFÜZET Szerző: Müller Judit Témavezető: Dr. Balogh György Tibor Konzulens: Dr. Hell Zoltán Richter Gedeon Nyrt. Szintézistámogató laboratórium 2017.

2 1. BEVEZETÉS A gyógyszerkutatás elsődleges célja olyan hatóanyagok azonosítása, melyek alkalmasak betegségek megelőzésére, gyógyítására, a tünetek enyhítésére, és ezeken keresztül az emberi életminőség javítására. A kutatás fejlesztés hosszú (12-15 év) és költséges (~1,5 milliárd USD) folyamat, melynek során nagy a vegyületek kiesésének kockázata, ezért fontos már a korai fázisban a sikeres klinikai kipróbálás esélyének növelésére törekvés. A kockázatok csökkentésének és a költséghatékonyság növelésének egyik alapvető eszköze a hatóanyagjelöltek biológiai aktivitásának és farmakokinetikai tulajdonságainak jellemzése. A Richter Gedeon Nyrt. originális kémiai kutatása a központi idegrendszerre (CNS) ható hatóanyagok azonosítására, fejlesztésére fókuszál. A Szintézistámogató laboratóriumban 2005 óta foglalkoznak kiterjedten a hatóanyagjelöltek korai fázisú fizikai-kémiai jellemzésével, ennek a kutatócsoportnak a munkájába kapcsolódtam be. Doktori munkám során elsődleges feladatom a hatóanyagjelöltek felszívódásának és szöveti megoszlásának előrejelzésére alkalmas in vitro nem sejtes kémiai modellek kidolgozása volt. 2. IRODALMI HÁTTÉR 2.1. Hatóanyagok in vitro permeabilitás mérése Parallel Artificial Membrane Permeability Assay (PAMPA) technika segítségével A gyógyszerhatóanyagok felszívódását és eloszlását, összességében biohasznosulását a legnagyobb mértékben a sejtek lipid kettősrétegén történő penetrációja határozza meg, melynek fizikai-kémiai értelemben vett jellemzője a permeabilitás. A permeabilitás általánosan egy vegyület lipidmembrán kettősrétegén történő átjutásának sebességét adja meg. A hatóanyagok permeabilitási sajátságának korai fázisú in vitro előrejelzésére széles körben elterjedt a Parallel Artificial Membrane Permeability Assay (PAMPA) módszer. A PAMPA modellt (1. ábra) Kansy és mtsai, a Hoffman-La Roche kutatói dolgozták ki a gasztrointesztinális felszívódás előrejelzésére (1998). 1 Egy 96-lyukú mérőtálcát (plate) töltöttek fel 7,4-es, vagy 6,5-ös ph-jú foszfát pufferrel (akceptor oldal), erre helyeztek egy ún. szűrőplate-et, melynek hidrofób membránjára valamilyen inert szerves oldószerben 1 M. Kansy és mtsai. J. Med. Chem. 41 (1998)

3 (pl. n-dodekán, n-hexadekán) feloldott lecitin került. Ezzel kívánták modellezni a biológiai membránokat. A szűrőplate-et az akceptor oldalival megegyező pufferrel töltötték fel, mely a vizsgálandó hatóanyagot is tartalmazta (donor oldal). Az így kialakult PAMPA-rendszer inkubálása után a donor és fogadó plate egyes rekeszeiben kialakult anyagkoncentráció spektrofotométeres meghatározására került sor. A koncentrációkból, a mérési időből és a membrán geometriájából kiszámított fluxust az ismert, humán intesztinális felszívódási (HIA%) adatokkal vetették össze, s azt találták, hogy a fluxussal jól közelíthetőek az in vivo értékek. 1. ábra A PAMPA rendszer elrendezése A PAMPA modell elterjedésével több kutatócsoport is módosította, továbbfejlesztette a technikát. Törekedtek a vegyületek szövet-specifikus felszívódásának modellezésére, így új módszereket dolgoztak ki a hatóanyagok gasztrointesztinális, vér-agy gáton keresztül és bőrön át történő felszívódásának előrejelzésére A szájüregi nyálkahártyán keresztüli hatóanyag bejuttatás A gyógyszerek szervezetbe juttatásának legegyszerűbb és leggyakoribb módja az orális adagolás. Vannak azonban olyan helyzetek, amikor a beteg nem akar, vagy nem tud együttműködni, ilyenkor alternatív adagolási módot kell választani. A nem invazív módszerek közül jól alkalmazhatóak pl. a szájüregi tapaszok, melyekből a szájüregi nyálkahártyán (bukkális mukózán) keresztül szívódnak fel a hatóanyagok. Ennek egyik előnye a gyors felszívódás. A szájüregi felszívódás előrejelzésére nincs széles körben elterjedt, standardizált in vitro modell. Kutatómunkám első célkitűzése egy, a szájüregből történő felszívódás előrejelzésére alkalmas PAMPA módszer kidolgozása volt. 3

4 2.3. A hatóanyagjelöltek transzportja a vér-agy gáton át A gyógyszeriparban a központi idegrendszeri célpontú kutatás egyik alapvető kihívása a hatóanyagjelölt molekulák átjuttatása a vér-agy gáton (blood-brain barrier, BBB), és a hatás helyének elérése. Ennek megfelelően az agyi penetráció korai fázisú előrejelzése kulcsfontosságú, melyet az is alátámaszt, hogy számos különböző in silico és in vitro prediktív modell jelent meg ennek becslésére. 2 Doktori munkám során a Di és mtsai 3 által kidolgozott PAMPA-BBB modellt kiindulási pontként tekintve finomhangoltuk a mérési módszert azzal a céllal, hogy a hatóanyagok permeabilitási sajátságairól pontosabb képet kapjunk, és ennek segítségével a vezérmolekula-optimálás során lehetőséget adjunk a különböző vegyületek agyi penetrációs készsége szerinti rangsorolására. Továbbá a PAMPA-BBB modellen kívántuk részletesen vizsgálni az egyes mérési körülmények változtatásának egyedi és együttes hatását az effektív permeabilitási és membránretenciós értékekre A foszfolipidózis (PLD) Foszfolipidózisnak (PLD) nevezzük a foszfolipidek túlzott felhalmozódását a sejtekben. 4 Ez a lipid-anyagcsere rendellenesség, mely szövetspecifikusan módosítja egyes sejtek fiziológiáját, mind a már kereskedelmi forgalomban levő gyógyszereknél, mind a gyógyszerkutatás és fejlesztésben problémát okoz. A jelenleg is alkalmazott gyógyszerkincs 5 %-ánál írták le a PLD megjelenését. A foszfolipidózist megfigyelések szerint általában a kationos amfifil gyógyszerek (CAD, hidrofób gyűrűs részt és hidrofil, bázikus amin funkcióval rendelkező oldalláncot tartalmazó vegyületek) ismételt adagolása váltja ki, embereknél és állatoknál egyaránt tapasztalható. A PLD azonosítása már a gyógyszerkutatás korai fázisában is nagy jelentőséggel bír. Több in silico 5, in vivo és in vitro 6 sejtes módszert is kifejlesztettek az előrejelzésére, ám ezek pontossága, illetve a kísérletes modell hatékonysága és áteresztőképessége nem mondható megfelelőnek nagyszámú molekula jó minőségű szűrésére. 2 J. Bicker és mtsai. Eur. J. Pharm. Biopharm., 87 (2014) L. Di és mtsai. Eur. J. Med. Chem., 38 (2003) W.H. Halliwell. Toxicol. Pathol., 25 (1997) J.P. Ploemen és mtsai. Exp. Toxicol. Pathol., 55 (2004) P. Vitovic és mtsai. J. Med. Chem., 51 (2008)

5 Doktori munkám során célunk volt egy új, az eddigiektől független, nagy áteresztőképességű, in vitro nem sejtes szövetspecifikus lipid-membránokon alapuló PAMPA modell kidolgozása a gyógyszer indukált foszfolipidózis előrejelzésére. 3. KÍSÉRLETI MÓDSZEREK A hatóanyagok penetrációjának vizsgálatára alkalmazott módszerünk a Parallel Artificial Membrane Permeability Assay (PAMPA) volt. A PAMPA mérések során a kialakult hatóanyag koncentrációkat folyadékkromatográfiás (HPLC-DAD) módszerrel határoztuk meg. A PAMPA-BBB mérésekből származó akceptor oldali puffer-oldatok DMSO-tartalmát lángionizációs detektorral kapcsolt gázkromatográfiás (GC-FID) rendszer segítségével állapítottuk meg. A fizikai-kémiai paraméterek (Mw, clogp, clogdph, TPSA, clogbb) in silico előrejelzése az alábbi programok segítségével történt: - Marvin 6.0.1, ChemAxon Kft. - ACD/Percepta, v2014, Advanced Chemistry Development, Inc., Toronto, ON, Canada. 4. EREDMÉNYEK 4.1. A szájüregi felszívódás előrejelzése PAMPA-modellel [I.] Doktori munkám során kidolgoztunk egy PAMPA módszert, mely előre jelzi a hatóanyagok szájüregi felszívódását. A PAMPA rendszer donor oldalán a nyálnak megfelelő ph 6,8-as, a fogadó oldalon a szisztémás keringésnek megfelelő ph 7,4-es puffert alkalmaztunk. 11 db vegyületet vizsgáltunk, az inkubálást 4 órán keresztül 37 o C-on végeztük. Különböző membránokat alkalmaztunk: tiszta oldószereket és foszfolipid oldatokat egyaránt. A kapott permeabilitási értékeket a szakirodalomban leírt 7 ex vivo sertés száj-nyálkahártya preparátummal végzett kísérletekből kapott látszólagos permeabilitási adatokkal (logkp) vetettük össze. Azt tapasztaltuk, hogy a n-dodekánnal végzett mérések permeabilitási eredményei közelítették legjobban (R 2 = 0,812) az ex vivo logkp értékeket (2. ábra). 7 A. Kokate és mtsai. Pharm. Res., 26 (2009)

6 2. ábra A vizsgált referencia vegyületek effektív permeabilitása (logp e) az optimált szájüregi PAMPA módszerrel az ex vivo logkp adatok függvényében 4.2. A PAMPA-BBB modell finomhangolása [II.] Munkám során vizsgáltuk a PAMPA rendszer változtatható paramétereinek hatását az agyi penetráció előrejelzésére. A vizsgált hatóanyagok PAMPA rendszerben kapott permeabilitási értékeit vetettük össze az ismert in vivo logbb adatokkal. Az inkubálást 4 órán át, 37 o C-on végeztük. A modell membránja sertés agyi lipid extraktum (PBLE, 10 m/v%) volt, melyet n-hexán: n-dodekán 3:1 elegyében oldottunk. Vizes közegként izo-ph = 7,4-es foszfát puffert, illetve 5 V/V% DMSO segédoldószert alkalmaztunk. Az általunk kidolgozott PAMPA-BBB rendszer révén az eddigieknél pontosabb előrejelző képességű in vitro modellt sikerült beállítanunk a hatóanyagok vér-agy gáton keresztüli átjutásának becslésére (3. ábra). 3. ábra A referencia vegyületek effektív permeabilitása (logp e) az optimált PAMPA-BBB módszerrel az in vivo logbb adatok függvényében 6

7 4.3. Természetes és félszintetikus ekdiszteroidok fizikai-kémiai jellemzése PAMPA-BBB és in silico modellekkel [III-IV.] A kutatócsoport korábbi vizsgálatai alapján a PAMPA-BBB modell kiterjeszthetőnek bizonyult természetes eredetű hatóanyagjelöltek vizsgálatára. Ezt kihasználva a Szegedi Tudományegyetem Farmakognóziai Intézet kutatói által izolált és előállított ekdiszteroidok vér-agy gáton keresztüli transzportját vizsgáltuk a PAMPA-BBB modell és in silico számítások segítségével. Az in vitro és in silico adatok alapján kiválasztottunk a vegyületcsaládból öt olyan vegyületet (E25, E30-E33), melyeket várható farmakokinetikai sajátságuk alapján érdemes lehet kijelölni a magasabb költségvonzatú in vivo preklinikai vizsgálatokra. Ezt követően in vitro neuroblasztomás sejtvonalon végzett vizsgálatok alapján mind az öt vegyületnél sikerült igazolni a tumor ellenes hatást A foszfolipidózis előrejelzése [V.] A foszfolipidózis előrejelzésére egy gradiens (donor: ph 7,4 akceptor: ph 4,0) PAMPA rendszert dolgoztunk ki, mely a hatóanyagoknak a citoszolból a lizoszómába történő transzportját modellezi. Membránként különböző szövetspecifikus lipid-keverékeket állítottunk össze, melyek a vér-agy gát, a szív, a tüdő, a máj és a vese lipidösszetételének feleltethetők meg. Vizsgálataink alapján azok a vegyületek okoznak várhatóan foszfolipidózist, melyek effektív permeabilitása > 25*10-6 cm/s a beállított PAMPA modellben. Ezzel sikerült kidolgoznunk egy robusztus, nagy áteresztőképességű, pontos és a korábbi PLD modellekhez képest ortogonális módszert a foszfolipidózis előrejelzésére. Egyúttal elmondható, hogy először írtunk le olyan PAMPA módszert, mely a sejtorganellumok közötti anyagtranszport modellezésére alkalmas, továbbá megmutattuk a különböző szöveteknek megfelelő lipidmembránok alkalmazásának lehetőségét és jelentőségét. A fenacetin és a bupropion vegyületek példáján megmutattuk a metabolitok szerepét a foszfolipidózis kialakulásában. 7

8 5. TÉZISEK 1. Kidolgoztunk egy robusztus, nagy áteresztőképességű PAMPA módszert gyógyszerhatóanyagok szájüregen keresztüli felszívódásának előrejelzésére. Megállapítottuk, hogy egykomponensű oldószermembránként n-dodekánt alkalmazva az effektív permeabilitási értékekkel jól közelíthető az ex vivo sertés bukkális mukózán keresztüli hatóanyag felszívódás. [I.] 2. Optimáltuk a PAMPA-BBB módszer mérési körülményeit (inkubálás 4 órán át, 37 o C-on, 10 m/v% PBLE alkalmazása membránként, n-hexán: n-dodekán 3:1 elegyében oldva, izo-ph = 7,4 körülmények, 5 V/V% DMSO segédoldószer használatával), így az eddigieknél pontosabb előrejelző képességű in vitro modellt dolgoztunk ki a hatóanyagok vér-agy gáton keresztüli átjutásának becslésére. [II.] 3. Természetes eredetű és félszintetikus ekdiszteroidok szerkezet-permeabilitás összefüggéseit határoztuk meg. Az in vitro PAMPA-BBB modell és in silico fizikai-kémiai jellemzők együttes alkalmazásával kidolgoztunk egy szűrési rendszert, mely alkalmas a vizsgált ekdiszteroidok agyi penetrációs készségének osztályozására, előrejelzésére. A modell alkalmazhatóságát in vitro farmakodinámiás, és patkányokon végzett in vivo agyi penetrációs vizsgálatok is alátámasztották. [IV.] 4. A gyógyszer-indukált foszfolipidózis kockázatának előrejelzésére kidolgoztunk egy, a korábbi in vitro rendszerektől független PAMPA rendszert. Vizsgálatainkban bizonyítottuk, hogy a (ph 7,4 ph 4,0) gradiens-ph elrendezésű PAMPA modell alkalmas a citoszol lizoszóma irányú transzport modellezésére, így elsőként alkalmaztuk a PAMPA módszert valamely sejtorganellum irányú hatóanyag transzport modellezésére. [V.] 5. A foszfolipidózis előrejelzésére kidolgozott PAMPA módszerrel megmutattuk a modell szövetspecifikus jellegét, melyet különböző összetételű lipid-membránok alkalmazásával értünk el. [V.] 6. A fenacetin és a bupropion molekulák esetében saját mérési eredményeinkkel igazoltuk a metabolizmus szerepét ezen gyógyszerek foszfolipidózis kialakulásának kockázatában. [V.] 6. ALKALMAZÁS A szájüregi felszívódás előrejelzésére kidolgozott PAMPA módszert a Budapesti Műszaki és Gazdaságtudományi Egyetem Szerves Kémia és Technológia Tanszékén sikeresen adaptálták az elektrosztatikus szálképzéssel előállított gyógyszerkészítmények kioldódáspermeabilitás vizsgálatára µflux TM készülékkel. 8

9 Az optimált PAMPA-BBB modellt a napi gyakorlatban alkalmazzuk a Richter Gedeon Nyrt.-nél az újonnan előállított gyógyszerjelölt vegyületek agyi penetrációjának előrejelzésére. Az in vitro PAMPA-BBB modell és in silico fizikai-kémiai jellemzők együttes alkalmazásával sikerült kidolgoznunk egy szűrési rendszert, mely alkalmas a vizsgált ekdiszteroidok agyi penetrációs készségének osztályozására, előrejelzésére. Ez a szűrési rendszer a továbbiakban jó kiindulópont más, természetes eredetű szerkezeti körök vizsgálatára. A PAMPA-PLD modell a gyógyszeripari gyakorlatban jól alkalmazható, robusztus, költséghatékony, nagy áteresztőképességű szűrővizsgálat a foszfolipidózis korai fázisú előrejelzésére. 7. KÖZLEMÉNYEK 7.1. Az értekezés alapját képező tudományos közlemények I. E. Borbás, A. Balogh, K. Bocz, J. Müller, E. Kiserdei, T. Vigh, B. Sinkó, A. Marosi, A. Halász, Z. Dohányos, L. Szente, G.T. Balogh, Z.K. Nagy. In vitro dissolution-permeation evaluation of an electrospun cyclodextrin-based formulation of aripiprazole using µflux. International Journal of Pharmaceutics, 491 (2015) [IF: 3,994; független hivatkozás: 8] II. J. Müller, K. Esső, G. Dargó, A. Könczöl, G.T. Balogh. Tuning the predictive capacity of the PAMPA-BBB model. European Journal of Pharmaceutical Sciences, 79 (2015) [IF: 3,773; független hivatkozás: 5] III. Á. Könczöl, J. Müller, E. Földes, Z. Béni, K. Végh, A. Kéry, G.T. Balogh. Applicability of a blood-brain barrier specific artificial membrane permeability assay at the early stage of natural product-based CNS drug discovery. Journal of Natural Products, 76 (2013) [IF: 3,285; független hivatkozás: 15] IV. J. Müller, A. Martins, J. Csábi, F. Fenyvesi, Á. Könczöl, A. Hunyadi, G.T. Balogh. BBB penetration-targeting physicochemical lead selection: Ecdysteroids as chemo-sensitizers against CNS tumors. European Journal of Pharmaceutical Sciences, 96 (2017) [IF: 3,756; független hivatkozás: 1] 9

10 V. G.T. Balogh, J. Müller, A. Könczöl. ph-gradient PAMPA-based in vitro model assay for drug-induced phospholipidosis in early stage of drug discovery. European Journal of Pharmaceutical Sciences, 49 (2013) [IF: 3,005; független hivatkozás: 7] 7.2. Az értekezés témájához közvetlenül nem kapcsolódó közlemények VI. T. Szabó, E. Hirsch, T. Tóth, J. Müller, E. Reithmüller, Gy.T. Balogh, P. Huszthy. Synthesis and enantioselective transport studies of optically active lipophilic proton-ionizable crown ethers containing a diarylphosphinic acid unit. Tetrahedron Asymmetry 26 (2015) [IF: 2,108; független hivatkozás: 1] VII. Á. Könczöl, K. Rendes, M. Dékány, J. Müller, E. Riethmüller, Gy.T. Balogh. Blood-brain barrier specific permeability assay reveals N-methylated tyramine derivatives in standardised leaf extracts and herbal products of Ginkgo biloba. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 131 (2016) [IF: 3,255; független hivatkozás: 2] VIII. V. Ilkei, A. Spaits, A. Prechl, Á. Szigetvári, Z. Béni, M. Dékány, Cs. Szántay, J. Müller, Á. Könczöl, Á. Szappanos, A. Mándi, S. Antus, A. Martins, A. Hunyadi, Gy.T. Balogh, Gy. Kalaus, H. Bölcskei, L. Hazai, T. Kurtán. Biomimetic synthesis and HPLC ECD analysis of the isomers of dracocephins A and B. Beilstein Journal of Organic Chemistry, 12 (2016) [IF: 2,340] IX. V. Ilkei, A. Spaits, A. Prechl, J. Müller, Á. Könczöl, S. Lévai, E. Riethmüller, Á. Szigetvári, Z. Béni, M. Dékány, A. Martins, A. Hunyadi, S. Antus, Cs. Szántay Jr, Gy.T. Balogh, Gy. Kalaus, H. Bölcskei, L. Hazai. C8-selective biomimetic transformation of 5,7- dihydroxylated flavonoids by an acid-catalysed phenolic Mannich reaction: Synthesis of flavonoid alkaloids with quercetin and ( )-epicatechin skeletons. Tetrahedron, 73 (2017) [IF (2016): 2,651; független hivatkozás: 1] X. B. Pethő, M. Zwillinger; J. T. Csenki, A. E. Káncz, B. Krámos, J. Müller, Gy. T. Balogh, Z. Novák. Palladium-Catalyzed 2,2,2-Trifluoroethoxylation of Aromatic and Heteroaromatic 10

11 Chlorides Utilizing Borate Salt and the Synthesis of a Trifluoro Analogue of Sildenafil. Chemistry - A European Journal, in press [IF (2016): 5,771] 7.3. Előadások 1. Müller J., Balogh Gy. T.: Szájüregi felszívódás vizsgálata in vitro permeabilitási modellel. Gyógyszerkémiai és Gyógyszertechnológiai Szimpózium 13, Herceghalom, Müller J., Balogh Gy. T.: Új in vitro kémiai modell a foszfolipidózis előrejelzésére a gyógyszerkutatás korai fázisában. VII. Szent-Györgyi Albert Konferencia, Budapest, Müller J., Esső K., Balogh Gy. T.: Gyógyszerfelszívódási folyamatok modellezése in vitro kémiai modellek segítségével. Tavaszi Szél Konferencia, Debrecen, Müller J., Balogh Gy. T.: Gyógyszerfelszívódási folyamatok modellezése in vitro penetrációs modellek segítségével. Oláh György Doktori Iskola Konferenciája, Budapest, Müller J., Könczöl Á., Riethmüller E., Hunyadi A., Hohmann J., Balogh Gy. T.: Természetes hatóanyagok szerkezet-permeabilitás összefüggéseinek vizsgálata. Gyógyszerkémiai és Gyógyszertechnológiai Szimpózium 16, Herceghalom, Müller J., Balogh Gy. T.: Új in vitro kémiai modell a foszfolipidózis előrejelzésére a gyógyszerkutatás korai fázisában. Fatal Analitikusok XXV. Előadóülése, Budapest, Poszterek 1. J. Müller, Gy. T. Balogh: Relationship between partition systems (classic n-octanolwater and anisotropic systems) and physicochemical parameters of PAMPA-Comparative study. PhysChem Forum 12, Budapest, Müller J., Balogh Gy. T.: Új in vitro kémiai modell a foszfolipidózis előrejelzésére a gyógyszerkutatás korai fázisában. Oláh György Doktori Iskola Konferenciája, J. Müller, Gy.T. Balogh: Novel in vitro noncell based model for predicting phospholipidosis. 4 th EuCheMS Chemistry Congress, Prága, Müller J., Balogh Gy.T.: Összefüggések a megoszlási rendszerek (klasszikus oktanolvíz és anizotróp rendszerek) és a PAMPA-modell fizikai-kémiai paraméterei között. Oláh György Doktori Iskola X. doktoráns konferenciája, Budapest, J. Müller, Gy. T. Balogh: Preliminary Study for Tissue- Specific PAMPA models. PhysChem Forum13, Cambridge,

12 6. J.Müller, Gy.T.Balogh: Buccal-PAMPA model: monosolvent or tissue specific lipid membrane systems? - Preliminary study. PCMDDD-Conference, Dubrovnik, J. Müller, E. Riethmüller, Á. Kéry, Gy. T. Balogh: Characterization of extracts of Betulaceae family species with respect to optimal absorption behavior of components, Trends in Natural Products Research, Olomouc, J. Müller, K. Esső, Gy.T. Balogh: Systematic optimization of the predictive capacity of the PAMPA-BBB model, PhysChemForum 15, Uppsala,