ALTERNATÍV ÖKOTOXIKOLÓGIAI TESZTEK

Átírás

1 ALTERNATÍV ÖKOTOXIKOLÓGIAI TESZTEK KÖRNYEZETSZENNYEZŐ KOMPONENSEK DETEKTÁLÁSÁRA Ács András DOKTORI (PhD) ÉRTEKEZÉS Pannon Egyetem Vegyészmérnöki tudományok és Anyagtudományok Doktori Iskola Témavezetők: Felpécziné Dr. Farkas Anna, tudományos főmunkatárs, MTA Balatoni Limnológiai Kutatóintézet és Dr. Kováts Nóra, egyetemi docens, Pannon Egyetem, Limnológia Intézeti Tanszék Pannon Egyetem VESZPRÉM, 2010

2 ALTERNATÍV ÖKOTOXIKOLÓGIAI TESZTEK KÖRNYEZETSZENNYEZŐ KOMPONENSEK DETEKTÁLÁSÁRA Értekezés doktori (PhD) fokozat elnyerése érdekében Írta: Ács András Készült a Pannon Egyetem Vegyészmérnöki tudományok és Anyagtudományok Doktori Iskolája keretében Témavezető: Felpécziné Dr. Farkas Anna Elfogadásra javaslom (igen / nem) Dr. Kováts Nóra Elfogadásra javaslom (igen / nem) A jelölt a doktori szigorlaton...%-ot ért el, (aláírás) (aláírás) Az értekezést bírálóként elfogadásra javaslom: Bíráló neve: igen /nem Bíráló neve:......) igen /nem ***Bíráló neve:......) igen /nem. (aláírás). (aláírás). (aláírás) A jelölt az értekezés nyilvános vitáján...%-ot ért el. Veszprém,. a Bíráló Bizottság elnöke A doktori (PhD) oklevél minősítése... Az EDHT elnöke

3 Tartalom Rövidítések jegyzéke...6 Kivonatok...8 Bevezetés és célkitűzés Irodalmi áttekintés Az ökotoxikológiai tesztek fogalma és szükségessége Klasszikus ökotoxikológiai tesztek Alternatív ökotoxikológiai tesztek In vivo módszerek In vitro módszerek A cianobaktériális toxicitás környezeti kockázata A cianobaktériumok felépítése, működése, viselkedése Cianobaktérium fajok a Balatonban Cianotoxinok Anyag és módszer Anyagok Algakivonatok Vizsgálatok Lemna minor makrofita növényen Növekedési inhibíció teszt Képelemzési módszeren alapuló Lemna minor teszt Vizsgálatok Daphnia magna plankton rákon Daphnia magna immobilitás teszt Daphnia magna táplálkozás aktivitás-gátlás teszt Thamnocephalus platyurus mortalitás teszt Mortalitás vizsgálatok Artemia salina héjnélküli kisrákon Vibrio fischeri biolumineszcencia-gátlás vizsgálat Enzimaktivitási vizsgálatok Artemia salina héjatlan kisrákon és Dikerogammarus villosus amphipoda rákon LDH enzimaktivitási vizsgálatok GST enzimaktivitási vizsgálatok

4 AChE enzimaktivitási vizsgálatok Összprotein tartalom meghatározása Analitikai módszerek Statisztikai elemzés Eredmények és értékelés Két új ökotoxikológiai módszer fejlesztése Daphnia magna táplálkozás aktivitás teszt Duckweed Detector (DwD) szoftveres képelemzési módszer Lemna minor növekedés-gátlás elemzésére Cianobaktérium törzsek ökotoxikológiai kockázatának becslése Daphnia magna táplálkozás aktivitás-teszt eredményei algakivonatokra Cianobaktérium izolátumok hatásának összehasonlító vizsgálata egyéb ökotoxicitási tesztek alapján Biokémiai marker vizsgálatok Artemia salina héjnélküli kisrákon Biokémiai marker vizsgálatok Dikerogammarus villosus amphipoda rákon In vitro acetilkolinészteráz gátlás vizsgálatok A cianobaktériumok nyers kivonatainak analitikai elemzése Az eredmények összefoglalása Tézispontok Theses Irodalomjegyzék Köszönetnyilvánítás

5 Rövidítések jegyzéke ACT 9502 balatoni Cylindrospermopsis raciborskii törzs ACT9503 balatoni Cylindrospermopsis raciborskii törzs ACT 9504 balatoni Cylindrospermopsis raciborskii törzs ACT 9506 balatoni Cylindrospermopsis raciborskii törzs AChE acetilkolinészteráz ANOVA varianciaanalízis (ANalysis Of VAriance) APHA foszfát puffer (American Public Health Association) ASTM Amerikai Anyagvizsgálati Társaság (American Society for Testing and Materials) ATCI acetiltiokolin-jodid AQS Ausztrál cilindrospermopszint termelő Cylindrospermopsis raciborskii törzs Atx anatoxin-a, 2 acetil-9-azabiciklo[4.2.1.]non2-én CCD töltéscsatolt félvezető eszköz (charge-coupled device) CDNB 1-klór-2,4-dinitrobenzol CYN cilindrospermopszin DTNB 5,5 ditio-bisz-nitro-benzol EC 50 FBS GSH GST GTX Hman IC 50 Median Effects Concentration, az a toxikus koncentráció, mely a kezelt alanyokon 50%-os hatást vált ki foetalis borjúszérum glutation glutation S-transzferáz gonyautoxinok homoanatoxin-a, 2-(propán-1-oxo-1-il)-9- azobiciklo[4,2,1]non- 2én Median Inhibitory Concentration, az a toxikus koncentráció, mely a vizsgált tulajdonság 50%-os gátlását okozza ISO Nemzetközi Szabványügyi Szervezet (International Organization for Standardization) KDO 3-deoxi-D-mannózsavon 6

6 LD 50 LC 50 LDH LPS MC-LR MTT NAD Median Lethal Dosis, az a toxikus mennyiség, melynél a kezelt alanyok 50%-a elpusztul Median Lethal Concentration, az a toxikus koncentráció, melynél a kezelt alanyok 50%-a elpusztul laktát dehidrogenáz, tejsav dehidrogenáz lipopoliszacharid mikrocisztin-lr (3,4,5-dimetilthiazol-2il)-2,5-difeniltetrazolium bromid nikotinamid adenin dinukleotid OECD Gazdasági Együttműködési és Fejlesztési Szervezet (Organisation for Economic Co-operation and Development) PBS fiziológiás sót tartalmazó foszfát puffer PCC 6506 francia Oscillatoria sp. algatörzs PP1 protein foszfatáz 1 PP2A protein foszfatáz 2A PP2C protein foszfatáz 2C PSI, PSII egyes és kettes fotokémiai rendszer STX szaxitoxin Tris-NaCl Trisz(hidroximetil)-aminometán, nátrium klorid és nátrium-azid tartalmú puffer WHO Egészségügyi Világszervezet (World Health Organization) 7

7 Kivonatok Alternatív ökotoxikológiai tesztek környezetszennyező komponensek detektálására A disszertáció célja újonnan kifejlesztett alternatív ökotoxikólógiai tesztek bemutatása, melyek megfelelően alkalmazhatóak környezeti kockázatbecslés céljára. A kidolgozott módszerek (Daphnia magna táplálkozás-gátlás teszt, szoftveres képelemzési módszer L. minor növekedés-gátlás értékelésére) kalibrálása az ökotoxikológiában általánosan elterjedt validáló vegyület, a kálium-dikromát révén történt. A D. magna táplálkozásgátlás-, valamint a konvencionális tesztek (D. magna, Thamnocephalus. platyurus, Asalina salina, Vibrio fischeri) érzékenységének összevetése a xenobiotikumok egy speciális csoportja, a vízi környezetre kockázatot jelentő cianobakteriális metabolit komplexekre adott válaszok alapján került sor. A vizsgálatok során a cilindrospermopszint termelő AQS Cylindrospermopsis raciborskii; anatoxinokat termelő Oscillatoria sp. (PCC 6506) és négy balatoni C. raciborskii törzset alkalmaztunk. A bioaktív anyagok toxicitásának jellemzése biokémiai marker vizsgálatok LDH, GST, AChE enzimaktivitás alapján in vivo kísérletekben, az A. salina sórákon és a D. villosus amphipoda rákon került sor. Az algakivonatokban megtalálható metabolitok analízise LC-ESI-MS útján történt. Valamennyi teszt a legnagyobb toxicitást az AQS törzsre jelezte. A legérzékenyebbnek T. platyurus, míg leghatékonyabbnak a V. fisheri és D. magna táplálkozás-aktivitás tesz bizonyult. Az A. salina naupliák GST aktivitásának változásai jól tükrözték az AQS törzs kivonatában a cilindrospermopszin jelenlétét. Az exponált A. salina naupliákban észlelt LDH aktivitás növekedés mértéke szoros pozitív korrelációt mutatott a nyers cianobaktérium kivonatok általános toxicitási mutatójával. Az AChE enzim aktivitásban észlelt változások néhány algatörzs esetében antikolinészteráz tulajdonságú metabolitok szintézisét jelzi. A D. villosus amphipoda rákokkal végzett akut vizsgálatok legjelentősebb eredménye, hogy a természetben is gyakran előforduló tömegprodukció esetén, még az AQS ill. PCC 6506 törzsek sem jelentenek számottevő környezeti kockázatot a vízi ökoszisztémára. A minták analitikai elemzése az AQS törzs cilindrospermopszin termelését mutatta ki nagy mennyiségben (12,7 mg/g). A PCC 6506 mintánál mindkét anatoxin homológ termelése igazolódott, az irodalomban leírt mennyiségi különbségekkel egyezően (anatoxin-a: 124 μg/g; homoanatoxin-a: 3,2 8

8 mg/g). A balatoni alga liofilizátumok analitikai elemzése alapján a törzsek a közismert cianotoxinokat nem termelik. A mortalitási tesztek kiválthatóak szubletális végpontú eljárások által. Utóbbiak érzékenységük, pontosságuk, ökológiai relevanciájuk alapján megfelelőbben extrapolálhatók az ökoszisztémára nézve. További előnyük, hogy a megfelelően kiválasztott módszerek egymással kombinálva többletinformációt nyerhetünk a bioaktív anyagok hatásmechanizmusát illetően. Alternative ecotoxicological testmethods for detecting environmental pollutants The main subject of the work was to develop new alternative ecotoxicity assays and to investigate the applicability of alternative test methods for the assessment of environmental health hazards of xenobiotics. The new assays (Daphnia magna feeding inhibition test, evaluation method of data processing for Lemna minor growth inhibition assay) were calibrated against potassium-dichromate, commonly applied as positive reference compound in ecotoxicological testing. The comparative sensitivity and reliability assessment of the Daphnia magna feeding inhibition test towards the conventionally used mortality/immobility assay methods was performed using a special group of xenobiotic compounds posing health hazards to the aquatic environment i.e. the cyanobacterial secondary metabolites complex. The biological health hazards of cyanobacterial matrices were characterized using in vivo biochemical marker assays on Artemia salina and Dikerogammarus villosus. Quantitative and qualitative analysis of cyanobacterial matrices were executed using LC-ESI-MS. The investigations revealed that the conventional lethality assays can be substituted by test alternatives relying on sub-lethal endpoints. Relevant advantage of alternative methods is their applicability in battery of assays purchasing in this way important extra information about the mechanisms of action bioactive compounds. Alternative Methoden für die Detektion Umweltschmutzstoffen Haupt Ziel der Arbeit war die Entwicklung von neuen alternativen ökotoxikologischen Testmethoden und die Untersuchung der Anwendbarkeit der alternativen Testmethoden für die Bewertung der Umweltrisiken von Xenobiotika. Die neue Testmetoden (Daphnia magna Nahrungsaufnahme-hemmung Test, Software Wertung Methode für Lemna minor Wachstum Hemmung Test) wurde kalibriert gegen Kalium-Bichromat, 9

9 das allgemein in Ökotoxikologie als Referenzmaterial verwendet wird. Vergleichende Untersuchungen der Anwendbarkeit und der Empfindlichkeit von D. magna Nahrungsaufnahme-hemmung Test gegen die konventionellen Mortalität/Immobilität Methoden wurde durchgeführt gegen eine spezielle Gruppe der Xenobiotika, welch oft Gesundheitsrisiken in Gewässern darstellt, wie die sekundäre cyanobakterielle Metabolit Komplexe. Die biologische Gesundheitsrisiken der cyanobakterielle Matrizes wurde charakterisiert durch die Untersuchungen von Indikatorenzymen in vivo in Artemia salina und Dikerogammarus villosus. Qualitative und quantitative Analyse von cyanobakterielle Matrizes wurde mit Benutzung einen LC-ESI-MS System ausgeführt. Die Untersuchungen zeigen darauf hin, dass die konventionelle Mortalitätsteste können durch subletalen Testalternativen ausgelöst werden. Wesentlicher Vorteil der alternativen Methoden ist ihrer Anwendbarkeit in Testbatterien, die wichtigen Extrainformationen liefern über die Effektmechanismus der bioaktiven Komponente. 10

10 Bevezetés és célkitűzés A forgalomba kerülő illetve már forgalomban levő, de a környezetre gyakorolt hatás szempontjából nem ellenőrzött vegyi anyagok kockázatbecslése nagyszámú ökotoxikológiai teszt elvégzését igényli. Az Európai Unió a Tanács 793/93/EEC rendelete alapján rendelkezik a létező vegyi anyagok emberekre és környezetre való veszélyességének értékeléséről és ellenőrzéséről. E szerint mintegy százezer, az Unió piacán regisztrált vegyület van jelenleg forgalomban, melyek közül több mint tízezer termék kerül forgalomba 10 tonnánál nagyobb mennyiségben, és húszezerre tehető azon kemikáliák száma, melyek 1-10 tonnás nagyságrendben kerülnek piacra. Ezen anyagok környezeti kockázatát utólag kell értékelni. Újonnan forgalomba kerülő anyagok kockázatelemzéséről rendelkezik a Tanács 67/548, 91/41 számú rendelete és a 98/8 számú irányelve: ezek szerint új anyagnak tekinthető minden 1981 óta forgalomba került kemikália, míg létező anyagkén az említett időpont előtt forgalomba került anyagokat definiálják az említett rendeletek és irányelvek. Az új anyagok száma 2700 körülire tehető, melyek környezeti és humán egészségügyi kockázatelemzését a 67/548 számú direktíva csak abban az esetben teszi kötelezővé piacra kerülésük előtt, amennyiben 10 kg felett van éves forgalmazott mennyiségük. Ezzel szemben a régi anyagok a piacra kerülő anyagmennyiség közel 99 százalékát alkotják, melyek közül elenyésző számú készítményre készült mindenre kiterjedő kockázati elemzés. A hazai jogszabályi környezetet, az előzőekkel konform jogszabályok, a évi XXV. törvény a kémiai biztonságról, a 12/2001. (V. 4.) KöM-EüM együttes rendelet (a vegyi anyagok kockázatának becsléséről és a kockázat csökkentéséről), valamint a 38/2003. (VII. 7.) ESzCsM-FVM-KvVM együttes rendelet (a biocid termékek előállításának és forgalomba hozatalának feltételeiről) alkotják. Ökológiai kockázatelemzést nemcsak az említett rendeletekben meghatározott vegyi anyagokra végeznek, hanem (a teljesség igénye nélkül) pl. már fennálló szennyezések detektálására, vagy természetes anyagok (pl. biotoxinok) környezeti kockázatának értékelésére, tovább növelve ezzel az elvégzendő tesztek számát. Az Európai Unió 11

11 vegyi anyagokkal kapcsolatos stratégiája (Anonímusz, White paper 2001) ugyanakkor kimondja, hogy a magasabb rendű állatokon végzett tesztek számát csökkenteni kell. Kiterjedt kutatás folyik annak érdekében, hogy olyan új teszteket dolgozzanak ki, amelyek eleget tesznek az alapvető minőségügyi követelményeknek, kellőképpen megbízható, és valós ökoszisztémákra/emberi hatásviselőre nagy biztonsággal extrapolálható eredményeket adnak, ugyanakkor az etikai követelményeknek is megfelelnek (Worth és Balls 2002). Mint ahogy a nemzetközi és Nemzeti szabályozásból is kitűnik, a fokozott védelem csak a gerinces állatokra terjed ki. A gerinctelen állatokon végzett kísérletekre semmilyen szabályozó rendelet nem vonatkozik. Egyre nagyobb azonban azoknak a szakembereknek a száma, akik a Russell és Burch által (Russell és Burch 1959) megfogalmazott 3R elveinek kiterjesztését szorgalmazzák ezen élőlénycsoportokra is, olyan mindenki számára hozzáférhető adatbázisok létrehozásával, amelyek lehetővé teszik az elvégzett kísérletek számának csökkentését. Ezen túlmenően az utóbbi évtizedben egyre nagyobb igény jelentkezett olyan tesztvégpontok keresésére, melyek kiválthatják a konvencionálisan alkalmazott mortalitási (immobilizációs) teszteket. A konvencionális mortalitási tesztek gyengesége, hogy olyan irreverzibilis és nem specifikus mutatót, azaz a tesztállat pusztulását alkalmazzák végpontként, mely jelentősége megkérdőjelezhető ökológiai szempontból. Ökológiai kockázatot jelenthetnek olyan anyagok is, melyek hatása mortalitási tesztekkel alacsony koncentrációjuk miatt még nem, azonban más, szubletális végpontok alkalmazása révén már megfelelően mérhetőek. Az ilyen anyagok megjelenése nem feltétlenül az emberi tevékenység közvetlen következménye. Például, a felszíni vizek nagymértékű tápanyagterhelése a vízterek eutrofizációjához vezet. Az eutrofizáció egyik legfeltűnőbb jelensége a fonalas nitrogénkötő cianobaktériumok tömeges elszaporodása (Carmichael 1997; Codd et al. 1999; Pitois et al. 2001). A cianobaktérium tömegprodukciókról ma már ismert, hogy az esetek mintegy 25%-át toxintermelő törzsek okozzák, súlyos és tömeges elhullást okozva, mind a mezőgazdaságilag fontos haszonállatok, mind a vadon élő állatok között. Kivételes esetekben a cianobaktérium mérgezések az emberek súlyos megbetegedését és halálát is előidézték (Byth 1980; Bourke et al. 1983; Carmichael 12

12 1997; Codd, et al. 2005), ami világszerte a cianobaktériumok toxicitásának átfogó kutatását indokolta. A cianobaktériumok toxikusságának és toxikus jellegének becslésére a leggyakrabban alkalmazott és a WHO által egyedüliként elfogadott szabvány eljárás az egérteszt, azonban, a toxikus vízvirágzások gyors kiszűrésére mind elterjedtebben alkalmaznak elsődleges elemzés céljából ökotoxikológiai bioassay eljárásokat is, közülük főként a planktonikus rákokra, mint a Thamnocephalus platyurus, Daphnia sp., vagy Artemia salina szervezetekre épülő teszteket is. Doktori értekezésem témája az alternatív ökotoxikológiai tesztek környezetszennyező komponensek detektálására való alkalmazhatóságának vizsgálata. Céljaim a következőképp foglalhatóak össze: Új alternatív ökotoxikólógia tesztek kifejlesztése, melyek megfelelő érzékenységgel és alkalmazhatósággal rendelkeznek ahhoz, hogy gyors és objektív környezetei kockázatbecslést tegyenek lehetővé potenciális környezetszennyezőkkel szemben. Az általam kifejlesztett módszerek kalibrálása az ökotoxikológiában általánosan elterjedt kalibráló/validáló vegyület, a kálium-dikromát által. A kalibrált Daphnia magna táplálkozás aktivitás-gátlás teszt érzékenységének és hatékonyságának összevetése a konvencionális, mortalitási/immobilitási tesztmódszerrel. Erre a célra a xenobiotikumok egy speciális csoportját, a vízi környezetre veszélyt jelentő anyagcsoportot, a cianobakteriális metabolit komplexet választottam. A cianobaktérium mátrixban található bioaktív anyagok toxicitásának jellemzése biokémiai marker vizsgálatok alapján in vivo- kísérletekben az Artemia salina sórákon és a Dikerogammarus villosus amphipoda rákon. A cianobaktériális kivonatokban megtalálható metabolitok minőségi és mennyiségi vizsgálata folyadék-kromatográfia és tömegspektrometria útján, valamint az analitikai adatok összehasonlítása ökotoxikológiai tesztek eredményeivel. 13

13 1. Irodalmi áttekintés 1.1. Az ökotoxikológiai tesztek fogalma és szükségessége Az ökotoxikológiai vizsgálatok célja, hogy viszonylag egyszerű biológiai tesztekkel az ökoszisztéma egészére extrapolálható kockázatbecslést adjanak. Az ökotoxikológiai tesztmódszerek egyed szinten az egyed élettani jelenségeit (pusztulás, növekedés, energiaháztartás, biokémiai folyamatok, mutáció) vizsgálják, a populáció szintjén pedig a szaporodás, egyedsűrűség, eloszlás törvényszerűségeivel foglalkoznak. Társulás szintjén a fajszám, a fajok közötti kapcsolatok, indikátor fajok jelenléte; míg az ökoszisztéma szintjén a rendszer egészének anyag és energia forgalma áll az ökotoxikológiai vizsgálatok középpontjában. Mindezekből látható, hogy az ökotoxikológia rendkívül széles eszköztárral rendelkezik és a vizsgálatok tárgyától függően igen változatos. A szennyezőanyagok ökotoxikus hatását vizsgálhatjuk egy fajú laboratóriumi tesztekkel, amelyeknek többsége laboratóriumi körülmények között könnyen elvégezhető; műszert nem igényel, így kivitelezési költsége alacsony. Hátrányuk, hogy viszonylag alacsony környezeti relevanciával rendelkeznek, mivel természetes viszonyok között nem pusztán egy faj egyedei kerülnek kapcsolatba a szennyezőanyaggal, hanem különböző fajok populációi. Így a szennyezőanyagok természetes viszonyok között fellépő komplex hatásának becslése során, az egy fajt alkalmazó tesztek félrevezető eredményt adhatnak. Az extrapoláció egy fajról, jelen esetben a tesztorganizmusról, egy másik fajra vagy az ökoszisztéma egészére csak nagy körültekintéssel végezhető el (Robinson és Thorn 2005). Alternatív tesztek alatt a toxikológiában/ökotoxikológiában olyan módszereket értünk, melyek helyettesíthetik, kiválthatják a magasabb rendű tesztszervezeteket a kísérletek során. Ez jelen pillanatban elsősorban a gerinceseket kiváltó módszereket jelent, ám egyre inkább érzékelhető azon szemlélet elterjedése, miszerint nem csak a gerincesek, de a gerinctelen élőlények kiváltása is kívánatos nem csak etikai szempontok miatt, de a tesztek eredményei által hordozott többletinformációk alapján is. Többletinformációt szolgáltatathat a különböző biomarker enzimek vizsgálata, illetve szubletális jellemzők megjelölése végpontként, melyek szorosan összefüggnek a vizsgált élőlény életfunkcióival (Schirmera, et al. 2008). Az így nyert adatok által sok 14

14 esetben nem csak pontosabban meghatározható a környezeti kockázat, de ismeretlen összetételű minta esetében következtetni lehet a káros hatást kifejtő anyag típusára is. Ugyanez megfordítva is igaz: ismert összetételű minta esetén fényt deríthetnek olyan mechanizmusokra, melyeket az összetétel ismeretében nem szükségképp feltételeznénk (Wadhia és Thompson 2007). Ez nagymértékben elősegítheti a vizsgált minta kvalitatív analitikai elemzését is. Végcélként az említett szempontok alapján, az élőlények használatának kiváltása értelmezhető elsősorban in vitro, illetve in silico módszerek által (Anonímusz 1986). Az in vitro módszerek alkalmazhatósága azonban erősen korlátozott. Ezen korlátok a következőképp foglalhatóak össze (Anonímusz 2005): Az élő szervezetet felépítő sejtek és szövetek diverzitása: több száz különböző típusú és fejlődési szintű sejt különféleképp és különböző mértékű reakciót mutat(hat). Közvetlen és közvetett (véráram, idegrendszer által közvetített) Kölcsönhatások a szövetek közt: az immunreakciók, a csírasejt fejlődés, a metabolikus folyamatok és sok más normális és rendellenesség hatására kialakuló folyamat kiterjedt kölcsönhatásokat generál a test különböző tájain és szövetein belül. A szövetszerkezet hatása a sejtkörnyezetre: az oxigénszint, a tápanyagellátás, a sejtközi kommunikáció és kommunikációs gátak egyaránt befolyásolják az egyes sejtek viselkedését és válaszát stimuláció hatására. Az említett korlátózó tényezők miatt az in vivo eljárások egyelőre nem helyettesíthetőek egyetlen in vitro módszer használatával sem, különösen, ha többféle szennyező/mérgező anyag hatásának vizsgálata a cél egyetlen mintán belül. Utóbbi elég gyakori az ökotoxikológiai gyakorlatban, hiszen sok esetben nem az egyes komponensek hatásának vizsgálata, hanem a környezet egészére gyakorolt összesített hatás és kockázat meghatározása a fő cél. Ezért a gerinceseken végzett kísérletek alternatíváit (az ökotoxikológia területén) elsősorban a gerinctelen állatokon végzett kísérletek jelentik. Az alacsonyabb rendű tesztszervezetet alkalmazó módszerek nem feltétlenül csak 15

15 etikailag elfogadhatóbbak, hanem sok esetben gyorsabban is adnak eredményt, mint pl. a hagyományosan használt (és sok esetben a WHO által egyedüliként elfogadott) egér kísérletek és egyéb gerinces szervezeten végzett vizsgálatok Klasszikus ökotoxikológiai tesztek A Klasszikus ökotoxikológiai tesztmódszereket kemikáliák önmagukban történő kockázatelemzésére fejlesztették ki. Később az így kidolgozott módszerek kerültek alkalmazásra természetes minták esetében is. Ezek a tesztek jellemzően egyfajú tesztek, melyek végpontja akut esetben leggyakrabban a tesztorganizmus túlélése, ill. valamely ehhez szorosan kötődő élettani jellemző. Ez a jellemző lehet például mortalitás (immobilitás), vagy növekedés-gátlás (pl. növényfajok, fitoplankton esetében) (Robinson és Thorn 2005). Mivel a toxicitás faj és vegyület specifikus jellemző, a vizsgálatok során célszerű több fajból álló, ún. battery-tesztrendszert alkalmazni. Természetes minták vizsgálata esetében fontos szem előtt tartani, hogy a vizsgált biótára jellemző fajok kerüljenek kiválasztásra a vizsgálatok kivitelezésére, melyek megfelelően reprezentálják az egyes trofikus szinteket (LeBlanc 2004). A konvencionális módszerek többnyire szabványok által meghatározott módon kerülnek alkalmazásra. A legelterjedtebben az OECD (Organisation for Economic Cooperation and Development), ISO (International Organisation for Standardisation), valamint az ASTM (American Standards for Testing Materials) által kiadott szabványokat alkalmazzák a laboratóriumok (1. táblázat). A standardizált módszerek közös előnye, hogy a megfelelően definiált eljárásoknak köszönhetően a különböző laboratóriumok által kapott eredmények jól összehasonlíthatóak. Hátrányuk, hogy az újabb eljárások és tesztszervezetek szabványosítása időigényes folyamat, így a korszerűbb eljárások csak kisebb-nagyobb időbeli csúszással jelenhetnek meg. Ezen felül a standardizált eljárások sem teljesen zárhatják ki az emberi szubjektivitást. 16

16 1. táblázat. A OECD, ISO és ASTM szabványok által alkalmazott tesztszervezetek. Trofikus szint Faj Szabvány Lebontók Vibrio fischeri ISO :2007 Eleveniszap mikroorganizmusai ISO 15522:1999 OECD Test No. 209 Földigiliszta-félék Eisenia foetida/andrei OECD Test No. 222 Eisenia fetida OECD Test No. 207 ASTM E ISO :1993-2:1998-3:1999 Televényféreg Elsődleges termelők Elsődleges fogyasztók Másodlagos fogyasztók Enchytraeus sp. OECD Test No. 220 ASTM E Zöld alga fajok Scenedesmus subspicatus OECD Test No. 201 Chlorella vulgaris Pseudokirchneriella subcapitata ISO 8692:2004 ASTM D , E e1 Tengeri alga fajok Skeletonema costatum ISO 10253:2006 Phaeodactylum tricornutum Gonyaulax polyhedra ASTM E (2004) Brakkvízi alga fajok Ceramium tenuicorne ISO 10710:2010 Békalencse fajok Lemna minor ISO 20079:2005 OECD Test No. 221 Lemna gibba ASTM E (2004)e1 OECD Test No. 221 Szárazföldi növények OECD Test No. 208, 227 ASTM E Édesvízi kisrák fajok Daphnia magna ISO 6341:1996, 10706:2000 OECD Test No. 202, 211 ASTM E (2004) Ceriodaphnia dubia ISO 20665:2008 ASTM E (2006) Tengeri kisrák fajok Acartia tonsa ISO 14669:1999 Tisbe battagliai ASTM E Nitocra spinipes Árvaszúnyog-félék Chironomus tentans OECD Test No. 218 / OECD Test No. 219 Chironomus riparius Hal fajok pl. Danio reiro, Pimephales promelas, Oncorhynchus mykiss ISO :1996, 10229:1994, 15088:2007, 12890:1999, OECD Test No , 210, 215, 219, 220, ASTM E (2008), E729-96(2007), E (2007), E (2008) 17

17 Alternatív ökotoxikológiai tesztek Az ökotoxikológiában használatos alternatív módszereket igen nagy sokféleség jellemzi. Ez a sokféleség adódik részben a vizsgálandó környezeti elemek sokféleségéből, részben pedig a potenciális stresszorok, xenobiotikumok diverzitásából. Környezetszennyezőnek olyan anyagok nevezhetőek, melyek meghatározott koncentráció felett és kémiai formában megterhelést jelentenek az ökoszisztéma biotáira, káros, vagy toxikus hatásuk által. A xenobiotikumok és a környezeti minták sokfélesége egy sor ún. mikrobioteszt kifejlesztéséhez vezetett, mint a Microtox (a Vibrio fischeri bakteriális biolumineszceciáján alapuló teszt), az Algaltoxkit (mikroalga teszt Raphidocelis subcapatia fajon), a Daphtoxkit, a Thamnotoxkit és a Rotoxkit (Pesoone 1998). A felsorolt módszerek mindegyike a mortalitást használja végpontkén. A tesztek fő előnye, hogy a mortalitás mérése viszonylag precíz, gyors és olcsó, főként mivel nem szükséges törzstenyészetek fenntartása (Rand és Petrocelli 1985). Ugyanakkor a szubletális végpontú tesztek is fontos szerepet játszanak az ökotoxikológiában. A szubletális végpontot vizsgáló eljárásokat három fő csoportra oszthatjuk: (1) biokémiai és fiziológiai tesztek (pl. enzimatikus és respirációs tesztek), (2) viselkedéstani vizsgálatok (pl. lokomóciós vizsgálatok, és (3) hisztológiai vizsgálatok (pl. testszövetek elváltozásainak vizsgálata) (Rand és Petrocelli 1985; Mitchell, et al. 2002). Az ökotoxikológia területén alkalmazott alternatív módszerek az alábbi csoportokba sorolhatóak (Jamie és Ingrid 1999): In vivo módszerek, ezen belül o Haltesztek o Rovar tesztek o Zooplankton tesztek o Makrofita tesztek o Mikrobiális tesztek In vitro módszerek: o Biokémiai, immunológiai módszerek o Enzimatikus tesztek 18

18 o Immunológiai (ELISA) módszerek o Sejtvonalakon végzett tesztek In vivo módszerek Az in vivo módszerek közös sajátossága, hogy nem alkalmazhatóak önmagukban specifikusan toxikus összetevők behatárolására, hanem összesített, kumulatív toxicitás meghatározására alkalmasak Hal tesztek Különböző halfajokat elterjedten alkalmaz az ökotoxikológia mint modellorganizmust, nem csak különböző anyagok környezeti kockázatának meghatározására, de a hatásmechanizmusok feltérképezésére is. Mivel a szennyező anyagok koncentrációja gyakran szubletális tartományba esik, számos módszer került kifejlesztésre az egyed alatti szintű kockázat meghatározására. A haltesztek elsősorban a különböző fejlődési stádiumú egyedek viselkedéstani, hisztológiai, molekuláris biomarker és endokrin rendszerbeli változásokra fókuszálnak (Domingues et al. 2010). A halfajok közül az egyik legelterjedtebben alkalmazott tesztorganizmus a Danio rerio. A faj alkalmazásának előnye, hogy megfelelő érzékenységgel használható vegyi anyagok széles skálájának kockázatbecslése során. Ezen kívül könnyen kivitelezhetőek a fajon embrionális vizsgálatok, mivel: (1) nagyszámú és kis méretű ikrát produkál, így lehetőség nyílik kis mennyiségű minták vizsgálatára (akár 24 lyukú mikropléten is); (2) az ikrák áttetszőek, így a szervek fejlődése könnyen figyelemmel kísérhető az első 48 órában; (3) szubletális végpontok széles skálája alkalmazható a tesztek során, mint például fejlődéstani, és biomarker változások (Oliveira et al. 2009). További pozitívuma a faj alkalmazásának, hogy megfelelő korreláció figyelhető meg a korai fejlődési stádiumú és a felnőtt egyedek reakciói között. Így például kálium-dikromátra a felnőtt egyedek ± 26,66 mg/l, míg a korai stádiumú (megtermékenyített ikrák) ± 108,6 mg/l LC 50 (96h) értékkel reagálnak (Domingues et al. 2010). További, a D. rerio fajhoz hasonlóan elterjedten alkalmazott fajok a Cyprinus carpio és az Oncorhynchus mykiss. Számos szubletális végpontú teszt kivitelezhető ezen taxonok felnőtt és embrió stádiumú egyedein is (Sanchez és Porcher 2009). A D. rerio fajhoz hasonlóan viselkedéstani, fejlődéstani és biomarker vizsgálatokra is van lehetőség. Az 19

19 O. mykiss érzékenysége kálium-dikromátra LC 50 = 28.5 mg/l, míg a C. carpio LC 50 = 61 mg/l körül adódik (96h) (Svecevicius 2007; Vutukuru et al. 2007). Számos halfaj reakcióit vizsgálták cianotoxinok kapcsán. A tesztek végpontja a mortalitás mellett kiterjedt az embriófejlődés során bekövetkező anomáliákra, rheotaxis vizsgálatára, enzimatikus változásokra, hisztopatológiai vizsgálatokra, valamint a táplálékszelekció képességére. A legkiterjedtebben vizsgált fajok a Danio rerio, Cyprinus carpio, Oncorhynchus mykiss. Az expozíciós mód leggyakrabban az orális és a hasüregi injektálás. Cyprinus carpio orális expozíciója esetén a mikrocisztin-lr már 550 μg/kg dózis mellett halálosnak bizonyult, melyet a máj károsodása okozott (Rabergh et al. 1991). Mivel azonban ezek a vizsgálatok sem az expozíciós út, sem pedig ökológiai szempontból nem nevezhetőek relevánsak, ezt követően a kísérletek elsősorban vízben oldott komponensekre irányultak. Korai fejlődési stádiumú Cyprinus carpio egyedeken a neurotoxikus anatoxin-a már 160 μg/l-es koncentráció és 9 órás expozíciós idő mellett is jelentős mortalitást okozott. Ugyanilyen koncentráció mellett 5 napos expozíció hatására 75 %-os kelési arány csökkenést okozott. Ugyanakkor az is bebizonyosodott, hogy hasonló toxintartalmú nyers algakivonat szignifikánsan nagyobb hatást fejt ki, mint tisztított toxin önmagában (Osswald et al. 2009). Danio rerio rheotaxis-vizsgálata során már 0,5 és 5 μg/l-es mikrocisztin koncentráció szignifikáns viselkedésbeli változást okozott. Ugyanakkor az 5 μg/l koncentráció felett jelentősen csökkent a szaporodás-aktivitás is (Baganz et al. 1998). Ugyanezen faj embrionális fejlődése kapcsán feljegyezték, hogy hasonló mikrocisztin-lr koncentráció (5-50 μg/l) a kezelés során nem okozott megfigyelhető elváltozást. Azonban a kezelt embriókat toxinmentes környezetbe áthelyezve jelentősen csökkent az embrió fejlődés üteme és a túlélési arány (Oberemm et al. 1997). Cilindrospermopszin nem okozott jelentős mortalitást D. rerio embrionális vizsgálata kapcsán. Azonban az embriókba injektálva az LD 50 érték 4.50 fmol CYN/embrióra adódott (Berry et al. 2009) Rovar tesztek Az ökotoxikológia számos rovarfajt és ezek különböző stádiumú lárváit alkalmazza a toxikus anyagok kockázatbecslése során. Ezek között számos szúnyogfaj és lárvái megtalálhatóak. Mind a felnőtt, mind pedig a lárvák egyedein gyakran végeznek 20

20 biomarker, fejlődési, lokomóciós és mortalitás vizsgálatokat. A leggyakrabban alkalmazott fajcsoport, a Chironomus sp. érzékenysége kálium-dikromátra 11,8 és 112,9 mg/l LC 50 (48h) közé esik (Khangarot és Ray 1989; Meister 1995; Choi és Roche 2004; Choi et al. 2001). További elterjedten vizsgált a faj a sivatagi sáska (Schistocerca gregaria) (McElhiney és Lawton 2005) és a gyümölcslégy (Drosophila melanogaster) (Kaya et al. 2002). A fajok egyedein elsősorban mortalitási, genetikai és biomarker vizsgálatokat végeztek. Az alternatív tesztek ezen csoportja a legkevésbé releváns, ha cianobakteriális toxicitás jelentette kockázat felmérését tekintjük. Ez részben nehézkes kezelésüknek, részben csekély ökológiai relevanciájuknak köszönhető, főként, ha azt vesszük figyelembe, hogy elsősorban nem vízi rovarokat vizsgáltak. A különböző rovarfajokon jellemezően akut toxicitási vizsgálatokat végeztek. A vízi rovarok közül különböző szúnyogfajokat és ezek lárváit tanulmányozták (Turell és Middlebrook 1988). A lárvák vizsgálata elsősorban nem a cianobakteriális toxicitás meghatározására, hanem a cianotoxinok, szúnyogirtó szerként történő alkalmazhatóságának lehetőségére terjedt ki. A kifejlett egyedeket injekciózták, a lárvákat pedig oldatba helyezték a kísérletek során. Microcystin-RR esetében a sárgaláz vektor faja az Aedes aegypti érzékenysége LC 50 =14,9 mg/l-re adódott (Kiviranta et al. 1992). A Westiellopsis sp. cianobactérium LC 50 értéke Aedes aegypti 55.84mg/l, Anopheles stephensi mg/l, Culex quinquefasciatusra 14,25 mg/l, Culex tritaeniorhynchusra 6.3 mg/l (Rao et al. 1999). Microcystis aeruginosa fajjal szemben a C. quinquefasciatusra és A. stephensi lárvák LC 50 értéke 8 és 15 mg/l között adódott (Dhananjaya et al. 2003). Egy neuro- és hepatotoxinokat nem termelő Oscillatoria agardhii faj az A.aegypti különböző fejletségi szintű lárváira 8,7 és 6,1 mg élő sejt/l közötti LC 50 értéket mutatott (Kiviranta és Abdel-Hameed 2004). A módszer megfelelő érzékenységet mutatott, de az organizmusok kezelésének bonyolultsága okán mégsem terjedt el alkalmazásuk. Egy további rovarfaj, melyen kísérleteket végeztek a gyümölcslégy (Drosophila melanogaster) volt. Ezeket az állatokat könnyű kezelni, nem igényelnek különleges felszerelést. A toxinokat orális úton juttatták be a tesztszervezetekbe, szűrőlapocskákra cseppentett, répacukorban oldott formában, és a 24 óra alatt elpusztult egyedeket 21

21 számlálták. Sajnos a módszer nem mutatott kellő érzékenységet a neurotoxikus Aphanizomenon fajokkal szemben (Swoboda et al. 1994). Tanulmányozták a sivatagi sáska (Schistocerca gregaria) fajt is, mint potenciális alternatívát. A módszer megfelelő érzékenységet mutatott bizonyos cianobakteriális toxinokra és törzsekre (Aphanizomenon flos-aquae LD 50 = 60 mg/kg; Anabaena aphanizomenoides LD 50 = 170,2 mg/kg; Cylindrospermopsis raciborskii LD 50 =131.4 mg/kg; LD 50 =15 mg/kg Microcystis aeruginosa 60 mg/kg Aphanizomenon flos-aquae; 170,2 mg/kg Anabaena aphanizomenoides; 131,4 mg/kg Cylindrospermopsis raciborskii; (15 mg/kg) Microcystis aeruginosa, microcystin-lr LD 50 = 130 mg/kg. ) (Hiripi et al. 1998; J. McElhiney et al. 1998). Egy további vizsgálat alapján azonban, a módszer nem mutatott megfelelő érzékenységet szaxitoxinokra (LD 50 = μg/100 g) Ez az eljárás sem terjedt el szélesebb körben Zooplankton tesztek A szakirodalom tekintélyes részét képezi a fajcsoporttal kapcsolatos vizsgálatok. Számos taxonon végeztek a témakörben vizsgálatokat, melyek közt megtalálhatóak édes- és sósvízi fajok egyaránt, előbbiek közül több hazánkban is őshonos. Ezek a fajok fontos tagjai a vízi ökoszisztémáknak, hiszen a zooplankton elsődleges fogyasztóként számos magasabb rendű fajnak szolgál táplálékául. A tesztek során a stresszor által kiváltott és vizsgált válasz, a mobilitás-gátlási (gyakorlatilag mortalitási) arány, a táplálkozás aktivitás gátlása, mozgási és légzési aktivitás csökkenése. Számos standardizált változata létezik az ilyen típusú vizsgálatoknak, illetve több faj hozzáférhető a kereskedelemben úgynevezett tox-kitek formájában, melyek tartalmazzák a vizsgálatok elvégzéséhez szükséges tesztszervezeteket tartóspete formájában, a keltetéshez szükséges oldatokat, valamint a szükséges eszközök többségét. Ezen körülményeknek, illetve a tesztszervezetek könnyű kezelhetőségének köszönhetően a toxikológiában, ökotoxikológiában igen elterjedt módszerekről van szó (Pesoone 1998). Az egyik legelterjedtebb ezen kisrákok közül talán a sórák, vagy sóféreg (Artemia salina), mivel könnyen hozzáférhetőek, egyszerűen tarthatóak, és a tesztek kivitelezéséhez nem szükségesek különleges eszközök. A sórákot hosszú ideje használják környezetszennyező anyagok hatásának vizsgálatára, standardizált ún. teszt- 22

22 kitek formájában is forgalmazzák. A tesztek során 24 órás expozíciós idejű mortalitási arányt vizsgálhatunk (Nunes et al. 2006). Az Artemia salina kálium-dikromátra adott válasza (EC 50 ; 24h) 91 és 126 mg/l között adódik (MacLean és Doe 1989). Jó érzékenységet mutat a módszer különböző cianotoxinokkal szemben: mikrocisztinek: LD 50 = 5 10 mg/l (McElhiney és Lawton 2005; Metcalf et al. 2002), cilindrospermopszin: LC 50 = 2,86 mg/l (Metcalf, et al. 2002), anatxin-a: 2-14 mg/l (Laht, et al. 1995), ugyanakkor az is bebizonyosodott, hogy a módszer jól korrelál az egér toxikológiai vizsgálatok eredményeivel (Kiviranta et al. 1991; Metcalf, et al. 2002). Hasonlóan elterjedten használják a Daphnia fajokat alkalmazó módszereket. Ezen fajok közül sok nálunk is őshonos, így nagy relevanciával bír a hazai ökotoxikológiában. A Daphnia fajok különösen alkalmasak mikrocisztinek vizsgálatára, a sórákhoz hasonló mortalitás teszteken keresztül. (Baird et al. 1989) A Daphnia fajokon alapuló kitek szintén elérhetőek a kereskedelemben. A Daphnia magna érzékenysége káliumdikromátra mg/l közé esik (Persoone et al. 2009). A Daphnia fajok érzékenysége a cianobakteriális toxinokkal szemben hasonló az Artemia salina fajhoz. Három Daphnia faj (D. pulicaria, D. hyalma, D. pulex) vizsgálata alapján a Mikrocisztin-LR 48 órás EC 50 értéke 9,6 és 21,4 mg/l közé, míg 24 órás vizsgálat esetén 10,7 és 50 mg/l közé esik. Ezek közül a D. pulex bizonyult a legérzékenyebbnek. (DeMott et al. 1991). D. magna esetében az LC 50 értékek 0,6-1,26 mg/l (24h) értékek közé esnek (Lindsay et al. 2006; Kim et al. 2003). Ugyanakkor mikrocisztin tartalmú cianobaktériumok nyers kivonataira D. pulicaria és D. similis fajok ,45, illetve 34, mg/l LC 50 értéket mutattak (Jungmann és Benndorf 1994; Sotero-Santos et al. 2006; Okumura et al. 2007). Egy kísérletsorozatban D. pulex 10 klónján M. aeruginosa cianobaktérium nyers kivonatának vizsgálata 0,022 és 2,61 mg/l közötti LC 50 (48h) értékek adódtak (Hietala, et al. 1997). Ezek az adatok azt mutatják, hogy nemcsak különböző Daphnia fajok között, de akár a klónok között is jelentős eltérések adódhatnak a cianotoxinokra (Dao et al. 2010). Számos szubletális hatásról számol be a szakirodalom cianotoxinok hatásával kapcsolatban. Így például számos Microcystis faj (Nizan et al. 1986; Henning et al. 1991; Lotocka 2001; Rohrlack et al. 2001) kapcsán a táplálkozás aktivitás csökkenéséről, illetve ezen túlmenően, Cylindrospermopsis raciborskii és 23

23 Aphanizomenon ovalisporum fajok kapcsán az emésztőrendszer károsodásáról és ezen keresztül közvetlen toxikus hatásról számolnak be a szerzők (Nogueira et al. 2006). Proteáz inhibitor szekunder metabolitok kapcsán (pl. microviridin J) a vedlési folyamat zavarát jegyezték fel. Bár az új kültakaró kialakult, az állatok képtelenek voltak a régitől megszabadulni, e közben a még lágy héj oly mértékben deformálódott, hogy végül az állatok pusztulását okozta (Rohrlack et al. 2004). Egy további, az Amerikai kontinensen őshonos kisrák, mely a kereskedelemben, teszt kitként forgalomban van, a Thamnocephalus platyurus. Ez a taxon is kellően érzékenynek mutatkozott egy sor toxinnal szemben (Törökné et al. 2000). A standard mortalitás teszten felül, lehetőség van úgynevezett táplálkozási aktivitás teszt kivitelezésére is, mely szintén standardizált és validált eljárás. Ennek előnye, hogy gyorsabb a mortalitási teszteknél, illetve szubletális végpontot vizsgál (Törökné et al. 2007). A T. platyurus érzékenysége kálium dikromáttal szemben (LC 50 ; 24h) 0,11 és 0,18 mg/l közé esik (Fochtman et al. 2000). A legnagyobb számú irodalmi hivatkozás a mikrocisztin típusú toxinok és az ezeket termelő algafajok hatásának vizsgálatával kapcsolatos. Tisztított mikrocisztinekre 3,6-8,6 mg/l (24h) (Blom et al. 2001), valamint mg/l (1h táplálkozás aktivitás teszt) LC 50 értékek adódnak (Törökné 1999). Hasonlóan érzékeny a tesztszervezet mikrocisztin tartalmú cianobaktériumok nyers kivonataira is, a toxintartalommal azonban az eredmények nem mindig korrelálnak (Törökné et al. 2007; Keil et al. 2002) Makrofita tesztek Makrofita növényeken végzett vizsgálatok során általában a növekedési aktivitás gátlás alapján lehet következtetni a vizsgált minta toxikus hatására. Az ilyen típusú vizsgálatoknál azonban sokkal nagyobb jelentőséggel bírnak és jóval elterjedtebbek az in vivo jellegű enzim vizsgálatok. A vizsgálatok során talán legelterjedtebben használt faj a kis békalencse (Lemna minor). Ez a faj könnyen hozzáférhető, könnyen tartható laboratóriumi körülmények között és könnyen hozható létre belőle törzstenyészet. A módszer hátránya ellenben, hogy a standard kísérleti eljárás meglehetősen hosszadalmas, egy hétig tart (OECD 2002). További, a békalencséhez hasonló, gyakran vizsgált faj, a vízi dara (Wolffia arrhiza), mely hasonlóan használható, mint a már említett békalencse. Mindkét faj megfelelő 24

24 érzékenységet mutat toxinokkal szemben (Mitrovich et al. 2005; Mitrovic et al. 2004). A L. minor IC 50 =10 és 30 mg/l értékek között adódik kálium-dikromátra (7 nap) (Merlin et al. 1993). Lemna minor és Wolffia arrhiza mirocisztin-lr 10 és 20 mg/ml hatására 5 nap expozíciós idő jelentős növekedés-gátlást és tömegcsökkenést eredményez. Ezen felül L. minor esetében megfigyelték a peroxidáz enzim aktivitásának szignifikáns növekedését is (Mitrovich et al. 2005). Ezzel párhuzamosan Microcystis aeruginosa allelopátiás válaszokat váltott ki Lemna japonica fajon (Jang et al. 2007), ugyanakkor hasonló elváltozásokat Lemna gibba nem produkált (LeBlanc et al. 2005). További, elterjedten vizsgált faj a közönséges nád (Phragmites australis). A vizsgálatok során a növények biomassza produkcióját, illetve növekedési ütemét határozzák meg. Gyakran vizsgált paraméter a gyökér növekedésének üteme is. 0,5 mg/l mikrocisztin- LR koncentráció felett 50 %-nál magasabb növekedés-gátlást figyeltek meg 5-20 napos expozíciós idő mellett. Ugyanakkor szignifikáns hatást váltott ki két napos expozíciós idő mellett már 1 mg/ml mikrocisztin-lr koncentráció is (Máthé, et al. 2009). Hasonló módon alkalmazott, faj a fehér mustár (Synapis alba). E faj vizsgálata során is a növények, vagy a magok (csíranövények) növekedési ütemét vizsgálják. A különböző mikrocisztin variánsok e növényre kifejtett inhibíciós hatása (IC 50 ) 1,6-7,7 mg/l közé esik (McElhiney et al. 2001) Mikrobiális tesztek A legtöbb figyelmet kapott eljárás, a Microtox, amelynek tesztszervezete a mélytengeri biolumineszkáló baktérium, a Vibrio fischeri. A toxicitás mértéke a Microtox esetén az által válik mérhetővé, hogy a baktériumok által kibocsátott fény mennyisége csökken a mérgező vegyületek hatására. A fényintenzitás csökkenéséért a luciferáz enzim működésének gátlása a felelős. (Bulich 1979). Az előzetes vizsgálatok azt mutatták, hogy ez a rendszer alkalmas lehet a mikrocisztinek gyors detektálására algamintákban. Ám a részletes vizsgálatok eredménye az volt, hogy az eljárás olyan mikrocisztintől eltérő anyagokra is érzékeny, melyeket tartalmaznak az algakivonatok, és eddig még nem sikerült azonosítani (Campbell et al. 1994). Mára számos olyan publikáció napvilágot látott, melyek egyértelműen azt mutatják, hogy nincs korreláció a Microtox eljárás által adott 25

25 eredmény és a sejtek cianotoxin tartalma között (Vezie et al. 1996). Mikrocisztinekre a módszer EC 50 értéke 0,02 és 0,46 mg/l közé esik (Lawton et al. 1990; Aboal et al. 2002; Volterra et al. 2006). Nodularinra a módszer kevésbé érzékeny, érzékelési határa 250 mg/l (Dahlmann et al. 2001). A másik eljárás, melyet vizsgáltak, a Serratia marcescens pigment-termelésének (prodigiozin) gátlásán alapul. Ez az eljárás alkalmasnak mutatkozott szaxitoxinok és mikrocisztinek detektálására, de hasonlóan a Microtox teszthez, ez az eljárás is túl gyengén korrelált az aktuális minta cianotoxin tartalmával (Dierstein et al. 1989; Lawton et al. 1994) In vivo enzimatikus módszerek Az in vivo enzimatikus vizsgálatok jó felvilágosítást adnak az élő szervezetben toxikus hatásra lejátszódó hatásokról. Az eljárásokkal általában azt vizsgáljuk, hogy az élőlény (lehet állati, vagy növényi szervezet) mely enzimjei gátoltak/aktiválódnak működésükben bizonyos mérgező anyag hatására. A gátolt enzim fajtája felvilágosítást ad egyrészt, hogy milyen hatásmechanizmus szerint hat az adott toxin, másrészt, a kérdést megfordítva, pontosítani lehet, hogy milyen típusú, minőségű anyagok okozzák a toxikus hatást. A tejsavdehidrogenáz (LDH) aktivitásban bekövetkezett változás vizsgálatát széles körben alkalmazza mind a toxikológia, mind pedig a klinikai kémia sejt, szövet és szervkárosodások diagnosztizálására. Az LDH fontos glikogén enzim, mely szinte az összes szövetben előfordul, ezért elterjedten alkalmazott eljárássá vált az ökotoxikológia területén is. (Diamantino et al. 2001). Az LDH-szint változása, elsősorban a sejtek, szövetek épségének jelzője. Megbízható, gyors és egyszerűen kivitelezhető (Decker és Lohmann-Matthes 1989). Széles körben használják, sokféle sejtvonalon pl.: HepG2 sejteknél (Dong et al. 1989), PC 12 sejtek (Satpute et al. 2008), RBE-4 endothel sejteknél (Price et al. 2006), de primer patkány kortikális neuronokon történő mérésre is van példa (Akasofu et al. 2006). Szövetek, magasabb rendű élőlények esetében egésztest/szövet homogenizátum, illetve vér alkalmas a vizsgálat céljára. Számos esetben alkalmazták cianotoxinok hatásának becslésére, többnyire más enzimek együttes vizsgálatával mind sejtvonalakon (Pichardo et al. 2005; Dias et al. 26

26 2009; Botha et al. 2004), halakon (Rabergh et al. 1991), rágcsálókon (Ding et al. 1989; Gehringer et al. 2004), makrogerinctelen fajokra (Dewes et al. 2006) és zooplanktonra (Chen et al. 2005). A glutation S-transzferáz (GST) a detoxifikációs folyamatok indukciójának markere, mely fontos szerepet játszik a szervezetbe került xenobiotikumok metabolikus folyamataiban. A GST a glutation SH csoportjának konjugációját katalizálja számos toxikus elektrofil komponensre, ezáltal semlegesítve és vízoldékonyabbá téve azt (Habig és et al. 1974). A GST aktivitást elsősorban a hepatotoxikus összetevőkkel (mikrocisztinek és nodularinok) kapcsolatban vizsgálták, hiszen metabolízisük ezen az enzimrendszeren keresztül megy végbe mind emlősökben (Kondo et al. 1992), vízi gerincesekben (Pflugmacher et al. 1998, Wiegand et al. 1999) és vízi gerinctelenekben (Vinagre et al. 2002; Beattie et al. 2003; Chen és Xie 2005; Pflugmacher et al. 2005). Ezen felül bebizonyosodott, hogy anatoxin-a hatására növényekben megnő a peroxidáz- és GSTaktivitás (Mitrovic et al. 2004). Az acetilkolinészteráz (AChE) az állatok szervezetének idegi működése során keletkező egyik neurotranszmitter anyag, az acetilkolin lebontását végzi. Optimális körülmények között az enzim az acetilkolint acetátra és kolinra bontja, gátlása esetén az acetilkolin felhalmozódik és blokkolja a neurotranszmissziót (Purves et al. 2004). A módszer elsősorban anatoxinok és anatoxin-a(s) detektálására alkalmas. Az anatoxinok az acetilkolin hatását másoló vegyületek, melyek rendkívül erős kolinerg antagonista vegyületek, melyek erősebb kötődésre képesek a nikotin- és muszkarin receptorokhoz és lassabban távoznak, mint az acetilkolin. Az anatoxin-a(s) pedig az acetilkolinészteráz aktivitást blokkolja (Osswald et al. 2007; Smith et al. 2008). A protein foszfatáz (PP2A) szerepét a fehérjék defoszforilálásában tölti be. Számos életfolyamatban, többek között a sejtciklusban, a növekedésben, a hő sokk folyamatokban, a jelátvitelben, a sejttranszformációban, ill. a DNS replikációban is részt vesz. Inhibíciója esetén ezek a folyamatok is károsodhatnak. Ez az enzim mikrocisztinek és nodularinok kimutatására szelektíven használható, alkalmazása azonban inkább ELISA módszerek esetében jelentős (Ikehara et al. 2008). 27

27 A különböző típusú cianobakteriális toxinok természetesen különböző enzimekre vannak hatással. Erről ad felvilágosítást a 2. táblázat. Látható, hogy a kékalgák által termelt toxinok vizsgálatára tejsavdehidrogenáz (LDH), Glutathion S-transferáz (GST), acetilkolinészteráz (AChE), valamint protein foszfatáz (PP2A) vizsgálatán alapuló módszerek alkalmasak (Wiegand és Pflugmacher 2005). 2. táblázat. A cianotoxinok enzimatikus hatásai. (Wiegand és Pflugmacher 2005) Toxin csoport Termelő algafaj Toxikusságot okozó molekularész Mikrocisztinek Microcystis, Adda-csoport Anabaena, Plankthotrix Hatás Proteinfoszfat áz gátlás (PP1 és PP2) Nodularinok Nodularia Adda-csoport Proteinfoszfat áz gátlás (PP1 és PP2) Szaxitoxinok Anatoxinok Dinoflagellate (Protogonyaulax, Alexandrium, Gymnodinium, Pyrodinium) Cyanobacteria (Aphanizomenon, Anabaena, Lyngbya, Cylindrospermopsis) Anabaena, Aphanizomenon, Cylindrospermopsis, Planktothrix, Oscillatoria, Microcystis Az idegsejtek Nátriumcsatornáinak blokkolása Irreverzibilis kötés a nikotin acetilkolin receptorokon Anatoxin-(a)s Anabaena Acetilkolinészteráz aktivitás gátlás Cilindrospermopszin Cylindrospermopsis, Aphanizomenon, Umezakia, Raphidiopsis, Anabaena hidroxil csoport az uracil-hídon, vagy a Ketoenol állapot az uracil csoporton Protein bioszintézis gátló, károsítja a sejt DNS-t Biotranszformáció Glutathion S-transferáz Glutathion S-transferáz Glutathion S-transferáz Citokróm P450, glutathion S-transferáz Citokróm P450, glutathion S-transferáz Citokróm P450, In vitro módszerek In vitro enzimatikus módszerek Az előző fejezetben bemutatott in vivo enzimatikus módszerek alkalmazhatóak in vitro formában is. Ez elsősorban állati eredetű, szintetizált, vagy tejsavdehidrogenáz esetében sejtvonalas kísérletek során felszabaduló enzimek által lehetséges. Találunk számos példát LDH (Aune és Berg 1986), GST (Okada és Hase 2005; Best et al. 2002), AChE 28

28 (Yunes et al. 2003; Monserrat et al. 2001) és PP2A (Sim és Mudge 1993) alkalmazására is Immunológiai (ELISA) módszerek Az ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) esetében biológiai-biokémiai folyamatokat/reakciókat alapul vevő eljárásról van szó. Az ELISA jól kiegészíti mind az analitikai, mind pedig a toxikológiai vizsgálatokat, sőt néhány esetben e kettőt ötvözik. Ide sorolhatóak a különféle enzimaktivitás-gátlás vizsgálatán alapuló kromatográfiás eljárások, illetve az enzimkapcsolt immunoszorbens (ELISA) módszerek (Wild 2005). Mivel az antigén - antitest reakció nagyon specifikus, elsősorban egészségkárosító mikrobák vagy toxinjaik azonosítására használják az orvostudományban; és innen került az ökotoxikológia/toxikológiai eszköztárába. Leggyakrabban alkalmazott változata az ún. szendvics ELISA, amelynél a keresett toxinra egy specifikus antitestet alkalmaznak egy hordozóközegen rögzített formában, legtöbbször a hordozó maga a vizsgálat kivitelezésére szolgáló mikroplét. Amennyiben a minta tartalmazta a kérdéses antigént, az megkötődik az antitest felületén. Enzimmel konjugált antitesteket tartalmazó reagenst a rendszerhez adva, újabb specifikus kötés jön létre az előzőekben kialakult antitest-antigén komplexeken. Majd az enzim kromogén szubsztrátját adjuk a rendszerhez, amely színreakciót eredményez és ez által detektálhatóvá válik a keresett vegyület (Wild 2005). Az antitestek elkülönítését szolgáló technológia fejlődése révén ez az eljárás vált a mikrocisztinek detektálásának legfőbb eszközévé az utóbbi évtized során. Az ELISA legnagyobb előnye, hogy képes a mikrocisztinek szelektív detektálására a WHO irányelveknek megfelelő (<1 µg/l) tartományban. Mindezek mellett minimális mintaigényük van és kivitelezésük is egyszerű (McElhiney és Lawton 2005) Sejtvonalakon végzett kísérletek A cianotoxinok kimutatására, az emlős sejtvonalakon végzett kísérletek elsőként ban keltették fel a tudományos világ érdeklődését, amikor egy kísérlet során, mikrocisztinnel kezelt patkányokból frissen izolált májsejteken a laktát-dehidrogenáz (LDH) enzim csökkenése bizonyítottan jó korrelációt mutatott az in vivo egérkísérletek során kapott értékekkel (Aune és Berg 1986). Tíz évvel ez után újra a figyelem 29

29 középpontjába került a módszer. Ekkor már patkányból izolált májsejteket inkubáltak tiszta toxinnal, vagy algakivonatokkal 4 illetve 20 órán keresztül, és a sejtek életképességét az MTT ((3,4,5-dimetilthiazol-2il)-2,5-difeniltetrazolium bromid) teszt segítségével vizsgálták. A kísérlet eredményei megfelelő korrelációt mutattak az in vivo tesztek eredményeivel (Heinze 1996). A májsejtek mellett, fibroblaszt-sejtekkel is végeztek kísérleteket cianobakteriális toxinok hatásának, főként mikrocisztin vizsgálatára (Lawton et al. 1994). A teszt jól korrelált az egérkísérletek eredményeivel, bár számos fals negatív és pozitív eredmény is született. Az idegsejteket alkalmazó eljárásoknak két fő típusa terjedt el. Ezek egyike eredményesen detektálja a szaxitoxinokat; ez a módszer a neuroreceptorok felületén kompetitív kiszorítást vizsgálja radioaktívan megjelölt szaxitoxinnal (Davido és Fontelo 1984). A másik módszer neuroblasztóma sejtvonalak alkalmazásával vizsgálja a nátrium-csatornák blokkolását (Cembella et al. 1995). Mindkét módszer jelen pillanatban is gyors fejlődés alatt áll és már kereskedelmi forgalomban is kapható, ám már a korai vizsgálatok eredményei is jó korrelációt mutattak az egérkísérletek eredményeivel. A közelmúltban ez a terület is óriási fejlődésen esett át és mára számos emlős (Price et al. 2006), hal (Pichardo et al. 2005), növény sejtvonal került alkalmazásra. Az enzimatikus vizsgálatok fejlődésével pedig ezek a vizsgálatok még inkább relevánssá váltak A cianobaktériális toxicitás környezeti kockázata A cianobaktériumok azon pionír élőlények közé tartoznak, melyek elsőként népesítették be a Földet (Brock 1973). Ezek a fotószintetizáló mikrobák lehettek az ősi Föld szerves anyagának elsődleges termelői, és az első olyan organizmusok, amelyek elemi oxigént bocsátottak a légkörbe. A DNS-elemzések bebizonyították, hogy a legelső élőlények kiemelkedő hő tűrő tulajdonsággal bírtak és képesek voltak életben maradni extrém körülmények között; a vulkánok által fűtött óceánokban és a magas hőmérsékletű forrásokban egyaránt (Holland 1997). 30

30 A cianobaktérium és a kék-zöldalga (Cyanophyceae) kifejezések egyaránt használatosak és egymással helyettesíthető rendszertani kifejezések, szinonimák. A mikroorganizmusok ezen csoportja egy és többsejtű prokariótákat foglal magában, melyek klorofill-a-t tartalmaznak, fotoszintetizálnak I és II típusú fotokémiai rendszeren keresztül (Castenholz és Waterbury 1989). Alkalmazkodó képességük, lehetővé teszi olyan élőhelyek benépesítésére, ahol más organizmusok életképtelenek. Számos talajlakó faj ismert, ahol a szervetlen tápanyagok forgalmában fontos szerepet töltenek be (Whitton 1992). Mindezek ellenére, a cianobaktériumok többsége sós- (tengeri) és édesvízi élőlény. Időlegesen uralkodóvá is válhatnak mind a felszín közeli (epilimnikus), mind pedig a mélyebb (hipolimnikus) vízrétegekben (Whitton 1973) A cianobaktériumok felépítése, működése, viselkedése Morfológiai szempontból egysejtű (pl. Chroococcales) (Chorus és Bartram 1999), csoportos (pl. Pleurocapsales) és többsejtű fonalas szerkezeteket (Oscillatoriales) különböztethetünk meg. A filamentumokat létrehozó rend tagjai esetében (Nostocales és Stigonematales) gyakran figyelhetőek meg heterogén sejtek. A vegetatív sejtek heterosejtekké differenciálódhatnak (vastag sejtfalú és áttetsző protoplasztiszú, valamint nitrogénfixációra képes sejtek), vagy akinéták (nagy, vastag sejtfalú sejtek, melyek tartalék tápanyagokat raktároznak) kialakítására is képesek. A Stigonematales rend tagjainál gyakran figyelhetünk meg többsoros filamentumokat, melyekből valódi ágak nyúlnak ki, valamint mindkét fent említett heterosejt-típus megtalálható. A cianobaktériumok kizárólag ivartalan szaporodásra képesek. A szálas formák elsősorban a szálak töredezésével, vagy különleges, ún. hormogóniumok létrehozása révén képesek reprodukcióra. A hormogóniumok a trichómáktól elvált, önálló mozgásra is képes sejtek, melyekből fokozatosan újabb trichómák jönnek létre. A cianobaktériumok fototrófok, melyek kétfajta reakciócentrummal rendelkeznek (PS I. és PS II), hasonlóan a fejlett növényekhez. Járulékos pigmentek segítségével (allofikocianint (kék), fikocianint (kék) és néha fikoeritrint (vörös)) képesek hathatósan kihasználni a fény nm tartományba eső spektrumát, melyet más algafajok aligha tudnak hasznosítani. A cianobaktériumok képesek azt a típusú járulékos 31

31 pigmentet előállítani, amely az adott fényviszonyok közt a leghatékonyabban abszorbeálja a fényt (Whitton 1992). A cianobaktériumok figyelemre méltó tulajdonsága, hogy képesek esszenciális tápanyagok és metabolitok tárolására a citoplazmában. Ilyen, a citoplazmába ékelődött anyagokat fénymikroszkóp segítségével is megfigyelhetünk (például glikogén granulátumokat, lipid gömböket, cianoficin granulátumokat, polifoszfát testeket, karboxiszómákat) (Fay és Van Baalen 1987). A tartalékképzésnek ez a formája figyelhető meg, mikor tápanyagok feleslegben állnak rendelkezésre. Például nitrogéntartalmú sejtkomponensek szintézisének gátlása esetén, amennyiben nem áll rendelkezésre használható nitrogénforrás, a fotoszintézis elsődleges produktumai glikogének és lipidek szintézisére, valamint raktározására fordítódnak. Anyagcsereszempontból fontos tulajdonság a nitrogénfixáció képessége, mely biztosítja számukra az elengedhetetlen szervetlen tápanyagot. Nitrogénfixáló cianobaktériumoknak számos képviselője van a filamentumokat, heterocisztákat képző fajok között (pl. Anabaena, Nostoc) (Stewart 1973), de találunk példát nitrogén fixációra olyan fajok esetében is, melyek nem képesek heterociszták képzésére (pl.trichodesmium) (Carpenter et al. 1992). Alapvetően a nitrogén-limitált esetekben, a nitrogénfixáló cianobaktériumok kompetitív előnyre tehetnek szert, ezáltal jelentősen elszaporodhatnak. Az ilyen fajok tömeges megjelenése (algavirágzás) gyakori jelenség világszerte, mind édesvízi (például eutrofizálódott tavakban), mind pedig tengeri környezetben (például a Balti-tengerben). Számos planktonikus cianobaktérium-faj képes gázvezikulumok létrehozására. Ezek olyan gázzal töltött aggregátumok, melyek üreges, hidrofil külső és hidrofób belső felületű kamrák (Walsby 1981). A gázvezikulumok sűrűsége körülbelül tizede a vízének, így a cianobaktériumok ezek számának változtatása révén képesek befolyásolni vertikális helyzetüket a víztesten belül. A gázvezikulumok optimális számát több környezeti komponens befolyásolja, mint például a fényintenzitás, a kémiai környezet, a hőmérséklet) (Walsby 1987). Ez a tulajdonság nagy előnyt jelenthet a többi algafajjal szemben; gyakran alakul ki olyan vastag kék-algaréteg a vízfelszínen, mely lehetetlenné teszi a fény bejutását a mélyebb rétegekbe. 32

32 A cianobaktérium fajok többsége a maximális növekedési ütemét 25 C felett éri el (Robarts és Zohary 1987). Ez a hőmérsékleti optimum magasabb, mint a zöldalgák és a kovamoszatok esetében. Ez megmagyarázza, hogy mérsékelt égövi és hideg klímájú területeken miért nyáron alakulnak ki cianobaktérium okozta algavirágzások Cianobaktérium fajok a Balatonban Az előzőekben leírtak egyenes következménye, hogy cianobaktériumok tömeges megjelenésére lehet számítani eutrofizálódott, vagy eutrofizáló hatásoknak (magas foszfor- és nitrogénterhelés) kitett víztestek esetében. Az utóbbi néhány évtized során ezek a hatások úgy világszerte, mint a Balaton esetében számos vízminőségi problémát okoztak. Kompetitív előnyük révén (pl. magas hőmérsékleti optimum, nitrogénfixációs képesség) gyakran válnak időszakosan egyeduralkodóvá mérsékelt égövi területen a nyári hónapok során (Fogg 2002). További problémát jelentenek a cianobaktériumok által termelt toxikus szekunder metabolitok, melyek nem csak az élővilágra, de az emberi szervezetre is hatással lehetnek (Codd et al. 1999). Különösen nagy figyelmet érdemelnek a gyűjtőnéven cianotoxinoknak nevezett biotoxinok olyan remediációs övezetekben, mint a Balaton. A Balaton kutatásának korai szakaszában, a XIX. sz. végén, 109 algafaj jelenlétét, köztük öt cianobaktérium fajt írtak le, melyek közül az Aphanizomenon flos-aquae heterocisztás cianobaktérium volt a legjellemzőbb (Istvánffy 1987). Későbbi kutatások már 13 az Anabaena és az Aphanizomenon nemzetséghez tartozó faj jelenlétét említik (Entz et al. 1937; Kol 1938; Tamás 1954; Tamás 1959). A hatvanas évektől felgyorsuló eutrófizációs folyamat következtében, újabb fajok megjelenése mellett (Rhaphidiopsis mediterranea, Anabaenopsis elenkini) (Tamás 1974; Hegewald et al. 1975), egyre inkább a cianobaktériumok válnak uralkodóvá a nyári hónapokban az egyéb fitoplankton fajokkal szemben. A folyamat a hetvenes évek közepétől tetőzik, amikor egyre gyakrabban jelennek meg cianobakteriális algavirágzások (Vörös 1980; Vörös és mtsai. 1983; G.-Tóth és Padisák 1986) ban jelenik meg a Balaton algaflórájában a Cylindrospermopsis raciborskii (Oláh et al. 1981), mely a megjelenését követő évben már felülmúlja az addig uralkodó Aphanizomemon flos-aquae egyedsűrűségét (Padisák et al. 1984; Vörös és mtsai. 1983), majd néhány évvel később már egyeduralkodóvá válik az egész tóban. Ez a folyamat az 33

33 1994. évben csúcsosodott ki, amikor ez a faj a fitoplankton több mint 90 %-át adja (Présing et al. 1996). A Cylindrospermopsis raciborskii egyeduralkodó szerepe mára megszűnőben van, azonban más fonalas cianobaktérium fajokkal (Aphanizomenon gracile és Aphanizomenon isssatchenkoi) együtt még ma is nagy számban megjelenik a nyári fitoplankton közösségben. A cianobaktériumok toxintermelése nem állandó, előfordul, hogy ugyanazon faj populációjának toxintermelése egy adott tóban, térben és időben is erőteljesen változik. Ezen felül egy faj többféle toxin termeléséért is felelős lehet, ebből adódóan egy faj populációi eltérő mértékű toxicitást mutathatnak, de gyakran előfordulnak toxint egyáltalán nem termelő törzsek is (Fastner et al. 2003) Cianotoxinok A cianotoxinok rendkívül változatos csoportja a természetes toxinoknak, mind kémiai, mind pedig toxikológiai szempontból. A cianobaktériumok sokféle különleges metabolitot termelnek, melyek funkciója nem teljesen tisztázott, bár némelyek (lehetséges, hogy csak indirekt módon), hatással vannak más biotópokra is (Wiegand és Pflugmacher 2005). Tanulmányok sokasága született világszerte az 1980-as évek folyamán a cianobaktériumok előfordulási gyakoriságával és eloszlásával kapcsolatban, melyek során számos, egér-toxikológiai vizsgálat készült. Kvantitatív módszer a cianotoxinok meghatározására csak az 1980-as évek végétől áll rendelkezésre, azóta az egyes cianotoxinokkal kapcsolatos kutatások száma ugrásszerűen megnőtt. Ennek eredményeképp ma már ismert, hogy a neurotoxinok megjelenése kevésbé általános, mint az egyéb toxinok előfordulása. Ezzel szemben a ciklikus peptid toxinok (mikrocisztinek és nodularinok), melyek elsődlegesen májkárosodást okoznak, sokkal inkább elterjedtek és gyakori kísérői a cianobaktériumok által okozott algavirágzásoknak (Codd et al. 1999). A cianobaktériumok által termelt toxikus anyagok okozta mérgezési tünetek mechanizmusa ma már jól ismert. Hatásuk nagyon sokrétű lehet, a hepatoxikus hatástól, neurotoxikus, dermatotoxikus hatáson át, egészen fehérjeszintézis általános gátlásáig terjed. A cianotoxinok három nagy kémiai csoportba sorolhatóak, ezek: ciklikus peptidek, alkaloidák, és lipopoliszacharidok (LPS). Vízi környezetben ezek a toxinok 34

34 általában a cianobaktériumok sejtjein belül maradnak és csak abban az esetben juthatnak a vízbe, ha valamilyen külső tényező jelentős sejtkárosodást okoz (Wiegand és Pflugmacher 2005; Araoz et al. 2009) Hepatoxikus ciklikus peptidek mikrocisztinek és nodularinok A cianobakteriális algavirágzásokat kísérő toxinok közül a ciklikus peptid típusú nodularin és mikrocisztin fordulnak elő leggyakrabban. Az ezeket termelő cianobaktériumok okozzák a legtöbb problémát a felszíni vízből történő ivóvíznyerés során. Egereken végzet toxikológiai kísérletek szerint, akut dózis esetén, mindössze néhány óra alatt halált okoznak, melynek elsődleges oka a fellépő májvérzés. A mikrocisztineket eddig planktonikus Anabaena, Microcystis, Oscillatoria (újabban Planktothrix), Nostoc, Anabaenopsis és a szárazföldi Hapalosiphon nemzetségekben mutatták ki (Carmichael 1992; Wiegand és Pflugmacher 2005). A mikrocisztinek több mint 80 variánsát írták le ez idáig, melyek LD 50 értéke széles tartományban mozog (50 és 1200 μg kg -1 egerekre, hasüregbe injekciózva) (Hotto et al. 2007). A nodularint viszont, eddig csak Nodularia spumigena fajjal kapcsolatban írták le (Carmichel et al. 1988). A ciklikus peptidek viszonylag nagyméretű természetes anyagok, molekulatömegük (MW) 800 Da és 1000 Da között van. Vagy öt (nodularinok, 1. ábra fent), vagy hét (mikrocisztinek, 1. ábra lent) aminosavból épülnek fel, melyek közül négy, illetve hat gyűrűt formál. Vízoldékonyak, és néhány kivételtől eltekintve, nem képesek áthatolni közvetlenül az állati és növényi sejtek lipid-membránján. Toxikus hatásukat ezért csak úgy fejthetik ki, ha membrán transzport folyamatok révén a sejtbe jutnak, amely egyébként csak bizonyos esszenciális biokémiai, vagy ásványi anyagokra jellemző. Kémiai stabilitásuk és vízoldékonyságuk miatt a környezetben nagy perzisztenciával rendelkeznek, és a felszíni vizeken keresztül veszélyt jelentenek az emberre is. 35

35 A mikrocisztinek általános molekulaképlete a következő: ciklo-(d-alanin-x2-d-measp3-z4-adda5-d-glutamát6-mdha7); ahol X és Z különböző L aminosavakat jelölnek; a D-MeAsp D-eritro-β-metilaszparaginsav-nak felel meg, míg az Mdha N-metildehidroalanin-t jelent. Az Adda nevű aminosav, (2S,3S,8S,9S)-3-amino-9-metoxi-2,6,8-trimetil-10-fenildeka-4,6-diénsav, a legkülönlegesebb ezek között a vegyületek között. Ez utóbbi esszenciális a toxinok biológiai aktivitásához (Chorus és Bartram 1999). 1. ábra. A mikrocisztinek (lent) és a nodularinok általános felépítése (fent) (Codd et al. 1999) Az első ilyen toxinokat a Microcystis aeruginosa fajból izolálták, innen ered a mikrocisztin név is. A mikrocisztinek közül talán leginkább ismert a mikrocisztin-lr (MC-LR). A MC-LR kovalensen kötődik a protein foszfatáz 1 (PP1) és a protein foszfatáz 2A-hoz (PP2A). Az MC-LR már nm koncentrációban direkt módon gátolja a PP2A működését azáltal, hogy irreverzibilisen kötődik az enzim karboxil végéhez, így a metiltranszferáz nem képes hozzáférni a foszfatázhoz. A mikrocisztin krónikus dózisa általános májkárosodást okoz, illetve arról is beszámoltak, hogy mikrocisztin tartalmú vizet fogyasztó embereknél megnőtt a májdaganat megjelenésének gyakorisága (Codd et al. 1999; MacKintosh et al. 1990). 36

36 A nodularin kémiai felépítse a következő: ciklo-(d-measp-l-arginin-adda-dglutamát-mdhb); ahol az Mdhb jelentése 2-(metilamino)-2-dehidrobutilén sav. A nodularinnak kevés, a természetben is előforduló variánsa ismert: kettő demetilált variáns; egy, melyben a D-MeAsp t D-Asp helyettesíti, valamint egy, melyben az Adda helyett DMAdda található; illetve egy nem toxikus nodularin, melyben az Adda 6Z-szetereoizomerje foglal helyet. Az ezzel ekvivalens mikrocisztin Adda 6Z- izomerje ugyanígy nem toxikus (Namikoshi et al. 1994). A mikrocisztin és a nodularin legtöbb változata erősen toxikus hatású és viszonylag szűk határon belül mozog toxicitásuk (egerek hasfalába injektált toxinokra μg kg -1 testsúly kilogrammonkénti LC 50 értékek adódnak). Csak néhány nem mérgező variánsa ismert ezeknek a toxinoknak. Általánosságban elmondható, hogy minden olyan izomerizációs változás, amely az Adda-glutamát régiót érinti (például ha az Adda-dién 6E 6(Z)-vé izomerizálódik), vagy a glutamát acilizációja, megszűnteti a molekula toxikus hatását (Rinehart et al. 1994). A lineáris mikrocisztinek és nodularinok több mint százszor kevésbé mérgezőek, mint a hasonló ciklikus molekulák. A lineáris mikrocisztinek felfoghatóak úgy is, mint mikrocisztin-prekurzorok, és/vagy bakteriális bomlástermékek (Choi et al. 1993) Neurotoxikus alkaloidák anatoxinok és szaxitoxinok A cianobakteriális nerotoxinok (a) a muszkuláris és idegi nikotin acetilkolin típusú receptorok antagonisztikus gátlása által (anatoxin-a, homoanatoxin-a), (b) az acetilkolinészteráz enzim irreverzibilis gátlása révén (anatoxin-a(s)), illetve (c) a Na + - ion csatornák blokkolása által (szaxitoxinok) fejtik ki toxikus hatásukat. A cianobakteriális neurotoxinokat ez alapján három csoportra oszthatjuk; ez a csoportosítás jól tükrözi a toxinok kémiai szerkezetét is (Araoz et al. 2009): Anatoxin-a és homoanatoxin-a, Anatoxin-a(S), Szaxitoxinok. Az alkaloid cianotoxinok kémiai stabilitása változó; mennek végbe rajtuk spontán folyamatok, melyek során még toxikusabb, vagy ártalmatlanabb melléktermékek keletkeznek. Néhányukon végbemehetnek fotokémiai reakciók is. 37

37 Az anatoxin-a jelenlétét Anabaena (Harada et al. 1989), Aphanizomenon (Selwood et al. 2007), Cylindrospermum (Sivonen et al. 1989), Microcystis (Park et al. 1993), Oscillatoria (Sivonen et al. 1989), Planktothrix (Viaggiu et al. 2004) és Raphidiopsis (Namikoshi et al. 2003) fajokból, míg homoanatoxin-a Oscillatoria (Skulberg et al. 1992), Anabaena (Furey et al. 2003), Raphidiopsis (Namikoshi et al. 2003) és Phormidium (Wood et al. 2007) fajokból került kimutatásra. Számos faj képes ugyanakkor a két toxin szimultán szintézisére, ilyen a Raphidiopsis mediterranea Skuja (Namikoshi et al. 2003), és néhány Oscillatoria faj (Araoz et al. 2005). Az anatoxin-a egy kis molekulatömegű alkaloida (MW=165 Da), szekunder amin, 2- acetil-9-azabiciklo(4-2-1)non-2-én (2. ábra, balra). A homoanatoxin-a (MW=179 Da) az anatoxin-a homológja, (2. ábra középen). A 2-es szénatomon egy propionil csoport foglal helyet, az anatoxin acetil csoportja helyén. A két vegyület LD 50 értéke egerekre 250 μg kg -1 körül adódik (Devlin et al. 1977; Araoz et al. 2009). 2. ábra. Anatoxinok általános felépítése. Anatoxin-a balra, homoanatoxin-a középen, anatoxin-a(s) jobbra (Codd et al. 1999) Toxikus hatásukat állatok (emlősok és madarak) esetében azáltal fejtik ki, hogy az acetilkolint imitálva irreverzibilisen kötődnek a nikotin acetilkolin típusú receptorokhoz. Ezáltal a nátriumcsatornákat nyitva tartják és az így beáramló nátriumionok túlstimulálják a sejtet. Növények esetében a fotoszintetikus oxigéntermelés csökkenéséről, glutation S-transzferáz enzim és peroxidáz szint megemelkedéséről számolnak be (Mitrovic et al. 2004). Az anatoxin-a(s) a ciklikus n-hidroxiguanin egyszeres foszfát észtere, amelyet egy Anabaena flos-aquae (Mahmood és Carmichael 1986) törzsnél mutattak ki elsőként (2. ábra, jobbra). Molekulatömege MW=253 Da. A közelmúltban azonosították és izolálták Anabaena lemmermannii (Henriksen et al. 1997) által okozott algavirágzások vizsgálata során. Egereken végzett toxikológiai vizsgálatok alapján az anatoxin-a(s) 38

38 LD 50 -értéke 20 μg kg -1 (Onodera et al. 1997). Az anatoxin-a(s) egyéb szerkezeti variánsai nem ismertek. Hatása hasonló a szerves foszfát- és karbamát típusú inszekticidekéhez, mint például, a paraoxon; irreverzibilisen kötődik az acetilkolénészteráz enzimhez (Araoz et al. 2009). A szaxitoxinokat elsőként az alaszkai vajkagylóból (Saxidomus giganteus) izolálták, amelyben egy vörös színű algából akkumulálódott (Schantz et al. 1957). Szaxitoxinokat néhány cinaobaktérium (Anabaena, Aphanizomenon, Cylindrospermopsis, Lyngbya, Planktothrix) faj esetében találtak (Negri és Jones 1995). 3. ábra. Szaxitoxinok általános felépítése (Codd et al. 1999) Közel harminc stabil szaxitoxin variánst különítettek el, amelyek közül néhány valószínűleg kémiai bomlástermék bizonyos fajokban. A szaxitoxinok a karbamált alkaloid toxinok egy csoportja, melyen belül lehetnek kénmentesek (szaxitoxin STX), egyszeresen szulfatáltak (gonyautoxinok GTX), vagy kétszeresen szulfatáltak (C toxinok) (3. ábra). Néhány fajban azonosítottak még dekarbamált variánsokat és néhány új toxint is (Araoz et al. 2009). Hatását az által fejti ki, hogy blokkolja az idegsejtek nátrium-csatornáit, ezáltal lehetetlenné válik a nátrium-ion beáramlás a sejtbe, ami paralízishez vezet (Cestele és Catterall 2000; Bricelj et al. 2005) Citotoxikus alkaloidák A clindrospermopszin egy ciklikus guanidin alkaloida Mw=415 Da-os molekulatömeggel (4. ábra), melyet néhány édesvízi cianobaktérium, például a Cylindrospermopsis raciborskii, Umezakia natans és az Aphanizomenon ovalisporum 39

39 termel. Vegytiszta formában a cilindrospermopszin a májat támadja, de a C. raciborskii törzsből készült nyers kivonatot egerekbe injektálva, más szerveken is patológiai tüneteket okozott (vesében, lépben, thymusban és a szívben). A tiszta cilindrospermopszin LD 50 értéke egerek hasfalába injektálva 2.1 mg/kg 24 óra alatt (Ohtani et al. 1992). A cilindrospermopszin gátlólag hat a proteinfoszfatáz enzimekre és szignifikánsan gátolja a proteinszintézist. Hatására glutation S-transzferáz aktivitásváltozást is kimutattak (Metcalf et al. 2002) (Lindsay et al. 2006). 4. ábra. Cilindrospermopszin általános felépítése (Codd et al. 1999) Iritatív toxinok lipopoliszaharidok A lipopoliszacharidok (LPS) a Gram-negatív baktériumok sajátjai. A lipopoliszacharidok kondenzált cukor származékok, általában egy hexózból és valamilyen lipidből állnak, leggyakrabban egy hidroxi C 14 -C 18 zsírsavból. Szerkezeti szempontból, az LPS egy polimer komplex, amely négy régióból áll. Az I. régió az O- antigén régió, amelyben oligoszacharid egységek ismétlődnek. Ezek szerkezete különböző, számos eltérő cukorgyök és glikogén egység összekapcsolódása révén jönnek létre. Ahogy a név is sugallja, az O-antigének tartalmaznak néhány olyan antigén determinánst, amely számos lizogén bakteriofág receptor helyein is megtalálható. A II. és a III. régiók a poliszacharid külső vázát és belső gerincét adja. A molekulák vázát alkotó vegyületek rendszerint csak kis változatosságot mutatnak különböző fajok esetében. A molekula gerincét alkotó régió egy glikolipidhez csatlakozik (A-lipid; IV. régió), egy rövid kapcson, 3-deoxi-D-mannózsavon (KDO) keresztül. Az A-lipid egy diszacharid, amelyben a glükózamint foszfát, zsírsav, vagy KDO helyettesíti, bár a cianobaktériumok esetében ez utóbbi aránya alacsony, vagy hiányzik. Az A-lipid komponenshez acetil csoporton keresztül kapcsolódik egy észterezett, vagy amid típusú hidroxi-zsírsav is. 40

40 Ezek az anyagok pirogénak és toxikusak. Többnyire a zsírsav komponens az, amely iritatívan, allergénként hat az emberre és az emlősökre. A cianobakteriális LPS azonban határozottan gyengébb hatású, mint az egyéb, patogén Gramm-negatív enterobaktériumok lipopoliszacharidjai, mint például a szalmonelláé. Az LPS-ek számos enzimre hatással lehetnek, így például csökkentik a GST-aktivitást, valamint a P450 izoenzim (CYP 1A2, Cyp 2B1/2) aktivitást (Wiegand és Pflugmacher 2005). 41

41 2. Anyag és módszer Az elmúlt évek során a Balatonból izolált cianobakteriumok (elsősorban Cylindrospermopsis raciborskii törzsek) toxicitását mind hazai, mind külföldi kutatócsoportok is vizsgálták, azonban a portugál (Saker et al. 2003), német (Fastner et al. 2003) és francia (Briand et al. 2002) esetekhez hasonlóan az izolált C. raciborskii törzsek toxicitását tekintve, gyakran ellentmondásos eredmények születtek. Az európai vizekben előforduló C. raciborskii toxicitását adó hatóanyagokat nem sikerült azonosítani, a kérdés tisztázására a kutatások még folynak. A cianobakteriális toxicitás kutatásának új irányvonala a cianobakteriális szekunder metabolit mátrix hatásmechanizmusának elemzése komplex módon a bioaktív komponensek szétválasztása nélkül, valamint az anyagok kölcsönhatásainak feltérképezése (Pegram et al. 2008). Munkánk során mi is ezt az irányvonalat követtük; a rendelkezésre álló alternatív, konvencionális és saját fejlesztésű tesztek segítségével kerestünk választ arra, hogy a Balatonból izolált négy C. raciborskii törzsek milyen jellegű toxikus hatással rendelkeznek. A vizsgálatok során pozitív kontrolként alkalmaztunk egy bizonyítottan cilindrospermopszint termelő C. raciborskii törzset (AQS), valamint egy anatoxin-a-t és homoanatoxin-a-t termelő Oscillatoria fajt (PCC 6506). Ezzel párhuzamosan értékeltük az alkalmazott teszteket, olyan szempontok alapján is, hogy mennyire alkalmasak a komplex összetételű bioaktív tulajdonsággal rendelkező kivonatok kockázatának jellemzésére. Referencia tesztként két szabványos akut mortalitás tesztet alkalmaztunk, a Daphnia magna tesztet (Daphtoxkit F magna), valamint, a Thamnocephalus platyurus letalitási (Thamnotoxkit F) tesztet. A cianobaktérium tenyészetek toxicitásának vizsgálata során párhuzamosan ellenőriztük a hatást, mind sórákon (Artemia salina, ArTox), mind a Vibrio fisheri biolumineszcens baktériumra épülő teszt alapján (ToxAlert 100), valamint saját módszerünkkel, a Daphnia magna táplálkozás aktivitás-gátlás teszt alapján is Anyagok A kísérletekhez az alábbi vegyszereket és anyagokat használtuk: nikotinamid adenin dinukleotid (NADH) (Sigma), piruvát (Sigma), Trish-HCl (Sigma), Bradford reagens 42

42 (Sigma, B6916foetalis borjúszérum (FBS) (Invitrogen), magnézium-klorid (Spektrum 3D), kálium-dikromát (Merck), Daphtoxkit F magna (MicroBioTests, Belgium), Tahmnotoxkit F (MicroBioTests, Belgium), Vibrio fischeri Lumineszcens baktérium kit (Hach Lange), foszfát puffer (ph=7,2) APHA (Sigma), 1-klór-2,4-dinitrobenzol (CDNB) (Sigma), fiziológiás sót tartalmazó foszfát puffer (PBS) (Sigma), Glutation (GSH) (Sigma), acetiltiokolin-jodid (ATCI) (Sigma), 5,5 ditio-bisz-nitro-benzol (DTNB) (Sigma), anatoxin-a (Ascent Scientific). Mikrocisztin-LR, Cilindrospermopszin (Prof. Dr. Borbély György bocsátotta rendelkezésünkre) Algakivonatok A kísérletek során 6 algatörzset teszteltünk. Négy, a Balatonból izolált C. raciborskii törzset (ACT 9502, ACT 9503, ACT 9504, ACT 9505); toxikus referenciaként a bizonyítottan cilindrospermopszint termelő ausztrál Cylindrospermopsis raciborskii (AQS), valamint a norvég, anatoxinokat termelő Oscillatoria sp. (PCC 6506) törzset. Az alga kivonatokat azonos módon és időben állítottuk elő, illetve teszteltünk. A cianobaktériumok fél-folyamatos tenyésztése 16 literes üveg hengerben történt. A tenyészetet BG-11-es médiumban tartottuk fent (Rippka et al. 1979). A C. raciborskii tenyészetekhez NaNO 3 mentes médiumot használtunk. Az alga kultúráinkat folyamatosan ellenőrzött körülmények között szaporítottuk 22±1 C-on, 14:10 órás fény:sötét ciklus mellett (a sugárzás mértéke 80 μmol m-2 s-1,(us-sqs/l spherical microsenzor, WALZ), melyet egy hidegfény fluoreszcens lámpatest biztosított (Tungsram F-33, 40 W). A kései exponenciális növekedési fázis elérése után a sejtek összegyűjtése GF/C szűrőpapíron (Watman) keresztüli centrifugálással történt. A médiummentes alga biomasszát lefagyasztottuk -20 C fokon, majd liofilizáltuk. A kivonat készítéséig a szárazanyagot 20 C-on tároltuk. Az algák feltárását desztillált vízben több ciklusú fagyasztás/kiolvasztás útján végeztük. A feltárás hatékonyságát mikroszkópban ellenőriztük. A sejttörmeléket két ciklusban, centrifugálással távolítottuk el (12000g, 10 perc, 4 C). 43

43 2.2. Vizsgálatok Lemna minor makrofita növényen Növekedési inhibíció teszt A teszt kivitelezése az OECD Test No. 221 Lemna sp. Growth Inhibition Test (2006) alapján történt. A békalencse-növekedés gátlásának vizsgálata, a Svéd szabványnak megfelelő növekedési közegben (SIS) történt. A tesztnövényeket a szabványban meghatározott módon létrehozott altenyészeteiből nyertük. A teszt kivitelezése során folyamatos, fehér fényű, lux intenzitású megvilágítást alkalmaztunk. A hőmérséklet 24±2 C (szobahőmérséklet), az expozíciós idő pedig 7 nap volt. A hígítási sorok készítése során a tápoldatot használtuk a tesztoldatok hígítására. Az expozíció 300 ml-es Erlenmeyer-lombikokban zajlott, melyekbe 150 ml mintát helyeztünk, valamint 10 darab kétlevelű Lemna minor egyedet. A kontrol médiumként a fent leírt módon készült tápoldatot használtuk. Az expozíciós idő letelte után feljegyeztük a levélkék számát, a levélkeszámok természetes alapú logaritmusából (lnf) meghatározható a növekedési sebesség (µ). Ezen µ értékeket először a tesztedényekre vonatkozóan számítottuk, majd a párhuzamosokra vonatkozóan átlagoltuk. Ebből meghatároztuk az egyes hígításokhoz tartozó növekedési sebességi értékeket. µ=(lnf t lnf 0 )/t, ahol: F t : az edényben lévő levélkeszám t idő elteltével F 0 : az edényben lévő levélkeszám a kísérlet kezdetén t: kísérlet közben eltelt idő A békalencsén végzett kísérletek során fontos paraméter a duplázódási idő (TD), melyet a növekedési sebességből határoztunk meg. TD= ln2/µ A növekedési sebesség ismeretében annak százalékos gátlása számolható (%Ir) minden egyes hígítás esetén: %Ir=(µ k -µ t )*100/µk, 44

44 ahol: µ k : a kontroll növekedési sebessége µ t : a mintában lévő növény növekedési sebessége A százalékos gátlás ismeretében számolható az EC 50 érték Képelemzési módszeren alapuló Lemna minor teszt A tesztek kivitelezése ez esetben azonos volt az előzőekben (Vizsgálatok Lemna minor makrofita növényen) leírtakkal. A levélkeszám helyett azonban a növekedés ütemének meghatározása érdekében a növények felületéről készült fotók szoftveres értékelése alapján került sor. Speciálisan ehhez a feladathoz fejlesztettük ki a Duckweed Detector (DwD) v0.1/v.02 szoftver, amely a felület vizuális becslését végzi. A programmal meghatározható mind az élő, mind a halott levélkék által fedett terület teljes vizsgálati területhez viszonyított százalékos aránya. Az eljárás algoritmusa a következő: 1. A békalencse-tenyészetet alulról fehér fénnyel megvilágítottuk, majd felülről lefényképeztük. 2. A képet színsávokra bontottuk. A kiértékeléshez célszerűen a piros vagy a kék sávot vizsgáltuk. (A háttérfény fehér, tehát tartalmaz kék, zöld, és vörös komponenst is. Ez azért fontos, mert a kamera CCD-je ezt a három sávot méri a színes kép előállításához. Ahol a fény (majdnem) akadály nélkül jut a kamerába (üvegen, a folyadékon vagy az elpusztult levélen keresztül), ott mindegyik sávból jut át fénymennyiség. A sötétzöld részeken viszont csak némi zöld fény jut át.) 3. Kijelöltük a vizsgálati területet. A DwD módot ad arra, hogy egy célkereszt mozgatásával mi jelöljük ki a vizsgált terület közepét, majd ehhez a kör sugarát a pixelek számának megadásával határozhatjuk meg. 4. Beállítottuk az érzékenységet, tehát definiáltuk az élő és a halott levélkékhez tartozó vágási küszöböt. Ezzel meghatároztuk, melyek azok a képpontok, amelyek elég sötétek (a kék csatornában), ezeket tekintjük élőnek. 5. Megkaptuk az élő, illetve a halott levélkék által borított terület nagyságát a vizsgálati terület százalékában. 45

45 Az így kapott százalékos értékeket az előzőekben leírt számítási algoritmusba helyettesítve határoztuk meg a növekedési-gátlás mértékét Vizsgálatok Daphnia magna plankton rákon Daphnia magna immobilitás teszt A MicroBioTests Inc.-től szereztük be a tesztszervezeteket tartósított formában tartalmazó DAPHTOXKIT F TM et, amely tartalmazza a keltetéshez és a teszteléshez szükséges eszközöket (mikroplétek, pipetták, Petri csészék) és anyagokat (sóoldatok NaHCO 3, CaSO 4, MgSO 4, KCl, melyekből a teszt során alkalmazott standard édesvíz készíthető). A tesztek kivitelezése az MSZ EN ISO 6341:1998 szabványnak megfelelően történt. A tesztek kivitelezése során a kittben található pléteket alkalmaztuk, hígító és kontrol közegként pedig az előlevegőztetett standard édesvizet használtuk. A kísérletek során három párhuzamos mérést alkalmaztunk minden esetben. A megfelelő hígítási arányok beállítását követően ml teszt oldatba 5-5 tesztállat került. A feltöltött mikropléteket 20 C-ra beállított inkubátorba helyeztük 24 óra (expozíciós idő) erejéig. 24 óra elteltével meghatároztuk a mortalitási arányt Daphnia magna táplálkozás aktivitás-gátlás teszt A Daphnia magna táplálkozásaktivitásán alapuló eljárás saját fejlesztés. A módszer alapja egy hasonló, Amerikában őshonos héjnélküli kisrák fajra (Thamnocephalus platyurus; Rapidtoxkit, MicroBioTests, Belgium) kidolgozott eljárás, mely során a lárvákat rövid idejű expozícióját követően (15-60 perc), színes jelölőanyaggal etetik be. A jelölő anyag az aktívan táplálkozó egyedek emésztőrendszerében mikroszkóp segítségével megfigyelhető. A teszt végpontja a táplálkozásaktivitás csökkenése. A miropléteket a mortalitási teszttel azonos módon feltöltve, majd 20 C-on, egy, két, illetve négy órás expozíciós idő elteltével 0,1 ml piros színű polisztirén mikrogyöngyök szuszpenzióját adagoltunk a tálca celláiba. A mikrogyöngyök átmérője 5μm, melyet akadálytalanul képesek a tesztállatok felvenni (Burns 1968). Újabb fél órát követően a tesztegyedeket fixáltuk, majd mikroszkóp tárgylemezére pipettáztuk. A fénymikroszkóp tárgyasztalára kék színű fényszűrőt helyeztünk (így könnyebben megkülönböztethetőek 46

46 a piros anyagot elfogyasztó egyedek azoktól, amelyek nem táplálkoztak) és meghatároztuk azon egyedek számát, melyek emésztőrendszerét kitölti a jelölőanyag Thamnocephalus platyurus mortalitás teszt A tesztek kivitelezése a Daphnia magna immobilitás teszt eljárás során alkalmazott kitthez hasonló, Thamnotoxkit F kit felhasználásával történt. Ennek tartalma hasonló a Daphtoxkit F-hez, valamint a standard oldat elkészítése is megegyezik. Fontos különbség azonban, hogy a tesztállatok keltetéséhez szükséges idő ez esetben 24 óra. A vizsgálatokat az MSZ 20359:2003 (Környezetvédelmi ökotoxicitás-vizsgálatok Thamnocephalus platyurus-szal) szabványnak megfelelően végeztük. A tesztszervezetek keltetését a teszt megkezdése előtt 24 órával kell megkezdeni. A petéket a keltetésre szolgáló Petri-csészébe visszük át 15 ml előlevegőztetett, 1:8 arányban hígított standard oldattal. A Petri-csészét lefedve 25 C-ra beállított inkubátorba helyezzük, melyben folyamatos, lux fényerősségű megvilágítást biztosítunk. Hígító és kontrol közegként az előlevegőztetett standard édesvizet használtuk. A kísérletek során három párhuzamos hígítási sort alkalmaztunk minden esetben. A megfelelő hígítási arányok beállítását követően 1-1 ml teszt oldatba tesztállat került. A feltöltött mikropléteket 25 C-ra beállított inkubátorba helyeztük, az alkalmazott expozíciós idő 24 óra. 24 óra elteltével meghatároztuk a mortalitási arányt Mortalitás vizsgálatok Artemia salina héjnélküli kisrákon A vizsgálatok elvégzéséhez szükséges tesztállatok petéit (JBL NovoTemia, Németország) helyi kisállat kereskedésből szereztük be és mesterségesen előállított standard sósvízben keltettük ki. A petéket 12 órán keresztül 4 C-on előhidratáltuk, majd az előhidratáció során alkalmazott standard oldatott lecseréltük. A petéket ez után folyamatos levegőztetés mellett 26 C-on inkubátorban 24 órán át keltettük. A kísérletek során az Thamnocephalus platyurus tesztekhez hasonlóan 24 lyukú polisztirén mikropléteket alkalmaztunk. Hígító és kontrollközegként előlevegőztetett mesterséges sósvizet használtunk. A megfelelően higított mintákból 950μl-t adagoltunk a mikroplét celláiba, három párhuzamosban, majd ehhez 50μl (kb darab) lárvát 47

47 tartalmazó folyadékot pipettáztunk a keltető edényből. Az így feltöltött mikropléteket 24 órán át 26 C fokon inkubáltuk, majd felülről, alsó megvilágítás mellett 10 másodperces felvételeket készítettünk a cellákról. Az így kapott felvételek alapján határoztuk meg később a mortalitás arányát. CAMERA ÁTALAKITÓ MINTA HIDEGFÉNY ADATRÖGZITŐ 5. ábra. Artemia salina akut toxicitási teszt során használt rendszer működési elve Vibrio fischeri biolumineszcencia-gátlás vizsgálat A mérések kivitelezésére a Vibrio fischeri baktériumtörzset alkalmazó, Merck által gyártott ToxAlert 100 típusú luminométert használtuk. A teszt során alkalmazott baktérium törzs mélyhűtött állapotban egy évig is eltartható. A liofilizált baktérium, a tesztet megelőzően, egy standard oldatban került felolvasztásra, ezáltal aktiválódott. A faj sajátossága, hogy egészséges állapotban fényt bocsát ki (biolumineszcencia), amely fénykibocsátás csökken, ha a sejtek struktúrájában, vagy működésében változás következik be. A fénykibocsátás csökkenéséért a luciferáz nevű enzim inhibíciója tehető felelőssé. A mérések során a kezeletlen baktérium szuszpenzió lumineszcenciáját hasonlítjuk össze a mintával kezelt szuszpenzió értékeivel 15, vagy 30 perces expozíciós idő letelte után. Így végeredményként százalékos értékben megkapjuk a minta hatására kiváltott gátlási arányt. 48

48 A ToxAlert 100 luminométer valamennyi értéket automatikusan kiszámít. Első lépésben az f kt korrekciós faktor meghatározása történik, a mért lumineszcencia-intenzitási értékből ([1] egyenlet). f kt = l kt / l 0 (t = 30 perc) [1] ahol f kt : az expozíciós (kontakt) időre megadott korrekciós faktor l kt : lumineszcencia intenzitás a kontrollban, RLU-ban (relative luminescence units) mérve, az expozíciós idő után l 0 : a kontroll tesztszuszpenzió lumineszcencia intenzitása közvetlenül a hígító (2%- os NaCl) oldat hozzáadása előtt. A korrekciós faktor alkalmazásával az egyes tesztmintákra a készülék meghatározza l 0 korrigált értékét ([2] egyenlet). l ct = l 0 f kt [2] ahol f kt : az f kt értékek átlaga l 0 : a kontroll szuszpenzió lumineszcencia intenzitása közvetlenül a hígító (2%-os NaCl) oldat hozzáadása előtt l ct : az l 0 korrigált értéke a küvettákra közvetlenül a tesztminta hozzáadása előtt. Ezek után a tesztminta H t inhibeáló effektusát számítja ki a készülék ([3] egyenlet). H t = [(l ct - l Tt /l ct )] x 100 [3] ahol H t : l ct : előtt l Tt : a tesztminta inhibeáló effektusa az expozíciós idő után, %-ban megadva az l 0 korrigált értéke a tesztminta küvettákra közvetlenül a tesztminta hozzáadása a tesztminta lumineszcencia intenzitása az expozíciós idő után Enzimaktivitási vizsgálatok Artemia salina héjatlan kisrákon és Dikerogammarus villosus amphipoda rákon Az enzimek aktivitását standard protokollok mikroplét adaptációi szerint határoztuk meg: a glutation-s transzferáz aktivitást (Habig et al. 1974), a tejsav dehidrogenáz 49

49 aktivitást (Vassault 1983)- és az acetilkolineszteráz aktivitást (Ellman et al. 1961). Az enzimatikus aktivitásokat összprotein tartalomra korrigáltuk (Bradford 1976) LDH enzimaktivitási vizsgálatok A mortalitási kísérletekben kezelt, még élő állatokat 1 ml Tris-NaCl (0,1 M; ph 7,2; T=4 C) puffer oldatba helyeztük és -20 C-on fagyasztottuk. A minták felengedése után üvegpotterrel homogenizáltuk, ugyanabban a pufferben, amelyben előzőleg is tároltuk, illetve a pottert átmostuk 0,5 ml Tris-NaCl pufferrel, így mintánként 1 ml-es végtérfogatot kaptunk. Újrafagyasztás és kiolvasztás után 6000g mellett 3 percig 4 C-on centrifugáltuk a mintákat. A mérés alapja az alábbi reakció: piruvát + NADH+ H + LDH L laktát + NAD + Az enzimaktivitás meghatározásának alapja, hogy az enzim a piruvátot NADH jelenlétében tejsavvá alakítja. A reakció a NADH fogyásával követhető nyomon, a mért abszorbancia-változás alapján. A mérések elvégzéséhez 96 lyukú mikroplétet használtunk. A felülúszókból μl-t pipettáztunk a mikroplét celláiba, majd hozzáadtunk 140 μl NADH oldatot és 30 μl piruvát oldatot. Vak mintaként a következő oldatok elegyét használtuk: 100 μl Tris- NaCl, 80 μl NADH, 100 μl piruvát. A mikroplét olvasó készülék (Perkin Elmer Viktor 3 ) segítségével mértük az abszorbancia változását, 340 nm-es hullámhosszon 20 másodpercenként, 5 percen keresztül (Diamantino et al. 2001; Vassault 1983). Az extinkció - reakcióidő görbe lineáris szakaszának meredekségéből számolható az enzimaktivitás változása. A kapott eredményekből minden egyes cellára számítható az LDH aktivitás a következő képlet által: LDH = (ΔA/ min 10 6 TV)/ (6, L V), ahol: ΔA/min percenkénti abszorbancia változás; TV- a teljes reakcióelegy térfogata ml-ben; 6,3 103 a NADH moláris abszorpciója 340 nm-en; 50

50 L- a fény útja mm-ben (jelen esetben 0,7 mm); V- a minta térfogata ml-ben GST enzimaktivitási vizsgálatok A kezelt állatokat 0,5 ml APHA (ph 6,5; T=4 C) pufferbe helyeztük, majd -80 C-on tároltuk az enzimatikus vizsgálatig. A minták felengedése után ezeket üvegpotterrel homogenizáltuk, abban a pufferben, amelyben előzőleg tároltuk a naupliákat, illetve a pottert átmostuk 0,5 ml friss APHA pufferrel, így mintánként 1 ml-es végtérfogatot kaptunk. A mintákat 9000g mellett 4ºC-on 10 percig centrifugáltuk. A mérési módszer alapja a következő reakció: A kolorimetriás meghatározás alapja a glutation s-transzferáz enzim által katalizált reakció glutation, valamint a szubsztrátként alkalmazott 1-klór-2,4-dinitrobenzol (CDNB) között. A megfelelő reakciókörnyezetben 6. ábra alapján lejátszódó reakció sebessége csak a jelenlévő aktív GST enzim mennyiségének a függvénye. A reakció terméke dinitrofenil-thioéter, melynek maximális abszorbanciája 340 nm-re esik (Frasco és Guilhermino 2002). 6. ábra. A GST enzim aktivitásának detektálásának alapjául szolgáló reakció A mérések kivitelezése során 96 lyukú mikroplétet használtunk. A felülúszókból μl-t pipettáztunk a mikroplét celláiba majd hozzáadtunk 180 μl GSH-t (20 mm, 6,5 ph, PO4) és 20 μl CDNB-t (20 mm, 6,5 ph, PO4). Kontrollként a következő oldatok elegyét használtuk: 100 μl PBS, 190 μl GSH, 10 μl CDNB. Az abszorbanciaváltozást mikroplét olvasó készülékkel (Perkin Elmer Viktor 3 ) mértük. A készülék a leolvasást 340 nm-es hullámhosszon, 5 percen keresztül, 20 másodperces olvasási gyakorisággal végezte. Az extinkció - reakcióidő görbe lineáris szakaszának meredekségéből számolható az enzimaktivitás változása. A kapott eredményekből minden egyes cellára számítható a GST aktivitás a következő képlet által: 51

51 ahol: ΔA/min percenkénti abszorbancia változás AChE enzimaktivitási vizsgálatok In vivo AChE vizsgálatok A kezelt rákokat 0,5 ml APHA (ph 6,5; T=4 C) pufferbe helyeztük, majd -20 C-on tároltuk az enzimatikus vizsgálatig. A minták felengedése után ezeket üvegpotterrel homogenizáltuk, abban a pufferben, amiben előzőleg tároltuk, illetve a pottert átmostuk 0,5 ml friss APHA pufferrel, így mintánként 1 ml-es végtérfogatot kaptunk. A mérés elvi alapja az acetiltiokolin-jodid (ATCI) acetilkolinészteráz enzim katalizáló hatására létrejövő hidrolízis nyomon követése, mely közben tiokolin keletkezik. Ez a keletkező tiol folyamatos reakciója által lehetséges, a reakcióközegben jelenlévő 5,5- dinitro-bisz-2-nitrobenzol ionnal (I), melynek eredményeként 5-tio-2-nitrobenzolsav keletkezik (II). Ez utóbbi mennyisége a 412 nm-es hullámhosszon mérhető (Ellman et al. 1961). AChEH 2 O + ATCI AChE (CH 3 ) 3 N + CH 2 CH 2 S - + CH 3 COO - +2H + (CH 3 ) 3 N + CH 2 CH 2 S - + RSSR (CH 3 ) 3 N + CH 2 CH 2 SSR + RS - (I) (II) A mérések elvégzésére 96 lyukú mikroplétet használtunk. A felülúszókból μl-t pipettáztunk a mikroplétre majd hozzáadtunk 50 μl PBS (0,1 M) puffert, 100 μl DTNB oldatot (1mM) és 100 μl ATCI oldatot (1,5 mm). Kontrollként a következő oldatok elegyét használtuk: PBS, DTNB és ATCI. Az abszorbanciaváltozást mikroplét olvasó készülékkel (Viktor 3 Perkin Elmer) mértük. A készülék minden a cellán mérte az abszorbanciát 412 nm-es hullámhosszon, folyamatosan, 10 percen keresztül. 52

52 Az extinkció - reakcióidő görbe lineáris szakaszának meredekségéből számolható az enzimaktivitás változása. A kapott eredményekből minden egyes cellára számítható az AChE aktivitás a következő képlet által: [μmol/perc/g] ahol: = ATCI extinkciós koefficiens 0,7 = olvasási magasság a cellában (cm) V s = bemért minta térfogata [50 μl] V cell = az assay térfogata [300 μl] C 0 = a feltárt szövetminta koncentrációja [mg/ml] In vitro AChE vizsgálatok A cianobaktériumok anatoxin-a(s) toxin termelő képességét Henriksen et al. (1997) alapján az in vitro acetilkolineszteráz enzim gátlás teszt alkalmazásával ellenőriztük. A módszert az anatoxin-a(s) specifikus toxikus hatása alapján dolgozták ki, amely a lebontó acetilkolineszteráz enzim aktivitásának irreverzibilis gátlásában nyilvánul meg. A vizsgálathoz 25 mg alga liofilizátumot 1 ml 98%-os etanol és 1N ecetsav eleggyel (20:80) szobahőmérsékleten, 4 órán keresztül tártunk fel folyamatos keverés mellett. A nyers kivonatot centrifugáltuk ( g, 10 perc, 4 C), majd a tisztított frakción azonnal elvégeztük az in vitro acetilkolineszteráz gátlás tesztet. A tesztben 10 μl alga kivonatot 50 μl angolna acetilkolineszteráz (AChE) oldattal (5U ml-1, 0,1M KH 2 PO 4, ph 8) szobahőmérsékleten inkubáltuk. Majd 3 ml KH 2 PO 4 puffer (ph 8), 100 μl 0,1 mm ditiobisznitrobenzoát oldat (0,1 M foszfát pufferben, ph 7,2) és 20 μl 75 mm acetiltiokolin jodid hozzáadását követően az abszorpcióváltozást 412 nm-en 30 másodperces időintervallumonként 10 percig követtük nyomon. A minták enzimatikus gátlásának mértékét az algakivonat helyet foszfát pufferrel végzet enzimaktivitás teszt sebessége alapján becsültük. A tesztet mintánként 3 párhuzamban végeztük. A detektálás alapját szolgáló reakció, valamint az eredmények érékelésének módja azonos az in vivo AChE enzimaktivitási vizsgálatok esetében bemutatottakkal. 53

53 Összprotein tartalom meghatározása A kezelt rákokat kiolvasztás után 1 ml desztillált vízzel, majd 1 ml Tris-NaCl (0,1 M; ph=7,2; T=4 o C) pufferrel mostuk, ezt követően a Tris-NaCl pufferben -20 C-on tároltuk. A minták felengedése után azokat 8000g mellett 4 C-on 8 percig centrifugáltuk. A méréshez 96 lyukú mikroplétet használtunk, amelyben a fehérje mennyiséget Coomassie Brilliant Blue G-250 festék piros változatát alkalmazva határoztuk meg, mely fehérjéhez kötődve kék színt ad. A felülúszóból 10 μl-t pipettáztunk át 70 μl Tris- NaCl pufferbe, amihez 60 μl Bradford reagenst adtunk a fehérjetartalom meghatározásához. A Bradford reagens hozzáadása után a mintákat 10 percig sötétben, szobahőmérsékleten inkubáltuk, majd mértük a minták abszorbanciáját a Victor 3 plate olvasó készülékkel (Bradford 1976) Analitikai módszerek A szaxitoxinok csoportjába tartozó toxinok detektálására a Gerdts et al. (2002) által kidolgozott módszert alkalmaztuk. A cianobaktérium törzsek esetén 100 ml tenyészetet, míg a természetes fitoplankton minták esetén a minták töménységétől függően 0,5 1 l mintát (kb sejt), centrifugálással koncentráltunk (3000 g, 10 perc), majd a pelletet ioncserélt vízzel átmostuk és újból centrifugálással koncentráltunk. Az algapelletet 1 2 ml 0,03 M ecetsavval szuszpenzióba vittük, majd jégfürdőben tartva 1 percig ultrahangos kezeléssel feltártuk (60 W). A nyers kivonatot centrifugálással tisztítottuk ( g, 10 perc, 4 o C). Mintánként 100 μl nyers kivonathoz 400 μl perjódsav oldatot adtunk (50mM perjódsav, 4% v/v NH 4 OH), 50 o C fokon 15 percig inkubáltuk, majd 500 μl 1M ecetsav oldattal közömbösítettünk. Az oxidáció hatására a szaxitoxinok fluoreszcens vegyületi formákká alakulnak, majd a minták vizsgálata Shimadzu 4500 spektrofluoriméterrel a 333 nm-es excitációs hullámhosszon, és 390 nm-es emissziós hullámhosszon történt. A cianobaktériumok vizes kivonatainak analitikai elemzése döntően az ismert cianotoxinok: a cilindrospermopszin, anatoxin-a, homoanatoxin-a és mikrocisztin-lr vizsgálatára irányultak. A cianotoxinok minőségi és mennyiségi meghatározását egy tömegspektrométerhez kötött folyadékkromatográffal végeztük. Az analitikai rendszer egy diódasoros detektorral felszerelt Agilent 1100 típusú folyadékkromatográf (Agilent, 54

54 Palo Alto, CA, USA) és egy Finnigan MAT LCQ klasszikus ioncsapdás tömegspektrométerből (ThermoElectron, San Jose, CA, USA) állt. A minták futtatásához egy Merck Purospher STAR C18e típusú kromatográfiás oszlopot alkalmaztunk (55mm x 4 mm I.D., 3 μm szemcseméret). A mintaelemzés 40 C fokon, gradiens elúcióval történt (A oldat: 0,05% triflórecetsavas desztillált víz; B oldat: 0,05% triflórecetsavas acetonitril; gradiens: 1-70% B, 20 perc időintervallumon), 1 ml min -1 áramlási sebességen. A diódasoros detektorral nm hullámhossz tartományban szkenneltük a mintákat, a specifikus leolvasást 262-, 238- ill., 227 nm-en végeztük, melyek a cilindrospermopszin, mikrocisztin-lr, valamint anatoxinok fényelnyelési hullámhosszai. A cilindrospermopszin, mikrocisztin-lr és anatoxin-a azonosítása és mennyiségi meghatározása retenciós idő alapján, referencia toxinok alkalmazásával történt. A homoanatoxin-a azonosítását, referencia anyag hiányában (nincs kereskedelmi forgalomban), electronspray ionizáció útján történő molekula fragmentáció mintázat alapján végeztük (James et al. 2005). Mivel a homoanatoxin-a az anatoxin-a egyik izoformája, és a két vegyület azonos fényelnyelési tulajdonságokkal rendelkezik, a homoanatoxin-a mennyiségi meghatározását a referencia anatoxin-a kalibrációs görbéje alapján végeztük el (Furey et al. 2003). A cianobaktérium minták hatóanyagainak tömegspektrometriai elemzése a Pannon Egyetem Környezettudományi Intézeti tanszék Levegőkémiai kutatócsoportjának laboratóriumában készült, Dr. Kiss Gyula szakmai irányításával Statisztikai elemzés A nyers adatokat OriginLab OriginPro 8 és MS Excel 2007 program segítségével elemeztük és ábrázoltuk. Az enzimaktivitás kontrolhoz viszonyított változását lineáris regresszióval vizsgáltuk. A nyers adatokat a J.J. Hubert-féle probitszám analízissel hasonlítottuk össze (Hubert 1980). A kísérletek mindegyikét legalább háromszor megismételtük. 55

55 3. Eredmények és értékelés 3.1. Két új ökotoxikológiai módszer fejlesztése Az új módszerek fejlesztése során elsődleges szempontunk volt olyan végpontok alkalmazása, melyek megfelelnek a mindennapi laboratóriumi tesztelés követelményeinek, lehetőség szerint kizárják az emberi szubjektivitásból adódó hibalehetőséget egyben gyorsítják a teszteljárás kivitelezését. Ezeknek a szempontoknak a két, alábbiakban bemutatott tesztmódszer maximálisan megfelel. A teszteljárások kalibrálása során az ökotoxikológia területén elterjedten alkalmazott kalibráló/validáló szert, a kálium-bikromátot (K 2 Cr 2 O 7 ) használtunk. A választást az irodalomban fellelhető megfelelő mennyiségű adat és hatásmechanizmusuk megfelelő ismerete indokolta (Cope et al. 2004; Persoone et al. 2009). Az eredmények összehasonlíthatóságának érdekében a kiválasztott kalibráló szerre elvégeztük a tesztorganizmusokra meglévő konvencionális teszteket is. Így az általunk kidolgozott és a konvencionális eljárások által adott válaszok összehasonlíthatóvá váltak az irodalmi adatokkal Daphnia magna táplálkozás aktivitás teszt A tesztmódszer alapját egy, a kereskedelmi forgalomban is kapható táplálkozás aktivitás-teszt, a Rapidtox (MicroBioTests, Belgium) képezi. Az említett eljárás a Thamnocephalus platyurus fajt használja tesztállatként, amely Amerikában őshonos édesvízi planktonrák, így ökológiai relevanciája hazai vizek tekintetében megkérdőjelezhető az őshonos Daphnia magna tesztszervezettel szemben. Ezen felül a Rapidtox eljárás nem pontosan meghatározott számú állat használatát írja elő, hanem meghatározott térfogatban (0,5 ml) lévő egyed tesztoldatba pipettázását írja elő. Így a bevitt állatok száma teljesen esetleges, ráadásul nem lehet szelektálni az élő (aktívan úszó) és elpusztult állatok közt. Ez a bizonytalansági faktor az anyaghatás becslése során komoly értékelési problémát okozhat, hiszen a megfelelő expozíciós időt követően a protokoll az állatok fixálását (elpusztítását) írja elő. Ennek következtében nem lehet eldönteni, hogy a lárvák a vizsgált anyag hatására csökkentették táplálkozási aktivitásukat, vagy már eredendően élettelenek voltak és e miatt nem található meg a jelölő anyag az emésztőrendszerükben. 56

56 response 3. táblázat. A kálium-bikromát LC 50 és IC 50 értékei a Daphnia magna akut toxicitási tesztek alapján aktivitás- táplálkozás teszt Exp (h) LC 50 /IC 50 (mg/l) sd (±) 2 4,19 0,49 4 1,74 0,13 mortalitás teszt 24 1,09 0, h 4 h 24 h ,0 0,5 1,0 1,5 2,0 conc. (mg/l) 7. ábra. A Daphnia magna tesztek koncentrációfüggése kálium-dikromátra A kálium-bikromátra kapott mortalitási teszt eredménye pontosan abba az általánosan elfogadott intervallumba esik, melyen belül a konvencionális mortalitási teszt hitelesnek tekinthető ( mg/l) (Persoone et al. 2009). Az etetéses tesztekkel kapcsolatban jól megfigyelhető az expozíciós idő hosszának hatása (7. és 8. ábra, 3. táblázat). Az eredményeket tekintve látható, hogy a 4 órás expozíció melletti válasz felel meg a 24 órás expozíciós idő melletti válasznak. Eredményeink azt mutatták, hogy az általunk kidolgozott módszer hasonló, de gyorsabb eredményeket hozott, mint a konvencionálisan alkalmazott mortalitási teszt. A teszt kivitelezése a rövid expozíciós időnek köszönhetően mintegy 5 órára csökken a 24 órához képest. Ez fontos előnyt jelenthet, ha ismeretlen anyag gyors vizsgálatára van szükség. 57

57 5 A Daphnia magna tesztek eredménye kálium-dikromátra 4 LC 50 /IC 50 2,0 3 1,8 1,6 1,4 1,2 1,0 0, Exp. (h) 8. ábra. A Daphnia magna tesztek LC 50 /IC 50 értékei az expozíciós idő függvényében 1. kép. A jelölőanyag az egyedek emésztőrendszerében (jobbra) és ennek hiánya (balra) További fontos előnye a módszernek, hogy kiküszöböli az emberi szubjektivitásból adódó tévedés lehetőségét, azáltal, hogy a végpont jól definiált, az az állat emésztőcsatornáját kitölti-e a jelölő anyag, vagy nem (1. kép). Ezzel szemben a hagyományos mortalitási tesztek esetében a tényleges pusztulás megállapítása sok esetben problémás lehet. Saját tapasztalatunk, hogy bizonyos anyagok (például neurotoxinok) esetében előfordulhat olyan eset, amikor az állatok paralízis hatására 58

58 válnak mozdulatlanná. Ilyenkor az eredményeket jelentősen befolyásolhatja a tesztorganizmusok korlátozott mozgása. A megfelelő érzékelhetőségen túl, a végpont rendelkezik egy további lényeges előnnyel is: ökológiai szempontból a szubletális táplálkozás ativitás változása sokkal relevánsabb végpontot jelent a fitoplanktont fogyasztó zooplankton fajok esetében, mint a túlélési arány. A nagyobb jelentőség oka, hogy a táplálkozás aktivitás fiziológiailag szoros kapcsolatban áll a reprodukciós rátával, ezen keresztül pedig a populációk növekedési ütemét is nagyban befolyásolja (Barata és Baird 2000). Az algafogyasztó zooplankton közösségek ugyanakkor fontos szerepet játszanak az algavirágzások kialakulásának megelőzésében (Jak et al. 1996). Ezért ha jelentkeznek szubletális mértékü táplálkozás aktivitásbeli hatások, ezeket a minták jellemzése során feltétlenül szükséges lenne megadni (Rosa et al. 2006) Duckweed Detector (DwD) szoftveres képelemzési módszer Lemna minor növekedés-gátlás elemzésére A kis békalencse gyakorlatilag az egész Földön elterjedt, a víz felszínén úszó edényes növény. Könnyű begyűjteni, és könnyű a laboratóriumban tartani. Ennek eredményeként a békalencsével végzett toxicitás-becslés gyakorlatilag a legolcsóbban elvégezhető ökotoxikológiai teszt. Nemcsak ebben rejlik a jelentősége: mivel az ökotoxikológiában nagyon kevés olyan tesztszervezetet alkalmazunk, amely a magasabb rendű növények közé tartozna, így a békalencse fontos taxonómiai csoportot reprezentál. (Suter 1993). Jellemzője, hogy ivartalanul szaporodik: a növény új leveleket hoz, amelyeknek saját gyökere fejlődik. Az új levelek előbb-utóbb leválnak az anyanövényről és önálló egyedként élnek tovább. A szaporodási sebesség általában nagy, néhány Lemna faj leveleinek duplázódási ideje 0,35-2,8 nap között van (Wang 1990). Az OECD (2002) szabvány, illetve a jelenleg hazánkban előkészületben levő ISO szabvány (ISO/FDIS 20079) a következő mérhető paramétereket veszi figyelembe: levélkeszám, száraz illetve nedves tömeg, valamint felület. Jelenlegi formájában a teszteljárás már most tartalmaz több bizonytalansági tényezőt: 1. a száraz tömeg mérése során sérülhetnek a levélkék; 2. a nedves tömeg mérése nehézkes, mert nagyfokú mérési hibát rejt magában, hiszen a víz tömegét is hozzászámítjuk a levélkék tömegéhez. A 59

59 levélkeszám megszámlálása bár nem igényel külön képzettséget, de itt is jelentkezhet egyfajta mérési hiba: olykor nem egyszerű eldönteni, pontosan mit is tekintünk új levélkének, hiszen egy frissen képződő levélke kezdetben egy dudorként jelenik meg. Ezek a mérési hibák az eredmények esetleges pontatlansága mellett azt is eredményezik, hogy az ökotoxikológiai teszteknek egy fontos minőségbiztosítási komponense, nevezetesen a reprodukálhatóság (USEPA 1997), nem teljesül. A nedves tömeg mérését, illetve a képződött új levélkék számának értékelését ugyanazon személy kell, hogy végezze, kiküszöbölve az eltérő manuális technikából vagy rutinból eredő eltéréseket. Alternatív lehetőség a felület mérése, erre a szabvány manuális valamint digitális technikákat javasol. Elsődleges célunk olyan vizuális módszer kidolgozása volt, amelynek segítségével a szaporodás ütemének mérése könnyen kivitelezhető, automatizálható és a mérési hibák kiküszöbölhetők. Kiindulási pontunk a felület volt, azaz a békalencse összfelületének a mérése. A kalibrálási eljárás során kálium-bikromát 19,89 mg/l végkoncentrációjú hígítási sorát alkalmaztuk öt (felező) hígításban, és egy hetes expozíciós idő után vizsgáltuk az oldat növekedési ütemre gyakorolt gátlását. A kísérletek végpontja egyrészt a levélkeszám, másrészt a szoftver által meghatározott terület volt. 4. táblázat. A szoftveres és a levélkeszámlálás alapú értékelési módszer esetén megfigyelt válaszok kálium-bikromátra. Átlagos növekedési Átlagos Átlagos növekedési Átlagos növekedési sebesség Koncentráció növekedési sebesség százalékos sebesség (µ) százalékos (mg/l) sebesség (µ) gátlása (% Ir) levélkeszámlálással gátlása (% szoftverrel levélkeszámlálással Ir) szoftverrel kontroll 0, , ,89 0, , ,46 45,38 9,95 0, , ,31 19,62 4,97 0, , ,38-7,53 2,49 0, , ,75-2,34 1,24 0, , ,39-23,88 60

60 0,16 Átlagos növekedési sebesség (µ) koncentrációfüggése levélkeszámlálással és képelemzéssel számlálás képelemzés 0,14 0,12 response ( 0,10 0,08 0,06 0, Conc. (mg/l) 9. ábra. A számlálással és szoftveres feldolgozással kapott adatok koncentrációfüggése Az így kapott adatok alapján meghatározható volt a növekedési ütem inhibíciója. A kálium-dikromát által kiváltott növekedés-gátlás számszerűsítve a két módszer révén nyert értékek összevethetővé váltak és meghatározható az eltérő módszerek adatai közti korreláció. A kísérletsorozat eredményeit összehasonlítva, megállapítottuk, hogy a két-két adatsor kiválóan korrelál egymással (9. ábra és 4. táblázat); a Pearson-féle korreláció értéke r= 0, Az így számolt korrelációs együttható értéke (-1) és (+1) közé eshet. Általában elmondhatjuk, ha a változók közötti korrelációs együttható abszolút értéke 0.8-nál nagyobb, akkor a változók között viszonylag erős lineáris kapcsolat áll fent. A kapott toxicitási értékek (K 2 Cr 2 O 7 : IC 50 = 19,61 mg/l levélkeszámlálással és IC 50 = 18,12 mg/l szoftveresen meghatározva) egybeesnek az irodalomban fellelhető értékekkel (Kegley et al. 2010). A kidolgozott szoftver alapján kapott növekedésgátlás-értékek megfelelően korreláltak a levélkeszámlálásos technikával kapott gátlás értékeivel. Az automatizált mérési módszerek az ökotoxikológiai vizsgálatokban nemcsak megkönnyítik a munkát, de az emberi hiba kiküszöbölésével a teszteredmények reprodukálhatóságát is javítják. 61

61 Irodalmi adatok alapján a Lemna minor faj csak magasabb koncentrációkban ad választ cianobakteriális toxinokra. Így mikrocisztin-lr-re szignifikáns növekedésgátlás illetve peroxidáz enzimaktivitás növekedés csak 10 mg/l koncentráció felett jelentkezett (Mitrovich et al. 2005). Anatoxin-a esetében még magasabb koncentrációk (15, ill. 25 mg/l) mellett sem tapasztaltak a növekedési aktivitásban szignifikáns csökkenést, ugyanakkor az enzimaktivás növekedés (GST, peroxidáz) ez esetben is szignifikánsan változott (Mitrovic et al. 2004). A módszer további hátránya, hogy viszonylag nagy mennyiségű minta szükséges a kivitelezéséhez. Ha tartani kívánjuk a szabvány előírásait, akkor egyetlen hígítási lépcsőben legkevesebb 450 ml mintaoldatot kell biztosítani. E miatt a teszt nem alkalmas kis mennyiségben rendelkezése álló minták tesztelésére. A Lemna minor gyenge érzékenysége miatt és a kivitelezéshez szükséges nagy mennyiségű minta miatt a tesztet nem alkalmaztuk cianobaktérium kivonatok hatásának vizsgálatára. 2. kép. A DwD szoftver kezelőfelülete 3.4. Cianobaktérium törzsek ökotoxikológiai kockázatának becslése Daphnia magna táplálkozás aktivitás-teszt eredményei algakivonatokra A vizsgált algatörzsek hatását tekintve, a legszembetűnőbb a pozitív referencia törzsként alkalmazott és bizonyítottan cilindrospermopszin (hepatotoxin) termelő, C. 62

62 raciborskii (AQS) erőteljes toxikus hatása. A toxicitási tesztek alapján, a következő hatáskoncentrációkat kaptuk: IC 50 (1h) = 0,043±0,006; IC 50 (2h)= 0,016±0,008; LC 50 (24h)= 0,11±0,048 mg/l (10. ábra). Az AQS által kifejtett táplálkozás aktivitás gátlás nagyságrenddel meghaladta a másik pozitív referenciaként alkalmazott és neurotoxint (anatoxin-a, homoanatoxin-a) termelő algatörzs (PCC 6506, Oscillatoria sp.) hatását: IC 50 (1h) = 0,663±0,178; IC 50 (2h)= 0,147±0,057; LC 50 (24h)= 1,33±0,214 mg/l. A balatoni C. raciborskii törzsekkel kapcsolatos legfontosabb eredmény, hogy hatásuk az anatoxinokat termelő PCC 6506 törzs hatásával vethető össze, azzal egy nagyságrendbe esnek. Az ACT 9502 törzs kivonatával a következő hatáskoncentrációkat regisztráltuk: IC 50 (1h)= 1,055±0,116, IC 50 (2h)= 0,157±0,015, LC 50 (24h)= 0,919±0,137 mg/l. Kisebb mértékű toxicitást fejtett ki ACT 9503-as törzs kivonata: IC 50 (1h) = 1,665±0,168, IC 50 (2h)= 0,271±0,025, LC 50 (24h)= 2,341±0,473 mg/l. A balatoni törzsek közül a legtoxikusabbnak az ACT 9504 törzs bizonyult: IC 50 (1h) = 1,457±0,156, IC 50 (2h)= 0,252±0,022, LC 50 (24h)= 2,243±0,339 mg/l. Számottevően kisebb mértékű toxicitást az ACT 9505 törzsnél mértünk: IC 50 (1h) = 2,359±0,241, IC 50 (2h)= 0,346±0,031, LC 50 (24h)= 4,234±0,719 mg/l. A balatoni törzsek toxicitási mutatói között viszonylag kismértékű, de szignifikánsnak minősülő különbségeket észleltünk. A toxicitási tesztek eredményei alapján a következő hatássorrend állapítható meg: ACT 9502> ACT 9504> ACT 9503> ACT 9505 (ANOVA teszt alapján; p<0,05). A Daphnia magna táplálkozás aktivitás tesztekkel kapcsolatos legfontosabb tapasztalat a két órás expozíciós időt alkalmazó vizsgálat érzékenysége volt. Ez közel egy nagyságrenddel bizonyult érzékenyebbnek, mint az egy órás expozíciós idejű táplálkozás-aktivitás teszt, illetve a konvencionális mortalitás teszt. A négy órás tesztek során az egy, két, illetve 24 órás tesztek esetében alkalmazott algakoncentrációk teljes gátlást váltottak ki. Mivel elsődleges célunk a minél gyorsabb kivitelezés volt, ezért a négyórás expozíciós időt a továbbiakban nem alkalmaztuk. A Daphnia magna táplálkozás-aktivitás teszteredmények szórása, különösen a két órás expozíció esetén számottevően kisebb, mint a mortalitás teszteké. Ez a tény is alátámasztja az új végpont megfelelőségét. Köszönhető ez a végpont jobb meghatározhatóságának annak a ténynek, hogy könnyebben eldönthető, hogy mely egyedek hagytak fel az expozíciós idő alatt a táplálkozással, mint az, hogy mely állatok pusztultak el ténylegesen. 63

63 Az irodalom beszámol mind cilindrospermopszin termelő, mind pedig toxint nem termelő C. raciborskii törzsek akut toxicitásáról D. magna esetében (Nogueira et al. 2004; Nogueira et al. 2006). Bár számos mérgezésről és állatelhullásról számol be a szakirodalom, mely C. racibroskii törzsnek tulajdonítható (Griffiths és Saker 2003; Hawkins et al. 1985; Saker et al. 1999), a szakirodalom még sem egységes D. magna fajjal szembeni toxicitását illetően (Soares et al. 2009). A szűréssel táplálkozó fajokkal kapcsolatban leírták, hogy a toxinok, melyek az idegrendszerre hatnak, befolyásolják a táplálkozás aktivitást. A szűrés ugyanis a lábak idegrendszer által történő koordinációját követelik meg (Ware 1983). Ugyanakkor Soares, et al. (2009) vizsgálatai azt mutatták, hogy egy cilindrospermopszint nem, de szaxitoxint termelő Brazíliában izolált C. raciborskii törzs Scenedesmus obliquus zöldalgával vegyesen etetve, csak nagyobb koncentrációban és arányban (75 % és 5 mg/l felett) volt hatással a D. magna táplálkozás aktivitására, és nem okozott számottevő akut mortalitást. Ám a szerzők is kijelentik, hogy csupán az alapján, hogy egy C. raciborskii törzs nem termel ismert toxinokat, nem jelenthető ki, hogy toxikus-e a D. magna fajra nézve. Például, a NIVA-CYA 43 M. aeruginosa törzsön végzett elsődleges vizsgálatok sem mutatták mikrocisztin jelenlétét az algatörzsön belül, azonban a D. magna táplálkozás aktivitására hatással volt (Lürling és Beekman 1999). A későbbi vizsgálatok cianopeptolin 954, egy klórtartalmú kimotripszin jelenlétét mutatták (Von Elert et al. 2005). Hasonlóan, néhány Európában izolált C. raciborskii fajon végzett kísérlet sem mutatta ismert toxinok jelenlétét, mégis számottevő toxikus hatást mutattak (Briand et al. 2002; Fastner et al. 2003; Saker et al. 2003). Az eredmények ismeretében, valamint saját tapasztalatainkat tekintve, a módszerről elmondható, hogy nagyon jól és megfelelő érzékenységgel alkalmazható cianobakteriális toxicitás meghatározására is. A teszt során a végpont jelentősen gyorsabban értékelhető, mint a konvencionálisan alkalmazott mortalitás teszt esetében. 64

64 LC 50 (mg/ml) IC 50 (mg/ml) IC 50 (mg/ml) A Daphnia magna táplálkozás aktivitás gátlás és mortalitási értékek ,40 0,35 0,30 0,25 0,20 0,15 0,10 0,05 0,00 1 h ACT 9502 ACT 9503 ACT 9504 ACT 9505 PCC AQS 2 h ACT 9502 ACT 9503 ACT 9504 ACT 9505 PCC AQS mortalitas ACT 9502 ACT 9503 ACT 9504 ACT 9505 PCC AQS 10. ábra. A Daphnia magna táplálkozás aktivitás gátlás eredményeinek összevetése a mortalitási értékekkel Cianobaktérium izolátumok hatásának összehasonlító vizsgálata egyéb ökotoxicitási tesztek alapján A kísérletsorozatban a négy balatoni C. raciborskii törzs (ACT 9502, ACT 9503, ACT 9504, ACT 9505) általános hatását elemeztük három további ökotoxicitási teszt (Daphtoxkit F, ToxAlert 100, Thamnotoxkit F, valamint ArTox) alkalmazásával. Az összehasonlító vizsgálat célja az volt, hogy ellenőrizzük a tesztek érzékenységét, megbízhatóságát, valamint hatékonyságát és ezeket összevessük az általunk kidolgozott módszer hasonló tulajdonságaival. E kritériumok döntő fontosságúak nagyszámú minták gyors elemzése során. Toxikus referenciaként jelen esetben is a cilindrospermopszint termelő ausztrál C. raciborskii (AQS), valamint az anatoxinokat termelő Oscillatoria sp. (PCC 6506) cianobaktérium törzsek vizes kivonatait alkalmaztuk. Az alga kivonatokat azonos módon és időben állítottuk elő, ill. teszteltünk. 65

65 Mind a négy ökotoxicitási teszt közel azonos trendet mutatott a hat cianobaktérium toxicitását tekintve (5. táblázat). 5. táblázat. Az ökotoxicitási tesztekkel vizsgált cianobaktérium izolátumok általános hatása (Toxalert 100: IC 50 (mg/ml); Daphtoxkit F (mg/ml), Thamnotox-F (μg/ml), ArTox (mg/ml): LC 50 ) ACT 9502 ACT 9503 ACT 9504 ACT 9505 PCC 6506 V. fischeri (ToxAlert100) SD(±) D. magna (Daphtoxkit F) SD(±) A. salina (ArTox) SD(±) T. platyurus * (Thamnotoxkit F) SD(±) * 4,253 1,1 0,919 0,137 4,2 0,7 9,38 4,42 3,667 0,8 2,341 0,473 4,5 1,1 37,5 17,68 0,893 0,4 2,243 0,339 2,7 0,6 9,38 4,42 3,423 1,2 4,234 0,719 5,8 1, ,36 1,246 0,9 1,327 0,214 2,4 0,5 6,38 2,65 AQS 0,171 0,05 0,11 0,048 0,23 0,03 2,88 0,88 * μg ml -1 A legerősebb toxikus hatást az AQS törzs nyers kivonata fejtette ki, körülbelül egy nagyságrenddel erőteljesebbnek bizonyulva mind a balatoni törzsek, mind a neurotoxinokat termelő PCC 6506 törzzsel szemben, hasonlóan a táplálkozás aktivitás teszthez. A balatoni Cylindrospermopsis raciborskii törzsek toxicitási mutatói között viszonylag kismértékű, de szignifikáns különbségeket találtunk, melyek alapján a következő hatássorrend állapítható meg: ACT 9504 > ACT 9502 > ACT 9503 > ACT Az ACT 9504, ill., ACT 9502 balatoni cianobaktériumok toxicitása jelen esetben is a neurotoxinokat termelő PCC 6506 törzs hatásával mérhető össze. A Toxalert EC 50 értékei 30 perces expozíció után közel azonos koncentrációban adódtak, mint a sórák teszt során. A négy ökotoxicitási teszt alkalmazhatóságát tekintve a legelőnyösebbnek a Vibrio fisheri teszt bizonyult, mivel a teszt időtartama előkészítéssel együtt kevesebb, mint 2 óra, azonban a legérzékenyebb eljárás a Thamnocephalus platyurus teszt, amelyben a letalitási mutatók a μg ml -1 koncentráció tartományban adódtak. Utóbbi eljárás alapján még a balatoni törzsek toxicitása között is a különbségek lényegesen jobban mérhetők. Az Artemia salina, valamint a Daphnia magna teszt érzékenysége a Vibrio fisheri módszerével közel azonos, az elemzés időtartama azonban, összességében 72 illetve 96 óra (a keltetési procedúrát is beleszámítva), emiatt ha csak az általános toxikus hatásbecslés a cél, a ToxAlert lehet a legelőnyösebb választás. 66

66 Az Artemia naupliák bevonása további bioassay vizsgálatokba azonban egy nagyon fontos előnyt is jelent, ugyanis a vizsgálati (1 ml) térfogatban akár 100 egyed is kezelhető, és a letalitási tesztet túlélő egyedekből készült szövetmintákból biokémiai vizsgálatok (biomarker enzimszint mérések) közvetlenül elvégezhetőek, mint azt a továbbiakban bemutatott eredmények is igazolják ( fejezet). A mortalitás tesztek eredményeit összehasonlítva a táplálkozás aktivitás-tesztek eredményeivel megállapítható, hogy a standard szórások utóbbi esetében jelentősen kisebbek (2 órás expozíció), ami ismét az alternatív végpont előnyösségét hangsúlyozza. Az időtényező szempontjából összevetve a táplálkozás aktivitás-gátláson alapuló tesztet a konvencionális mortalitás tesztekkel, megállapítható, hogy az előbbi alkalmazása esetén (a keltetéshez szükséges időt nem tekintve), közel 12 órát nyerhetünk. A V. fischeri teszttel összehasonlítva, a bemutatott módszereket, a ToxAlert tesztrendszer gyorsabb, azonban kevésbé differenciál az algák között Biokémiai marker vizsgálatok Artemia salina héjnélküli kisrákon A cianobakteriális szekunder metabolitok hatását az ökotoxikológiai vizsgálatokban legfontosabb marker enzimek alakulása alapján is értékeltük. Az akut expozíció során a tesztállatokban a glutation-s transzferáz (a detoxifikációs folyamatok indukciójának markere), a tejsav dehidrogenáz (a metabolikus állapot mutatója), valamint az acetilkolineszteráz (neurotranszmisszió jelzője) enzimaktivitás változásait vizsgáltuk. A teszteket sórákon (Artemia salina) azzal a céllal végeztük, hogy részletesen nyomon tudjuk követni a nyers algakivonatok dózisfüggő hatását a kontroll és az LC 50 -es szintnek megfelelő koncentráció tartományban. A mortalitási tesztek alapján legtoxikusabb AQS törzs nyers kivonata jelentős LDH aktivitásnövekedést okozott (0,2 mg/ml kezelési koncentrációnál a kontroll érték háromszorosát) (11. ábra és 6. táblázat). Az ACT 9504, ACT 9502 és PCC 6506-ös törzsek kivonatai általánosan a kontroll érték 2,5- szeresét jelentő LDH aktivitásnövekedést szintén előidéztek. Az LDH aktivitás maximális szintjét az ACT 9504 és PCC 6506 törzsnél 1 mg/ml kezelési koncentrációnál mértük, míg az ACT 9502 törzsnél 2 mg/ml koncentrációnál. Az ACT 67

67 9503 és ACT 9505 törzsek kivonatai mintegy 2-szeres LDH aktivitásnövekedést a 3 mg/ml kezelési koncentrációnál fejtettek ki a sórák naupliákban. ACT 9502 ACT 9503 AQS 1,4 1,4 1,4 1,2 1,2 1,2 nm tejsav dehidrogenáz perc -1 mg protein -1 1,0 1,0 1,0 0,8 0,8 0,8 0,6 0,6 0,6 0,4 0,4 0,4 0,2 0,2 0,2 0,0 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 0,0 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 0,0 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 ACT 9504 ACT 9505 PCC 1,4 1,4 1,4 1,2 1,2 1,2 1,0 1,0 1,0 0,8 0,8 0,8 0,6 0,6 0,6 0,4 0,4 0,4 0,2 0,2 0,2 0,0 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 0,0 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 0,0 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 kezelési koncentráció [mg alga ml -1 ] 11. ábra. Tejsav dehidrogenáz aktivitásának változása a sórák naupliákban a nyers cianobaktérium kivonatok hatására Az AQS törzs kivonatával ellentétben valamennyi balatoni Cylindrospermopsis raciborskii ill., a PCC 6506-os törzs nyers kivonata szignifikáns GST aktivitásnövekedést okozott a kezelés során, mely dózisfüggően nőtt az LC 50 expozíciós küszöbig (12. ábra). Az ACT 9504 és ACT 9502 törzsek kivonatával kezelt rákokban a GST aktivitás mintegy 80%-al volt nagyobb a kontroll szintnél, míg az ACT 9503 és ACT 9505 törzsek kivonata kisebb mértékű (45-, ill. 30%), de ugyancsak szignifikáns növekedést okozott. A PCC 6506-os törzs közel azonos mértékű GST aktivitásnövekedést fejtett ki, mint a balatoni ACT 9504 és ACT 9502 törzsek. Az AQS törzs nyers kivonata GST aktivitás gátlást (0,2 mg ml -1 kezelési koncentrációnál 50% a kontrollhoz mérten) váltott ki a tesztállatokban, ami az AQS törzs által termelt cilindrospermopszin sajátos citotoxikus ill., hepatotoxikus jellegéből adódik. 68

68 ACT 9502 ACT 9503 AQS ,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 0 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 0 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 nm glutation S-transzferáz perc -1 mg protein -1 ACT 9504 ACT 9505 PCC ,0 0,5 1,0 1,5 2,0 0 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 0 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 kezelési koncentráció [mg alga ml -1 ] 12. ábra. Glutation-S transzferáz aktivitásának változása a sórák naupliákban a nyers cianobaktérium kivonatok hatására A rák naupliák acetilkolineszteráz aktivitására a kontroll szint 50%-át elérő AChE aktivitás gátlását okozta a PCC 6506 törzs nyers kivonata (1,5 mg ml -1 ), valamint az ACT 9504 (1,5 mg ml -1 ) és ACT 9502 (2,0 mg ml -1 ) törzsek kivonatai, ami a cianobaktériumok által termelt hatóanyagok neurotoxikus hatását jelzik. Az AQS, valamint az ACT 9503 és ACT 9505 törzsek kivonatai nem váltottak ki szignifikáns hatást az acetilkolineszteráz aktivitásra (13. ábra). A biokémiai marker enzimek dózisfüggő változása alapján probit analízissel meghatároztuk az algakivonatok 50%-os hatáskoncentrációit, melyek alapján megállapítható, hogy a balatoni Cylindrospermopsis raciborskii törzsek toxikus jellegükben illetve hatásmechanizmusuk szerint az anatoxinokat termelő PCC 6506-ös törzshöz állnak közelebb. 69

69 ACT 9502 ACT 9503 AQS nm acetilkolineszteráz perc -1 mg protein -1 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0 ACT ,0 0,5 1,0 1,5 2,0 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0 ACT ,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0 PCC 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 kezelési koncentráció [mg alga ml -1 ] 13. ábra. Az acetilkolineszteráz aktivitásának változása a sórák naupliákban a nyers cianobaktérium kivonatok hatására 6. Táblázat. A cianobaktérium kivonatok 50%-os hatáskoncentrációi a sórák naupliák biokémiai marker enzimeire Cianobaktérium törzsek Pusztulási arány 24 h LC 50 [mg/ml] GST aktivitás változása 24 h EC 50 [mg/ml] LDH aktivitás változása 24 h EC 50 [mg/ml] AChE aktivitás változása 24 h EC 50 [mg/ml] ACT ,2 3,46 0,70 2,87 ACT ,5 1,95 ACT ,7 2,32 0,97 1,53 ACT ,8 2,88 PCC ,4 1,93 0,49 1,94 AQS 0,23 0,41 0,07 A tesztsorozat célja a három általánosan alkalmazott biokémiai biomarker, az LDH, a GST, valamint az AChE rutinszerű alkalmazhatóságának vizsgálata volt az ökotoxikológia vizsgálatok során. 70

70 Az LDH citoplazmatikus eredetű enzim, amely számos szövet sejtjeiben jelen van. Az LDH enzimnek fontos szerep jut a sejtek energiaellátásában, különösen, ha gyors energia utánpótlásra van szüksége a sejteknek. Negatív korreláció figyelhető meg a vízi élőlények LDH aktivitása és az elérhető oxigénmennyiség között, amely egy lehetséges biokémiai kiegyensúlyozó folyamatra utal alacsony oxigénszint esetén (Wu és Lam 1997). Az anaerob metabolitikus folyamatok felerősödése világos jelzője az oxigénhiány hatására létrejövő energiahiányos állapotnak (Van DerThillart 1986). Halak esetében például peszticidek károsító hatására a károsodó kopoltyúk nem képesek ellátni feladatukat az oxigénfelvétel során (Lichtenfels et al. 1996). Hasonlóan, propanil hatására létrejövő anémiás állapotban az anabolikus és katabolikus metabolitikus folyamatok kerülnek előtérbe (McMillan et al. 1990; McMillan et al. 1991). Ez a folyamat kémiai stressz hatására is aktivizálódik, amikor a szervezetben nagyobb energiaigény indukálódik a toxikus komponensek ártalmatlanítása érdekében. Az energianyerés ilyenkor anaerob glikolízis útján megy végbe. Ezért az LDH aktivitásának vizsgálata vízi gerinctelenek esetében megfelelő eljárás toxikus hatások detektálása (Diamantino et al. 2001). A cianobakteriális toxicitás hatásainak vizsgálatában az LDH-t mint toxicitási végpontot, szinte kizárólag sejtkultúrára épülő in vitro tesztekben alkalmazzák (Botha et al. 2004; Humpage et al. 2005; Dias et al. 2009). A széles körben alkalmazott ökotoxikológiában azonban gyakran alkalmazott végpont (Das és Jena 2004; Sancho et al. 2009), egyebek mellet a kémiai stresszor által indukált energiaprodukció folyamatbeli változásainak nyomon követése során például Daphnia magna (De Coen et al. 2001), közönséges géb (Pomatoschistus microps) (Monteiro et al. 2006; Vieira et al. 2008) fajokon vizsgálták az in vivo LDH aktivitás változását. Az általunk tapasztalt GST aktivitás gátlást jegyeztek Lindsay et al. (2006) Artemia salina sórák naupliáknál cilindrospermopszinnal történő expozíció során. A szerzők 1μg/ml CYN koncentráció mellett szignifikáns GST aktivitás csökkenést tapasztaltak. A CYN toxinról irodalmi adatokból tudjuk, hogy toxikus hatását csak akkor képes kiváltani, ha a citokróm P450 metabolizáló rendszer aktiválódik (Runnegar et al. 1995; Shaw et al. 2000). Ha a citokróm P450 rendszer károsodik, vagy telítődik, a CYN nem képes hatását kifejteni, ezért telítődési értéket követően csökken a GST aktivitás (Lindsay et al. 2006). A GST rendszer elsősorban a hepatotoxikus xenobiotikumok detoxifikációjában játszik fontos szerepet, de kisebb mértékben egyéb toxikus anyag 71

71 szervezetbe jutása is befolyásolja aktivitásának mértékét (Pflugmacher et al. 1998; Pflugmacher és Steinberg 1998; Pflugmacher et al. 2001; Beattie et al. 2003). Lindsay et al. (2006) cianobakteriális LPS hatására is szignifikáns GST aktivitás csökkenést regisztráltak. Hasonlóan GST inhibíciót figyeltek meg cianobakteriális LPS hatására Danio rerio fajon Runnegar et al. (1995) is. A balatoni törzsek, valamint a PCC 6506 jelentősen kisebb hatását ez utóbbi tény magyarázza, illetve a GST aktivitás kisebb mértékű változása hepatotoxinok hiányára utal. Az általunk leírt haranggörbe alakú telítési mintát írtak le Veira et al. (2009) higany hatásainak vizsgálata kapcsán közönséges géb esetében (Pomatoschistus microps). A szerzők a telítődési minta megjelenését a GST enzim toxin által történt felélésének tulajdonítja, melyhez hasonló jelenséget tapasztaltak fekete törpeharcsa (Ictalurus melas) vizsgálata kapcsán (Elia et al. 2003) is. Az AChE klasszikus biomerkere a neurotoxikus hatásoknak, általában szerves foszfátés karbamát peszticidek hatásának leírására alkalmazzák. Ugyanakkor számos egyéb fontos szennyező anyag típussal kapcsolatban, mint például fémek, szénhidrogének és detergensek vizsgálata során is leírtak AChE gátló hatást (Zinkl et al. 1991; Payne et al. 1996; Najimi et al. 1997; Guilhermino et al. 1998). A hepatotoxikus nodularinnal (cianotoxin) kapcsolatban szintén leírtak AChE gátló hatásokat Macoma balthica kagylófaj vizsgálata kapcsán. A szerzők ezt egyfelől a nodularin általános toxikus hatásából fakadó idegi elváltozásokkal magyarázzák. Másfelől feltételezik, hogy a toxikus folyamatok hatása által a szövetekben kiváltott megnövekedett energiaigény gátló hatással van a proteinszintézisre, ezen belül az AChE szintézisre és a szervezetben jelenlévő mennyiségre is (Lehtonen et al. 2003). Vizsgálataink során szignifikáns AChE inhibíciót a nagymennyiségben citotoxikus és protein szintézist gátló cilindrospermopszint tartalmazó AQS törzs hatására nem tapasztaltunk, bár ez a törzs bizonyult a legtoxikusabbnak valamennyi mortalitási teszt során. Ez nem támasztja alá Lehtonen et al. (2003) következtetését az AChE közvetett gátlására vonatkozólag. Ugyanakkor szignifikáns AChE gátló hatást váltottak ki a balatoni C. raciborskii ACT 9502 és ACT 9504 törzsek, valamint az anatoxinokat termelő PCC 6506 törzs. Ez a gátló hatás azonban nincs összefüggésben az anatoxinok mennyiségével, mivel az analitikai vizsgálatok nem mutatták anatoxinok jelenlétét 72

72 egyik balatoni C. raciborskii törzs esetében sem (3.5 fejezet). Mindamellett az anatoxin-a és a homoanatoxin-a hatását nem a kolinészteráz enzim blokkolása révén, hanem a muszkuláris és idegi nikotin acetilkolin típusú receptorok antagonisztikus gátlása által fejti ki. Specifikus AChE gátlást csak az anatoxin-a(s) vált ki az anatoxinok közül (Araoz et al. 2009; Osswald et al. 2007). A vizsgálatok során az AChE aktivitás a bevitt algamennyiséggel negatív korrelációt mutatott. A korreláció arra utal, hogy mind a PCC 6506, mind a balatoni ACT 9502 és ACT 9504 C. raciborskii törzsek tartalmazhatnak ismeretlen AChE inhibitor szekunder metabolitokat Biokémiai marker vizsgálatok Dikerogammarus villosus amphipoda rákon A balatoni cianobaktériumok esetleges tömegprodukciója során felmerülő környezeti kockázat becslésére vizsgáltuk a négy balatoni C. raciborskii törzs nyers kivonatának hatását egy Balatonból gyűjtött amphipoda rákfajon (Dikerogammarus villosus). A 48 ill. 96 órás kezelés során alkalmazott cianobaktérium szuszpenziók (10- ill., 20 mg/l alga liofilizátum) a μg/l klorofill-a tartalomnak megfelelő mennyiségek. Hasonló értékek a Balatonon az ben észlelt Cylindrospermopsis tömegprodukciók alkalmával jegyeztek fel, vagyis a 10 mg l-1-es dózis a balatoni C. raciborskii tömegprodukcióval megegyező állapotnak felelt meg. Pozitív referenciaként ez esetben is a cilindrospermopszint termelő AQS és a neurotoxinokat termelő PCC 6506-os törzs nyers kivonatait alkalmaztuk a balatoni mintákkal megegyező koncentrációban. A kivonatok biomarker enzimekre kifejtett hatását az Artemia tesztekhez hasonlóan a három biokémiai végpont GST, LDH, AChE változásai alapján értékeltük, melyeket egésztest homogenizátumban követtük nyomon, egyedenkénti feldolgozásban (7. táblázat). 73

73 7. táblázat. Biokémiai marker enzimek változása a Dikerogammarus villosus amphipoda rákban cianobakteriális expozíció hatására Cianobaktérium törzsek Expozíció [96 h] GST aktivitás változása [%] 10 mg l μg Chl-a l mg l μg Chl-a l -1 LDH aktivitás változása [%] 10 mg l μg Chl-a l mg l μg Chl-a l -1 AChE aktivitás változása [%] 10 mg l μg Chl-a l mg l μg Chl-a l -1 ACT % 21% 82% 200% 9% 17% ACT % 12% 63% 170% 11% ACT % 27% 97% 290% 17% 26% ACT % 33% 48% AQS 13% 17% 98% 550% PCC % 43% 240% 9% 24% A kísérletekben alkalmazott koncentrációknál egyetlen cianobaktérium kivonata sem okozott mérhető letalitást, vagyis a biokémiai eredmények szubletális dózisnak megfelelő változásokat tükröznek. A GST aktivitás szignifikánsan csak a 20 mg/l kezelési koncentrációnál nőtt meg a kezelt állatokban mind a balatoni (ACT 9502, ACT 9504), ill., a PCC 6506-os törzsek kivonatai hatására. Az AQS kivonat csekély aktivitásnövekedést okozott, ami látszólag ellentétes az Artemia ökotoxicitási tesztekben kapott eredményekkel. Ismerve viszont a GST szint dózisfüggését (nő, majd csökken a GST aktivitás), az AQS hatásában ill. GST szintben mért különbségének magyarázata, hogy Artemia esetén toxikus koncentrációkat teszteltünk, míg a Dikerogammarus kísérletek szubletális (természetes állapottal közel megegyező) dózisban történtek. Az állatokban az Artemia-teszt eredményekkel megegyezően minden balatoni algakivonat, legerőteljesebben az ACT 9504 törzs okozott számottevő LDH aktivitásnövekedést, míg az ACT 9505-ös törzs bizonyult a legkevésbé károsnak. Ugyancsak az Artemia eredményekkel összhangban, az ACT 9504, valamint PCC 6506-os törzsekkel kezelt rákok szöveteiben mérhettük a legnagyobb mértékű acetilkolineszteráz enzim gátlását is. Az ACT 9504 és az ACT 9502, valamint a PCC 6506 törzsek hatására megfigyelt szignifikáns AChE aktivitás csökkenés (7. táblázat) korrelációt mutatott a rákok spontán mozgásában megfigyelt csökkenésével jelezve a kivonatokban az acetilkolinesztaráz gátló neurotoxikus komponens(ek) jelenlétét. A Balatonon eddig előfordult tömegprodukciót a fenti kísérletsorozatban modellezve megállapíthattuk, hogy az in situ algavirágzásnak megfelelő koncentrációban 74

74 In vitro AChE inhibíció IC 50 (mg/ml) alkalmazott balatoni C. raciborskii algakivonatok, de még a bizonyítottan toxintermelő (AQS, PCC 6506) törzsek sem okozzák a tesztállatok mortalitását, viszont szubletális változásokat (viselkedési és biokémiai válaszreakciókat) idéznek elő. A modellként alkalmazott planktonikus rákszervezetek (Thamnocephalus platyurus, Artemia salina, Daphnia magna), valamint az amphipoda (Dikerogammarus villosus) rákkal végzett toxicitási tesztek szoros korrelációja azt mutatja, hogy az Artemiateszteken alapuló toxicitási vizsgálatok eredménye alkalmas lehet in situ cianobakteriális tömegprodukció kockázatbecslésére az édesvízi amphipoda ill. planktonikus rákok tekintetében is In vitro acetilkolinészteráz gátlás vizsgálatok Az anatoxin-a(s) kimutatására alkalmazott in vitro acetilkolineszteráz gátlás vizsgálat két törzs esetében (ACT 9502, ACT 9504) mutatott pozitív eredményt, ezek IC 50 értéke rendre 3,94 és 3,89 mg/l (14. ábra). Az alkalmazott legkisebb (0,25 mg/l) algakoncentráció esetében is már kisebb mértékű, 35-, ill. 40%-os gátlást mértünk a Cylindrospermopsis raciborskii ACT 9502, valamint ACT 9504 törzsek esetében, és minden mintánál szignifikáns dózisfüggést találtunk (15. ábra). A cianobaktérium liofilizátumok acetilkolineszter gátlása in vitro - IC 50 értékek [mg/l] AQS PCC 14. ábra. Cianobaktérium törzsek acetilkolineszteráz gátló hatása 75

75 AChE gátlás [%] ACT 9504 ACT ,25 0,50 0,75 1,00 mg liofilizátum 15. ábra. Az ACT 9502 és az ACT 9504 törzsek dózisfüggő hatása acetilkolinészterázra in vitro Az anatoxin-a(s) pontos azonosítása csak HPLC-MS technikával valósítható meg, így az eredmények értékelésénél csak azt állíthatjuk biztonsággal, hogy a cianobaktérium minták anatoxin-a(s)-hez hasonló hatású antikolineszteráz gátló bioaktív komponenst tartalmaztak. Számos szintetikus szerves foszfát és karbamát vegyület is hasonlóképpen hat az acetilkolineszterázra, azonban mivel a tesztet csak izolált cianobaktérium törzsek esetén alkalmaztuk, más enzimatikus gátló komponens jelenléte nagy biztonsággal kizárható a mintákból A cianobaktériumok nyers kivonatainak analitikai elemzése Az ökotoxikológiai vizsgálatokban alkalmazott cianobaktérium mintákban a cilindrospermopszin, anatoxin-a, homoanatoxin-a, honoanatoxin-a(s), valamint szaxitoxinok azonosítását és mennyiségi meghatározását végeztük el. Az AQS és PCC 6506 törzsek vizes kivonataiban a cilindrospermopszin és anatoxin-a azonosítása UV detektálást alkalmazva a retenciós idő-, valamint molekulatömeg alapján történt. Az ismert cianotoxinok azonosítása és mennyiségi meghatározása részben standard (kereskedelemben kapható) toxinok alkalmazásával, illetve a tömegspektrumok irodalmi adatokkal való összehasonlítása alapján történt. A szaxitoxinok detektálása spektrofotometriás úton történt. A cinaobakteriális vizes kivonatok elemzése során 50 különböző molekulát sikerült elkülönítenünk a kromatogramok és a tömegspektrumok elemzése során 8. táblázat). Az 50 molekulából mindösszesen négyet tudtunk minden kétséget kizáróan azonosítani 76

76 (anatoxin-a, homoanatoxin-a, cilindrospermopszin, valamint fenil-alain) részben irodalmi adatok, részben referencia minták által. A C. raciborskii törzsekre (AQS, ACT ACT 9502, ACT 9503, ACT 9504, ACT 9505) 6 molekula bizonyult specifikusnak (R t =0,7 m/z=244,1; R t =1,0 m/z=330,1; R t =1,9 m/z=152,1 ; R t =2,5 m/z=276,1; R t =2,8 m/z=479,2; R t =11,9 m/z=228,3). Ugyanakkor 13 molekula csak a balatoni törzsekben volt megtalálható. 8. táblázat. Az azonosított molekulák megoszlása az egyes algatörzsek esetében Összes Azonosított Összes molekula 50 4 C. raciborskii fajra specifikus 6 0 Balatoni C. raciborskii fajra specifikus 13 0 AQS specifikus 12 1 PCC 9606 specifikus 11 2 Mindegyikben megtalálható 2 1 Az elkülönített molekulák közül 41 bizonyult UV-aktívnak. Ezek közül hét csak az AQS törzsre volt jellemző (R t =0,6 m/z=209,1 R t =0,8 m/z=209,1 R t =1,6 m/z=269,1 R t =1,8 m/z=416,2 R t =2,1 m/z=240,1 R t =2,8 m/z=238,1 R t =15,6 m/z=270,4). A felsorolt ionok közül egyet tudtunk azonosítani, az 1,8 perces retenciós idővel eluálódó cilindrospermopszint (16. ábra). 16. ábra. Az AQS C. raciborskii törzs teljes ion (fent) és UV kromatogramja (lent). Kékkel a törzsre kizárólagosan jellemző UV-aktív ionok; pirossal kiemelve a cilindrospermopszin. 77

77 Az UV-aktív ionok közül nyolc kizárólag a PCC 6506 törzsben volt megtalálható (R t =0,5 m/z=191,0; R t =1,7 m/z=416,2; R t =1,9 m/z=230,2; R t =2,7 m/z=479,2; R t =3,0 m/z=166,1; R t =4,2 m/z=180,1; R t =11,3 m/z=303,2; R t =13,3 m/z=331,3). Ezek közül kettő volt azonosítható, a 3,1 perces retenciós idővel megjelenő anatoxin-a, illetve a 4,0 percnél eluálódó homoanatoxin-a (17. ábra). 17. ábra. A PCC 6506 törzs teljes ion (fent) és UV kromatogramja (lent). Kékkel a törzsre kizárólagosan jellemző UV-aktív ionok; pirossal kiemelve az anatoxinok. A 41 UV-tartományban aktív molekula közül nyolc (R t =0,5 m/z=293,1; R t =0,8 m/z=244,1; R t =0,9 m/z=137,1; R t =1,3 m/z=240,1; R t =1,4 m/z=240,1; R t =2 m/z=152,1; R t =2,2 m/z=406,3; R t =2,8 m/z=204,1; R t =14,2 m/z=291,3) található meg kizárólag a balatoni C. raciborskii törzsekben (18. ábra). 78

78 18. ábra. Az balatoni ACT 9504 C. raciborskii törzs teljes ion (fent) és UV kromatogramja (lent). Kékkel a törzsre kizárólagosan jellemző UV-aktív ionok; pirossal kiemelve a fenil-alanin. Az alkalmazott kromatográfiás protokoll alapján a tisztított cilindrospermopszin (CYN) 1,8 perces retenciós időnél eluálódott (19. ábra A) az oszlopról, és a tömegspektrométer pozitív ionizációs üzemmódja miatt a tömegspektrumokon a m/z=416,1 molekulatömeg (M + ) alapján detektáltuk (19. ábra A, jobbra). A fényelnyelési maximumot =262 nm UV hullámhosszon szkenneltük. Az anatoxin-a referencia (Atx) azonos kromatográfiás körülmények között 2,9 perces retenciós időnél eluálódot, az M + = 166,1 molekulatömeggel, =227 nm UV szkennelési hullámhosszon (19. ábra és ábra). Cilindrospermopszin egyedül az AQS tisztított frakciójában volt kimutatható (19. ábra B). A CYN referenciával azonos retenciós időnél eluálódott az oszlopról (1,8 ), azonos tömeggel (416,1 Da). A mért paraméterek teljes azonosságot mutattak a CYN referenciával, ezért a hatóanyag azonosítása minden kétséget kizáró. A CYN referencia kalibrációs görbéje alapján az AQS cianobaktérium liofilizátumának CYN tartalma 12,7 mg CYN g -1 alga liofilizátum. 79